03 Métodos de análisis bioquímicos
-
Upload
jlmaravillas7104 -
Category
Documents
-
view
739 -
download
0
Transcript of 03 Métodos de análisis bioquímicos
Métodos de Análisis Bioquímico y Técnicas en Biología Molecular
Departamento de Biomedicina MolecularCINVESTAV-IPNDepartamento de Biomedicina MolecularCINVESTAV-IPN
Métodos
MÉTODOS PARA INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA
• Bioquímicas
• Biología Molecular
CentrifugaciónFraccionamiento Celular
Electroforesis de Proteínas
Sedimetación
• Cultivo Celular
Purificación de Proteínas
• Interacciones ProtéicasFRET
Doble híbrido
Western blot
Coomasie
PCREnzimas de RestricciónSecuenciación
Fluorescesce Activated Cell Sorter
FACS
Laser capture microdissection (LSM)
Cultivo Celular
HISTORIA DEL CULTIVOEl inicio del cultivo de células y tejidos in vitro, tuvo su orígen en el siglo
XIX como una continuación de las técnicas de embriología:
• 1866 Rechlinhausen• 1885 Wilhem Roux• 1907 R.G. Harrison• 1910 Burrows y Carrel• 1913 Carrel• 1916 Rous y Jones• 1920-1940 Surgen los antibióticos
• 1948 Earle y col• 1952 Grey y col• 1954 Rita Levi-Montalcini• 1955 Eagle• 1961 Hayflick y Moorhead• 1965 Ham.• 1969 Augusti-Tocco • 1976 Sato y col
CULTIVO CELULAR ACTUAL
Se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Dependiendo del grado de preservación, de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración, se puede hablar de diferentes tipos de cultivos: de células, de órganos y explantes primarios o secundarios.
TIPOS DE CULTIVO
Adulto Embrión Huevo
Disección
Picado fino Disección posteriorsi es necesario
Digestión enzimática
Cultivo celular Explantes primarios Cultivo de órganos
El uso de algún sustrato (fibronectina, colágeno, etc) que mejore la adhesión
PRODUCCION DE HIBRIDOMAS
1975 Kohler and Milstein
Métodos Bioquímicos
CENTRIFUGACION
SEDIMENTACIÓN
Velocidad de Sedimentación Equilibrio de Sedimentación
Gradientes de Sacarosa: proteínas CsCl ácidos nucléicos
Purificación por Cromatografía
Tipos:Intercambio Ionico
Filtración en Gel (exclusión de tamaño)
AFINIDAD:
Ni-NTA (6x His-Tag)
GST (glutation S-Transferasa)
Anticuerpos
ATP
Oligonucleotidos
PURIFICACION POR CROMATOGRAFIA
PURIFICACION POR CROMATOGRAFIA
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
WESTERN BLOT
Biología Molecular
Tecnología del DNA recombinante comprende
una mezcla de técnicas:
1. Amplificación de fragmentos de DNA por PCR,
• restricción del DNA por enzimas de restricción
2. Clonación del DNA ,donde un fragento específico DNA es
integrado a un elemento genético de replicación (plasmido or
virus),
3. Hibridación de ácidos nucleicos, el cual hace posible identificar
genes.
4. Secuenciación del DNA de un fragmento amplificado
5. Ingenieria, donde nucleotidos especificos pueden ser
cambiados y determinarse las consecuencias funcionales de la
mutación determinada
ENZIMAS DE
RESTRICCION
LIGACION
PCR:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
TM=Temperature Melting
TERMOCICLADOR PARA PCR
Marcadores Productos de PCR
Marcadores Productos de PCR
Secuenciar Mutar Hibridizar
5’ 3’
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Mutagénesis dirigida
Gene Discovery Efforts: Head and Neck-Cancer Genome Anatomy Project
• NCI and NIDCR have recently teamed up to establish the Head and Neck Cancer Genome Anatomy Project (HN-CGAP), a collaborative joint effort aimed to creating a complete information infrastructure of genes expressed in squamous cell carcinomas of the head and neck
Laser capture microdissection
CGAP-Sequencing
-Blast
known genesanonymous ESTs
cDNA Librariesnovel genes!
Gene Evaluation Efforts: Genomic approaches to understand head and neck cancer
Leethanakul et al, Oncogene, 19: 3220-3224, 2000
HNSCC: Laser capture microdissection and membrane arrays
Advances in molecular biology allow one to experimentally move from gene to protein and from protein to gene to gain a better
understanding of the structure and function of a target gene/protein
. Nature 2000; 407, 971 - 977Naoki kunishima et al.
FRET
FRET
ECFP
903 903EYFP
hCaR
Excitación
FRETEmisión
<100Å
Reductoras No-Reductoras
hC
aR
Wt
hC
aR
/EC
FP
hC
aR
/EY
FP
hC
aR
Wt
hC
aR
/EC
FP
hC
aR
/EY
FP
0 5 10 15 20 250
10000
20000
30000
40000
hCaR Wt
hCaR/E C FP
hCaR/E YFP
CM
P
212
121
96
kDa
[Calcio] mM
hCaR ECFP
Contraste fase
hCaR EYFP
ECFP
EYFP
Contraste fase
Contraste fase
GST
293T
LT G
ST-
CaR
cter
GS
T-C
aRct
er
LT G
ST-
Δ89
5-10
75
LT G
ST
Mar
acad
ore
s
GS
T
GS
T-Δ
895-
1075
Pull-down
Doble Híbrido
GRACIAS