Chromiumシステム

大量並列分画化のパワー

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Chromiumコントローラー

Chromiumシステム | 大量並列分画化のパワー

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GemCodeテクノロジーを備えたChromiumシステムは、精密に設計された試薬のデリバリー技術により、数千にわたるマイクロ反応の並列化を可能にしました。

図1．GEMは“Gel Bead in emulsion”と呼ばれる液滴で、Chromiumシステム内で各マイクロ反応をカプセル化します。ここでは、シングルT細胞、試薬、およびバーコード付加ゲルビーズが1つの液滴に分画化されたシングルセルGEMを示しています。

分画化のパワー

大量分画化と バーコード付加数分間でサンプルを個々に参照可能な数百から数万の分画を実施します。それぞれの分画には後々のデータ解析時に同定が可能なバーコードが含まれています。

各ゲルビーズには数百万にもわたる固有のオリゴヌクレオチド配列が含まれており、サンプルと混合します。サンプルには、高分子量（HMW）DNA、個々の細胞、Feature Barcodingテクノロジーでラベル化した細胞、細胞核、トランスポゼース処理した細胞核、またはセルビーズが使用できます（次のセクションを参照）。次にゲルビーズとサンプルをオイル－界面活性剤溶液に加え、Gel Beads in emulsion（GEMs）を形成します。これが個々の反応系の単位となり、内部ではゲルビーズが溶解し、サンプルにバーコードが付加されます（図1）。バーコードを付加した産物はプールし、ショートリードシーケンサーに対応したライブラリーを調製します。シーケンス後は、バーコード付きのショートリード配列を既成のパイプラインで解析し、識別用のバーコード配列を用いて元のHMW DNA、シングルセル、またはシングル細胞核へ各リードをマップします。

シングルセルGEM

分画化オイル

機能化されたゲルビーズ

シングルT細胞

溶液中の逆転写試薬

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Single Cell 3’ v3 Gel Bead

ゲルビーズ

10xBC

UMI

UMI

UMI

10xBC

10xBC

Poly(dT)VNTruSeq Read 1

Capture Seq 1

Nextera Read 1(Read 1N)

Capture Seq 2

Nextera Read 1(Read 1N)

回収

10xバーコードが付加されたcDNA

逆転写反応

プールオイルの除去

オイル

シングルセルGEM

10xバーコードが付加されたcDNA

10xバーコードが付加されたゲルビーズ

細胞酵素

Chromiumシステムでは、最大で数万の細胞を対象にシングルセル遺伝子発現解析を行えます。シングルセル懸濁液をシステムにロードしてGEMに分画化し、転写産物を細胞特異的なバーコードで標識します。バーコードが付加されたcDNAはその後のプロセスおよびライブラリー調製のためにプールします（図2）。

精密で効率的なマイクロ流路により、1回の効率的なランで液滴中の細胞を100～80,000個以上回収できます。2つ以上の細胞が入る確率は低く、貴重で希少な細胞集団のプロファイリングを容易にします。シーケンスの後、下流解析のバイオインフォマティクスツールで、細胞ごとのバーコードから同じ細胞に由来する転写産物をグループ化し、トランスクリプトームを明らかにします。Feature Barcodingテクノロジーでは、特異的なオリゴヌクレオチド配列を用いることで個々の細胞に関連する細胞表面タンパク質やCRISPRによる摂動を同定し、より強固な細胞の表現型や特徴づけを行います。

図2．シングルセル遺伝子発現解析のためのChromium分画化ワークフロー

トランス クリプトーム解析のためのシングルセル分画化

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10xバーコードが付加されたゲルビーズ

回収

逆転写反応

プールオイルの除去

オイル

10xバーコードが付加されたcDNAおよびFeature Barcode DNA

10xバーコードが付加されたcDNAおよびFeature Barcode DNA

GEM中のシングルセル

細胞酵素

10xバーコード

UMIR1

スイッチオリゴ

Chromiumシステムでは、最大で数万のT細胞およびB細胞について細胞ごとの免疫プロファイリングを行えます。フローソートされた細胞を含むシングルセル懸濁液、あるいはFeature Barcodingテクノロジーを用いて抗体またはペプチド－MHC多量体で標識された細胞をシステムにロードし、GEMに分画化します。転写産物を生成した後、細胞特異的なバーコードで標識し、下流プロセスおよびライブラリー調製のためにcDNAをプールします（図3）。免疫レパトアのプロファイル解析時には、ライブラリー調製に先立って、cDNAに対しT細胞およびB細胞受容体転写産物のターゲット濃縮を行います。

精密で効率的なマイクロ流路により、短時間で液滴中の細胞を100～80,000個以上回収できます。2つ以上の細胞が入る確率は低く、貴重で希少な細胞集団のプロファイリングを容易にします。シーケンスの後、下流解析のバイオインフォマティクスツールで、細胞ごとのバーコードから同じ細胞に由来する転写産物をグループ化し、個々の細胞のトランスクリプトームとT細胞またはB細胞の受容体ペアの配列全長を明らかにします。Feature Barcodingの配列は、個々の細胞に関連する特異的抗原または細胞表面タンパク質の同定にも使用され、自然免疫および適応免疫のより正確な分類を可能にします。

図3． シングルセル免疫学アプリケーションのためのChromium分画化ワークフロー

免疫学アプリケーションのためのシングルセル分画化

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10xバーコードが付加されたゲルビーズ

R1N

10xバーコード

P5

10xバーコードが付加されたアクセシブルDNAフラグメント

10xバーコードが付加されたアクセシブルDNAフラグメント

シングル細胞核GEM

バルクでの細胞核のトランスポゼース処理

リニア増幅

プールオイルの除去

回収

オイル

エピゲノム 解析のための単一細胞核の分画化

Chromiumシステムは、シングルセルレベルでのクロマチンアクセシビリティ解析を可能にします。ChromiumシングルセルATAC（Assay for Transposase Accessible Chromatin）ワークフローでは、初めにバルクで単一細胞核をトランスポゼース酵素処理し、アクセシブルなDNA領域へシーケンス用アダプターを選択的に挿入します。トランスポゼース処理された細胞核はChromiumコントローラー内でGEMに分画化されます。同じ細胞核に由来するアクセシブルDNAフラグメントは全て、共通の10xバーコートを持っています。バーコードが付加されたアクセシブルDNAフラグメントは、ダウンストリームのプロセシングおよびライブラリー調製のためにプールされます（図4）。

精密で効率的なマイクロ流路により、1回のランでドロップレットに分けられた細胞核を500～80,000個以上回収できます。2つ以上の核が入る確率は低く、不均一なサンプルのオープンクロマチン領域プロファイリングおよび希少な細胞集団の検出を容易にします。直観的に使用できるバイオインフォマティクスツールを用いると、バーコードが付加されたライブラリーフラグメントから、元々の細胞核のオープンクロマチンランドスケープへと容易に遡ることができます。

図４．シングルセルでのエピゲノミックプロファイリングのためのChromium分画化ワークフロー

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分画化ステップ#1

10xバーコードが付加されたGEM

GEM

細胞の溶解

セルビーズ

オイル

CBポリマー

細胞

分画化ステップ

#2

酵素

オイル

回収

ゲルビーズ

10xバーコードが付加されたライブラリー

プールオイルの除去

等温インキュベーション

10xテクノロジーを用い、シングルセルのDNAを2ステップの分画化プロセスで調製します。ChromiumシングルセルDNAワークフロー1では、シングルセルはまずハイドロゲルのセルビーズ（CB）にカプセル化され、これによりハイドロゲルマトリックス内にインタクトなDNAを保持したまま細胞のタンパク質分解および変性を行うことができます（図5）。細胞融解の後、DNAを含むCBは10xバーコード付加ゲルビーズ（GB）と共に分画化され、セルビーズゲルビーズ（CBGB）GEMを形成します（図5）。シングルセル由来のDNAにはCBGB内でバーコードが付加され、バーコード付加したフラグメントはライブラリー作製のためにプールされます。バーコードが付加したライブラリーフラグメントはデータ解析時のバイオインフォマティクスツールを使用して、元の細胞へ容易に遡ることができます。

図5．シングルセルゲノム解析のためのChromium分画化ワークフロー

ゲノム 解析のための シングルセル 分画化

1 Chromium コントローラー（PN 120223および120246）、あるいはChromium Single Cell コントローラー(PN120263および120212)でのみ利用可能です。

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ゲノムGEM

10xバーコードが付加されたフラグメント

10xバーコードが付加されたフラグメント

等温インキュベーション

プールオイルの除去

10xバーコードが付加されたゲルビーズ

回収

高分子gDNA

高分子量 DNAの分画化

全ゲノムまたは全エクソーム解析用に、Chromiumコントローラーは約1 ngのHMWゲノムDNAから100万以上のユニークなバーコードを持つシーケンス可能なライブラリーを調製できます（図6）。ゲノムの大量分画化を行うことにより、ハプロタイプレベルに希釈した上で長鎖のインプットDNA分子にバーコードを付加し、バルクでシーケンスを実施して、Linked-Readと呼ばれる独特のデータを産出します。バーコードが付加されたLinked-Readがコードする長領域の情報は、革新的なバイオインフォマティクスのパイプラインにを使い、反復領域も含め長距離にわたるゲノム配列へアセンブルします。Linked-Readの正確なアセンブリはヘテロ接合体部位を利用して個々のハプロタイプを決定し、二倍体のde novoアセンブリを可能にします。またSNP、短いindel、複雑な構造変異を含めたヒトのあらゆる遺伝的変異について、フェージング情報とともに変異コールを行えます。

図6．ゲノムシーケンスのためのChromium DNA分画化ワークフロー

2 Chromium コントローラー（PN 120223および120246）でのみ利用可能です。

© 2020 10X Genomics, Inc. FOR RESEARCH USE ONLY.NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.LIT000025-JP Rev F The Power of Massively Parallel Partitioning: Inside the Chromium Controller

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