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- MicroRNA -- MicroRNA -
Vorhersagen menschlicher ZielgeneVorhersagen menschlicher Zielgene
Präsentation von Sophia BardehlePräsentation von Sophia BardehleSeminar Genomics, Juni 2005Seminar Genomics, Juni 2005
betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZbetreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ
InhaltInhalt
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Bedeutung der miRNA
„TargetScan“
Target - Vorhersagen
Nachweis im Experiment
Funktion von Zielgenen
News
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Bedeutung der miRNABedeutung der miRNA
• endogene, ~22-nt, nicht-codierende RNA
in Pflanzen und Tierzellen
Funktionen:
molekulare Mechanismen unklar
bis 2003 miRNA Targets in Vertebraten unbekannt
(http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html)
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
miRNA : TargetmiRNA : Target
keine perfekte W-C- Komplementarität
„miRNA seed“= konservierte 5‘ Region
3‘ UTR Sequenz der mRNA
nach Quelle 1)
„„TargetScan“TargetScan“
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Algorithmus zur Vorhersage von Zielgenen
für konservierte miRNA in Wirbeltieren
Prinzip:
Identifizierung der mRNA,
die konservierte Bindung
mit „miRNA seed“
eingeht.
„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Grundlage:
• konservierte miRNA mehrerer Organismen(Rfam Download; Sanger Institute)
• Annotationen orthologer 3‘UTR mRNA-Sequenzen (Ensembl EnsMart)
„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
1)Suche nach „seed-match“,d.h. perfekte W-C-Paarung einer Heptamersequenz
zwischen 3‘ UTR und 5‘ „miRNA seed“
2)„RNAfold“ liefert optimale Basenpaarung für 3‘ Ende der miRNA
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
3)Berechnung der freien Energien G der
miRNA : Target Interaktionen
G1
G2
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
4) jede UTR erhält Z-Score
n
k
T
G
i
K
eZ1
5.3=e+e=e+e=Z 20
17.0
20
21.8
T
dG-
T
dG- 21
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
5) Sortierung der Z-Scores der UTRs
Rangfolge (Rank R)
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
6) Targetvorhersage
Kriterien: - hoher Z-Score mit Z ≥ Zc
- Rank R ≤ Schwellenwert Rc
Parameter: Zc, Rc und T sind frei wählbar
T = Gewichtungsfaktor für Affinität der
Basenpaarung
Erfahrungswerte: (Analyse von Maus, Ratte,
Mensch)T= 20 Zc= 4,5 Rc= 200
„„TargetScan“- ErgebnisseTargetScan“- Ergebnisse
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Analyse von miRNA : TargetInteraktionen
14.539 16.370 15.590
451Limitierung auf
konservierte, high-scoringmiRNA : TargetInteraktionen> 400 verschiedene Zielgene
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- ErgebnisseTargetScan“- Ergebnisse
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
signal
noise („false positive“)
signal:noise Verhältnis von 3.5
Ø 3,9 Targets pro miRNA
(Klasse: Mammalia)
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- ErgebnisseTargetScan“- Ergebnisse
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Bedeutung der Bindung an die 5‘ Region der miRNA
nach Quelle 1)
„„TargetScan“- ProblemeTargetScan“- Probleme
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
• unvollständige Annotationen für orthologe UTRs
• reale Targets fallen durch Z-Sore/Rank-Kriterium
• Bindestellen außerhalb 3‘ UTR unbeachtet
• nur konservierte Gene in Betracht gezogen
• gleichzeitige Interaktionen verschiedener miRNAs
an einer UTR ausgeschlossen
Fazit:
reale Anzahl an Zielgenen pro miRNA ist viel
größer
Experimenteller NachweisExperimenteller Nachweis
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Methode - Luciferase Assay -
• Auswahl von 3‘ UTR menschlicher Zielgene
PCR
• Klonierung in Luciferase Vektor
• PCR Selektion nach Insert: Wildtyp oder
Mutante
• Transformation des Luciferase Reporter
Plasmids
in menschliche HeLa-Zellen
• Messung der Luciferase Aktivität (Lumineszenz)
Photinus pyralis
Experimenteller NachweisExperimenteller Nachweis
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
Luciferase Reporter Vector
nach Quelle 1)
Experimenteller NachweisExperimenteller Nachweis
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Interpretation
• Wildtype: miRNA : Target site Bindung
Luciferaseexpression ↓
geringe Lumineszenz
• Mutante: lückenhafte miRNA : Target Basenpaarung
Luciferaseexpression ↑
hohe Signale
Luciferase
Experimenteller NachweisExperimenteller Nachweis
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Luciferaseaktivität
nach Quelle 1)
Experimenteller NachweisExperimenteller Nachweis
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Ergebnis:
15 vermutliche Zielgene („TargetScan“)
getestet
11 Gene experimentell bestätigt
ca. 30 % der Vorhersagen sind „false
positive“
Funktionen von ZielgenenFunktionen von Zielgenen
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
große funktionelle Diversität
Beispiele
• TF: High-mobility-Proteine• Signaltransduktion:STAT3• Rezeptor: LDL-R• Strukturproteine: Collagen• Enzyme:G6PD• Translationsregulator:COP9
> 400 Zielgenekonserviert
zwischen Maus, Ratte
Mensch
Funktion von ZielgenenFunktion von Zielgenen
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
GO ID Biological Process miRNAs
all orthologous genes
no assignment/unknown130 (32%) 5737 (40%)
known biological process270 (68%) 8802 (60%)
GO:0007275 development 52 (13%) 1192 (8%)
GO:0019538 protein metabolism 60 (15%) 1788 (12%)
GO:0008151 cell growth and/or maintenance 92 (23%) 2742 (19%)
GO:0006810 transport 44 (11%) 1442 (10%)
GO:0008283 cell proliferation 23 (6%) 764 (5%)
GO:0007154 cell communication 76 (19%) 2704 (19%)
GO:0007165 signal transduction 61 (15%) 2217 (15%)
GO:0006793 phosphorus metabolism 30 (8%) 589 (4%)
GO:0009605 response to external stimulus 28 (7%) 1065 (7%)
GO:0045449 regulation of transcription 82 (21%) 1210 (8%)
GO:0006350 transcription 84 (21%) 1310 (9%)
NewsNews
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
TargetScanS 2005
• 5-Genome-Analyse (signal:noise ↑)
Identifizierung von 5300 meschlichen
Genen, die durch miRNA reguliert werden
(~30% des Genoms)
TargetScan Webserver
• Datenbank zur Suche nach konserv. miRNA
Targets bzw. Zielgenen
http://genes.mit.edu/targetscan/
ReferenzenReferenzen
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
1) Prediction of Mammalian MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,3, I-hung Shih2,3, Matthew W Jones-Rhoades1,2, David P Bartel1,2, Christopher B Burge1. Cell, Vol. 115 (7), December 26, 2003.
2) Conserved Seed Pairing, Often Flanked by Adenosines, Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,2, Christopher B Burge1, David P Bartel1,2. Cell, Vol. 120 (1), January 14, 2005.
ReferenzenReferenzen
- miRNA Targets - Sophia Bardehle
3) Bartel Lab: http://web.mit.edu/biology/www/facultyareas/facresearch/bartel.shtml
4) Burge Lab: http://genes.mit.edu/burgelab/
5) I-hung_Shih-original-presentation.pdf
6) David Baulcombe (2002) "An RNA Microcosm", Science, 297: 2002-2003)
7) Ambion: http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html
8) Marianthi Kiriakidou, Peter T. Nelson et al.
“A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets”