گردآوري و نگارش: دکتر پريسا داهيم

نظارت علمي: اعضاي کميتة هماتولوژی آزمايشگاه مرجع سالمت

اعضاي کميته به ترتيب حروف الفبا:

وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكيمعاونت سالمت

دستگاه هاي خودكار شمارندة سلولي)اساس كار، كاليبراسيون، كنترل كيفيت و خطاها(

با همكاري: دکتر مرجان رهنمای فرزامی)متخصص آسيب شناسی(

دکتر مينو احمدی نژاد)متخصص آسيب شناسی(دکتر بهزاد پوپک)دکتراي تخصصي هماتولوژی(

دکتر کتايون خداورديان)دکتراي علوم آزمايشگاهی(دکتر پريسا داهيم)متخصص آسيب شناسی(

دکتر آتوسا شريعت تربقاني)متخصص آسيب شناسی(دکتر عبدالعلی شمس برهان)متخصص علوم آزمايشگاهی( دکتر محمد فرهادی لنگرودی)متخصص آسيب شناسی(

دکتر فريد کوثری)متخصص آسيب شناسی(

آزمايشگاه مرجع سالمت

گردآوري و نگارش: دکتر پريسا داهيمنظارت علمي اعضاي کميتة هماتولوژی آزمايشگاه مرجع سالمت: دکتر مينو احمدی نژاد)متخصص آسيب شناسی( دکتر بهزاد پوپک)دکتراي تخصصي هماتولوژی(ـ دکتر کتايون خداورديان)دکتراي علوم آزمايشگاهی(ـ دکتر پريسا داهيم)متخصص آسيب شناسی(ـ دکتر آتوسا شريعت تربقاني)متخصص آسيب شناسی(ـ دکتر عبدالعلی شمس برهان)متخصص علوم آزمايشگاهی(

دکتر محمد فرهادی لنگرودی)متخصص آسيب شناسی( ـ دکتر فريد کوثری)متخصص آسيب شناسی( با همكاري: دکتر مرجان رهنمای فرزامی)متخصص آسيب شناسی(

خدمات طراحي، چاپ و نشر: مرکز نشر صدانوبت چاپ: اول)1388(شمارگان: 5000 نسخه

قيمت: ندارد ISBN: 978-964-359-247-9 978-964-359-247-9 :شابک

»حق چاپ براي آزمايشگاه مرجع سالمت محفوظ است.«.

سرشناسه: داهيم، پريسا، 1345-عنوان و نام پديدآور: دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

گردآوري و نگارش: پريسا داهيم؛ نظارت علمي اعضاي کميتة هماتولوژي آزمايشگاه مرجع سالمت؛ با همكاري آزمايشگاه سالمت؛ معاونت پزشكي؛ آموزش و درمان بهداشت، وزارت سفارش[ ]به فرزامي؛ رهنماي مرجان

مرجع سالمت.مشخصات نشر: تهران: مرکز نشر صدا، 1388.

مشخصات ظاهري: 64 ص.: جدولشابک: 978-964-359-247-9

وضعيت فهرست نويسي: فيپاموضوع: پزشكي -- آزمايشگاه ها -- ابزار و وسايل

موضوع: پزشكي -- آزمايشگاه ها -- کنترل کيفيموضوع: تشخيص آزمايشگاهي -- کنترل کيفي

شناسه افزوده: ايران، وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي؛ معاونت سالمت؛ آزمايشگاه مرجع سالمت.RB 36/2/رده بندي کنگره: 1388 5د2د

رده بندي ديويي: 616/075028شماره کتابشناسي ملي: 1913678

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

مركز نشر صدا: تهران، تقاطع خيابان مطهري و ولي عصر، خيابان منصور، شمارة 2488553429 - 88553403 - دورنگار: 88713653

پيش گفتارمقدمه

فصل اول: کلياتاصول اولية کار با دستگاه های خودکار شمارندة سلولی

شناسنامة دستگاه های خودکار شمارندة سلولیCBC نكته هاي مهم در انجام آزمايش

فصل دوم: اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

1. اساس کار دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي2. کاليبراسيون دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

3. کنترل کيفيت دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي3-1- خون کنترل

3-2- آزمون پايداري کاليبراسيون3-3- آزمايش دوتايي3-4- آزمايش بازبيني

3-5- آزمايش دلتا3-6- استفاده از نتايج بيماران )CV(3-7- بررسی عدم دقت

3-8- بررسی صحت 3-9- تطابق نتايج دستگاه با يافته های ميكروسكوپی يا بالينی

4. خطاهای دستگاه های خودکار شمارندة سلولی

فصل سوم: روش هاي مرجع انجام آزمايش ها1. اندازه گيري هموگلوبين خون به روش سيان مت هموگلوبين

2. روش اندازه گيري حجم سلول های متراکم شده به روش ميكروهماتوکريتکنترل کيفيت و بررسی کاليبراسيون دستگاه ميكروهماتوکريت

3. شمارش سلول های خونی به روش دستیشمارش گلبول های سفيد

شمارش پالکتمنابع

579

111213

1719242727313334353636383842

4951545759596164

فهرست

کتاب پيش رو تحت عنوان دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها( به همت استادان و کارشناسان آزمايشگاه مرجع سالمت، زير نظر مستقيم کميتة تخصصی هماتولوژی اين ادارة کل و با استناد بر آخرين اطالعات

علمی موجود در منابع معتبر و تجربيات کاربردی تدوين شده است.کيفيت کنترل روند يكسان نمودن و استاندارد هدف با که مجموعه اين در کاربردی و تهيه گرديده، به دستورالعمل هاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي قابل اجرا براي استفادة تمام همكاران و کارشناسان در رشته های مرتبط آزمايشگاهی

متناسب با نياز آزمايشگاه ها اشاره شده است. شاهد کتاب، اين در موجود توصيه هاي و نكات از بهره گيري با است اميد

ارتقاي کيفيت عملكرد بخش هماتولوژي آزمايشگاه هاي پزشكي کشور باشيم.

پيش گفتار

دکتر سعيد مهدویمدير کل آزمايشگاه مرجع سالمت

به‌نام‌خالق‌هستي‌بخش

دستيابی به نتايج صحيح و دقيق در آزمايشگاه های پزشكی بدون استفاده از برنامه های تضمين کيفيت امكان پذير نيست. مسئول آزمايشگاه موظف است با توجه به تعداد مراجعان، تعداد و نوع تجهيزات، روش های آزمايشگاهی به کار رفته، تعداد کارکنان و...، با روش های مختلف ازجمله آموزش کارکنان، استفاده از روش های استاندارد آزمايشگاهی، انتخاب روش های مناسب کنترل کيفيت و شرکت در برنامه های ارزيابی خارجی کيفيت از درست بودن نتايج

اطمينان حاصل نمايد. 1)CBC(يكی از آزمايش های معمول در آزمايشگاه های پزشكی ، شمارش سلول های خوناست که در بيشتر آزمايشگاه ها با دستگاه های خودکار شمارندة سلولی)سل کانتر(2 انجام می شود؛ بنابراين، اطمينان از صحت و دقت نتايج اين آزمايش، مستلزم آگاهی کامل از عملكرد اين

دستگاه ها و آشنايی با روش های کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهای مربوط است. )WHO(متن اين کتاب با استفاده از منابع معتبر و راهنماهای منتشرة سازمان جهانی بهداشتو مؤسسة استاندارد آزمايشگاه بالينی)CLSI(3 و متون و منابع معتبر خون شناسی با هدف ارائة مطالب کاربردی و روش های کنترل کيفيت قابل اجرا در کشور، براي کارکنان آزمايشگاه های

کشور در تمام سطوح تهيه شده و مشتمل بر سه فصل است:فصل اول شامل کلياتي در ارتباط با دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي؛

فصل دوم دربارة اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و انواع خطاهای دستگاه های خودکار شمارندة سلولی؛

فصل سوم دربارة روش های مرجع انجام آزمايش هاي کاربردي براي کاليبراسيون دستگاه ها.

1. Cell Blood Counter2. Cell Counter

3. Clinical Laboratory Standard Institute

مقدمه

يادآور مي شود، عالوه بر لزوم آشنايی کامل با موارد مزبور، آگاهی از روش های کاليبراسيون و کنترل کيفيت ابزار پايه اي نظير سمپلر، اسپكتروفتومتر، فتومتر و سانتريفوژ ميكروهماتوکريت براي تضمين کيفيت نتايج آزمايش هايي که براي کاليبراسيون اين دستگاه ها کاربرد دارد، ضروري است. براي آشنايی با روش های ارزيابی کيفيت ابزار پايه، مي توان از متن ها و منابع معتبر و يا کتاب کنترل کيفيت در آزمايشگاه های پزشكی، که توسط

اساتيد و کارشناسان آزمايشگاه مرجع سالمت گردآوري و تأليف گرديده، بهره برد.

دکتر پريسا داهيم

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

8

فصل اولكليات

به منظور رعـايت اصول ايمنی و جلوگيـری از بروز اشكاالت مربوط به نوسانات برق، وجود سيم اتصال به زمين و تثبيت کنندة نوسانات

برق برای دستگاه ضروری است.

نكته

اصول‌اولية‌كار‌با‌دستگاه‌های‌خودكار‌شمارندة‌سلولی‌ تمام کاربران دستگاه های خودکار شمارندة سلولی بايد اصولي را که به عملكرد بهتر

دستگاه منجرشده و در زير به برخي از آنها اشاره مي شود، درنظر داشته باشند: 1. رعـايت مـواردی مـاننـد روشن و خـاموش کـردن دستگاه، بـررسی درجـات فشار)برحسب نوع دستگاه(، نحوة نگهداري و شست وشو)روزانه، هفتگي، ماهانه(، تعميرات الزم، تعويض محلول ها و ساير اقدام ها مطابق دستورالعمل شرکت سازنده.2. گذراندن دورة آموزشي نحوة کار با دستگاه و اصول نگهداري، زير نظر کارشناسان شرکت هاي پشتيبان)در اين رابطه، سوابق مربوطه شامل تاريخ و شرح آموزش بايد در پروندة هـر کاربر نگهداری شود و درصورت يا گـواهی دورة آموزشی

تعويض کاربر نيز آموزش هاي الزم درنظر گرفته شود(. 3. نگهـداري مدارك دستـگاه از قبيل شناسنامه، دستورالعمل فنی و سوابقي مانند سـوابق خريد، کاليبراسيون، کنتـرل و نگهداری، تـعويض محلول هـا، تعميرات و

سرويس هـا، و ساير اقـدام هـا درصورت لزوم.4. آشنايی کامل با نحوة کاليبراسيون و کنترل کيفی دستگاه.

11

وجود ذرات اضافی و نامحلول در محلول های ذکرشده به ويژه ايزوتون، باعث تداخل در شمارش زمينه و خطا در شمارش سلول های خونی

به خصوص پالکت ها می شود.

نكته

شناسنامة‌دستگاه‌های‌خودكار‌شمارندة‌سلولی‌دستگاه های خودکار شمارندة سلولی مانند ساير تجهيزات آزمايشگاهی بايد شناسنامه ای

با اين اطالعات داشته باشند:1. تاريخ خريد؛

2. تاريخ نصب و کاليبراسيون و نام کارشناس شرکت پشتيبان که دستگاه را راه اندازي نموده است؛

3. تاريخ شروع کار دستگاه؛4. کارخانه و کشور سازنده؛

5. مدل و شماره سريال دستگاه؛6. شرايط دستگاه هنگام خريد)نو، مستعمل و بازسازی شده(؛

7. نام، شماره تلفن و نشاني شرکت پشتيبان؛8. نام کاربر يا کاربران دستگاه؛

9. مشخصات و نحوة آموزش کاربر دستگاه توسط شرکت پشتيبان.

نكاتي در رابطه با محلول های دستگاه های خودکار شمارندة سلولی)ايزوتون، اليز و...(

1. محلول های دستگاه بايد بـا داشتن تـاريخ انقضا و سری ساخت مشخص، فقط بهـداشت، درمـان و ثبت شـده در وزارت يـا شرکت های از شرکت پشتيبان و

آموزش پزشكی تهيه شوند.2. روی ظرف حاوی هر محلول بايد برچسبی با حداقل اطالعات مانند نام محلول،

تاريخ انقضا و تاريخ تعويض الصاق شده باشد.3. هيچ گاه ته ماندة محلول قبلی به محلول جديد اضافه نشود.

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

12

1. Pre Analytical Phase

CBCنکته‌هاي‌مهم‌در‌انجام‌آزمايش‌تمام کارکنان مرتبط در آزمايشگاه ها بايد از روش صحيح انجام آزمايش شمارش سلول های خونی)CBC(، به عنوان يكی از شايع ترين آزمايش های انجام گرفته در آزمايشگاه های پزشكی مختلف مـراحل در بايد زيـر موارد ،CBC آزمايش نتايج از اطمينان براي باشند. آگاه

آزمايش رعايت شوند.

1. مرحلة پيش از آزمايش1 مراجعه کننده بايد پيش از خونگيری حداقل 5 دقيقه آرام بنشيند.

نام، نام خانوادگی و شمارة پذيرش مندرج روی برچسب ظرف با برگ درخواست يا برگ پذيرش مطابقت داده شود.

تورنيكه بيش از يک دقيقه بر دست نمونه دهنده بسته نماند. از ضدانعقاد مناسب با رعايت نسبت الزم به مقدار خون استفاده شود)توجه به الزامات

مورد نياز دستگاه در اين خصوص ضروری است(. به محض گرفتن خون، نمونه با ضدانعقاد مخلوط شود)2 دقيقه با ميكسر يا 8 تا10 بار

سروته نمودن ويال(. ظرف حاوی نمونة CBC دربسته باشد.

عالوه بر شناسنامه، موارد زير نيز بايد به صورت مكتوب برای هر دستگاه در آزمايشگاه موجود باشد:

مشخصات محلول ها و مواد مصرفی؛ سوابق کاليبراسيون و کنترل کيفي؛

سوابق تعمير با ذکر قطعة تعويض شده؛ سوابق نگهداری، سرويس های دوره ای و خدمات پشتيبانی.

نكته

توصيه می شود در اين شناسنامه ميزان عدم دقت و عدم صحت دستگاه هنگام نصب نيز قيدشود.

فصل اول

13

کليات

نمونه با مشاهدة دقيق يا با استفاده از اپليكاتور ازنظر نبود لخته و هموليز يا ليپمی بررسی شود.

حداکثر فاصلة زماني بين نمونه گيري و انجام آزمايش حدود 4 تا 6 ساعت باشد. بالفاصله پيش از انجام آزمايش، نمونة خون با قراردادن ويال به مدت 3 تا 5 دقيقه

روی روتاتور و يا حداقل 10 بار سروته نمودن کامل، هموژن و يكنواخت شود.

2. مرحلة انجام آزمايش1 هر روز پيش از شروع آزمـايش، شمارش زمينة دستگاه2 انجام شـده و درصورت امكان سوابق آن نگهداری شود. به طور معمول، مقادير مربوط به شمارش زمينة هر دستگاه در دستورالعمل آن ارائه شده است. سازمان جهاني بهداشت نيز در اين رابطه معيارهايي ارائه

نموده است که در زير به آنها اشاره مي شود:x 1012/ L 0/03 < تعداد گلبول های قرمز x 109/ L 0/04 < تعداد گلبول های سفيد0/2g / dL < هموگلوبين

x 109/ L 0/5 < تعداد پالکت هادرصورت زيادبودن تعداد نمونه های مورد آزمايش در هر سری کاری، بهتر است در

فواصل آزمايش ها دستور شست وشوی دستگاه و بررسی شمارش زمينه مجدداً اجراشود.برای اطمينان از صحت مرحلة انجـام آزمايش، آشنايی کـامل کاربر با اصول کـار با

دستگاه ، اجرای برنامه های کاليبراسيون و کنترل کيفيت و رفع خطاها الزامی است.

3. مرحلة پس از آزمايش3هنگام بررسی نتايج و پيش از ارائة گزارش، موارد زير بايد درنظر گرفته شوند:

اثر مواد ضدانعقاد %1 تا را هموگلوبين مقدار نمونه، در رقت ايجاد به دليل K3EDTA مايع ضدانعقاد

کاهش مي دهد.1. Analytical Phase2. Back Ground3. Post Analytical Phase

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

14

استفاده از ضدانعقاد K3EDTA باعث چروکيدگي گلبول هاي قرمز و کاهش 2% ميزان هماتوکريت مي شود. درصورتي که آزمايشگاهي ضدانعقاد مورد استفادة خود را از %2 MCV ميانگين که توجه نمايد نكته اين به بايد تغييردهد، K2EDTA به K3EDTA

افزايش و ميانگين MCHC به همين ميزان کاهش مي يابد.

خطاهاي ناشي از ماهيت نمونه يا خطاهاي کاذب ناشي از دستگاه 3g/L 109 ×30، مقدار همـوگلوبين را بـه ميـزان/ L تعداد گلبول هاي سفيد بيش از

افزايش مي دهد. مواردی مانند تعداد پالکت بيش از L /109 ×700، مقدار زياد هموگلوبين S، ميكروسيتوز

و هايپوکرومي ميزان Hb را به طور کاذب باالمي برند. خطاهاي کاذب ناشي از دستگاه به تفصيل در انتهاي فصل دوم آمده است.

مشاهدة گسترش خون محيطی و بررسی وضعيت بالينی بيمار و مطابقت آنها با نتيجة دستگاه پيش از گزارش دهي ضروري است.

نكته

فصل اول

15

کليات

فصل دوماساس كار، كاليبراسيون، كنترل كيفيت و خطاهاي دستگاه هاي

خودكار شمارندة سلولي

1.‌اساس‌كار‌دستگاه‌هاي‌خودكار‌شمارندة‌سلولياساس کار اکثريت دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي بر دو مكانيسم زير استوار است:

1. مقاومت الكتريكي1: اين روش اولين بار توسط واالس کولتر2 در سال 1956 مطرح شد و اساس کار دستگاه هايي نظير کولتر3، بک من4، سيسمكس5، ابوت6 و... قرارگرفت. در اين مكانيسم، خون در يک محلول بافري الكتريكي رقيق شده و از بين دو الكترود حامل جريان الكتريكي مستقيم عبورمي کند. با عبور هر سلول خوني از اين مسير، مقاومت الكتريكي و يک پالس الكتريكي ايجاد مي شود. تغيير در پتانسيل بين الكترودها متناسب با مدت زماني است که گلبول از فضای بين دو الكترود، که اصطالحًا دريچه7 ناميده می شود، عبورمي کند. ارتفاع هر پالس نشان دهندة حجم سلول و تعداد پالس

نشان دهندة تعداد سلول است.

1. Electrical Impedance2. Wallace Coulter3. Coulter4. Beckman

5. Sysmex6. Abbott7. Aperture

)Aperture(تصوير شمارة 1: نمايی از فضای بين دو الكترود

Oscilloscope

PowerSupply

PneumaticSupply

Electrodes

Aperture

Vacuum

Close up of Aperture

40 fL35 fL30 fL25 fL20 fL

19

1. Light Scattering2. Photomultiplier3. Photodiod

4. Packed Cell Volume5. Mean Corpuscular Volume

2. پراکندگي نور1: در اين روش، سوسپانسيون رقيق شدة سلول ها به صورت يک رديف سلولي از مقابل منبع نوري عبورمي کند و باعث پراکندگي نور مي شود. نور پراکنده تبديل مي شود که الكتريكي پالس هاي به يا فوتوديود3 فزايندة نوري2 از طريق يک در اين حالت، تعداد پالس ها نمايانگر تعداد سلول ها و ارتفاع پالس هاي الكتريكي، که متناسب با ميزان پراکندگي نور بوده، نشان دهندة حجم سلول ها است. منبع نوري بر حسب نوع دستگاه، ليزر يا تنگستن است. هرچه قطر رديف سلول هاي عبوري کوچک تر باشد)به اندازة قطر گلبول هاي قرمز(، نور با دقت بيشتري بر جريان سلول ها

تابيده و نتايج دقيق تري حاصل مي شود.در دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي حداقل دو مجرا طراحي شده است:

در مجراي اول، با افزودن رقيق کننده به نمونه خون، اندازه و تعداد گلبول هاي قرمز و پالکت ها مشخص مي شود، که بـه منظور جـداسازي پالکت هـا از گلبول های قرمز

و شمارش آنها در دستگاه دو آستانة جداکنندة باال و پايين تعيين شده است. در مجراي دوم، با افزودن مادة ليزکننده به نمونه و با کمک رقيق کننده، گلبول هاي در شمارش مي شوند. مانده اند، دست نخورده که سفيد گلبول هاي و ليزشده قرمز به روش نيز مقدار هموگلوبين اين مجرا، عالوه بـر شمارش گلبول هـای سفيد،

سيان مت هموگلوبين اندازه گيري مي شود. در دستگاه هاي جديدتر براي شمارش افتراقي لكوسيت ها مجراهاي ديگری درنظر

گرفته شده است. اندازه گيري 4PCV و5MCV در دستگاه هاي خودکار شمارندة سلول کاماًل به يكديگر وابسته اند. در برخي دستگاه ها، با محاسبة ميانگين ارتفاع پالس هاي حاصل از عبور گلبول هاي قرمز از دريچه، مقدار MCV مشخص مي شود و براساس تعداد گلبول هاي قرمز شمارش شده، ميـزان هماتـوکريت تـوسط دستگاه محـاسبه مي شود. در دستگاه های PCV تعيين شده از عبور گلبول های قرمز، ميزان پالس های حاصل از مجموع ديگر، و بـا استفاده از تعـداد گلبول های قرمز، مقدار MCV محاسبه می شـود. تقريبًا در تمام

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

20

دستگاه ها ساير شاخصه های گلبول های قرمز مانند 1MCH و 2MCHC ازطريق محاسبه و با استفاده از مقاديـر هموگلوبين، PCV و تعداد گلبول هاي قرمز مشخص می شوند.

از استفاده با دستگاه هـا، در 3)RDW(قرمز گلبول هـای انـدازة پـراکندگی ميزان محاسبة ميزان تغييرات ارتفاع پالس هـای ايجادشده به دنبـال عبور گلبول هـای قرمز تعيين و بـه صورت انحراف معيـار 4SD )با واحد فمتوليتر( يا ضريب انحراف معيار

5CV)درصد( ارائه می شود.

داخل هموگلوبين پراکندگي ميـزان بـايرتكنيكون6، نظيـر دستگاه هـا بـعضي در سلول)HDW(7 نيز مشخص می شود. اين مقدار در واقع نشان دهندة پراکندگی)CV( غلظت هموگلوبين در هر سلول يا آنيزوکروميا8 يا نمای دی مورفيک9 گلبول های قرمز است.

شمارش افتراقي گلبول سفيد در دستگاه هاي مختلف، با استفاده از مكانيسم هاي مختلف مانند مقاومت الكتريكي و جريان هاي الكتريكي با تواترهاي مختلف، تعيين از گرانول ها و... ناشي نور، واکنش هاي شيميايي پراکندگي و جذب اندازة هستـه، صورت گرفته و به صورت سه، پنج و هفت قسمتي گزارش مي شود. در شمارش افتراقي سه قسمتي، سه گروه سلول براساس اندازه، شامل سلول هاي بزرگ يا گرانولوسيت ها، سلول هاي کوچک يا لنفوسيت ها و سلول هاي متوسط شامل مونوسيت ها، بازوفيل ها، ائوزينوفيل ها و سلول هاي مونونوکلئر شمارش مي شوند. در شمارش افتراقي پنج قسمتي، و مونوسيت ها شمارش شده و لنفوسيت ها بازوفيل، ائوزينوفيل، نوتروفيل، رده های نابالغ افتراقي هفت قسمتي عالوه بر رده هاي ذکرشده، سلول هاي بزرگ در شمارش )بـالست و گرانـولوسيت هاي نابالغ( و لنفوسيت هـاي آتيپيكال)بالست هاي کوچک(

نيز جاي مي گيرند.

1. Mean Corpuscular Hemoglobin2. Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration3. Red cell Distribution Width4. Standard Deviation5. Coefficient Variation6. Byertechnicon7. Hemoglobin Distribution Width8. Anisochromia9. Dimorphic

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

21

تصوير شمارة 2: هيستوگرام های گلبول های سفيد

از برخي برای عددي داده هاي ارائة عالوه بر تمام خودکار دستگاه های بسياری پارامترهای مورد اندازه گيری، نمودارهايی)هيستوگرام( نيز رسم می نماينـد که مشاهدة آنها به کاربر اطالعات بيشتر و کامل تری می دهد. اين هيستوگرام ها معموالً نمايانگر پراکندگی اندازة گلبول های سفيد و قرمز و پالکت ها براساس اندازه هستند. بعضی دستگاه ها عالوه بر اين نمودارهـا، نمودار ميزان پراکندگی غلظت هموگلوبين گلبول های

قرمز را در مقابل اندازة آنها نشان می دهد.در اين نمودارها، محور افقی نشان دهندة اندازة)حجم( سلول و محور عمودی نمايانگر

تعداد سلول مورد نظر است.a62.6 fL

b88 fL

Volume (fL)

Volume (fL)

c145 fL

Volume (fL)

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

22

تصوير شمارة 3: هيستوگرام های نحوة پراکندگی گلبول های سفيد برحسب اندازه در دستگاه هاي با توانايی شمارش افتراقی سه قسمتی

Classification of WBC typesbased on size100%

WBC

Rela

tive

Num

ber

50

27 92 152

100 150 200 250 300 (fL)

400 fL

(after addinglysing reagent)WBC

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

23

2.‌كاليبراسيون‌دستگاه‌های‌خودكار‌شمارندة‌سلولی‌کاليبراسيون به مجموعه فعاليت هايی اطالق می شود که ارتباط ميان مقادير اندازه گيری شدة يک کميت توسط يک دستگاه يا روش آزمايشگاهی را با مقادير واقعی آن ماده، که با روش های مرجع اندازه گيری شده است، مشخص می نمايد. کاليبراتور ماده اي است که براي کاليبراسيون روش آزمايشگاهي به کار مي رود و مقدار مشخصي دارد، درحالي که مواد کنترلي بايد براي کنترل کيفيت روش آزمايشگاهي به کار رود و اغلب محدودة غلظتي دارند؛ بنابراين، مواد کنترلي هيچ گاه نمي توانند بـه عنوان جايگزين کاليبراتور

استفاده شوند. تمام دستگاه ها بايد پس از نصب و پيش از شروع کار کاليبرشده و ميزان عدم دقت

آنها نيز بررسی شود. سوابق اجرايي اين امر بايد در آزمايشگاه نگهداری گردد. کاليبراسيون بايد به طور کل سالي يک يا دو بار و نيز در موارد زير انجام شود:

هنگام نصب و راه اندازی، پس از هر بار تعمير يا سرويس،

قابل قبول نبودن نتـايج کنترل کيفی روزانه)درصـورت اطمينان از خـراب نبودن نمونة کنترل(،

تعويض محلول ها)درصورت تغيير مشخص در نتايج خون کنترل يا نمونة بيماران(.برای بررسی ميزان عدم دقت)CV( پارامترهای مختلف اندازه گيري شونده توسط تازه در دامنه های طبيعی و غيرطبيعی از نمونه های کنترل يا خون دستگاه، می توان مطابق توضيحات بند 3 مبحث »کنترل کيفيت دستگاه هـاي خودکار شمارندة سلولي« استفـاده کرد که مقادير به دست آمده بايد مطابق ادعای کـارخانة سازنده باشـد کـه در

دستـورالعمل دستگاه درج شده است. براي کاليبراسيون دستگاه ، کاليبراتورهاي تجاري وجوددارد که مقادير مورد نظر در آنها با روش هـاي مرجع اندازه گيری شده است. اين سوسپانسيون های سلول هاي خوني، درصورت داشتن تاريخ انقضاي معتبر و تأييديه هاي الزم و به شرط رعايت

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

24

دستورالعمل هاي کارخانة سازنده، براي کاليبراسيون دستگاه ها مناسب هستند. مي توان موفقيت روند کاليبراسيون را به وسيلة آزمايش نمونة کنترل، مقايسة نتايج دستگاه با نتايج آزمايش شده روي چند نمونه خون با روش هاي مرجع و يا کنترل دقيق ميانگين هاي

متحرك دربارة شاخص هاي گلبول هاي قرمز1 تأييدکرد.به ترديد نسبت داشتن يا کاليبراتورهاي تجاري به نداشتن درصورت دسترسي اعتبار آن، استفاده از خون کامل براي کاليبراسيون ضروري است. براي کاليبراسيون بايد از خون طبيعي و تازه استفاده کرد. برای اين کار، پارامترهاي حداقل سه نمونة دستگاه شمارندة با بار دو و دستي مرجع با روش هاي بار دو طبيعی، کامل خون سلولی اندازه گيري مي شود و پس از محاسبة ميانگين نتايج هر پارامتر با روش دستی و دستگاهی، ضريب کاليبراسيون جديد با استفاده از فرمول زير تعيين مي شود. با افزايش

تعداد نمونه ها، دقت کاليبراسيون بيشتر مي شود.

1. Moving Average

= ضريب کاليبراسيون ميانگين روش دستگاهی ـ ميانگين روش دستی

ميانگين روش دستگاهي × 100

روش های مرجع اندازه گيری هموگلوبين، هـماتوکريت و شمارش گلبول هـای از هماسيتومتر)با استفاده به ترتيب سيان مت هموگلوبين، ميكروهماتوکريت و سفيد نئوبار اصالح شده( هستند. در کتاب هاي مرجع، روش مرجع شمارش درجه بندی قـرمـز و پالکت هـا، شمارنده های سلولی تک کاناله گلبول هـای سفيد، گلبول های از همچنان تجهيزات، اين نبـودن دردسترس بـه علت ايران، در که عنوان شده اند هماسيتومتر استفاده می شود. به علت احتمال وجـود خطای زياد در شمارش سلولی با اين روش، به ويژه در گلبول های قرمز و پالکت ها، توصيه مي شود که کاليبراسيون

اين پارامترها به وسيلة شرکت پشتيبان صورت گيرد.

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

25

140 -145145

ضريب کاليبراسيون × 100 = -3/44 =

محاسبة ضريب کاليبراسيون: اگر ميانگين اندازه گيری هموگلوبين به روش با دستگاه خودکار شمارندة سلولي 145g/L باشد، عامل 140g/L و دستی

تصحيح کاليبراسيون دستگاه با استفاده از فرمول زير محاسبه می شود:

مثال

طبق محاسبة باال، ضريب کاليبراسيون دستگاه برای هموگلوبين بايد به مقدار 3/44 کاهش يابد. به عنوان مثال، اگر ضريب کاليبراسيون دستگاه پيش از اين 100 بوده است، بايد

3/44% کاهش يابد و روی 96/56 تنظيم شود.انواع دستگاه هاي شمارنده مثل گروه سيسمكس، ضريب کاليبراسيون از در بعضی با استفاده از فرمول کاليبراسيون که در دستورالعمل درج گرديده است، به ترتيب جديد

زير محاسبه می شود: ميانگين روش دستی

ميانگين روش دستگاهی= ضريب کاليبراسيون ضريب کاليبراسيون قبلي ×

کاليبراسيون دستگاه بايد در موارد خاصی که در باال به آنها اشاره شد و با استفاده از روش ذکرشده، صورت گيرد، درغير اين صورت، تغيير مكرر ضريب کاليبراسيون به دنبال مشاهدة هرگونه اختالل در نتايج،

به هيچ وجه توصيه نمی شود.

نكته

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

26

3.‌‌كنترل‌كيفيت‌دستگاه‌هاي‌خودكار‌شمارندة‌سلوليبايد هماتولوژی بخش در سلولی دستگاه های شمارندة کيفيت کنترل برای آزمايشگاه دستورالعمل مكتوبی داشته باشد و سوابق انجام برنامه های کنترل کيفی نيز به نحو مقتضی نگهداری شود. توصية مراجع معتبر بين المللی براي انجام اين امر، استفاده از خون کنترل است که بسياری از آزمايشگاه های کشور به داليل مختلف ازجمله دسترسی نداشتن به اين نمونه، از روش هـای ديگري برای کنترل کيفيت دستگاه شمارنـده استفاده می کنند. درهر صورت، هـر آزمايشگاه ملزم به استفاده از روش هـای کنترل کيفی بوده که انواع

خطاهاي سيستماتيک و تصادفی را مشخص نمايد. در ادامة اين مبحث، عالوه بر نحوة استفاده از خون کنترل، دربارة روش های مختلف

کنترل کيفيت که براي بررسی عملكرد دستگاه نيز کاربرد دارند، توضيح داده خواهدشد.

3ـ1ـ‌خون‌كنترلطبق توصيه هـای منابع معتبـر بين المللی خـون شناسی، بـرای کنترل کيفيت دستگاه هـای شمارندة سلولی، بايد در هر سری کاری، دست کم از دو نمونه خون کنترل در دامنة طبيعی و غيرطبيعی استفاده کرد. به اين ترتيب، در ابتدای هر سری کاری، نمونة کنترل طبيعی و غيرطبيعی و در پايـان، نمونة طبيعی بـا دستگاه شمارنـده آزمـايش و نتايج تمام بـرای مختلف دامنه هـای در کنترل بـه خون دسترسی ايران، در ثبت مي شـود. آزمايشگاه ها به راحتی امكان پذير نيست؛ به همين دليل، به طور معمول از خون کنترل در

يک دامنه استفاده می شود.نمونه خون کنترل هر روز صبح پيش از آزمايش نمونه های بيماران و درصورت نياز، به فواصل در طي روز آزمايش و نتايج روي نمودار ثبت می شود. براي رسم نمودار، نمونة کنترل بايد به دفعات و در فواصل زماني مختلف با دستگاه آزمايش شود تا دست کم براي ، ±1SD هر پارامتر 20 خوانده حاصل شود. پس از محاسبة ميانگين و انحراف معيارهاي2SD± و 3SD± براي هر پارامتر، مقادير آنها روي محور عمودي و روزها روي محور

افقي ثبت مي شود.

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

27

کنترل کيفيت دستگاه صرفًا با منطبق بودن نتايج خون کنترل با دامنة ذکرشده در بروشور مربوطه قابل قبول نيست و همچنين استفاده از ميانگين و دامنة مندرج در بروشور براي رسم نمودار توصيه نمی شود. هر آزمايشگاه بايد خود با استفاده از روش ذکرشده در باال،

نسبت به تعيين ميانگين و دامنه برای رسم نمودار اقدام نمايد. در زير نمودار کنترل کيفيت هموگلوبين، با ميانگين 144g/L و انحراف معيارهای

نقاط ثبت شده در 2SD ،±1SD± و 3SD± بـه ترتيب 2g/L، 4 و 6 مشاهـده می شود.

نمودار نمايانگر ميزان هموگلوبين خون کنترل در روزهای متوالی است. مي توان نمودار کنترل کيفيت را با استفاده از قوانين لوی جنينگ1، وستگارد2 يا سازمان جهانی بهداشت تفسيرکرد. هر آزمايشگاه مي تواند براساس اهداف کيفيتی که برای نتايج آزمايش های خود درنظر دارد، از يكی از اين قوانين استفاده کند. با استفاده از نمودار کنترل کيفيت

می توان خطاهای تصادفي و سيستماتيک را درصورت بروز مشخص کرد.

1. Levyjening 2. Westgard

تصوير شمارة 4: نمودار کنترل کيفی هموگلوبين

g/L

DayHemoqlobin

+3s+2s+1s

-1s-2s-3s

152150148146144142140138136134

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

28

تفسيرنتيجة خون کنترل

±2SD هشدار، نشان دهندة خطای تصادفی يا سيستماتيکيک کنترل خارج از محدودة±3SD رد نتايج، نشان دهندة خطاي تصادفی يا سيستماتيکيک کنترل خارج از محدودة

±2SD رد نتايج، نشان دهندة خطاي سيستماتيکدو خواندة متوالي هم سو و خارج از محدودةاز محدودة چهار خواندة متوالي و هم سو و خارج

-1SD 1+ ياSDرد نتايج، نشان دهندة خطاي سيستماتيک

هشدار، نشان دهندة خطاي سيستماتيکشش خواندة متوالی در يک طرف ميانگين

جدول شمارة 1: تفسير نمودار کنترل کيفيت براساس قوانين سازمان جهانی بهداشت

تفسيرنتايج خون کنترل ±2SD 12 يک کنترل خارج از محدودةs

)نمودار الف(هشدار، لزوم بررسي ساير قوانين

±3SD 13 يک کنترل خارج از محدودةs

)نمودار ب(رد نتايج، نشان دهندة خطاي تصادفی يا سيستماتيک

22s دو خواندة متوالي و هم سو، خارج از محدودة

±2SD

)نمودار ج(رد نتايج، نشان دهندة خطاي سيستماتيک

R4s يک خوانده خارج از محدودة 2SD+ و ديگري

-2SD خارج از محدودة)نمودار د(

رد نتايج، نشان دهندة خطاي تصادفی

41s چهار خواندة متوالي و هم سو، خارج از محدودة

-1SD 1+ ياSD

)نمودار ه ( رد نتايج، نشان دهندة خطاي سيستماتيک

10x ده خوانـدة متوالي در يک طرف ميـانگين)باال

يا پايين ميانگين و بدون توجه به اندازة انحراف( )نمودار و(

رد نتايج، نشان دهندة خطاي سيستماتيک

جدول شمارة 2: تفسير نمودار کنترل کيفيت براساس قوانين وستگارد

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

29

قوانين چندگانة وستگارد بين مجموعه هاي کاري مختلف و نيز بين دو غلظت نمونة کنترلی قابل استفاده هستند.

نكته

)الف(

)ج(

)و(

)ب(

)د(

)ه(

12S ruleviolation

13S ruleviolation

R4S ruleviolation

22S ruleviolation

10x ruleviolation

41S ruleviolation

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

+3s+2s+1s

Mean-1s-2s-3s

+3s+2s+1s

Mean-1s-2s-3s

+3s+2s+1s

Mean-1s-2s-3s

+3s+2s+1s

Mean-1s-2s-3s

+3s+2s+1s

Mean-1s-2s-3s

+3s+2s+1s

Mean-1s-2s-3s

تصوير شمارة 5: نمودارهاي کنترل کيفي با قوانين وستگارد

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

30

3ـ2ـ‌آزمون‌پايداری‌كاليبراسيون1به منظور کامل شدن روند کنترل کيفيت دستگاه، عالوه بر استفاده از خون کنترل، مي توان ،RBC ،WBC نظير پارامترهايي پايداري به توجه با استفاده کرد. تازه نمونه هاي خون از HCT ،Hb و اندکس هاي خوني در نمونة خون حاوی ضدانعقاد، به مدت 24 ساعت در

دماي C˚4، مي توان در روز اول حداقل 5 و ترجيحًا 10 نمونه که داراي مقادير طبيعي آزمايش مورد مجدداً بعد، روز و نگهداري کرد يخچال در آزمايش از پس را هستند آزمون از استفاده با را نمونه هاي جفت مقادير بين معني دار اختالف و وجود قرارداد

آماري پايداري کاليبراسيون محاسبه کرد.

n: تعداد جفت هاي مورد بررسیd: اختالف بين دو خوانده)روزبه روز(

SD: انحراف معيار اختالفات

d: ميانگين اختالفاتمقدار t بايد برای هر متغير محاسبه شود. اگر مقدار آن برای 5 نمونه از 2/78 و برای 10 نمونه از 2/26 بيشتر باشد، با اطمينان 95% می توان گفت که بين مقادير شمارش شده در دو روز، اختالف معنی دار وجوددارد. وجود اختالف معنی دار برای يک متغير، بيان کنندة اشكال احتمالی است که درصورت تداوم، براي رفع آن بايد اقدام مناسب صورت گيرد.

درصورت يافتن هرگونه خطا با استفاده از نمودار، ابتدا، بايد از آلوده يا خراب از پيش امر اين از مطمئن شدن با حاصل نمود. اطمينان کنترل نمونة نبودن برنامه ريزی برای کاليبراسيون دستگاه، بايد اقدام هاي ديگری مانند شست وشوی دستگاه، آزمايش مجدد نمونه، آزمايش روی نمونة خون کنترل ديگر با همان

سری ساخت، بررسی وضعيت محلول های دستگاه و... را مدنظر قرارداد.

1. T-Brittin

SD =∑d2

n∑( d)2

n - 1tn = d n

SD

نكته

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

31

استفاده با نمونة خون 5 هموگلوبين اندازه گيری نتايج که درصورتي از يک دستگاه شمارندة سلولي در دو روز متوالی مطابق جدول زير باشد، عملكرد دستگاه با کمک فرمول پايداري کاليبراسيون به صورت

زير بررسی می شود.

چون عدد t به دست آمده از 2/78)مقدار t برای 5 نمونه( کمتر است، نتايج هموگلوبين دستگاه قابل قبول است.

مثال

)g/L(مقدار هموگلوبين روز دوم)g/L(مقدار هموگلوبين روز اول d2 d

941

2516

32154

120133170150138

123135171155142

∑d = 15

)∑d(2 = 225

∑d2 = 55

SD = = 2/54

225555

tn = = 2/672/53 5

= 3d = = ∑d5

155

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

32

مقدار هموگلوبين 5 نمونه در دو بار اندازه گيری به شرح زير است:

3ـ3ـ‌آزمايش‌دوتايی‌1درصورت نبود امكان انجام تمام آزمايش ها به صورت دوتايی، بايد در هر سری کاري، خوانده ها اختالف بررسي با تا آزمايش شوند دوتايی به صورت نمونه 3 تا 2 حداقل ازطريق محاسبات آماري، از وجود خطاهاي تصادفي آگاه شد. افزايش اختالف بين دو خواندة بيش از 2SD محاسبه شده، احتمال وجود خطاي تصادفي را مطرح مي کند. فرمول

زير طريقة محاسبة SD نمونه های دوتايی را نشان می دهد:

تفاوت بيشتر از 2SD بين دو نتيجة آزمايش در نمونة سوم)d = 10(، نمايانگر بروز خطای تصادفی و لزوم تكرار آزمايش روی همان نمونه است.

1. Duplicate Test

)g/L(مقدار هموگلوبين)g/L(مقدار هموگلوبين d2 d

44

10004

112

-2-21002

122163100140132

120161110140134

SD = 6/7

d2SD =

∑2n

3/34SD = ∑d2

2n11210= =

مثال

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

33

3ـ4ـ‌آزمايش‌بازبيني‌1يكی ديگر از روش های کنترل کيفيت، آزمايش بازبيني است که درصورت نگهداری نمونه ها در دمای مناسب)يخچال( اجراشدني است. براي اين کار بايد ابتدای سری کاری يا صبح دو تا سه نمونه را پس از آزمايش بالفاصله با در بسته در يخچال قرارداد و در انتهای سری کاری يا بعد از ظهر يا روز بعد، آنها را مجدداً مورد آزمايش قرارداد. پيش از آزمايش، نمونه ها بايد به دماي اتاق رسيده و کاماًل مخلوط شوند. نتايج اين دو آزمايش را می توان با استفاده از فرمول آزمايش دوتايي مقايسه نمود که اختالف نتايج در محدودة 2SD قابل قبول است. درصورت نگهداری نمونه ها در شرايط مناسب، هرگونه تغيير در نتايج خارج از اين محدوده، نشان دهندة اشكال در عملكرد دستگاه يا معرف ها است. اين آزمايش براي بررسی تغييرات هموگلوبين و گلبول های قرمز مناسب است و به ميزان کمتر براي گلبول هاي سفيد و پالکت ها کاربرددارد؛ ولي براي هماتوکريت، به ويژه اگر فاصلة زماني بين دو آزمايش 6

ساعت يا بيشتر باشد، کارايي ندارد.

نتايج اندازه گيری هموگلوبين 5 نمونه توسط دستگاه شمارنده در صبح و بعد از ظهر به شرح زير است:

بهتر است نمونه هـايي کـه بـراي آزمايش بـازبيني و دوتايي آزمايش مي شوند، يكسان باشند.

)g/L(مقدار هموگلوبين بعد از ظهر)g/L(مقدار هموگلوبين صبح d2 d

14401

10

-12

-20

-1

121159112140135

120161110140134

1. Check Test

مثال

نكته

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

34

2SD با توجه به آنكه هيچ يک از اختالفات نتايج دو بار آزمايش روی يک نمونه، ازبيشتر نيست، عملكرد دستگاه قابل قبول است.

3ـ‌‌5ـ‌آزمايش‌دلتا‌1

مقايسة مقادير به دست آمده از يک نمونه با نتايج قبلي نمونة همان فرد به عنوان روشي براي کنترل کيفيت به کار مي رود؛ با درنظر گرفتن اين نكته که فاصلة زمان بين دو آزمايش بيش از دو تا سه هفته نباشد. درصورت استفاده از اين روش، بايد به نكاتي نظير تغييرات فيزيولوژيک طبيعی و روزانة پارامترهای خونی و همچنين، مواردی نظير ابتالي فرد به بيماری و يا استفاده از دارو به داليل مختلف که باعث تغيير شمارش سلول ها مي شوند، توجه داشت. با توجه به تغييرات روزانة طبيعي پارامترهای خونی در يک فرد، تنها وجود

اختالفات واضح بين مقادير به دست آمده، نشان دهندة بروز خطا است.

2SD = 2

1. Delta Test

پارامتر مورد نظرتفاوت بين دو نتيجه که مي تواند نمايانگر خطا باشد

2g/dL

0/05 L/L

> 6fL

> 5pg

از تعداد طبيعي به غيرطبيعيافزايش يا کاهش تعداد، بيش از %50

Hb

PCV

MCV

MCH

WBC

Platelets

1SD = ∑d2

2n1010= =

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

35

3ـ‌6ـ‌استفاده‌از‌نتايج‌بيماران‌به دليل ثابت بودن مقادير ميانگين شاخص هاي گلبولي)MCH ،MCV و MCHC( در فواصل روزها و هفته ها، می توان از اين شاخص ها به منظور ارزيابي کيفيت عملكرد دستگاه شمارنده در آزمايشگاه هايی که حداقل روزی 100 نمونه CBC پذيرش می کنند، استفاده نمود. بررسی ها نشان مي دهند، درصورتي که نمونه های CBC مورد آزمايش در روزهای مختلف ازنظر ميزان اندکس های خونی تفاوت مشخصی با يكديگر نداشته باشند که به تأثير بارز بر ميانگين ها منجرشود، مانند پذيرش نمونه های افراد مبتال به فقر آهن يا تاالسمي در يک روز خاص در هفته که باعث کاهش شاخص های گلبولی می شوند، هرگونه تغيير مشخص در ميانگين اندکس ها نشان دهندة تغيير در کاليبراسيون يا اختالل عملكرد دستگاه است. برای استفاده از اين روش، ابتدا بايد ميانگين و 2SD± اندکس های MCH ،MCV و MCHC حداقل 300 تا

500 نمونه را محاسبه و سپس، نمودار کنترل کيفيت را رسم نمود. در صورت مراجعة بيمارانی که اندکس های خونی طبيعی ندارند، مانند مبتاليان به بيماری های ذکرشده، نتايج اندکس های گلبولی آنها نبايد در محاسبة ميانگين لحاظ شود. پس از رسم نمودار، نمونه های بيماران را روزانه به گروه های بيست تايی تقسيم کرده و پس از محاسبة ميانگين شاخص های گلبولی آنها و ثبت اين ميانگين روی نمودار، هرگونه براي دانست. دستگاه نامناسب عملكرد نمايانگر مي توان را مجاز مقادير از انحراف اطمينان از درست بودن اين روش، انتخاب گروه های بيست تايی نمونه ها، بايد به صورت تصادفی باشد و در هر دسته نيز بيش از 7 نمونه دارای شرايط باليني يكسان نباشند. اين روش

کنترل کيفي به صورت برنامه های نرم افزاری روی بعضی دستگاه ها نصب شده است.

‌)CV(3ـ7ـ‌بررسی‌عدم‌دقتبا اين بررسي به دو شكل انجام پذير است. درصورت استفاده از خون کنترل، می توان استفاده از نتايج نمونة کنترل که طی روزهای متوالی با دستگاه آزمايش شده، عدم دقت هر پارامتر را محاسبه کرد و درصورت دسترسی نداشتن به خون کنترل، بايد از نمونه های روزانه برای اين امر استفاده کرد. به اين ترتيب، هر ماه دو نمونه يا بيشتر را حداقل 10 بار به صورت متوالی با دستگاه آزمايش کرده و از نتايج به دست آمده، عدم دقت هر پارامتر

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

36

را محاسبه کرد. توصيه می شود که عدم دقت دستگاه به ويژه هنگام نصب و راه اندازی، با استفاده از نمونه هايی با دامنه های طبيعی و غيرطبيعی بررسي شود. برای تهية نمونة غيرطبيعی پايين، می توان از نمونة رقيق شده استفاده کرد، به اين ترتيب که پالسماي نمونه را جداکرده و سپس حجمي از نمونه را با اين پالسماي به دست آمده مخلوط کرد. نمونة خون با دامنة غيرطبيعی باال را نيز می توان با غليظ کردن نمونه تهيه نمود. براي اين کار بايد ظرف نمونه را به مدت 2 ساعت با زاوية °45 نگهداري کرد و سپس با برداشتن نيمی از پالسمای ايجاد شده و مخلوط کردن کامل، از آن به عنوان نمونة غيرطبيعي باال استفاده نمود. درصورت مطابقت نداشتن عدم دقت هر پارامتر با ادعاي سازنده که در بروشور درج شده است، ضروري است

با شرکت پشتيبان تماس گرفته شود.

ميزان عدم دقت دستگاه برای شمارش گلبول هاي سفيد به روش زير محاسبه می شود:

)x-x-(2x-x-WBC شمارش0/0009-0/037/60/017-0/137/50/0290/177/8

0/0009-0/037/60/017-0/137/50/0730/277/90/017-0/137/5

0/0009-0/037/60/017-0/137/50/0290/177/8

∑)x-x-(2 = 0/201∑x = 76/3x- = 7/63

CV% = %1/9

CV% = SD × 100x

CV% = 0/148 × 1007/63

SD =

SD =

∑ (x - x)2

0/201n -1

9 = 0/148

مثال

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

37

3ـ‌‌8ـ‌بررسی‌صحت‌روش های ذکرشده جزئی از برنامه های کنترل داخلی کيفيت هستند و به منظور بررسی تكرارپذيری مناسب آزمايش ها انجام می شوند، ولی تكرارپذيری مناسب همواره نشان دهندة صحت نتايج نيست. براي ارزيابی صحت عملكرد تجهيزات و روش های آزمايش، بايد از روش های ديگری نظير استفاده از استاندارد، کاليبراتور و يا شرکت در برنامه های کنترل خارجی کيفيت استفاده کرد. هدف برنامة کنترل خارجی کيفيت، ايجاد هماهنگی بين نتايج

آزمايشگاه ها است. در اين برنامه، نمونه های مجهول از مرکز اجرای برنامه به آزمايشگاه های شرکت کننده فرستاده می شود. آزمايشگاه ها پس از انجام آزمايش های الزم روی نمونه ها، نتايج را جهت روش های به ذکرشده مرکز در نتايج ارسال می نمايند. برنامه اجرای مرکز به پردازش مختلف بررسي مي شود که يكي از آنها مقايسة نتايج هر آزمايشگاه با ميانگين نتايج کل

آزمايشگاه ها است که نتيجة آن به صورت)DI(1 به اطالع آزمايشگاه رسانده می شود.

1. Deviation Index

DI = x xSD

نحوة تفسير:DI > 1 = نتيجة مناسب

DI 1-2 = قابل قبول اما بينابينيDI 2-3 = نياز به بررسی روش آزمايش و يا کاليبراسيون

DI > 3 = نياز به اقدام فوري

x: ميانگين گروه x: نتيجة هر آزمايشگاه

SD: انحراف معيار مجاز هر پارامتر

3ـ‌9ـ‌تطابق‌نتايج‌دستگاه‌با‌يافته‌های‌ميکروسکوپی‌يا‌بالينیبه توصية سازمان جهاني بهداشت، بررسی نتايج آزمايش های حاصل از دستگاه و مقايسه و مطابقت آنها با مشاهدة ميكروسكوپی گسترش های خونی مربوطه و يافته های بالينی بيمار، بايد از برنامه های دائمي کنترل کيفيت آزمايشگاه باشد. به اين ترتيب، هرگونه نتيجة

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

38

1. Variance

فرمول های محاسبة t با استفاده از آزمون آماری Paired t test به روش زير است:

Variance)SD2( =Standard error of difference in mean (SEdiff) = t =

n: تعداد نمونه هاd: اختالف نتايج روش دستی و دستگاهی برای هر نمونه

d: ميانگين اختالف نتايج

SD2: واريانس1 اختالف بين نتايج

SE diff: تفاوت استاندارد ميانگين دو گروه داده

با توجه به ضرايب اطمينان مختلف در جدول t test درج t مقادير مجاز )n-1(و درجة آزادی )n(شده است. با استفاده از اين جدول براساس تعداد نمونه ها

و درنظر داشتن ضريب اطمينان 95%، می توان عدد t مجاز را مشخص کرد.

اگر چه مقايسة روش دستی)مرجع( و دستگاهی در مراجع معتبر روش روزمره برای کنترل کيفيت عنوان نشده است، ولی در بسياری از آزمايشگاه های کشور از اين روش به عنوان يكی از راه های کنترل کيفيت استفاده می شود. درصورت استفاده از اين روش،

توجه به نكته هاي زير الزامی است:1. آزمايش دست کم روي 3 نمونه)بديهی است آزمايش روی تعداد نمونه های بيشتر

امكان دستيابی به نتايج صحيح تر را فراهم می نمايد(؛2. انجام آزمايش دوتايي به روش دستی و دستگاهی روی هر نمونه و محاسبة

ميانگين نتايج برای هر پارامتر با هر دو روش ؛3. استفاده از آزمون آماری Paired t test براي مقايسة هم خوانی نتايج.

∑)d - d (2

n-1

dSEdiff

nSD2

از دستگاه نظير لكوسيتوز، لكوپنی، ترومبوسيتوپنی، هموگلوبين انتظار حاصل غيرقابل خيلی پايين يا باال و اندکس های غيرطبيعی بايد پيش از گزارش با مشاهدة گسترش خون

محيطی يا بررسی وضعيت بالينی و يا سابقة بيمار تأييدشود.

نكته

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

39

جدول شمارة 3: جدول مقادير t براساس ضرايب اطمينان مختلفسطح درصد اطمينان

151020304050df63/65712/7066/3143/0781/9631/376119/9254/3032/9201/8861/3861/0610/81625/8413/1822/3531/6381/2500/9780/76534/6042/7762/1321/5331/1900/9410/74144/0322/5712/0151/4761/1560/9200/72753/7072/4471/9431/4401/1340/9060/71863/4992/3651/8951/4151/1190/8960/71173/3552/3061/8601/3971/1080/8890/70683/2502/2621/8331/3831/1000/8830/70393/1692/2281/8121/3721/0930/8790/7103/1062/2011/7961/3631/0880/8760/697113/0552/1791/7821/3561/0830/8730/695123/0122/1601/7711/3501/0790/8700/694132/9772/1451/7611/3451/0760/8680/692142/9472/1311/7531/3411/0740/8660/691152/9212/1201/7461/3371/0710/8650/690162/9892/1101/7401/3331/0690/8630/689172/8782/1011/7341/3301/0670/8620/688182/8612/0931/7291/3281/0660/8610/688192/8452/0861/7251/3251/0640/8600/687202/8312/0801/7211/3231/0630/8590/686212/8192/0741/7171/3211/0610/8580/686222/8192/0741/7171/3211/0610/8580/685232/7972/0641/7111/3181/0590/8570/685242/7872/0601/7081/3161/0580/8560/684252/7792/0561/7061/3151/0580/8560/684262/7712/0521/7031/3141/0570/8550/684272/7632/0481/7011/3131/0560/8550/683282/7562/0451/6991/3111/0550/8540/683292/7502/0421/6971/3101/0550/8540/683302/7042/0211/6841/3031/0500/8510/681402/6782/0081/6761/2991/0480/8490/680502/66021/6711/2961/0460/8480/679602/6171/9801/6581/2891/0410/8450/6771202/5761/9601/6451/2821/0360/8420/674∞

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

40

براساس جدول t با توجه به تعداد نمونه های مورد آزمايش)3 نمونه( و درجة آزادی t مورد قبول بـا ضريب اطمينان 95% برابر 4/3 است. کمتربـودن مقدار t مقدار ،)n-1(2محاسبه شده در اين آزمايش)0/15( از مقدار t مجاز)4/3( نشان دهندة هم خوانی و قابل قبول

بودن نتايج است.

ميانگين هماتوکريت به روش دستگاهی

ميانگين هماتوکريت به روش دستی (d-d)2 d-d d

0/190/40/4

∑)d-d(2 = 0/99

0/4370/6370/637

0/50/70/7

%45%38/3%41

%45/539

%41/7

)SD2( =واريانس ∑)d-d(2

n-1 0/99

2 0/5= =

SE diff t d 0/063

0/4 0/15= = =

n 3 0/4= = = SE diff SD2 5

مثال

d = 0/063

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

41

4.‌‌خطاهای‌دستگاه‌های‌خودكار‌شمارندة‌سلولیاگرچه استفاده از دستگاه های شمارندة سلولی در آزمايشگاه ها در مقايسه با روش های دستی، تكرارپذيری يا دقت نتايج حاصل را به ميزان قابل توجهی بهبود بخشيده است، ولی صحت نتايج حاصل ممكن است به داليل گوناگون همواره قابل اطمينان نباشد. بنابراين، کاربر دستگاه عالوه بر آشنايی با نحوة کار، نگهداری، کاليبراسيون و کنترل کيفي دستگاه، بايد از تمام عللی که منجر به خطا در شمارش يا اندازه گيری پارامترهای خونی توسط دستگاه شمارنده می شود، نيز آگاه باشد. گروهی از اين خطاها ناشي از نحوة طراحي دستگاه ها براي شمارش سلول ها است، مثاًل عبور هم زمان دو سلول از بين دو الكترود که به ايجاد يک پالس و در نتيجه، شمارش يک سلول به جای دو سلول منجرمی شود يا سلول هايي که پس از عبور از بين دو الكترود و شمارش، دوباره به گردش بين الكترودها وارد و مجدداً شمارش می شوند. در شرايطی نيز که بنا به داليلمختلف آگلوتيناسيون گلبول هاي قرمز رخ می دهد، گلبول های به هم چسبيده در دستگاه به عنوانيک سلول بزرگ شمارش می شوند. شمارش حباب هاي هوا، قطرات چربي، ميكروارگانيسم ها

يا ذرات خارجي به عنوان يک سلول نيز از موارد ديگر خطا در دستگاه ها هستند. در زيـر به مـوارد ديگری که ممكن است بالقوه مـوجب اختالل در شـمارش دستگاه

شوند، اشاره می شود:1. افزايش شمارش گلبول هاي سفيد بيش از L/109 × 30 معموالً به دليل ايجاد کدورت باعث افزايش کاذب، ولي جزئي در هموگلوبين و همچنين، افزايش کاذب هماتوکريت

و MCV می شود.2. افزايش غلظت گلوکز)بيش از 400mg/dL( و افزايش اسموالليتة خون ناشي از ساير شود. MCHC کاهش و هماتوکريت و MCV کاذب افزايش ممكن است سبب علل براي رفع اين خطا خون بايد پيش از انجام آزمايش ده دقيقه با ايزوتون انكوبه شود.

3. آگلوتينين هاي سرد با تيترهاي باال، به طور کاذب باعث کاهش شمارش گلبول هاي قرمز و افزايش MCV و MCHC مي شوند که با گرم کردن خون يا محلول رقيق کننده اين مشكل حل مي شود.

4. در بعضی از انواع لوسمي ها که گلبول هاي سفيد شكننده هستند، شمارش آنها به طور کاذب کاهش نشان مي دهد که در اين موارد، شمارش با هماسيتومتر کمک کننده است.

مقدار افزايش کاذب درنتيجه باعث کدرشدن پالسما و باالي چربي بسيار سطوح .5هموگلوبين، MCH و MCHC مي شود. براي حل اين مشكل، اندازه گيري هموگلوبين بايد

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

42

1. نمونه گيری از بيمار ديگر2. نمونة خون با برگة درخواست بيمار ديگر

3. رقيق بودن نمونه4. استفاده از EDTA بسيار غليظ

5. غليظ بودن نمونه به علت استفادة طوالنی مدت از تورنيكه6. لخته شدن قسمتی از نمونه

7. هموليز نمونه8. بيش از حد گرم يا منجمدکردن نمونه

9. نمونة خون کهنه10. نمونة آلوده به چربی زير جلد

خطا در جمع آوری يا ذخيرة نمونه

1. خطا در شست وشو و آماده سازی دستگاه2. مخلوط کردن ناکافی نمونه

3. انسداد مسير پروب دستگاه)به طور مثال، توسط لخته که از نمونة قبلی به جای مانده است(

با نمونة فعلی)اين 4. تداخل نمونة بسيار غيرطبيعی قبلی مورد در دستگاه های جديد به حداقل رسيده است(

خطا در برداشت نمونه توسط دستگاه

تعيين در يا خطا کاليبراتور به عنوان کنترل مواد از استفاده دقيق مقادير پارامترها برای روش کاليبراسيون خطا در کاليبراسيون

در اختالل دستگاه، نامناسب نگهداری و مختلف داليل به دستگاه عملكرد

اشكال در معرف ها1. تعيين ميزانMCV کمتر از مقدار واقعی درصورت وجود

گلبول های قرمز هيپوکروم در دستگاه های امپدانس2. ناتواني شناسايی سلول ها درصورت کمبود آنزيم پراکسيداز

عدم صحت اندازه گيری دستگاه ها به دليل ماهيت برخی روش های اندازه گيری که

برای دستگاه طراحی شده1. خطا در تعيين ميزان هموگلوبين و اندکس های گلبولی

به دليل وجود آگلوتينين های سرد يا افزايش چربی خون2. نوتروپنی کاذب درصورت کمبود آنزيم پراکسيداز

دنبال به دستگاه عملكرد صحت عدم وجود ويژگی هاي خاص در نمونه

جدول شمارة 4: برخی از داليل خطا در شمارش های سلولی دستگاه های خودکار شمارندة سلولی

به روش دستي و با افزودن حجم مناسبي از پالسمای بيمار به بالنک و صفرکردن دستگاه اسپكتروفتومتر با آن انجام شود.

بـه ممكن است که اشاره مي شود بيشتري موارد به ،10 تا 4 شمارة در جدول هاي نادرست بودن نتايج دستگاه های شمارندة سلولی خودکار منجر شوند. کاربر دستگاه عالوه بر

آشنايی با موارد مندرج در اين جدول ها بايد از نحوة رفع اين خطاها نيز آگاه باشد.

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

43

MCHC و MCH جدول شمارة 6: برخی از داليل ايجاد خطا در تعيين مقادير

1. افزايش کاذب هموگلوبين2. کاهش کاذب تعداد گلبول های قرمز

3. هموليز داخل عروقی با هموگلوبين آزاد در پالسماMCH افزايش کاذب

1. افزايش کاذب هموگلوبين 2. هموليز داخل عروقی با هموگلوبين آزاد در پالسما يا ليز

گلبول های قرمز خارج بدن3. کاهش کاذب هماتوکريت، MCV يا گلبول های قرمز

4. شرايط هيپواسموالر

افزايش کاذب MCHC يا مشخص نشدن MCHC کاهش واقعی

1. افزايش کاذبMCV)غير از مواردی که علت آن آگلوتينين های سرد باشد(

2. افزايش کاذب تعداد گلبول های قرمز به دليل وجود تعداد زياد پالکت های ژانت3. شرايط هيپراسموالر

MCHC کاهش کاذب

جدول شمارة 5: برخی از داليل افزايش کاذب هموگلوبينتعداد زياد گلبول های سفيد

افزايش چربی خون اندوژن يا به دليل تغذيه از راه وريدکرايوگلوبولينمی

پاراپروتئين يا هيپرگاماگلوبولينمی

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

44

MCV جدول شمارة 7: برخی از داليل ايجاد خطا در شمارش گلبول های قرمز، ميزان هماتوکريت و

1. وجود پالکت های درشت به تعداد زياد2. افزايش چربی خون)ناپايدار(

3. کرايوگلوبولينمی4. کرايوفيبرينوژنمی

افزايش کاذب تعداد گلبول های قرمز

EDTA 1. پان آگلوتيناسيون ناشی از ايجاد آگلوتينين های سرد وابسته به2. ليز گلبول های قرمز خارج از بدن به دنبال نگهداری نامناسب نمونه يا وجود

گلبول های قرمز غيرطبيعی 3. ميكروسيتوز بسيار شديد يا تكه تكه شدن گلبول های قرمز در بعضی بيماری ها

کاهش کاذب تعداد گلبول های قرمز

1. نگهداری خون در دمای اتاقEDTA 2. آگلوتينين های سرد و آگلوتيناسيون گلبول های قرمز وابسته به

3. تعداد زياد گلبول های سفيد4. شرايط هيپراسموالر

K2EDTA .5 اضافی

افزايش کاذب MCV

1. گلبول های قرمز هيپوکروميک2. افزايش دمای اتاق

3. شرايط هيپواسموالر4. مخلوط کـردن مكرر نمونـه کـه بـاعث افزايش اکسيژناسيون گلبول هـای

قرمز می شود

کاهش کاذب MCV

1. افزايش کاذب MCV)غير از مواقعی که به دنبال آگلوتينين های سرد رخ می دهد(2. کاهش کاذب تعداد گلبول های قرمز

افزايش کاذب هماتوکريت

MCV 1. کاهش کاذب ميزان2. کاهش کاذب گلبول های قرمز به دليل ميكروسيتوز بسيار شديد يا ليز گلبول های

قرمز خارج بدن3. آگلوتينين سرد

4. مخلوط کردن مكرر نمونه که باعث افزايش اکسيژناسيون گلبول های قرمز می شود

کاهش کاذب هماتوکريت

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

45

جدول شمارة 8: برخی از داليل ايجاد خطا در شمارش پالکت

1. لخته شدن نسبی نمونه2. فعال شدن پالکت ها در حين خون گيری و تجمع آنها

EDTA 3. تجمع پالکتی ايجادشده توسطPlatelet Satellitism .4

برای تعيين شده آستانة از آنها اندازة که ژانت پالکت های .5پالکت ها بيشتر باشد

پايين بودن کاذب شمارش پالکت ها

1. گلبول های قرمز ميكروسيت يا تكه تكه شده2. گلبول های سفيد خردشده

H 3. بيماری هموگلوبين4. کرايوگلوبولين

5. هيپرتری گليسريدمی يا هيپرليپيدمی6. وجود ميكروارگانيسم ها در نمونة خون

7. گرم کردن ناخواستة خون

باالبودن کاذب شمارش پالکت ها

جدول شمارة 9: برخی از داليل کاهش کاذب تعداد گلبول های سفيد

ليز سلول ها به دليل ماندن خون بيش از 3 روز

نگهداری نمونه در دمای اتاق به مدت 24 ساعت

تجمع گلبول های سفيد يا گلبول های سفيد و پالکت ها به دنبال وجود آنتی بادی يا تغيير در غشاء سلولی يا وجود سلول های نئوپالستيک با ويژگی های غيرطبيعی)نظير تجمع نوتوفيلی با واسطة آنتی بادی، تجمع

سلول های لنفومی و يا سلول های نئوپالستيک پالسماسلی(

آگلوتينين های سرد قوی

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

46

جدول شمارة 10: برخی از داليل افزايش کاذب تعداد گلبول های سفيدوجود گلبول قرمز هسته دار

پالکت های ژانت به تعداد زيادليزنشدن گلبول های قرمز

اورمینمونه از جنين يا نوزاد

)AS, SS, AC, AE, AD, AO-Arab هموگلوبين های غيرطبيعی)مثلبيماری های کبدی

آگلوتينين های سردسندرم های ميلوديسپالستيک

آنمی مگالوبالستيکبعد از برداشتن طحال

تجمع پالکتیکرايوگلوبولينمی و کرايوفيبرينوژنمی

پاراپروتئينمیوجود رشته های فيبرين

افزايش چربی خونآلوده شدن نمونه به چربی زيرجلدی

وجود انگل ماالرياهموگلوبين های ناپايدار

فصل دوماساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاهاي دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي

47

فصل سوم

روش هاي مرجع انجام آزمايش ها

1.‌اندازه‌گيري‌هموگلوبين‌خون‌به‌روش‌سيان‌مت‌هموگلوبينروش شيميايی اندازه گيري هموگلوبين در خون با روش سيان مت هموگلوبين، روش دستي اندازه گيری مرجع هموگلوبين است که برای کاليبراسيون دستگاه هاي شمارنده نيز کاربرددارد. نكته هـاي مهمی کـه هنگام انجـام اين آزمايش بـراي دستيابي به نتـايج صحيح بايـد

در نظر گرفته شوند: از ظرف هاي شيشه اي استفاده شود که ازنظر صحت در حد استاندارد)کالس A( و از

لحاظ شيميايي تميز باشند. از دقت و صحت عملكرد سمپلرها، اسپكتروفتومتر و يا فتومتر با استفاده از برنامه هاي

کنترل کيفيت اطمينان حاصل شود)تمام مستندات کنترل کيفيت ثبت شود(. درصورت امكان، از درابكين با ترکيب توصيه شدة CLSI)مؤسسة استاندارد آزمايشگاه

بالينی(، که مقادير الزم برای تهية آن در زير آمده است، استفاده شود.KCN K3Fe(CN)6

KH2PO4(Anhydrous) Nonionic Detergent

Clinical laboratory Reagent water(type I) به 5 دقيقه تمـام هموگلوبين هـا را غير از سولفوهموگلوبين اين معرف در مـدت سيان مت هموگلوبين تبديل مي کند. کربوکسی هموگلوبين که در افراد سيگاری افزايش می يابد،

برای اکسيد شدن به 30 دقيقه زمان نيازدارد. محلول درابكين را بايد در ظرف هاي تيرة دربسته از جنس بوروسيليكات نگهداري نمود

و درصورت مشاهدة کدري دور ريخت. هنگام استفاده از اين محلول ها و دفع آنها، به علت سمي بودن، احتياط هاي الزم بايد

ازنظر ايمنی به کار رود.

0/05g

0/2g

0/140g

0/5-1mL

1000mL

51

از درابكين با ترکيب هاي ديگر)غير از فرمول باال( نيز مي توان استفاده نمود، ولي زمان کامل شدن واکنش طوالني تر و احتمال ايجاد کدري بيشتر است.

ولی استفاده نمود، وريدي يا مويرگی خون نمونة از می توان آزمايش انجام براي استفاده از خون وريدی برتري دارد.

يا دي پتاسيک( هستند که به مقدار مناسب، نمک هاي EDTA)دي سديک ضدانعقاد 2/2mg/mL - 1/5 به ازای هر ميلی ليترخون بايد استفاده شوند.

پس از خون گيري، بايد نمونه را بالفاصله با ضدانعقاد مخلوط نمود. درصورت استفاده از K3EDTA، به دليل ايجاد رقت در نمونه، ميزان هموگلوبين تا %1

کاهش نشان مي دهد.

روش آزمايش 5mL 0/02 خـون بـاmL ،در روش معمول اندازه گيري هموگلوبين بـه روش دستي درابكين مخلوط و پس از طی مدت الزم براي کامل شدن واکنش، جذب نوری آن با

فتومتر خوانده می شود.زياد1 از روش رقت کاليبراسيون دستگاه شمارنده ، بـه منظور آزمـايش انجام برای استفاده می شود تا احتمال خطای ناشی از رقيق سازی کاهش يابد. برای اجرای اين کار،

مي توان از روش های رقيق سازي زير استفاده کرد:ــ 0/04mL خون با 10mL درابكين يا

ــ 0/4mL يا 0/5mL خون با 100mL درابكين ياــ 0/1mL خون با 25mL درابكين.

1. Macro Dilution

برای انجام آزمايش، به ويژه به منظور بررسی کاليبراسيون دستگاه شمارنده، استفاده از وسايل شيشه ای کالس A و ابزار و تجهيزات کاليبره ضروری است.

در هر دو روش معمولی و با رقت زياد، ابتدا نمونة خون توسط پيپت يا سمپلر با سرعت آهسته و ثابت کشيده می شود و پس از پاك کردن سطح خارجي پيپت يا سرسمپلر با پارچة بدون پرز، که

نكته

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

52

با آب مقطر يا نرمال سالين مرطوب شده، داخل لولة آزمايش تخليه می شود. نمونة باقی مانده در پيپت يا سرسمپلر، بايد با 8 تا 10 بار برداشت و تخليه، با محتويات لوله کاماًل شسته شود. براي مخلوط شدن کامل خون و درابكين، پس از 5 تا 6 بار سروته نمودن لوله، بايد محلول را براي

کامل شدن واکنش پيش از خواندن جذب نوری، 5 دقيقه در دماي اتاق نگهداري نمود.به منظور خواندن جذب نوري از فتومتر يا اسپكتروفتومتر با طول موج 540nm استفاده می شود. درصورت استفاده از استاندارد هموگلوبين، جذب نوري اين محلول نيز در طول موج ذکرشده

خوانده شده و مقدار هموگلوبين برحسب گرم در ليتر از فرمول زير محاسبه مي شود:

براي رسم منحني استاندارد هموگلوبين، ابتدا از محلول استاندارد، رقت هاي مختلف 1/2، 1/3 و 1/4 تهيه و جذب نوري آنها در طول موج 540nm مقابل بالنک)درابكين( خوانده مي شود. پس از تعيين مقدار هموگلوبين هر رقت، روي کاغذ نمودار خطی مقادير جذب نوري هر رقت روي محور عرضی)Y( و مقدار غلظت هموگلوبين هر رقت روي محور طولی)X( ثبت مي شود. خطي که از مبدأ و نقاط تالقي مقدار هموگلوبين و جذب نوري مربوط مي گذرد، منحني

استاندارد نام دارد که مي توان با استفاده از آن غلظت هموگلوبين نمونه ها را محاسبه کرد.

منابع خطا افزايش کاذب مقدار نمونه سبب تغليظ با نامناسب خون گيري وريدي که تكنيک

هموگلوبين و شمارش سلولي مي شود؛ استفاده از تجهيزات بدون سوابق کنترل کيفيت و کاليبراسيون؛

آگاهی ناکافي کارکنان از نحوة صحيح انجام آزمايش و منابع خطا؛ مخلوط نمودن ناکافی نمونه پيش از آزمايش؛

وجود لخته در نمونه؛ نگهداری درابكين در مقابل نور يـا يخ زدن؛

استفاده از استاندارد خراب يا تاريخ مصرف گذشته)به ويژه اگر پس از بازشدن مدت طوالنی در دمای اتاق بماند(؛

کاليبـراسيون نادرست اسپكتروفتومتر؛

= )g/L( غلظت هموگلوبين نمونه× غلظت هموگلوبين استانداردجذب نوری نمونه

جذب نوری نمونة استاندارد

فصل سومروش های مرجع انجام آزمايش ها

53

عملكرد نامناسب اسپكتروفتومتر ناشی از کافی نبودن زمان گرم شدن دستگاه يـا بيش از حد گرم شدن دستگاه، اختالالت مربوط به منبع نوری، فتوسل، ولتاژ، خطی نبودن

دستگاه، صحيح قرارنگرفتن کووت و يا استفاده از کووت کثيف يا خش دار.

2.‌روش‌اندازه‌گيري‌حجم‌سلول‌های‌متراكم‌شده‌به‌روش‌ميکروهماتوكريتPCV نسبت حجم گلبول هاي قرمز متراکم شده به حجم خون کامل است. اين نسبت پس از

سانتريفوژ مناسب نمونة خون به دست آمده و ترجيحًا به صورت اعشاري گزارش مي شود )مانند 0/42 به جاي 42% (. روش مرجع اندازه گيری حجم سلول هاي متراکم شده، روش

ميكروهماتوکريت است که براي کاليبراسيون دستگاه هاي شمارنده نيز استفاده می شود.

نكته هاي مهم در آزمايش اندازه گيري حجم گلبول هاي قرمز متراکم شده انجام آزمايش با استفاده از خون مويرگی، شريانی و وريدی امكان پذير است.

در جمع آوری نمونه به طريق مويرگی، از لوله های هپارينه حاوی حداکثر 7 واحد هپارين به ازای هر لولة مويينه استفاده مي شود.

مي توان نمونه را پس از جمع آوري در دماي اتاق نگهداري و حداکثر در مدت 6 ساعت پس از نمونه گيری آزمايش نمود.

نمونه ها بايد به روش دوتايي آزمايش شوند. مقدار هماتوکريت نمونه هاي دوتايي نبايد بيش از 0/005)0/5%( با يكديگر اختالف داشته باشند.

درصورت انجام اين آزمايش، به منظور کاليبراسيون دستگاه شمارنده فقط بايد از ضدانعقاد از استفاده جلوگيری شود. قرمز گلبول هاي چروکيدگي از تا استفاده شود K2EDTA

%2 را MCV ميزان قرمز گلبول هاي در چروکيدگي ايجاد به علت K3EDTA ضدانعقاد کاهش مي دهد. درصورت استفاده از ضدانعقاد مايع، ضريب رقت بايد محاسبه شود.

توصيه می شود براي انجام آزمايش کاليبراسيون دستگاه شمارنده از لوله هاي مويينه با حلقة آبي)بدون ضدانعقاد( استفاده شود.

هنگام خواندن نتيجه با خط کش مخصوص، مقدار بافي کوت درنظر گرفته نشود. خطای قابل قبول اندازه گيری حجم سلول هاي متراکم شده به روش ميكروهماتوکريت

1%± است.

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

54

روش آزمايش2/3 تا 3/4 طول لولة ميكروهماتوکريت بايد از خون کامل، که پيش از آن حداقل 8 بار سروته شده است، پر و با خمير مخصوص مسدودشود. طول خمير نبايد از 4mm کمتر و سطح آن نيز بايد کاماًل صاف باشد. از هر نمونة خون بايد دو لوله به اين روش پرشده و روبه روي هم در دستگاه ميكروهماتوکريت قرار گيرد. با تنظيم زمان سنج دستگاه سانتريفوژ نمونه ها انجام شده و پس از طي مدت تعيين شده نتيجة آزمايش حداکثر 10 دقيقه پس از توقف دستگاه و با استفاده از خط کش هماتوکريت خوانده مي شود. با گذشت زمان و باقي ماندن لوله ها به صورت

افقي، حد فاصل پالسما و سلول به تدريج شيب دار و خواندن نتيجه با مشكل مواجه مي شود.

منابع خطا توقف جريان خون1 به علت بستن طوالني تورنيكه که باعث افزايش غلظت خون مي شود؛

خون گيري های سخت و طوالنی به دليل ورود مايع بين بافتي به فضای داخل عروقی که باعث رقيق يا لخته شدن خون مي شود؛ هموليز در اثر استفاده از سر سوزن نازك؛

مخلوط نشدن نمونه با ضدانعقاد؛ پر يا مسدودکردن نادرست انتهای لولة هماتوکريت؛

مسدودکردن انتهاي لوله با حرارت؛ خطاي ديد هنگام خواندن نتيجة آزمايش؛

تصوير شمارة 6: نمای شماتيک از نمونة هماتوکريت پس از سانتريفوژ

1. Stasis

Sealingcompound

WBC

RBC

Plasma

100%

42%

0%

فصل سومروش های مرجع انجام آزمايش ها

55

1. Plasma Trapping2. Relative Centrifugal Field3. Revolution Per Minute

ويژ گي هاي دستگاه ميكروهماتوکريت استاندارد شعاع چرخش بيشتر از 8cm ؛

توانايی رسيدن به حداکثر سرعت در 30 ثانيه؛دقيقه 5 به مدت در محيط، حداقل 12000g تا 10000g RCF حدود ايجاد توانايي

بدون افزايش دما از C°45؛ داشتن زمان سنج خودکار)با قابليت تنظيم حداقل 30 ثانيه(.

RCF = 1/118 × 10-5 × r × RPM2

2RCF: ميدان نسبی سانتريفوژ

3RPM: دور در دقيقه

جدول شمارة 11: علل کاهش و افزايش کاذب هماتوکريت

علل افزايش کاذب ميزان هماتوکريتعلل کاهش کاذب ميزان هماتوکريتهيپوناترمی EDTA اضافی

هموليز به دام افتادن پالسما

هيپرناترمی

محـاسبة بـافي کوت بـه عنوان جـزيی از ستـون گلبول هـای قـرمـز هنگام خواندن نتيجة آزمايش؛

خطاي به دام افتادن پالسما1 که اين مورد در آنمی های ماکروسيتيک کم و در اسفروسيتوز، تاالسمي و آنمي سيكل سل زياد است. در حالت طبيعي، ميزان پالسماي به دام افتاده

1% تا 3% است که هنگام کاليبراسيون دستگاه شمارنده بايد 2% درنظر گرفته شود.

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

56

كنترل‌كيفيت‌و‌بررسی‌كاليبراسيون‌دستگاه‌ميکروهماتوكريتدستگاه ميكروهماتوکريت بايد توانايي ايجاد حداقل نيرويي برابر با 10000g به مدت 5

دقيقه را دارا باشد.کنترل کيفيت دستگاه بايد هر سه ماه انجام شـود. براي انجـام اين کـار بررسی موارد

زير ضروري است: سرعت سانتريفوژ،

زمان سنج، حداکثر توان در تجمع سلول ها1.

تاکومتر با به ترتيب دستگاه زمان سنج عملكرد و دقيقه( در سانتريفوژ)دور سرعت کاليبره و کرونومتر ارزيابي مي شوند.

استفاده مي شود. تازه از خون توان دستگاه در تجمع سلول ها بررسی حداکثر براي براي انجام اين امر دو نمونه خون تازه حاوی ضدانعقاد EDTA دی پتاسيک که به خوبی مخلوط شده اند را به صورت دوتايی به مدت دو دقيقه سانتريفوژکرده و مقادير PCV آنها ثبت می شود. سپس، زمان سانتريفوژ را 30 ثانيه به 30 ثانيه افزوده تا زمانی که ميزان دو زمان به عنوان حداقل زمان اين تغييربماند. بدون پی درپی اندازه گيری شدة هماتوکريت است بهتر آزمايش اين گرفته می شود. درنظر قرمز گلبول های متراکم نمودن براي الزم

حداقل با يک نمونه دارای هماتوکريت 0/5)50%( يا بيشتر نيز انجام شود. جدول شمارة 12 مثالي است از ارزيابي حداکثر توان يک دستگاه ميكروهماتوکريت

در تجمع سلول ها.

1. اين مورد پس از خريد و پيش از شروع به کار با دستگاه و حداقل هر 6 ماه يک بار بايد انجام شود.

فصل سومروش های مرجع انجام آزمايش ها

57

جدول شمارة 12: بررسی دستگاه از نظر حداکثر توان تجمع سلولی

PCVزمان)دقيقه( نمونة 1نمونة 2

0/590/4920/580/392/50/570/383

0/560/383/5)حداقل زمان براي تجمع سلول ها(

4ــ0/550/55

4/5ــ)حداقل زمان براي تجمع سلول ها(

داده های جدول باال نشان مي دهد که زمان متراکم نمودن گلبول های قرمز در دستگاه ميكروهماتوکريت مورد آزمايش، 3/5 دقيقه براي آزمايش نمونه ای با ميزان هماتوکريت

کمتر از 0/5 و 4/5 دقيقه براي نمونه اي با هماتوکريت بيشتر از 0/5 است. ارزيابی عملكرد دستگاه ميكروهماتوکريت به روش توصيه شدة سازمان جهاني بهداشت

به صورت زير انجام مي شود: چند نمونه خون با هماتوکريت کمتر از 0/5 و حاوی ضدانعقاد EDTA دی پتاسيک نمونه، ظرف سروته نمودن بار بيست از پس را ميلی ليتر خون( هر برای 1/5mg(به صورت دوتايی به مدت 3، 5، 7، 9 و 11 دقيقه سانتريفوژ کرده و سپس نتايج آنها ثبت مي شود. درصورت مناسب بودن توان دستگاه)برحسب g(، نتايج بايد از دقيقة 5

به بعد بدون تغيير بماند.براي بررسي ابزار خواندن هماتوکريت مي توان لولة هماتوکريتی که طول ستون سلول و پالسمای آن مجموعًا حدود 5cm وPCV آن 0/5 بوده را انتخاب کرد و روي خط کش معمولي طوري قرارداد که ابتداي ستون گلبول قرمز روي نقطه صفر و انتهاي ستون سلول 2/5cm 5 باشد. قرارگرفتن انتهاي بااليی ستون گلبول های قرمز رويcm و پالسما روي

نشان دهندة صحت خواندن توسط ابزار خواندن هماتوکريت مورد استفاده است.

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

58

3.‌‌شمارش‌سلول‌های‌خونی‌به‌روش‌دستیشمارش گلبول های سفيد و پالکت ها به روش دستي، جايگزين قابل قبولی برای دستگاه های شمارندة سلولی است، ولی برای شمارش گلبول های قرمز کاربرد زيادی ندارد؛ زيرا در آزمايشگاه ها در شرايط معمول برای شمارش های دستی، حدود 400 گلبول قرمز شمارش

شده که موجب عدم دقت زياد در شمارش اين سلول ها می شود.از هماسيتومتر)نئوبار اصالح شده( به روش دستی برای شمارش سلول های خونی استفاده می شود که بر روی آن 9 فضای خط کشی شده با مساحت mm × 1 mm 1 تعبيه شده است. پس از قرارگرفتن المل سنگين)دارای سطح صيقلی( روی آن فضايی با حجم

0/1 ايجادمی شود.

4mm

هماسيتومتر و المل سنگين پس از هربار استفاده بايد بالفاصله با آب گرم شسته شده و با پارچة تميز بدون پرز پاك و در هوا خشک شود. سطح اين الم نبايد با گاز يا پارچة زبر تماس داده شود؛ زيرا باعث خراشيدگی خطوط روی الم می شوند. نمونة مورد آزمايش پس از رقيق شدن، کاماًل مخلوط شده و به وسيلة پيپت در فضای هماسيتومتر زير المل سنگين واردمی شود. پراکندگی سلول ها بايد با عدسی ×10 بررسی شده و سپس، با عدسی شي ئی ×40 و عدسی چشمی ×10 يا ×6 شمارش انجام شود)به طور معمول، از عدسی شي ئی ×10 برای

شمارش گلبول های سفيد و از عدسی شي ئی ×40 برای شمارش پالکت ها استفاده می شود(.

شمارش‌گلبول‌های‌سفيدمادة حاوی محلول با EDTA ضدانعقاد حاوی خون سفيد، گلبول های شمارش برای نيز را سفيد گلبول های هستة قرمز، گلبول های ليز عالوه بر که مخلوط مي شود رنگی به رنگ بنفش ـ سياه درمی آورد. برای انجام اين آزمايش استفاده از ضدانعقاد هپارين توصيه نمی شود. محلول رنگی با استفاده از اسيد استيک 20mL /L(%2( تهيه مي شود که با

اضافه نمودن چند قطره ويولة دوژانسيان به رنگ بنفش در آمده است.

عدم دقت)CV( شمارش گلبول های سفيد در نمونة طبيعی و غيرطبيعی باال 6/5% و در نمونة غيرطبيعی پايين 15% است.

نكته

فصل سومروش های مرجع انجام آزمايش ها

59

روش آزمايشبرای انجام آزمايش، در لولة آزمايش پالستيكی يا شيشه ای، 0/1mL از خونی که به خوبی مخلوط شده به 1/9mL محلول رقيق کننده اضافه می شود تا رقت 1/20 ايجادشود)مخلوط کردن ناکافی خون پيش از تهيـة رقت، موجب خطای زياد در نتيجة آزمـايش می شود(. پس از بستن دهانة لوله، با استفاده از مخلوط کننده های مكانيكی يـا سروته نمودن آن با دست با زاوية °120 و چرخاندن هم زمان به مدت 2 دقيقه، محتويات لوله کاماًل مخلوط می شود. بـا اين کـار، حباب های هـوا نيز با محلول مخلوط می شونـد. سپس، بالفاصله با استفاده از پيپت يا لـولة مويينه، فضای زيـر المـل ضخيم در همـاسيتومتر در يک مـرحله از اين مخلوط پـرمی شود.

به منظور ته نشين شدن سلول ها، هماسيتومتر بايد به مدت 2 دقيقه روی سطحی صاف، بدون لرزش و دور از نور خورشيد و حـرارت نگهداری و سپس، شـمارش سلول هـا انجام شود. گلبول هـای سفيد بايد در چهار مـربع کناری و در دو طرف محفظه شمارش شوند. در اين مربع ها، عالوه بر شمارش گلبول های داخل اين فضا، گلبول هايی که روی اضالع بااليی و سمت چپ هستند نيز شمارش می شوند؛ ولی گلبول هاي روی اضالع

سمت راست و پايينی مربع در شمارش به حساب نمی آيند.

تصوير شمارة 7: نمايی از فضاهای هماسيتومتر به کار رفته برای شمارش گلبول های سفيد

COUNTEDNOT COUNTED

0.0025 mm2

0.4 mm2

1 mm

1 mm2 0.1 mm deep

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

60

درصورت ايجاد هريک از مشكالت زير هنگام پرکردن هماسيتومتر، شمارش بايد با استفاده از الم خشک و تميز ديگری انجام گيرد:

پرکردن بيش از حد اساليد و سرريزشدن آن؛ پرنشدن کامل محفظه ها از محلول؛

ايجاد حباب هوا در هر قسمت محفظه؛ هرگونه ذرة اضافی در محفظه ها.

طبق تـوصية سازمان جهانی بهداشت، حداقل 100 گلبول سفيد بايد شمارش شود، ولی برای دستيابی به عدم دقت)CV( 5%، شمارش 400 سلول الزامی است. برای به حداقل رساندن خطای ناشی از پراکندگی نامناسب سلول ها، توصيه مي شود که شمارش گلبول های

سفيد در کل فضای خط کشی شده هماسيتومتر)9 فضای 0/1μl( انجام گيرد. برای محاسبة تعداد گلبول های سفيد می توان از فرمول زير استفاده نمود:

10 × 106 × ضريب رقت × تعداد سلول هاي شمارش شده= WBC/L تعداد مربع های بزرگ شمارش شده

برای مثال، اگر در 0/9μl)9 فضای خط کشی شده( 420 گلبول سفيد شمارش شود، تعداد کل گلبول های سفيد به طريق زير محاسبه می شود:

420 × 20 × 106 × 109 = 9/3 × 109 /L

شمارش‌پالكتشمارش پالکت ها روی خون وريدی حاوی ضدانعقاد EDTA انجام پذير است. شمارش با استفاده از خون مويرگی نيز انجام می شود، ولی تعداد پالکت ها نسبت به خون وريدی محل در پالکت ها از متفاوتی تعداد زيرا است؛ ناپايدارتر نيز آن شمارش و کمتر

سوراخ کردن پوست باقی می مانند.

فصل سومروش های مرجع انجام آزمايش ها

61

منابع خطااين خطاها به دو گروه تكنيكی)مربوط به روش آزمايش( و ذاتی تقسيم می شوند:

1. خطاهای تكنيكی خطاهای جمع آوری نمونه؛ مخلوط نكردن کامل نمونه؛

10 × 106 × ضريب رقت × تعداد سلول هاي شمارش شده= PLT/L تعداد مربع های بزرگ شمارش شده

ميزان ساخت محلول رقيق کننده در هر بار نبايد از 500mL بيشتر باشد و برای تهيه امكان، درصورت استفاده شود. ديونيزه يا مقطر آب و تميز شيشه ای ظرف هاي از اين درغير نگهداری شود. يخچال در و صاف 22μl فيلتر از استفاده با رقيق کننده صورت، هر روز پيش از انجام آزمايش حجم مشخصی از آن با دور باال سانتريفوژ

شده و از محلول رويی برای رقيق کردن استفاده شود.

نكته

روش آزمايشمحلول رقيق کننده حاوی اکساالت آمونيوم آبی 10g/L(%1( است که موجب ليز گلبول های قرمز می شود. پيش از تهية رقت بايد از نبود لخته در نمونه اطمينان حاصل کرد. درصورت وجود لخته، بايد دوباره نمونه گيری انجام شود. برای تهية رقت 0/1mL ،1/20 خون کاماًل مخلوط شده با 1/9mL محلول رقيق کننده مخلوط می شود، اين مخلوط بايد به مدت 10 تا 15 دقيقه روی مخلوط کنندة مكانيكی قرار گيرد. سپس، هماسيتومتر با روش ذکرشده برای 20 ته نشين شدن پالکت ها، حداقل برای و پر اين مخلوط از گلبول های سفيد شمارش دقيقه در ظرف پتری که کف آن کاغذ صافی مرطوب قراردارد، نگهداری می شود. پس از گذشت مدت ذکرشده، پالکت ها با ميكروسكوپ شمارش می شوند. درصورت پايين بردن کندانسور ميكروسكوپ، پالکت ها به صورت ذرات کوچک درخشانی قابل رؤيت هستند. شمارش ولی می شوند، شمارش محفظه هر مرکزی مربع در پالکت ها معمول، به طور پالکت ها بايد در يک يا بيشتر از فضاهای 1mm2)حجم 0/1μl( انجام شود. برای دستيابی

به عدم دقت 8% تا 10%، شمارش حداقل 200 پالکت الزامی است.

دستگاه هاي خودکار شمارندة سلولي)اساس کار، کاليبراسيون، کنترل کيفيت و خطاها(

62

پيپت کردن نادرست)استفاده از پيپت و هماسيتومتر غيرکاليبره و غيراستاندارد(؛ استفاده از المل عادی به جای ضخيم)سنگين(؛

مخلوط نكردن کافی نمونه با رقيق کننده؛ پرکردن نادرست اساليد؛

شمارش نادرست سلول ها.

2. خطاهای ذاتیاين خطاها به پراکندگی غيريكنواخت سلول ها در نواحی مختلف اساليد مربوط است که با مخلوط نمودن کافی محلول پيش از پرکردن محفظه های اساليد نيز برطرف نمی شود.

فقط شمارش سلول ها به تعداد زياد می تواند اين خطا را کاهش دهد. جدول زير ميزان پراکندگی نتايج شمارش دستی گلبول های سفيد را در مقايسه با تعداد ميزان شمارش شده، سلول های تعداد افزايش با نشان می دهد. شمارش شده سلول های

پراکندگی نتايج کاهش می يابد.

جدول شمارة 16: ميزان پراکندگي شمارش دستي در مقايسه با تعداد کل سلول هاي شمارش شده

قطعيت نداشتن شمارش سلول ها در ميكروليتر

قطعيت نداشتن تعداد سلول های شمارش شده

تعداد سلول های شمارش شده

تعداد مربع هاي شمارش شده در هموسيتومتر

12/8 - 2/7 64 - 36 50 1 12 - 8 120 - 80 100 2

11/4 - 8/6 228 - 172 200 411/1 - 8/9 334 - 266 300 6 11 - 9 440 - 360 400 8

10/8 - 9/2 544 - 456 500 1010/6 - 9/4 856 - 744 800 1610/6 - 9/4 1064 - 936 1000 2010/6 - 9/4 1578 - 1422 1500 3010/2 - 9/8 10200 - 9800 10000 200

فصل سومروش های مرجع انجام آزمايش ها

63

1. Clinical Laboratory Diagnosis and Management by Laboratory Method; Henry, M.D.; 21th edition; 2006.

2. Practical Hematology; Dacie & Lewis; 10th edition; Churchill-Livingston; 2006.

3. Clinical Hematology Theory and Procedures; Mary Louise Turgeon; 4th edition; Lippincott Williams & Wilkins; 2004.

4. Blood Cells a Practical Guide; Barbara, J. Bain; 3th edition; Black Well Science; 2002.

5. Procedure for Determining Packed Cell Volume by Microhematocrit Method; Approved Standard; (CSLI) H7-A3-2006.

6. Guidelines on Standard Operating Procedures for Hematology-HTML Document ; Available from www.WHO.net; Chapter 6, 7 & 8.

7. Reference and Selected Procedures for Quantitative Determination of Hemoglobin in blood, (CLSI) H15-A3-2006.

8. Calibration and Quality Control of Automated Hematology Analyzers; Proposed Standard; (CLSI) H38-P-2006.

9. Quality Assurance in Hematology; WHO; 1998.

10. WHO/LAB/92.8.

11. WHO/LAB/98.3.

منابع

مظفر جباري

دآتر حسين غالمي

هنر خون گيری

يادگيری تکنيک های مورداستفاده برخورد مناسب وابراز درک متقابل بيمار

مهارت بردباریبرخورد ويژه درمقابل کودک

آودك زير يك سال

خونگيري از قسمت داخلي خارجي آف پا عمق سوراخ در پا ۴/٢

٣/١سوراخ در ناحيه ديستال انگشت عمق آن آمتر از - در دست

،فاصله بين سطح پوست ميليمتر ١/٣عمق سوراخ انگشت تاواستخوان

١/ ٢-٢/٢ميليمتر درکودکان اين فاصله برابر ٣/١حدود . ميليمتر،خونگيری ازاين محل ممنوع است

. محل خونگيری نبايدمتورم باشد ، قبال خونگيری نشده باشد

هنر خون گيری

آماده کردن محل خونگيری

)دقيقه ٣-۵(درجه ۴٢گرم کردن محل باپنبه مرطوب بادمای کمتراز

%٧٠تميزکردن محل با الکل

بتادين استفاده نشود( ← )باالرفتن مقادير شيميايی به طورکاذب

خشک کردن کامل محل خونگيری باگازاستريل

ايجادسوراخ درسطح پوست به وسيله النست اختصاصي

خشک نمودن قطره اول خون باگازاستريل

سانتيمتر ١واردکردن يک فشارماليم در

عقب تر از محل خونگيري آمك به بر قراري جريان خون

برداشتن فوری فشاربرای برقراری جريان خون دوباره

آماده کردن محل خونگيری

جمع آوری نمونه به وسيله لوله

تکرارمراحل برای جمع آوری نمونه مورد نياز

قراردادن پا ياانگشت کمی باالتر ازسطح بدن : درپايان نمونه گيری

وفشارآن بايک گازاستريل

فشارزياد سبب مخلوط شدن مايع ميان بافتی باخون ورقيق شدن آن می

.شود

خونگيری

برای نمونه های هماتولوژی

انگشت تميزوخشک جلوگيری ازتجمع توده های پالکتی درمحل ←

خونگيری

درموارد چندآزمايشی لوله اول جهت شمارش پالکت وگسترش ←

خون محيطی

اختالف خون وريدی وموئينه

شمارش -١ Hct ,Hb, RBC عروق موئينه کمتراز عروق وريدی

درنوزادان درجمع آوری نمونه ازپاشنه پا -٢ Hb بيشتری نسبت به

خون وريدی

g/dlدرساعت اول زندگی اختالف تاروزپنجم به ٣/۵ g/dl می ٢/۵

.رسد

شمارش پالکتی پايين تربه دليل چسبندگی پالکت به محل نمونه -٣

برداری درعروق موئينه

درنمونه گيری ازلب گوش شمارش باالی -۴ WBC درعروق موئينه

حالت آرامش دربيماروتکنسين -١

انتخاب بهترين وريد با بازرسی هردودست -٢

درشت تر واضح تروثابت تر درچين آرنج وريدها -٣

عدم استفاده از رگهای شبيه طناب که براثرتزريق يا نمونه برداری -۴

غلط دارای نسوج خراب هستند

منجر به خونمردگی جريان خون فقير پشت مچ وپشت دست -۵

ودردناك

تهيه خون وريدي

تدابيرالزم برای افزايش خون وريدي

ايجادانبساط دروريد به وسيله بستن تورنيکه درباالی بازو

مشت نمودن دست توسط بيمار، برجستگی وريد

ضربه زدن به سطح قدامی بازو برای کمک به جريان

به خوبی دربافت لنگر Median cephalicخون وريد انتخابی

.می اندازد ودرحين کارحرکت نمی کند

ماساژدست ازسمت مچ به طرف بازو

قراردادن وريد دروضعيت عمودی برا پرشدن کل ظرفيت آن از خون

ميليمتر جيوه ۴٠-۶٠درصورت بستن فشارسنج ،فشارخون بين

دربيمارمبتال به پلی سيتمی،بستن تورنيکه تازمان ورودسوزن وسايرموارد کمترازيک دقيقه

% ٧٠تميزکردن پوست باالکل

خشک شدن الکل روی پوست،جلوگيری از هموليزواحساس سوزش دربيمار

نكته مهم در خونگيري

ثابت نمودن وريد با شست دست چپ

سوزن از آن طرف وريد عبور نكند

اجتناب از آسپيره آردن شديد

سبب آالپس وريد هموليز خون

خون سريع تر از آنچه آه وارد وريد ميشود آسپيره نشود زيرا

.باعث آالپس رگ و قطع جريان خون مي شود

وريد هاي آوچك نمونه گيري در بچه ها و بزر گساالن با

٢٣يا٢١سوزن

٢٠ يا١٩نمونه گيري در بزرگساالن با سوزن

تخليه پر فشار خونتكان هاي شديد نمونه

هموليز

ليبل زدن به شيشه در ابتداي آار

فشار ندادن محل خونگيري سبب ايجاد هماتوم

تورم در حين خونگيري به علت عبورسوزن از وريد

در خونگيري وريدي در بچه هاي آوچك

بايد به محض ورود به داخل سرنگ

تورنيكت آزاد شود

جلوگيري از آالپس و اصالح جريان خون

Evacuated Tube

مناسب جهت نمونه گيري هاي متعدد

استفاده از لوله خال آوچك در بچه ها و افراد با

) جلوگيري از آالپس وريدي ( وريدهاي ضعيف

Isolation Techniques

: اهداف اصلي

.بيمار دچار عفونت مسري است - ١

روش هاي اختصاصي براي حفاظت بيماراز - ٢.پاتوژن ها

بيمار مبتال به بيماري مسري

استفاده تكنولوژيست از گان ماسك و دستكش پس از نمونه -١گيري تمام وسايل يكبار مصرف د ر يك ظرف اختصاصي

در اتاق بيمار قرار داده شود

در ايزوله حفاظتي دربيماران لوسمي ، سوختگي ، پيوند -٢

شستن دست ها قبل وبعد از خونگيري در هر دو نوع در -٣انتقاال توسط مايعات بدن عالمت گذاري همه لوله ها

Packed cell volume

.

.نسبت حجم گلبولهاي قرمز به حجم خون آامل ميباشدPCV

اصول آزمايش

ميباشد% ١خطاي اين روش

K2EDTA ضد انعقاد مناسب جهت آاليبراسيون

K3EDTA به علت ايجاد چروآيدگي در گلبول هاي قرمز

MCV آاهش و% ٢راMCHC را به همين ميزان افزايش ميدهند.

.ساعت پس از نمونه گيري انجام شود ٦آزمايش حد اآثر

١٨-٢۶و نگهداري در دماي خونگيري مويرگي؛وريدي وشرياني

مشخصات لوله

جنس از شيشه مخصوص

ميليمتر٧٥+ ـ٥/٠طول لوله

ميليمتر ٢/٠ضخامت جداره

٥٥/١ ـ+ ٠.٠٨۵اخلي قطر د

داراي باند آبي در يك انتها

مشخصات دستگاه ميكروسانتريفوژ

سانتيمتر٨شعاع چرخش بيشتر از

ثانيه به حداآثر سرعت برسد ٣٠در عرض

RCF هزار ١٥-١٠حدودg دقيقه بدون ٥در محيط بمدت حداقل

.درجه رادارا باشد ٤٥افزايش دمااز

با قابليت تنظيم حداقل (.داراي زمان سنج اتوماتيك باشد

) ثانيه٣٠

روش آزمايش

ميانگين ودامنه مرجع

مردان )٠.٤-٠.٥٤( ٠.٤٧

زنان )٠.٣٧-٠.٤٧(

٠.٤٢

منابع خطا

خطاهاي نمونه گيري

هاي لولهاخط

خطاي خواندن

خطاي بدام افتادن پالسما

بدام افتادن پالسما–هيپو ناترمي :افزايش آاذب

هيپرناترمي-هموليز-ضد انعقاد اضافي:آاهش آاذب

آاليبراسيون

روش آاليبراسيون

صحت سرعت

صحت زمان سنج

صحت حداآثر توان تجمع سلولي

بررسي صحت خط آش

آا ليبراسيون سمپلر

استفاده از روش رنگ سنجي به آمك محلول رنگي با جذب پايدار در طول زمان

۶٢٠-۶٣٠آاربرد رنگ سبز خوراآي در طو ل موج تقسيم سمپلرها به دو گروه

l µ و ١٠-١٠٠l µ ١٠٠ -١٠٠٠.تهيه يك محلول ذخيره سبز خوراآي براي هر گروه

µ l 100-10گروه

155 mg 100رنگ سبز درmlآب مقطر

1/101رقت نهايي

0.4جذب حدود

گروه 100-1000 µ l

15.5 mg100آب پودر رنگ د رml 1/11رقت نهايي

0.4جذبي حدود آمترين0.4اسپكترو فتو مترها در محدوده جذب

. خطاي عملكردي را دارند

آنترل دقت .لوله چيده ١٠ -١

.انتخاب محلول ذخيره رنگي متناسب با حجم سمپلر -٢

.ريختن آب مقطر با دقت بسيار زياد به داخل لوله ها -٣

ريختن محلول ذخيره رنگي با سمپلر مورد آنترل به لوله ها-۴

لوله در مقابل آب مقطر١٠قرائت جذب نوري -۵

‚در صورت انتقال صحيح حجم آب -۶

اختالف در جذب نوري لوله ها مربوط به اختالف در حجم رنگ

.انتقالي توسط سمپلر است

١٠-١٠٠روش آنترل دقت سمپلرهاي

) ١٠١/١( سبز ) Aآالس ( آب مقطرنوع سمپلر

cc ١ l µ١٠ l µ ١٠

cc ٢ l µ ٢٠ l µ ٢٠ cc ۵/٢ l µ ٢۵ l µ ٢۵ cc۵ l µ ۵٠ l µ ۵٠ cc ١٠ l µ ١٠٠

١٠٠-١٠٠٠روش آنترل دقت سمپلر هاي

نوع سمپلر) ١١/١( سبز Aآ ب مقطر آالس cc ١ l µ ١٠٠ l µ ١٠٠

cc ٢ l µ ٢٠٠ l µ٢٠٠ cc ۵/٢ l µ٢۵٠ l µ ٢۵٠

cc ۵ l µ۵٠٠ l µ۵٠٠ cc ١٠ l µ١٠٠٠ l µ ١٠٠٠

مقدار عدم تكرار پذيري در سمپلر

%٣حداآثر خطاي عدم دقت قابل قبول

خوانده معرف ١٠بين CVمحاسبه

آنترل صحتبايد بتوان به درستي محلول رنگي ذخيره را با ضريب مربوطه رقيق

.نمود

Aپي پت آالس : تجهيزات

Aبالن ژوژه آالس

سمپلر مورد آنترل

:روش آار

) بر حسب ضريب رقت مورد نظر( مقداري از محلول رنگي

بالن ژوژه محتوي آب مقطر بعالوه

١٠-١٠٠آنترل صحت سمپلر هاي

آب مقطرcc١٠٠محتوي Aبالن ژوژه آالس

cc از ماده رنگي با غلظت ١mg-dl١۵۵

است ١٠١به ١رقت به دست آمده

ODاندازه گيري

١٠٠-١٠٠٠آنترل صحت سمپلر هاي

آب مقطر١٠٠ ccمحتوي Aبالن ژوژه آالس

cc از ماده رنگي باغلظت ١٠dl/mg ١۵.۵

١١به ١ رقت به دست آمده

ODاندازه گيري

Bias% = در صد عد م صحت

جذ ب نوري با لون ژوژه

)جذب واقعي (جذ ب در با لون )جذ ب به دست امده ( جذب لوله ها ١٠٠x

-

در صورت عدم صحت غير قابل قبول با مراجعه به راهنما .تصحيح حجم صورت مي گيرد

.آنترل درستي تنظيم با آنترل مجدد سمپلر

ايمني

خروج از آاليبر اسيون ←ضربه به سمپلر -١

انتخاب حجم مناسب ←انتخاب سر سمپلر مناسب -٢

عدم تماس دست با نوك سمپلر آلوده -٣

بخش ) اسيدي (در مكش محلول هاي با خاصيت خورندگي -۴باز و شسته شود Tip-holderنگهدارنده سر سمپلر

قرار ندادن سمپلر پر به پهلو زمين-۵

سمپلرهاي متغيير بر روي حجم خارج از محدوده ادعايي تنظيم -۶نشوند

Measurement of Blood

Hemoglobin using

Hemiglobincyanide(HiCN) Method

) همي گلوبين(ابتداآهن هموگلوبين توسط فري سيانيد پتاسيم اآسيده شده

سپس همي گلوبين توسط سيانيد پتاسيم تبديل به همي گلوبين سيانيد

.ميشود

واآنش در حرارت اتاق

دقيقه يا آمتر ۵زمان الزم براي ايجاد واآنش

pH=7-7.5

مواد ، وسايل وتجهيزات

آليه وسايل شيشه اي مثل پي پتهاولوله ها استاندارد وآاليبره

.از لحاظ شيميايي تميز باشند

معرف حاوي فري سيانيد پتاسيم وسيانيد پتاسيم

.انها ليز گليول هاي زمان واآنش را آم ميكنندژدتر

اسپكتروفتومتر آاليبره

استانداردهموگلوبين

معرف

KCN 0.05g

K3Fe(CN) 6 0.2g

KH2PO4(Anhydrous) 0.140g

Detergent 0.5-1ml

Reagent water(Type 1) 1000ml

مشخصات معرفمعرف حاوي فري سيانيد پتاسيم وسيانيد پتاسيم

شفاف وزرد رنگ

دقيقه يا آمتر ۵زمان الزم براي ايجاد واآنش

.انها ليز گلبول هاي قرمزورسوب پروتئين ها را افزايش مي دهندژدتر

. نانومتر جذب نوری ندارد۴٨٠در طول موج بيشتر از

.در صورت آدورت دور ريخته شود

.هرماه بصورت تازه تهيه شود

Reference Method Macrodilution

ميلي ليتر معرف ٢۵ميكروليتر خون با ١٠٠ميلي ليتر ١٠٠ميلي ليتر خون با ۵/٠يا ٠/۴

معرفميلي ليتر معرف١٠ميلي ليتر خون با ٠/٠۴

غلظت هموگلوبين نمونه با استفاده از جذب نوري نمونه در

نانومتر در مقابل بالنك با آمك جذب ۵۴٠طول موج

نوري و غلظت استانداردو يا با آمك منحني استاندارد

.محاسبه ميشود

واحد اندازه گيري گرم در ليتر

تداخالت

Lipoproteinemia

Lipemia

WBC > 20×109

Plt > 700×109

Hb S

خطا ها

خطا هاي نمونه گيريخطا هاي روش انجام آزمايش

خطا هاي مربوط به مواد و تجهيزاتخطا هاي آزمايشگر

اسپكتروفتومتر

اساس اندازه گيري .سنجش شدت نور عبور آرده از يك محلول در طول موج مشخص

gratingانتخاب طول موج با منشور يا : اسپكتروفتو مترانتخاب طول موج با فيلتر: فيلتر فتو متر قانون بير المبرت با مقدار نور جذب شده مستقيمغلظت محلول نسبت

با لگا ريتم نور عبور آرده بر حسب درصد معكوسنسبت

المبرت-آاربرد قانون بير

باشد منوآروماتيكنور منتشره بر روي ما ده مورد نظر -١.غلظت ماده حل شده در محدوده خطي باشد -٢.در مقايسه با ماده حل شده ناچيز باشد ) بالنك(جذ ب حالل -٣واآنش شيميايي ديگري بين ماده مورد نظر و ساير مواد -۴

.موجود در محلول صورت نگيردمحدوده اي از طول موج انتخا ب گردد آه در آن بيشترين -۵

.جذب حاصل شود

اجزاء اسپكتروفتومتر منبع نور -١

) enterance slit(شيار ورودي -٢

منو آروماتور -٣

شكاف خروجي -۴

(Analytical cell)آووت -۵

(Detector)دتكتور -۶

صفحه نمايشگر -٧

ويژگيهاي منبع نور

داشتن انرژي تابشي با ثبا تي در طيف مرئي وغير مرئي

)ترجيحاهالوژنه(ايجاد طيف نورمرئي بااستفاده ازالمپ تنگستن

ايجادطيف ماوراء بنفش به وسيله المپ هيدروژني ، دوتريوم ،

المپ قوس جيوه وگزنون

آنترل المپ ها درفواصل زماني مشخص

به علت اشكال ( تعويض المپ درصورت ناپايداري ميزان جذب )المپ

براي رسيدن ( تنظيم سيستم نوري بعد ازهرتعويض المپ )حداآثرميزان نور پس ازعبورازآووت به فتوسل

ويژگيهاي شيار ورودي

( Stray light)آاهش دهنده نورمزاحم وپراآندهجلوگيري ازپخش نور وارد شده به منوآروماتور

:نكتهStray light نبايدواردآووت شود زيرادرآن صورت قانون

. المبرت صدق نمي آند -بير

منوآروماتور

وسيله اي براي جداآردن طول موج د لخواه از امواج تابيده شده توسط منبع نور وهدايت آنها به سوي آووت

استفاده از فيلترهاي تداخل خاص: منوآروماتوردرفتومتر -١

استفاده از منشور ويا : منوآروماتور در اسپكتروفتومتر -٢grating

آووت

مفظه شفافي براي ريختن محلول مورداندازه گيري

درمحل ثابت

درمسير طيف جدا شده

داراي شكل و حجم متغيير بنابر نوع مصرف

در انواع چهار گوش و استوا نه

Analytical Cellاستفاده از شيشه نرم: براي محلول هاي اسيدي -١

استفا ده از بوروسيليكات: براي محلول ها ي قليايي -٢

استفاده از لوله هاي آوارتز يا پالستيك: ٣٢٠براي طول موج زير -٣

SOGعموما استفاده از -۴

Detectorنورسنج يا

وسيله اي براي تبديل انرژي نوراني عبور آرده از محلول به انرژي الكتزيكي

تقويت آننده نورعبوري به ميزان قابل توجه

صفحه نمايشگر

نشان دهنده مقدار نور عبورآرده ازمحلول

ميزان جذ ب متناسب با نور عبوري

نتيجه نهايي

تلويزيوني صفحه ، د يجيتالي، عقربه ايداراي انواع مختلف

S B W – Spectral Band Width

.نور ساطع شده از اسپكترو فتومتر آامال منوآروماتيك نمي باشد

SBW :ميزان منوآروماتيك بودن را نشان مي دهد.

SBW : طيفي از طول موج منتخب است آه از شيار خروجي

.سيستم به آووت تابيده ميشود

.توسط آارخانه سازنده تعيين مي شود

نانومتر انتخاب شود ٨-١٠بهتر است در آزمايشگاه حدود

Nominalطول موج اسمي

داراي حداآثر شدت تابش نور -١درمرآز طيف همان طول موج انتخابي وتنظيم شده در هنگام -٢

آار بادستگاه: مثال

SBW=10 اسپكتروفتومترnm 520درصورت انتخاب طول موج

± 520طيف نوري ساطع شده درمحدوده - 515يعني 5525nm

آنترل آيفي اسپكتروفتومتر

Linearityخطي بودن -١

صحت فتو متريك -٢

صحت طول موج -٣

آ زمون پايداري يا رانش فتو متري -۴

Stray Lightsانوار ناخواسته -۵

خطي بودن

.تعيين محدوده اي از جذ ب آه متناسب با غلظت است -١

.نمايش قابليت دستگاه در تبعيت از قانون بير و المبرت -٢

به موازات افزا يش غلظت محلول جذب نوري نيز بايد به -٣

.همان نسبت افزايش يابد

محلول هاي آنترل خطي بودن

۵١٢–سولفات آمونيوم آبالت -١

۴٠۵پارا نيترو فنل -٢

۶۵٠سولفات مس -٣

۵۴٠سيان مت هموگلوبين -۴

٢۵٧، ۶٣٠،۴١٠سبز خوراآي -۵

٣۵٠دي آرومات پتاسيم -۶

داراي رنگ پايدار و عملكرد خطي در محدوده جذبي مورد آنترل -

محلول دي آرومات پتاسيم

1hبه مدت Oven -١١٠قرار دادن پودر دي آرومات در

mg-100پودر +نرمال ٠.٠١اسيد سولفوريك

ليتر ١حجم نهايي

.محلول استوك در شيشه تيره نگهداري شود

.صفر شود 350nmنرمال 0.01اسيد دستگاه بايد قبل از آار با

.تهيه آرده mg 100-10از محلول استوك ر قت هاي

جذب نوري محلول ها را با جذ ب نوري مورد انتظار مقايسه مي .آنيم

جذب مورد انتظار 50mg /Lغلظت ODبا توجه به .ساير غلظت ها محاسبه مي شود

Bias=expected Observed -

x100expected

صحت فتو متريك )آنترل ماهيانه (

بررسي حد اآثر جذ ب نوري به مقدار مشخص در طو ل موج خاص

:وابسته به توانايي المپ اسپكتروفتومتر در ارائه حداآثر تابش فتو -

الكتريكSBW -

نوع وآيفيت منو آروماتور -

سنجش صحت فتو متريك با دي آرومات پتاسيم

درجه ١١٠ساعت در ١–دي آرومات 50mgبيش از

50mg 1 +دي آرومات خشكlit0.01اسيد سولفوريكN

350nmدر 0.01Nصفر آردن اسپكتروفتومتر با اسيد

در صورت صحت فتو متريك نمايش جذب

0.536 ± 0.005

سنجش صحت فتو متريك با محلول سولفات آمو نيوم آبالت

14.481 g 10+ از اين ماده cc اسيد سولفوريك غليظآب مقطر Lit 1تا حجم

جذب نور ي در طول موج هاي مختلف400nm -0.012450nm -0.077500nm -0.163550nm -0.077

صحت طول موج

به منظور اثبات ادعاي سيستم در تاباندن طول موجي است آه

.دستگاه براي آن تنظيم شده

روش هاي آنترل صحت طول موج

صحيح ترين راه جايگزيني منبع نوري معمولي با منبع -١

نوري ديگري با حداآثر تا بش نوري در طو ل موج هاي

.مشخص

-313-405-436-546المپ جيوه باتابش قوي در 365nm

686nm-656داراي خطوط تابشي در المپ دو تريوماستفاده از فيلتر هاي شيشه اي

Didymium ,Oxide, Holmium داراي قله هاي جذ بي مشخص) اآثرا فاقد چنين ا مكا ناتي(در طول موج خاص

محلول ها ي رنگي داراي حداآثر جذب نوري در طول موج هاي مشخص

0.01Nدر اسيد سولفوريك 50mg-Lبا غلظت : آرومات پتاسيم دي270nm-350 حداآثر جذب در

– NaOH 0.01 Nدر 0.04mM-Lبا غلظت : پارا نيترو فنل nm 405حداآثر جذب در

درابكين حد اآثر 5ccخون و µl 20: سيان مت همو گلو بين 540nmجذب در

روش سيان مت همو گلوبين

محلول درابكين به عنوان بالنك

550nm 545-540-535-530قرائت جذب نوري محلول در

.صفر آردن دستگاه پس از هر تغيير طول موج

.رسم منحني بر اساس طول موج و ميزان جذب

در صورت صحت طول موج در طيف مرئي منحني زنگوله 540nmاي با حداآثر جذب در

طيف ماوراء بنفشآنترل صحت طول موج در دي آرومات پتاسيمبا استفاده از

با استفاده از طيف مرئيآنترل صحت طول موج در سيان مت هموگلوبين و پارا نيترو فنلمحلول هاي

.طول موج ضروري است ٣آاليبراسيون در

)drift(آزمون پايداري يا رانش فتو متري

.صفرآردن دستگاه با درابكين -١ ريختن سيان مت همو گلوبين در آووت و بستن دها نه آن -٢

.با پارافيلم دقيقه يكبار به مد ت يك ١٠-١۵نوشتن جذب نوري هر -٣

.ساعت در ساعت قابل قبول است ±٠٠۵/٠حداآثرتغيير -۴

.فرسودگي شديد منبع نوري مي باشد driftعلت اصلي

Stray Lightانوار نا خواسته

وجود طول موج ها ي نا خواسته اي آه از منو آرو ماتور خارج مي شوند

.

اندازه گيري درصد عبور نور – Stray Lightتعيين و % ١٠٠از درون ماده اي با جذ ب نوري

%٠ترانس ميتانس .علت عبور نور وجود طيف نا خواسته است

روش ارزيابي انوار نا خواسته stray lightمحلول هاي اندازه گيري

طول موجمحلول

12g/L175-200 nmآلريد پتاسيم

10g/L195-223 nmبرميد سديم

10g/L210-259 nmيديد سديم

nm 320-250استون

50g/L300-385 nmنيتريت سديم

عبور نور قرار دادن محلول مورد نظر در مسير

Transmitans = 0%

Stray Lightهر گونه قرائت جذب مربوط به

دستگاه هاي شمارشگر سلولي اتوماتيك

اساس آار

آاليبراسيون

تصديق آاليبراسيون وآنترل آيفي

خطا ها

تهيه شناسنامه

اساس آار

Electrical Impedance

شمارش وتعيين اندازه سلول ها با استفاده از مقاومت الكتريكي

Light scattering

شمارش وتعيين اندازه سلول ها با استفاده از ميزان پراآندگي نور توسط سلول ها

اندازه گيري هموگلوبين به روش سيان مت هموگلوبين

ارتفاع (شمارش سلول هاي خوني با استفاده از حجم سلولي) پالسها

با استفاده از ميانگين ارتفاع پالسهاي ولتاژ در MCVتعيين هنگام شمارش گلبول هاي قرمز

با استفاده از شمارش گلبول MCHCو HCT ،MCHمحاسبه MCVهاي قرمز و

روش امپدانس

روش پراآندگي نور

اندازه گيري هموگلوبين به روش سيان مت هموگلوبين

از طريق مقايسه RDWو PCV ،MCV اندازه گيري ميزان پراآندگي نور توسط گلبول هاي قرمز در زواياي

مختلف

ازطريق محاسبه با استفاده از MCHCو MCHاندازه گيريMCVو Hb ،RBCمقدار

RDW

پهناي توزيع گلبول هاي قرمز با استفاده از شمارش گلبولهاي .قرمزاندازه گيري و ميانگين گرفته مي شود

%١١/ ۶ -% ۶/١۴دامنه طبيعي

پايين MCVطبيعي و RDWتاالسمي هتروزيگوت

پايين MCVباالو RDWآمبود آهن

آاليبراسيون

آاليبراسيون

استفاده از خون آاليبراتورخون طبيعي تازه و اندازه گيري ١٠-٢٠استفاده از

پارامترهاي خوني به روش مرجع دستي و مقايسه آنها با داده هاي دستگاه

CF =ميانگين روش دستي

١٠٠x- ميانگين روش دستگاهي

ميانگين روش دستگاهي

تصديق آاليبراسيون

نمونه و اندازه گيري ۵-١٠اندازه گيري پارامترهاي خوني مجدد آنها روز بعد ومقايسه داده ها با استفاده از فرمول

T-Brittinآماري

T= ×√ nd

SD

آنترل آيفي

استفاده از خون آنترل در هر سري آاري

رسم نمودار آنترل آيفي بااستفاده از خون آنترل

بررسي مقايسه روش دستگاهي با روش دستي

MCV,MCHوMCHCاستفاده ازميانگين داده هاي بيماران مانند

Delta checkاستفاده از

Duplicate tests-Check testsاستفاده از

بررسي ميران عدم دقت دستگاه

خطاها

افزايش آاذب هموگلوبين

تعداد بسيار زياد لكوسيت

هايپر ليپيدمي

پاراپروتئين ها يا هايپرگاماگلوبولينمي

آرايوگلوبولينمي

-نيز مي MCHC,MCHاين خطاها باعث افزايش خفيف (.)گردند

شمارش گلبول هاي قرمز

:آاهش آاذب

گلوتينين هاي سردآ -

EDTAآگلوتيناسيون با واسطه -

ليز -

گلبول هاي قرمزغير طبيعي-

ميكروسيتوز شديد –

شيستوسيت -

:افزايش آاذب

) ٣٠×١٠/ليتر(تعداد لكوسيت باال -

پالآتهاي بزرگ -

آرايوگلوبولينمي وآرايو فيبرينوژنمي -

٩

ميزان هماتوآريت

:آاهش آاذب

MCVآاهش آاذب -

آاهش آاذب گلبول هاي قرمز -به دليل ميكروسيتوز شديد يا ليز يا

آگلوتينين سرد

:افزايش آاذب

MCVافزايش آاذب -

افزايش آاذب گلبول هاي قرمز -

MCVميزان

:آاهش آاذب

گلبولهاي قرمزهيپوآروميك -

شرايط هايپواسموالريتي -

:افزايش آاذبنگهداري نمونه به مدت طوالني در

دماي اتاقآگلوتينين هاي سرد -EDTAآگلوتيناسيون با واسطه -

شمارش زياد لكوسيت ها -شرايط هايپراسموالريتي -افزايش غلظت گلوآز خون -K2EDTAافزايش غلظت -

شناسنامه سل آانترنام وآدرس آزمايشگاه

شرآت پشتيباننام وآدرس

مدل وشماره سريال دستگاه

تاريخ شروع به آارونصب دستگاه

همشخصات فرد راه اندازي آنند

مشخصات اپراتور

مشخصات مواد مصرفي دستگاه

تاريخ آخرين تعمير با ذآر قطعه تعويض شده

تاريخ آخرين مشكل وراه حل آن