实验四 进行性肌营养不良症( DMD) 基因检测
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实验四 进行性肌营养不良症(实验四 进行性肌营养不良症( DMDDMD ))基因检测基因检测
• 进行性肌营养不良症 (Duchenne muscular dystrophy , DMD) 是肌肉组织的遗传病,特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。
• 本病呈 X 连锁隐性遗传,一般男性儿童发病。
Genetics of DMD OMIM# 310200Genetics of DMD OMIM# 310200
• occurring in about 1 in 3500 males, • X-linked recessive, lethal in males, • 1/3 of patients are new mutants;• 2/3 have carrier mothers, • Gene location Xp21, • large gene (more than 2000 kb), 79 exons. • High mutation rate, 60% to 65% of the
mutations are deletions, and about 6% are duplications ,
• Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy.
Duchenne Muscular Dystrophy, DMD
• DMD 基因定位于 Xq21.2-21.3 之间, 79 个外
显子组成,编码 3685 个氨基酸、分子量为 42
7 kD 的蛋白质一抗肌营养不良蛋白
(dystrophin) ,这种蛋白具有稳定细胞膜和细
胞内钙调节的功能。
• 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式, 60 %是外显子缺失突变,通常选择DMD 基因中 9 个缺失热点的外显子扩增,可检出缺失突变中的 90% 。
• 本实验设计为扩增 DMD 基因中 4 个外显子,其中外显子 45 和 48 在中国患者中的检出率分别为 26% 和 48% 。
DMD 基因 4 个外显子的引物顺序见表:
外显子 PCR 产物大小 引物 F 引物 R
8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag
19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc
45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac
48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac
聚合酶链反应( polymerase chain reaction, PCR )是一种体外由引物介导的特定 DNA 序列的酶扩增方法,由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性,近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为 DNA 模板热变性,双链 DNA 解链成单链;在低温下与引物退火,引物与单链 DNA 互补配对;在适宜温度下 Taq DNA 聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环,循环 25-35 次,模板DNA 可扩增 100 万倍左右,整个反应可在 2 到 3 小时内完成。
PCR操作如下:
每一个薄壁离心管中加入试剂的量为:(反应总体积为 25l ):
双蒸水 17.8 l
10XBuffer 2.5 l
MgCl2 2 l
dNTPs 0.5 l
Primer R+F ( 混合 ) 1.4 l
DNA 模板 0.5 l
Taq-DNA 聚合酶 0.3 l
石蜡油 1滴
放置在 PCR循环仪上,循环参数设置为:
Step 1 (1个循环 ) 94C 5分钟
Step 2 (30个循环 ) 94C 30秒
56C 30秒
72C 30秒
Step 3 (1个循环 ) 72C 7分钟
琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis ):
① 配制 2% 的琼脂糖凝胶
配制 1×TBE 电泳缓冲液 70ml 于三角烧瓶中,称取 1.4 克的琼脂 糖粉放入后,微波炉加热熔化 , 冷却至 60℃,加入溴乙锭 (EB) ,倒入电泳槽中,插入梳子,待凝固。
② 向电泳槽中倒入 1×TBE ,没过胶面 2mm ,小心移去梳子。
③ 取 PCR 扩增样品 15l 加入 3l 的 6× 载样缓冲液,混匀后,加入样品孔内。
④ 接通电源,一般红色为正,极黑色为负极,切记 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负 )。 140V ,电泳 2 小时左右。
⑤ 卸下凝胶,于紫外仪上观察电泳条带,并与核酸分子量标准PUC19/Msp (marker)Ⅰ 比较。
10l PCR 产物
混匀
加样
电泳(140V,2hr)
紫外灯下观察
2 l 6*loading buffer
注意事项:
1 、引物设计时长度 15~ 30 个碱基为宜, G+C含量一般为 40%~ 60% 。
2 、退火温度决定 PCR 反应的特异性,退火温度高 PCR 反应的特异性好;温度低,有时会有非特异性条带。
3 、 Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响, Mg2+浓度低,扩增产物的特异性好,但有时产量低; Mg2+浓度高,扩增产物的特异性差,有非特异性条带。
4 、 PCR 循环的次数主要取决于模板 DNA 的浓度。理论上 25-30 次循环后, PCR 产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。