生物技术综合实验Comprehensive experiments of bio

technology

主要内容 Contents ：一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction四、 DNA 序列测定 DNA Sequencing五、分子杂交技术 Molecular Hybridization － Southern,Northern and Western Blot六、基因文库和 cDNA 文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。 杂交是指亲源关系相近的不同来源的 DNA 单链或 DNA 单链与 RNA 单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下 ( 适宜的温度及离子强度等 ) 可按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。

Part 5 分子杂交 Molecular Hybridization (DNA,RNA & protein)

杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组 DNA 和细胞总 RNA 。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交 ( 膜上印迹杂交 ) ，也可直接在细胞内进行 ( 细胞原位杂交 ) 。

用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe) 。为了便于示踪（检测杂交信号），探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性核素，近年来也发展了一些非放射性标记物。

由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方

法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术在分

子生物学领域中被广泛应用于：基因克隆的筛选基因表达水平的定性和定量检测基因组中特定基因序列的定性和定量检测基因突变分析疾病的诊断

核酸分子探针的标记 ：放射性标记、非放射性标记

核酸分子杂交：膜上印迹杂交、液相杂交、原位杂交

本部分重要内容

在化学及生物学意义上的探针 (probe) ，是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可以被特殊的方法所探测。 例如抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、激素—受体等的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。

一、核酸分子探针的标记 (labeling of probe)

（一）概述

所谓核酸分子探针则是指特定的已知核

酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，然

后用特定的方法进行杂交信号的检测。从而

可以用于待测核酸样品中特定基因序列的

探测。

探针的选择与特异性 核酸探针分为两种类型： 克隆探针与合成的寡核苷酸探针 克隆探针序列较长、复杂性大。随机性小，特

异性高 合成的寡核苷酸探针相对较小， 18-50bp ， G,

C 含量在 40-60% 之间，探针内不含互补区，探针内不含一个碱基的多次重复（长度 4 ）如 GGGGG 等。

（二）探针的种类

根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为： 基因组 DNA 探针 cDNA 探针 RNA 探针 人工合成的寡核苷酸探针 根据研究目的不同，可以采用不同类型的核酸探针。探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结果的分析。

要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物 ( 即标记物 ) 进行标记。 核酸分子探针的标记是核酸分子杂交的基础。

（三） 各种标记物及其选择

① 检测方法要有高度灵敏性，同时应具有高度特异性，尽量减低假阳性率。

② 标记物与核酸探针分子的结合，应不影响探针分子的主要理化特性，特别不应影响杂交特异性和杂交稳定性；

1. 理想的探针标记物，应具备以下几种特性

④ 标记反应的效率和标记产物的比活性应较高；

⑤ 如果要求更严一些，它还应具有较高的化学稳定性，

保存时间较长，标记及检测方法简单；对环境无污

染，对人体无损伤；价格低廉等。

优点：放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，因此对各种酶促反应无任何影响，也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质。另外放射性同位素的检测具有极高的特异性，极少出现假阳性结果。

2. 几种常见的探针标记物 （ 1 ）放射性同位素

主要缺点：易造成放射性污染；不够稳定（有半衰期）。

放射性同位素与相应的元素具有完全相同的化

学性质，是因为二者之间的差别只在中子数目上，质子和电子数完全一致，而元素的化学性质是由其核外电子决定的， 例如： 32p 、 35S 、 3H 、 125I 等。

优点：无放射性污染、较稳定（可以较长

时间保存，从而更便于临床诊断应用）。

缺点：灵敏度和特异性都不太高。

（ 2 ）非放射性标记物

荧光素：异硫氰酸荧光素（ FITC ）、罗丹明类等。

半抗原：生物素、地高辛等。

化学发光类：如 Lightsmith LuminescenⅡce Engineering System (Promega)

光密度或电子标记物：如金、银等。

3 根据检测方法不同分以下几种

1.双链 DNA 探针的标记

（ 1 ）切口平移法 (nick translation)

（ 2 ）随机引物法 (Random Primer Labeling )

（ 3）末端标记法 (terminal labeling)

（四）探针的放射性同位素标记

2. 单链 DNA 探针的标记（采用 DNA polymeraseⅠ Klenow片断催化合成）

3.cDNA 探针的标记（反转录合成）

4.RNA 探针的制备与标记（采用 RNA聚合酶 合成）

RNA 探针的制备与标记 -T7/SP6 polymerase system

.

T7 promoter

Inserted gene

linearized

Transcription start site

T7 or SP6 RNA polymerase, NTP, [–32p]-UTP, ~CTP

DNase

–32p labeled RNA probe

cDNA 探针的标记

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

Poly(A) mRNA

Oligo(dT) or Random Primer

AMV, [–32p]-dNTP , dNTP

RNA/DNA hybrid

Denature, isolation by Sephadex G-50

cDNA 探针的标记

. AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

TTTTTTTTT

Oligo(dT) or Random Primer

AMV, [–32p]-dNTP , dNTP

Denature, isolation by Sephadex G-50

Poly(A) mRNA

RNA/DNA hybrid

单链 DNA 探针的标记

.

M13

Inserted gene

Universal primer or downstream primer

Klenow fragment [–32p]-dNTP

Restriction endonuclease

Denature

isolationSingle strand DNA probe

切口平移法 (nick translation labeling)

5’

5’3’3’

5’

5’

5’

5’

3’3’

3’3’

DNA polymerase I, [–32p]-dNTP

denature

DNase I, Mg2+

切口原始位置切口最终位置

随机引物法 (Random Primer Labeling )

5’

5’3’3’

5’

5’3’

3’

Klenow DNA polymerase [–32p]-dNTP

denature

denature

Random Primer

5’3’

末端标记法 (terminal labeling)

5’ dsDNA

Restriction endonuclease

Klenow DNA polymerase –32p-dNTP

denature

5’

5’

5’

5’

5’3’

3’3’

Cloning a segment of DNA into a plasmid vector

• bacteria are “transformed” with the recombinant plasmid• colonies that grow in tetracycline, but not in ampicillin are isolated

PstIHuman DNA cut with PstI

P

P

pBR322 ampR, tetR

pBR322 (human clone) tetR

P

P

ampR tetR

pBR322 DNA cut with PstIinactivating the ampR gene

tetR

tetR

combineand

ligate

按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有两种类型：1. 标记物预先已连接在 NTP或 dNTP上，因此可像放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等；2. 标记物直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上。此后一类标记物标记过程更为简单，可能是今后研究发展的主流。

（五）探针的非放射性标记法

膜上印迹杂交 液相杂交原位杂交

二、核酸分子杂交

其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交，然后洗去未杂交的游离的探针分子，最后检测杂交信号。 由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。

（一）膜上印迹杂交

1.印迹技术

印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定的固相支持物上的方法，这些结合在固相支持物上的核酸分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。 选择良好的固相支持物与有效的转移方法是此项技术成败的两个关键因素。

一种良好的固相支持物应具备以下几个特性：① 具有较强的结合核酸分子的能力，一般要求每平方厘米结合核酸分子的量不应低于 10ng，最好能达到数十微克；

② 与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；③与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落或脱落极少；

1.1 固相支持物的选择

④非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；

⑤ 具有良好的机械性能，如柔软性好、韧性强等，以便于操作。

以下介绍最常用的几种固相支持物。

(1)硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) ：优点：杂交信号本底较低 ;

非特异性地吸附蛋白质的作用较弱，因此特别适合于那些涉及蛋白质作用 ( 如抗体和酶等 ) 的非放射性标记探针的杂交体系。

因为硝酸纤维素膜是依靠疏水性相互作用结合 DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜的进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素膜，特别是高温情况下，从而使杂交效率下降。因此不太适宜于在同一膜上重复进行杂交。再者，硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后，操作不方便，须特别小心。

缺点：

(2)尼龙膜 (nylonmembrane) ： 尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰。这种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。

结合核酸的能力强，对于小分子量 DNA 片段 ( 特别是 <200bp 的 DNA 片段 )现在更多的人倾向于使用尼龙膜。 尼龙膜可重复用于杂交，一次杂交后，探针分子可经碱变性而被洗脱下来，从而可用于与第二探针进行杂交。缺点：杂交信号本底较高，可以用加大预杂交液中的非特异性封闭试剂的方法克服。

优点：

(3) 化学活化膜 (chemical activated paper) ：将滤纸用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜 ( 如 ABM和 APT纤维素膜 ) 。

优点：① DNA 与膜共价结合，因此反复多次使用不会有太多的损耗；②对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力，这是硝酸纤维素膜及尼龙膜都不具备的。 但其结合能力一般较硝酸纤维素膜要低，活化过程较复杂，因此较少为人们所使用。

1.2 印迹方法

印迹的方法有多种：①可直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点

或狭缝印迹法；②利用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转

移到固相支持物上；③利用电场作用的电转法；④利用真空抽滤作用的真空转移法。

Southern 印迹法是指将电泳分离的 DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程。 Northern 印迹法则是指将电泳分离的 RNA 从凝胶中转移到固相支持物上的过程。

根据待检测的核酸类型不同，分为 Southern 印迹法和 Northern 印迹法。

1.3 固 -液相杂交技术

在固相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶 DNA自我复性等优点，所以比较常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

1.3 固 -液相杂交技术

（ 2 ）杂交体系的建立

（ 1 ）基本原理

双链 DNA 在一定的条件下 ( 适宜的温度及离子强度等 )变性，具有一定同源性的两条核酸单链可按碱基互补原则退火复性形成双链的过程。

（ 1 ）离子强度：一般杂交体系中离子强度为 5×或6×SSC(1xSSC 为 0.15mol/L NaCI 和 0.015mol/L 柠檬酸钠 ) 。 （ 2 ） DNA浓度： DNA浓度愈高，复性速度愈快。为保证足够的 DNA浓度，除应加入足够的 DNA 量外，还应尽量减少杂交体积，一般以每平方厘米滤膜面积加 50-100μl杂交液为宜。

建立杂交体系应考虑到以下几个因素：

（ 3） DNA 探针的长度：探针片段越大，其扩散的速度越慢，因此复性的速度越慢。

（ 4 ）温度：选择适当的杂交和洗膜温度是核酸分子杂交成败最关键的因素之一。通常杂交反应在低于 Tm值 15-25℃温度下进行。 Tm值除受 (G+C)含量影响外，还与杂交体系中离子的强度，探针的复杂性 ( 长度 ) 、是否含甲酰胺及错配率等多种因素影响。准确确定 Tm值是比较困难的，也无必要。

Tm=81.5 +16.6lgM+0.4l(G+C)℃ ％ -500/n-0.6

1(甲酰胺％ )

其中 M 为 Na+摩尔浓度， n 为探针的复杂性（没有重复序列时，复杂性即为探针的长度，单位为 bp ）。

以下经验公式对于帮助判断 Tm值很有用处：

预杂交 杂交洗膜 杂交信号检测

（ 3）操作步骤

放射自显影：利用放射线在 X线片上的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。

100bp

200bp

300bp

400bp

7531M 2 4 6 8 9 10 11 M

1.4 液相杂交技术液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型，由于液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高，所以不如固相杂交那样普遍。

1.5 原位杂交技术

（一）固相膜核酸分子杂交方法。

固相核酸杂交多是在膜上进行，因此，以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法。

1 ． DNA 的变性解链是杂交成功的关键 ,Southern 印迹杂交时 DNA 在凝胶中变性 ,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的 1.5mol/L NaCl 和 0.5mol/L NaOH 中 1小时，然后用数倍体积的 1mol/L Tris-HCl （ pH8.0 ）和 1.5mol/L NaCl 溶液中和 1小时。 DNA 受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。碱变性可避免 DNA 的降解 .

2. 变性 DNA 的转膜

变性 DNA 在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径 0.45um ）先在蒸馏水中充分浸泡，再用 6SSC浸泡 30min ～ 2h ，凉干， DNA 样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥 4h ，然后再在 80℃真空干燥 2h 。

3 ．预杂交。湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加 0.2ml预热至 60℃的预杂交液（ 6×SSC ， 0.5%SDS ， 5×Denhardt 液， 100μg/ml鲑鱼精 DNA ）。鲑鱼精 DNA需经过剪切和 DNA 酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至 10μg/ml ，用前放 100℃水溶液中煮沸变性 10min ，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，用封口器将袋口封住。将杂交袋浸入 68℃水浴中保温 3-12h ，当预杂交液温度升至 68℃时，在滤膜表面常会形成水气泡，轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。

4 ．杂交。 从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液，用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好足量的液体保持滤膜湿润（ 50μl/cm2）。溶液的组成是 6×SSC ， 0.01mol/L

EDTA ，变性的标记核酸探针， 5×Denhardt 液， 0.5%SDS ， 100mg/ml 变性的鲑鱼精 DNA 。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口。杂交反应在 68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶 DNA 的性质及探针的比活性等情况而定，一般为 4-20 h 。

5 ．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有 2×SSC 和 0.5% SDS 溶液的盘中 ,室温下漂洗 5min, 再将滤膜移入 2×SSC 和 0.1% SDS 中 ,室温下洗涤 15 分钟 (轻轻摇动 ), 然后将滤膜移入 0.1%×SSC 和 0.5%×SDS 溶液中 ,68℃轻轻摇动保温 2h ，更换缓冲液后继续保温 30min 。

洗脱的温度一般应控制在 Tm值 12℃以下， [Tm=69.3+0.41×(G+C)%]，双链 DNA 的 Tm值随错配碱基对数每增加 1%而递减 1℃。

6 ．结果显示。放射性测定方法，固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射自显影法、另一是液闪计数法，放射自显影法比较简单，只需将杂交膜与 X光片在暗盒中暴光数小时至数天，再显影，定影即可。对于杂交信号较强的固相膜，用一块增敏屏可显著增强暴光强度。此外，为了减弱 32P的放射，暴光通常在 -20℃或 - 80℃下进行。

( 二 ) 固相核酸分子杂交类型

1 ．菌落原位杂交（ colony in situ hybridization ）。

是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出 DNA ，将 DNA烘干固定于膜上与 32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。

实验步骤如下： ①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。

②培养细菌至产生 1-2mm大小的菌落。 ③在一块平皿中置 4张滤纸，用 10%SDS 浸透，倒掉多余液体，

将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。

④5min 后，将滤膜转至用变性溶液（ 0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl ）浸湿的滤纸上，放置 10min 。

⑤将滤膜转至中和溶液（ 1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸湿的滤纸上，放置 10min ，重复中和一次。

⑥将滤膜移至用 2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置 10min ， SSPE 配成 20×贮备液： 3.6mol/L

NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)， 20mmol/L EDTANa2 （ pH7.4)。

⑦将滤膜用滤纸吸干， 80℃真空烘干 2h。

2 ．斑点杂交（ Dot blot ） 是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，

可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（ Manifold），如 MinifoldⅠ和Ⅱ、 Bio-Dot(Bio-Rad)和 Hybri-Dot ，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。

（ 1） DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿，再放到 15×SSC 中。 ②将 DNA 样品溶于水或 TE，煮沸 5min ，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置 , 将 DNA点样于膜上 ,每

个样品一般点 5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干，密封保存备用。 （ 2） RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加 10μg总RNA （经酚 /氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将 RNA溶于 5μlDEPC 水，加 5μl甲醛 /SSC缓冲液（ 10×SSC 中含6.15mol/L甲醛），使 RNA 变性，然后取 5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。

（ 3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经 NaOH 处理，使 DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。

3. Southern 印迹杂交（ Southern blot ）

Southern 印迹杂交的基本方法是将 DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性， Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将 DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中 DNA片段的相对位置在 DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的 DNA 与 32P 标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条 DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的 DNA片段的位置和大小。

（ 1）琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将 DNA限制酶消解片段（ 0.3 ～ 25kb）分离开，分离大分子 DNA片段（ 800-12000bp ）用低浓度琼脂糖（ 0.7%），分离小分子片段（ 500 ～ 1000bp ）用高浓度琼脂糖（ 1.0%）， 300-5000bp 的片段则用 1.3%的琼脂糖凝胶。

电泳时，同时将分子量标记物加到旁边孔中，便于确定样品 DNA 的分子量。 20伏恒压电泳过夜，电泳完毕，将胶浸到含 0.5μg/mlEB的 TBE 缓冲液中染色 30min ，也可将 EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中，在 254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈 f4.5 ，曝光 20-40s 。

（ 2）硝酸纤维素膜吸印。 [1]将胶片切成合适大小，切去右上角作为记号。 [2]将胶片放进盛有变性缓冲液（ 1.5mol/L NaCl,0.5mol/

L NaOH ）的盘中轻晃 15min 。 [3] 换到中和缓冲液（ 1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH ）的盘中轻晃 30min 。 [4]裁一张硝酸纤维素膜、 2-4张 3mm 滤纸和一些吸印纸

（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入 10×SSC缓冲液 ,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。

[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张 3mm 滤纸 ,起灯蕊作用 ,盘中加入少量 10×SSC缓冲液（ 2.5cm厚），不能没过平板，使 3mm 滤纸充分饱和。

[6]将胶倒扣在 3mm 滤纸上。 [7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐

放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。

[8]膜上放一张 3mm 滤纸，不能与胶接触。 [9]上面加吸印纸及重物（ 500g左右）。

[10] 通过滤纸的灯芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将 DNA吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸，在室温下转印过夜。

[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出，在 6×SSC 中洗一下。

[12] 自然干燥， 80℃烤 2h 。

[13] 这是的膜就可进行杂交，或室温密封保存。

Southern Blotting

1 DNA isolation and purification2 DNA digested by Restriction enzyme 3 Gel electrophoresis of fragments4 Transfer to membrane

5 prehybridization

6 Hybridization with radioactive probe 7 DNA fragments are visible after autoradiography or chemiluminescence

4 ． Northern 印迹杂交（ Northern blot ）

这是一种将 RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 DNA 印迹技术由 Southern 于 1975年创建，称为 Southern 印迹技术， RNA 印迹技术正好与 DNA 相对应，故被称为 Northern 印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot 。 Northern 印迹杂交的 RNA吸印与 Southern 印迹杂交的 DNA吸印方法类似，只是只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使 RNA 变性，而不用 NaOH ，因为它会水解 RNA 的 2'-羟基基团。

RNA 变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则 RNA 会被洗脱。在胶中不能加 EB，因为它会影响 RNA 与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行 Northern 转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含 5μg/ml EB的 0.1mol/L醋酸铵中 10min ，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的 RNA 胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使 RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的 mRNA 时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免 RNase 的污染。

RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。

<1> 试剂： 10×MSE 缓冲液： 0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（ MOPS ），

pH7.0 ， 50mmol/L醋酸钠， 1mmol/L EDTA pH8.0 。 5×载样缓冲液： 50%甘油， 1mmol/L EDTA ， 0.4%溴酚蓝。

甲醛：用水配成 37% 浓度（ 12.3mol/L ），应在通风柜中操作， pH高于 4.0 。

20×SSC； 去离子甲酰胺；50mmol/L NaOH( 含 10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris ， pH7.5 。

<2>步骤： [1]40ml 水中加 7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到 60℃，加 7ml

10×MSE 缓冲液， 11.5ml 甲醛，加水定容至 70ml ，混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入 1×MSE 缓冲液的电泳槽。

[3]使 RNA 变性（最多 20μg）， RNA4.5l,10×MSE 缓冲液2l ，甲醛 3.5 l ，去离子甲酰胺 10 l 。

[4]55℃加热 15min ，冰浴冷却。 [5] 加 2ml5×载样缓冲液。 [6]上样、同时加 RNA标记物。 [7]60伏电泳过夜。

[8] 取出凝胶，水中浸泡 2次，每次 5min 。 [9] 室温下将胶浸到 50mmol/L NaOH 和 10mmol/L NaCl 中 45min ，水解高分子 RNA ，以增强转印。

[10] 室温下将胶浸到 0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中 45min, 使胶中和。

[11]20×SSC洗胶 1h。 [12]20×SSC 中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 [13] 取出硝酸纤维素膜， 80℃真空烘烤 2h 。

RNA extraction and isolation

5 –10g isolated RNA 260/280nm ~ 2.0(c.f. DNA 1.8)

Northern Blotting

Denaturing agarose gel electrophoresis甲醛 Formaldehyde 0.66M/2.2mM乙二醛 Glyoxal /氢氧化甲基汞Methyl Mercuric Hydroxide

Heat in formamide to denature

Blot/transfer the RNA onto a membrane using salt solution

RNA transferred to nylon or nitrocellulose membrane/filter

Probe can be radiolabelled or chemiluminescent. Random priming is the usual method for generating a labelled probeHybridization buffer is important

as is stringency of washing (Rapid Hyb ~ 1hr)

Northern Blotting

Northern Blotting

Probe can be washed off the membrane which can be reprobed or multi-probed.

Use a housekeeping type to probe to analyse changes

Glyceraldehyde 3’ phosphate dehydrogenase (GAPDH 三磷酸甘油醛脱氢酶 ),

-actin, 2-microglobulin

5 ．组织原位杂交（ in situ hybridization ）

简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出 DNA ，然后进行杂交，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与 DNA 或 RNA 杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体 DNA 的原位杂交可用于显示按规定序列的位置，对分裂期间核 DNA 的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞 RNA 的杂交可精确分析任何一种 RNA 在细胞中和组织中的分布。用来检测组织、细胞或染色体上的特殊 DNA 序列或 mRNA的表达水平。

用来检测组织、细胞或染色体上的特殊 DNA 序列或 mRNA的表达水平。最初是使用带放射性的 DNA 或 RNA 探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置

用于原位杂交的探针可以是单链或双链 DNA ，也可以是 RNA探针。通常探针操作的长度以 100-400nt 为宜，过长则杂交率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（ 16-30 nt ）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，因此，寡核苷酸探针和不对称 PCR 标记的小 DNA 探针或体外转录标记的 RNA 探针是组织原位杂交优选探针。

探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中， 3H 和 35S最为常用， 3H标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低， 35S标记探针活性较高，影像分辨率也较好，而 32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。

原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要，去除蛋白质的方法是，用 0.2mol/L HCl 处理载玻片，用蛋白酶 K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水。原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。

6 Western Blot

1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤

维素（ NC)或聚偏氟乙烯膜（ PVDF)膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体（一抗）进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体（二抗），反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

2 操作过程

SDS-PAGE电泳 转膜（ PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影

Hours 0 4 8 16

Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3.IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed inlysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and theexpression of actin was detected as a loading control

0h 4h 8h 16h 

Western Blot analysis of cytochrome C release.

Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody.

Cyto-C

X-Protein

3 注意的问题 （ 1） 蛋白质电泳 常用 SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性 PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine 胶中电泳：用于分子量小于 10kDa 的多肽

和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。 Tricine電泳膠將 buffer中的 glycine置換為Trycine，並降低 pH值至 pH7，使得小分子蛋白質與胜月太在 stacking gel中可移動較 DS快，因此在分析膠體中可有明顯的分離效果。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套

（ 2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂

会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致。 以适量的转移 Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜 15－ 30mi

n ，如果是 PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极。 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间： 100V 1-2h, 可根据蛋白分子量的大小灵活选

择。 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置

（ 3）封闭 用 5％脱脂奶粉或 3％ BSA （含 0.1％ Tween20 TBS 或 PBS配制）

时间：室温 2h 或 4ºC过夜

（ 4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为联苯胺 DAB 碱性磷酸酶：底物为 5-溴 -4-氯 -3-吲哚磷酸二钠

（ BCIP） /硝基四氮唑兰（ NBT ） 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）

注意：化学发光前将膜用不含 Tween20 的 TBS 或 PBS洗涤一次

曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定

（ 5）膜的再利用

化学发光后的硝酸纤维素膜用 Stripping Buffer洗涤后（洗涤 Buffer: 62.5mm pH6.7 的 Tris-HCI含 2％ SDS 和 100mm 的 － 2ME ）用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用 3－ 4次。

碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交