Ⅲ. 구조·성분 분석법 ② 공초점 레이저 주사현미경...

28 29l 지류의 조사·분석을 위한 표준시험법

② 공초점 레이저 주사현미경 (CLSM)

공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)은 생물학, 세포

미생물학, 미생물학, 의학, 반도체 등의 분야뿐 아니라 펄프 및 종이 연구 등 다양한 분야에서

광범위하게 사용되고 있다. CLSM은 단일파장의 레이저를 광원으로 이용하여 정확한 초점부위를

통과하는 파장만을 선택적으로 관찰하게 함으로써 선명한 이미지를 얻도록 고안된 현미경이다.

펄프섬유로부터 고분해능의 영상을 얻어 3차원으로 재구성할 수 있기 때문에 응용 용도가 넓게

확대되고 있으며 종이 내의 미세분 분포 및 종이의 양면성까지 보여주는 기술이 개발되기에

이르렀다. 더 나아가 CLSM 및 영상분석을 통해 종이 Z-방향에서의 섬유분포를 수치로 나타낼

수 있으며 섬유분포지수(Fiber Distribution Index, FDI)를 통해 종이 물성과의 상관관계를 예측할

수 있다.

그림 10은 흘림뜨기 한지의 특성으로서 뒷면(발이 닿는 부분)의 섬유배향은 발의 직각방향

으로서 주로 한쪽 방향으로 배열되어 있음을 알 수 있고, 앞면의 경우 섬유의 방향이 임의적으로

배열되어 있음을 알 수 있다. 이는 한 방향으로만 물질하는 가둠뜨기와는 다른 흘림뜨기의 독특한

형태이다.

Ⅲ. 구조·성분 분석법

1. 구조적 특성 분석

1.1. 현미경 검경법

① 광학현미경

섬유식별은 염색한 섬유를 광학현미경(optical microscope)을 이용하여 관찰한다. 섬유장,

섬유폭, 세포벽 두께, 루멘 폭, 룬켈 계수, fiber bonding ratio, 형태적 특성 등을 평가한다.

종이의 섬유가 물리적, 화학적 처리를 받으면 섬유 고유의 특징을 잃어버리는 경우가 있으므로

주의가 필요하다. 섬유의 식별 요소인 cross-marking, 유세포와 가도관, 도관요소의 존재 및

형태, 섬유의 끝 형태 등으로 섬유 식별이 가능하다.

Table 12. Comparative characteristics of the paper mulberry and wood fiber Fiber

목재섬유 닥나무 섬유

침엽수 활엽수 닥나무 삼지닥나무

섬유장2~4.5 mm

(수종에 따라 다름)0.8~1.8 mm 6~21 mm 3~5 mm

섬유폭 20~70 ㎛ 10~50 ㎛ 10~30 ㎛ 10~30 ㎛

섬유

구성주로 가도관으로 구성

목섬유가 특징임섬유 이외의 도관요소 및 유세포를 포함

인피섬유수산화칼슘 결정을 포함한 유세포 존재

섬유

형태

섬유는 리본모양으로 조재부 세포벽은 얇고

만재부 세포벽은 두꺼우며, 조재부 가도관의 내강은 넓고, 만재부 가도관의

내강은 좁음 섬유 끝부분은 무딘 편임

섬유는 원통형으로 끝이 뾰족하고, 세포벽이 두꺼움

섬유가 가는 것은 끝부분이 뾰족하고 세포벽이 두껍고

넓은 것은 벽이 얇고 끝부분이 둥근형태임

횡단면은 타형 cross marking과 dislocation, transparent

membrane 존재함

부정형 관모양으로 세포벽 두께는 같지

않고, 내강은 군데군데 중단되어 있음.

끝부분은 둥글고 그 중에 갈라져 있는 것도 있음

특징

벽공은 대부분 유연벽공으로 존재 조재의 벽공

모양은 원형으로 수가 많고, 만재는 적음

갈라진 금 모양의 벽공이 있고 내강경

은 수종에 따라 각각 다름

Fig. 10. CLSM images of Hanji (×200).

Ⅲ. 구조·성분 분석법 l


1.2. 분광분석법

빛은 파장, 주파수, 속도와 진폭을 가지는 파동으로서의 특성과 빛 에너지가 흡수되거나 방출

되는 광자라는 입자로서의 성격을 지닌다. 특정 파장을 지닌 빛 입자는 어떠한 물질을 통과할

때 물질과 상호작용을 하며 이 때 빛 에너지와 빛이 통과하는 물질의 특성에 따라 상호작용의

양상은 달라진다.

Table 13. Application and Characteristics of light used in the area spectroscopy

종류 파장 범위 전이 (Transition) 분광기

Gamma-rays < 10 ~ 12 m nuclear

X-rays 1 nm ~ 1 pm inner electron X-선 분광기

Ultraviolet 400 nm ~ 1 nmouter electron

자외선 - 가시 분광학 (UV-Vis)Visible 750 nm ~ 400 nm

Near-infrared 2.5 um ~ 750 nm outer electron molecular vibrations

근적외선 분광기(NIR)

Infrared 25 um ~ 2.5 um molecular vibrations 적외선분광기(IR)

Microwaves 1 mm ~ 25 um자기장에서

전자 스핀의 전이전자스핀공명분광학(ESR)

Radio waves > 1 mm자기장에서

핵스핀의 전이핵자기공명분광학(NMR)

① X선 투과사진법

X-선(X-ray)의 감광작용과 물질을 투과하는 성질을 이용하여 지류유물의 내부 구조를 밝힐

수 있다. 지류 유물에 내부결함이 존재할 경우 그 부위에 투과되는 X선 량이 달라지고 X선

필름의 흑화정도가 달라진다. 따라서 지류 유물의 상태, 내부구조, 제작 시 기법, 후처리 작업

등을 발견할 수 있다. X-선 투과사진법에 의한 지류 유물에의 적용 분야로는 내부구조 조사,

문양 및 명문 관찰, 서로 다른 종류의 소재와 그것들의 조합방법, 제작기술 조사, 결손부분 등에

대한 관찰. 이전의 수리 조사, 열화 상태에 대한 조사, 수리 전후 기록, 회화의 경우, 내부에

숨겨져 있는 작가의 최초 의도 등을 확인할 수 있다.

③ 주사전자현미경 (SEM)

주사전자현미경(scanning electron microscope)은 10~3 Pa 이상의 진공 중에 놓인 시료

표면을 1~100 ㎚정도의 미세한 전자선으로 x-y의 이차원방향으로 주사하여 시료표면에서

발생하는 2차 전자, 반사전자, 투과전자, 가시광선, 적외선, X선, 내부기전력 등의 신호를 검출한

후 음극선관 화면상에 확대화상을 표시하거나 기록하여 시료의 형태, 미세구조의 관찰이나

구성원소의 분포, 정성, 정량 등의 분석을 행하는 장치이다. 주로 시료 표면의 정보를 얻을 수

있으며 시료의 두께, 크기 및 준비에 크게 제한을 받지 않는다. 주사전자현미경은 광학현미경에

비해 집점 심도가 2배 이상 깊고 또한 광범위하게 집점을 맞출 수 있어 입체적인 상을 얻는 것이

가능하다.

일반적으로 종이 시료의 분석 시 gold coating을 통해 전도성을 부여한 후 SEM을 이용해

분석한다. 표면 혹은 단면의 분석을 통해 섬유의 배열 상태를 파악할 수 있으며, 섬유 이외의

첨가물의 유무를 확인 수 있다. 확대 배율에 따라서는 섬유의 도관요소, 목섬유, 가도관, 투명막,

마디, dislocation 등에 대한 관찰이 가능하고, 열화나 보강과 같은 처리 전후의 SEM 분석을

통해 섬유의 상태 변화를 확인할 수 있다.

Fig. 11. SEM images of Hanji.



② 적외선 분광분석 (FT-IR)

적외선(IR, infrared light)이 어떠한 물질을 통과할 때 그 물질의 분자는 다양한 화학결합의

진동에너지와 일치하는 파장에서 빛을 흡수한다. 빛의 흡수 정도는 검출기에 의해 측정되는데

결과적으로 spectrum은 그 분자가 빛을 흡수하는 파장에 일치하는 부분에서 peak를 나타낸다.

흡광도의 크기는 시료 중 분자의 농도와 직접 연관되어 있으며, spectrum pattern은 고유의

뒤틀림, Band, 회전 및 각 원자들의 화학결합의 회전 및 진동 등 분자의 실제 구조를 반영한다.

적외선을 이용한 분광분석법은 다양한 분야에 적용되고 있으며, 정성에서 정량분석으로 그

영역을 넓혀가고 있다. 특히 적외선 분광분석기(FT-IR, fourier transform infrared

spectroscopy)는 미지시료를 판별하는데 아주 유용한 도구로 사용된다. 적외선 분광기는 분자의

작용기에 의한 특성적 spectrum을 비교적 쉽게 얻을 수 있고, 광학 이성질체를 제외한 모든

물질의 spectrum이 서로 차이가 있어서 분자 구조를 확인하는데 결정적인 정보를 제공해 준다.

지류 유물의 경우 셀룰로오스의 산화 과정에서 생성되는 carbonyl group을 1724 ㎝⁻¹에서

확인할 수 있으며, intensity의 변화를 통해 지류 유물의 열화 정도를 파악할 수 있다.

③ UV-VIS-NIR 분광분석

물질을 구성하는 분자 또는 원자가 외부에서 조사되는 빛 에너지를 흡수하게 되면 바닥상태에

있던 분자나 원자가 전자전이를 일으키면서 흡수 spectrum을 나타낸다. 빛 에너지가 조사될 때

전자전이 상태와 분자의 운동 종류에 따라 흡수하는 빛 에너지의 파장이 다르고, 따라서 특정

환경에 있는 특정 분자구조가 흡수 spectrum에 반영된다.

UV-VIS-NIR (ultra violet-visible-near infrared spectroscopy)은 자외선부터 근적외선에

이르는 폭넓은 범위의 빛 에너지를 조사할 수 있고, 특정 파장대에서 나타나는 흡수 spectrum의

강도를 분석하여 유기물 분자 내 작용기(functional group)를 검출할 수 있다. 특히, 종이의

경우 260 ㎚ 파장에서 carbonyl group을 검출할 수 있고, 지류 유물의 염료 분석 및 지류 유물의

lignin 발색단 등의 분석에 활용할 수 있다.

Table 14. Charge transfer transition

Chromophore Excitation λmax, ㎚ ε

C = C π → π* 171 15,000

C = C π → π* 180 10,000

C = O n → π* π → π* 290180 1,510,000

N = O n → π* π → π* 275200 175,000Fig. 12. ATR-FTIR spectra of papers.

Fig. 13. Adsorption of radiation by molecular.



④ X-선 회절분석 (XRD)

X-선 회절분석(X-ray Diffraction)은 X선이 결정 화합물의 표면에 θ각으로 입사하면 결정

표면의 원자에 의해 산란되는 X선 회절현상을 이용하여 각종 물질의 결정구조를 밝히는데 응

용하고 있다. XRD는 주로 시료를 구성하고 있는 성분과 그 결합상태, 시료의 제작기술과 보존환경

등의 규명, 유물의 정량, 정성분석 또는 화합물 상태를 분석하는데 이용될 수 있다.

지류 문화재를 대상으로 한 연구에서는 XRD를 이용해 결정화도 분석이 가능하다. 셀룰로오스의

결정화도는 셀룰로오스 전질량에 대한 결정영역의 비를 말한다. 셀룰로오스의 결정화도가 증가

하면 섬유의 장력, 영율, 견고도, 밀도, 입체안정성 등이 증가하는 반면, 결정화도가 감소하면

신장율, 보수성, 팽윤성, 염료흡착성, 화학반응성, 유연성 등이 감소하는 것으로 알려져 있다.

한지의 인공열화 시간에 따른 결정화도를 분석한 결과(그림 14), 열화 시간이 12시간 이상이 되면

결정영역의 파괴로 결정화도가 점차 낮아지는 것으로 나타났다.

Fig. 14. X-ray diffractograms of Hanji according to artificial aging at 150℃.

Fig. 15. Example of separation by borate complex anion exchange.

2. 성분 분석

2.1. 당분석

종이를 구성하는 주요 물질은 셀룰로오스이다. 셀룰로오스는 β-D-글루코스가 1-4 글루

코시드 결합을 통해 중합체를 이룬 다당류이다. 따라서 종이의 열화는 셀룰로오스의 분해를

의미하고 셀룰로오스를 구성하는 당(saccharide) 조성을 분석함으로써 종이의 열화 정도를

파악할 수 있다.

Fig. 16. Sugar contents of Hanji according to artificial aging.



셀룰로오스 분자들은 근접한 3번, 6번 탄소의 수산기 사이에 수소결합이 형성되어 선형 사슬로

존재하고, 이 구조는 비교적 경직된 구조로 서로 글루칸이 밀접하게 배열되고 서로 결합하여 매우

안정적이고 강인하다. 따라서 셀룰로오스의 결합 구조를 분해하여 분석이 가능한 상태로 전처리를

하는 것이 필요하다.

다음은 HPLC (high performance liquid chromatography)를 이용한 한지의 당조성 분석을

위한 전처리 방법이다.

• 2 × 2 ㎜ 이하로 시료 재단

• 105℃ 건조기에서 1시간 이상 건조

• 전건 중량 200 ㎎의 시료 준비

시료

• 시료를 시험관에 넣고, 72%(w/w) 황산(H₂SO₄) 3 ㎖ 첨가

• 유리막대를 이용하여 10분마다 한 번씩 교반

• 2시간 동안 산 가수분해 진행

가수분해

• 시료를 serum bottle에 옮기고, 탈이온수 112 ㎖ 첨가

• bottle 밀폐 후, 121℃에서 1시간 동안 정치가온

여과 • 상온까지 냉각한 후, glass filter로 여과

분석• 여과액을 분석용 바이알에 분취

• 시료와 농도별 표준 당 용액 분석

• 표준 당의 검량선 작성

• 검량선을 이용하여 시료의 검출량 계산

2.2. 카복실산 (Carboxylic acid)

Carboxylic acid는 carboxyl group (COOH)을 포함하는 유기화합물을 말한다. 종이 내에서

carboxyl group은 셀룰로오스 chain에 결합되어 있는 acidic group으로 셀룰로오스의 산화

분해 과정에서 주로 생성된다. 종이의 열화 과정에서 carboxyl group가 생성되면 이 산성물질을

촉매로 셀룰로오스의 산가수분해가 촉진되고 따라서 종이의 열화가 급속하게 진행되기 때문에

지류문화재의 보존에 있어서 carboxylic acid는 매우 중요한 의미를 가진다.

다음은 TAPPI T 237 cm-98 규격에 따른 펄프의 carboxyl contents 의 분석 방법이다.

• 전건 무게 기준 120 ㎎의 시료 준비

• 핀셋을 이용해서 시료를 작은 조각으로 찢음 시험편

• 100 ㎖ 삼각플라스크에 시험편과 증류수 25 ㎖ 첨가

• 구리선(Ø3 ㎜ × 10~20 ㎜) 5 ~ 10 조각 첨가

• 플라스크를 밀폐하고 시험편이 완전히 해리될 때까지 교반

• CED 용액 (0.5 mol/ℓ) 25 ㎖ 첨가

• 고순도 질소를 불어넣어 삼각플라스크 안의 산소 제거

• 플라스크를 밀폐하고 시험편이 완전히 용해될 때까지 교반

• 플라스크를 항온수조(25±0.1℃)에서 정치

• 점도계에 용액을 넣고, 피펫 홀더를 이용해 끌어올림

• 홀더를 제거하고 용액이 기준선 사이를 통과하는 시간 측정

측정

결과표시 • 10 ㎖/g 까지 한계 점도수 기록

계산• 점도비 ηratio(η/η ο) 계산

• 부속서 B로부터 η×C의 값을 구하여 한계 점도수 계산

t : 시험액의 유출 시간 (초)

h : 점도계 상수 (s⁻¹)

ηratio = = h x t η η ο



2.3. 휘발성 유기화합물 (VOCs)

종이가 장기간 공기 중의 산소와 수분 그리고 다양한 화학물질에 노출되면 종이를 구성하는

셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌의 분해가 일어난다. 특히, 헤미셀룰로오스와 리그닌은

셀룰로오스에 비해 열화에 취약하기 때문에 셀룰로오스보다 빠르게 분해된다. 셀룰로오스의

분해는 주로 산화 분해 반응 및 산을 촉매로 하는 가수분해에 의해 이루어지며, 이 과정에서

알칸(alkane), 알코올(alcohol), 알데히드(aldehyde), 카르복시산(carboxylic acid) 등이 생성

된다. 종이의 열화과정에서 생성되는 다양한 저분자의 유기화합물을 측정하여 종이의 열화

정도 및 안정성을 파악하고자 하는 것이 바로 휘발성 유기화합물(VOCs, volatile organic

compounds) 모니터링 기술이다.

VOCs의 측정분석을 통해 지류문화재의 상태를 파악하는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다.

하나는 분석된 많은 유기화합물 중 특정 물질을 지표물질(marker)로 선정하고 이 지표물질의

방출량 변화를 통해 지류문화재의 상태를 파악하는 것이다. 실제 최근 연구결과를 통해 셀룰

로오스의 분해로 formic acid, acetic acid 등이 생성되는 것으로 밝혀졌으며, furfural의 방출량

변화는 종이 열화 정도와 일정 수준의 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. VOCs 방출량을

이용해 지류문화재의 상태를 파악하는 두 번째 방법은 fingerprint 기술이다. 셀룰로오스의

분해 과정에서 방출되는 유기화합물의 종류나 방출량은 열화 정도에 따라 변화한다. 따라서

셀룰로오스의 열화 과정에서 발생되는 다양한 유기화합물의 방출량을 열화 단계별로 분석하여

몇몇 특정 성분들의 방출 유무 및 물질들 사이의 상대적인 방출량을 하나의 패턴으로 저장하고

데이터베이스화 하면 이를 지류문화재의 VOCs 분석결과와 비교하여 지류문화재의 열화 정도

및 안정성을 파악할 수 있게 된다.

VOCs 측정분석에서 중요한 부분은 시료로부터 방출되는 VOCs의 포집과 이를 정확하게

분석하는 기술이다. VOCs를 포집하는 가장 일반적인 방법은 흡착튜브나 SPME(solid phase

microextraction)를 이용하는 것이다. 흡착튜브의 흡착물질과 SPME의 fiber를 코팅하고 있는

물질은 다양한 종류가 있으며, 각각의 종류마다 흡착하는 VOCs의 종류나 범위가 다르다.

VOCs의 분석은 보통 GC (gas chromatography)를 이용해 분리하고 MS (mass spectrometry)나

FID (flame ionization detector)를 이용해 검출한다.

Fig. 17. Chromatogram of Hanji artificially aged for 20 days.

Fig. 18. Adsorption tube(left) and SPME(right).



2.4. 분자량 (Molecular weight)

종이는 천연 고분자 물질인 셀룰로오스로, 헤미셀룰로오스, 리그닌 그리고 기타 첨가물들로

이루어져있다. 종이의 주요 구성 물질인 셀룰로오스는 비교적 큰 분자량을 가지고 있다. 하지만

오랜 시간 공기 중에 노출되면서 산화 및 산가수분해 등의 열화과정을 거치면 분자량이 감소

되는 것으로 알려져 있다. 셀룰로오스의 분자량 혹은 분자량 분포를 정확히 측정할 수 있다면

분자량 분포의 변화와 인장강도, 내절도와 같은 물리적 강도와의 상관관계를 분석할 수 있게

되고, 이를 통해 분자량 분포로부터 지류 문화재의 열화 정도와 물리적 강도, 안정성 등을 파악할

수 있게 된다. 고분자의 분자량은 GC/Mass, LC/Mass, MALDI-TOF 등 여러 가지 방법으로

측정할 수 있으나, GPC (gel permeation chromatography)가 가장 보편적인 방법이다. GPC는

다른 방법에 비하여 신속하고, 재현성이 높아 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있는 방법이다. GPC의

여러 가지 장점에도 불구하고 결과적으로 산출되는 분자량 결과가 상대분자량이라는 단점을

가지고 있었지만 최근에는 광산란 검출기(light scattering detector)를 이용한 다각도광산란

분광기(MALLS, multi angle laser light scattering)의 도입으로 절대분자량을 측정할 수 있는

system이 개발되어 많은 분야에서 활용되고 있다.

GPC-MALLS system을 이용해 셀룰로오스의 분자량을 측정하기 위해서 필요한 사항은

적절한 전처리 과정, 적절한 컬럼의 선택 그리고 정확한 데이터 처리 등이다. 이 중 가장 중요한

것은 전처리 과정으로 사실 가장 복잡하고 어려운 과정이다. 전처리 과정에서 가장 중요한 점은

셀롤로오스를 분자량 손실 없이 완전히 용해시키는 것이며, 데이터 처리 과정에서 정확한 시료의

중량이 필요하기 때문에 전처리 과정에서 시료의 손실이 없어야 한다.

다음은 GPC-MALLS를 이용한 종이의 분자량 측정 시 필요한 전처리 과정이다.

• DMAc에 Molecular sieve를 넣고 24시간 이상 방치시약

• 10 ㎎ 정도의 시료를 105℃ 건조기에서 1 시간 정도 건조

• 데시케이터에서 식힌 후, 0.0001 g까지 정확하게 무게 측정시료

• 바이알(12 ㎖)에 시료와 탈이온수 10 ㎖ 첨가

• 유리 beads 4~5개를 넣고 교반

• 해리된 섬유 현탁액을 여과장치를 이용해 여과

• 0.45 ㎛ membrane filter 사용

• 여과 후 시료를 분리하여 다시 바이알에 옮김

해리

용해• 9% LiCl/DMAc 용액 제조

• 팽윤된 시료를 여과 후 바이알에 다시 옮김

• 9% LiCl/DMAc 용액 1 ㎖ 첨가

• 12시간 동안 교반 후 시료가 모두 용해될 때까지 저온 보관

희석• 용해된 시료에 DMAc 9 ㎖를 첨가

• 희석된 시료를 분석용 바이알에 분취

• 실린지 필터(0.45 ㎛)가 결합된 실린지 사용

팽윤• 시료가 들어있는 바이알에 메탄올 4 ㎖ 첨가

• 1시간 동안 교반 후, 시료를 여과하고 다시 바이알에 옮김

• DMAc 4 ㎖를 넣고 12시간 동안 교반

Fig. 19. GPC-MALLS system.


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