| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het ...
Transcript of | Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het ...
Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie |
Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur
Laarbeeklaan 121 | B-1090 Jette | t +32 (0)2 472 52 00 | [email protected] | www.erasmushogeschool.be
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen
Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT)|
Wilke Vandensande
Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx
Labo Hematologie Militair Hospitaal Koningin Astrid (MHKA) Neder-Over-Heembeek
Departement Gezondheidszorg
Academiejaar 2013-2014
Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie |
Erasmushogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur
Laarbeeklaan 121 | B-1090 Jette | t +32 (0)2 472 52 00 | [email protected] | www.erasmushogeschool.be
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen
Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
| Bachelorproef aangeboden tot het verkrijgen van het diploma bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie (MLT)|
Wilke Vandensande
Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx
Labo Hematologie Militair Hospitaal Koningin Astrid (MHKA) Neder-Over-Heembeek
Departement Gezondheidszorg
Academiejaar 2013-2014
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 I | P a g i n a
VOORWOORD
Ik zou graag mijn dankwoord willen uiten aan geneesheer Kolonel Neirinckx, directeur
van het Militair Hospitaal Koningin Astrid voor de mogelijkheid en de toestemming om in
het bioklinisch laboratorium een eindwerkstage te mogen uitvoeren.
Mijn promotor Klinisch Bioloog Apr. Luitenant-kolonel Heuninckx zou ik willen bedanken
voor de mogelijkheid om een eindwerkstage te mogen uitvoeren in het bioklinisch
laboratorium onder zijn begeleiding en steun, maar ook omwille van het vertrouwen in mij.
Vervolgens wil ik Klinisch Biologe Apr. Van Haute bedanken voor de begeleiding, maar ook
voor de kennis en expertise die ze met mij wou delen. Tevens wil ik ook Christa Van de Ven
bedanken voor de goede opvang, de technische uitleg en de begeleiding bij het uitvoeren
van dit eindwerk, maar ook alle laboranten van het laboratorium voor het goed ontvangst,
uitleg, aangename sfeer en het vertrouwen om mij gedurende deze periode zelfstandig te
laten werken.
Graag had ik ook mijn dankwoord geuit aan Marjan Van Esbroeck en Anne-Marie Feyens van
het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor het uitwisselen van
malariapositieve monsters, de hulp en informatie gedurende deze stage. Ik apprecieer ook
de hulp van Anne Demulder van het UVC Brugmann om bereid te zijn malariapositieve
monsters uit te wisselen.
Ook mijn dank aan An Vermoesen en Lobke Tremmerie van de firma ANALIS voor de
opleiding, hulp en informatie van het toestel UniCel DxH800.
Mijn dankwoord gaat ook uit naar Apr. Dorien Van den Bossche voor het contact met het ITG
en de hulp gedurende deze periode.
Mevrouw Brisaert, Mevrouw Crabbe en Mevrouw Roelandt zou ik tevens ook willen
bedanken voor hun tussentijdse opvolging en hulp tijdens dit eindwerk.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 II | P a g i n a
ORGANIGRAM
Klinisch laboratorium Militair Hospitaal Koninging Astrid (MHKA)
(Klinisch Bioloog Apotheker Luitenant-kolonel Heuninckx)
Pre- en postanalytische diensten Analytische diensten
Labo Hematologie
Labo Biochemie
Labo Bacteriologie
Labo Serologie
Labo Toxicologie
Labo Urine
Wachtpersoneel
Quality Manager Klinisch Bioloog
(Apotheker Luitenant-kolonel Heuninckx)
Adjunct Klinisch Biologen (Apotheker Luitenant-kolonel (res) Van Haute
Apotheker Kapitein (res) Hing)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 III | P a g i n a
INHOUDSTAFEL
VOORWOORD ...................................................................................................................... I
ORGANIGRAM ..................................................................................................................... II
INHOUDSTAFEL .................................................................................................................. III
FIGURENLIJST ................................................................................................................... VI
TABELLENIJST ................................................................................................................... IX
LIJST AFKORTINGEN ........................................................................................................... XI
SAMENVATTING ................................................................................................................ XII
ABSTRACT ....................................................................................................................... XIII
I. INLEIDING ................................................................................................................ 1
II. PROBLEEMSTELLING ............................................................................................... 2
III. PROEFOPSTELLING ................................................................................................. 3
IV. THEORIE ................................................................................................................ 4
1. ACHTERGROND ................................................................................................... 4
1.1. MALARIA .................................................................................................... 4
1.2. MALARIA IN BELGIË ..................................................................................... 4
1.1. PARASIET ................................................................................................... 5
1.1.1. ASEKSUELE CYCLUS IN DE MENS ............................................................... 5
1.1.2. SEKSUELE CYCLUS IN DE ANOPHELES MUG ................................................ 6
1.2. IMMUNITEIT ............................................................................................... 6
1.3. THERAPIE ................................................................................................... 7
1.3.1. PROFYLAXIE ............................................................................................ 7
1.3.2. BEHANDELING ......................................................................................... 8
1.4. RESISTENTIE .............................................................................................. 8
1.5. RECIDIVITEIT ............................................................................................. 9
1.6. SYMPTOMEN ............................................................................................... 9
1.7. KLINISCHE VERSCHIJNSELEN ....................................................................... 9
1.7.1. HEMATOLOGIE ......................................................................................... 9
1.7.2. BIOCHEMIE ............................................................................................. 9
1.8. DIAGNOSE ................................................................................................. 10
1.8.1. MICROSCOPIE ........................................................................................ 10
1.8.2. IMMUNOCHROMATOGRAFIE (SNELTEST) .................................................... 10
1.8.2.1. HRP-2 ................................................................................................ 10
1.8.2.2. PLDH ................................................................................................. 10
1.8.3. SEROLOGIE ............................................................................................ 11
1.8.4. MOLECULAIRE TECHNIEKEN ..................................................................... 11
1.8.5. HEMATOLOGISCHE ANALYSERS ................................................................ 11
2. LITERATUUR ...................................................................................................... 12
V. EXPERIMENTEN ..................................................................................................... 20
1. BECKMAN COULTER UNICEL DXH 800 .................................................................. 20
1.1. MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................... 20
1.1.1. APPARATUUR .......................................................................................... 20
1.1.2. MONSTER ............................................................................................... 20
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 IV | P a g i n a
1.1.3. MEETPRINCIPES ...................................................................................... 20
1.1.3.1. COMPLETE CLOOD COUNT (COULTER PRINCIPE) ..................................... 21
1.1.3.2. HEMOGLOBINE (SPECTROFOTOMETRISCH PRINCIPE) ............................. 23
1.1.3.3. DIFFERENTIATIE (VCS PRINCIPE) ......................................................... 23
1.1.3.3.1. VOLUME ....................................................................................... 24
1.1.3.3.2. CONDUCTIVITEIT .......................................................................... 24
1.1.3.3.3. LICHTVERSTROOIING .................................................................... 25
1.1.3.3.4. MTM ............................................................................................ 25
1.1.3.4. NRBC (VCS METHODE) ........................................................................ 26
1.1.4. REAGENTIA ............................................................................................ 26
1.1.4.1. DXH DILUENT ..................................................................................... 26
1.1.4.2. DXH CELL LYSE ................................................................................... 26
1.1.4.3. DXH DIFF PACK .................................................................................. 26
1.1.4.4. DXH CLEANER .................................................................................... 26
1.1.5. RAPPORTERING ...................................................................................... 27
1.1.5.1. CBC EN DIFFERENTIATIE ..................................................................... 27
1.1.5.2. FLAGS ............................................................................................... 27
1.1.5.3. SUPPLEMENTAIRE DATA ....................................................................... 28
1.1.5.4. HISTOGRAM ....................................................................................... 29
1.1.5.5. 2D-DATAPLOTS ................................................................................... 29
1.1.5.6. 3D-DATAPLOTS ................................................................................... 31
1.1.5.7. SURFACE-PLOTS ................................................................................. 31
1.1.5.8. CODES ............................................................................................... 32
1.1.5.9. SUSPECT/SYSTEM/DEFINITIVE MESSAGES ............................................. 32
1.1.6. PROEFOPSTELLING .................................................................................. 32
1.1.7. METHODE ............................................................................................... 33
1.1.7.1. MONSTERAFNAME ............................................................................... 33
1.1.7.2. CONTROLES ....................................................................................... 33
1.1.7.3. ANALYSE OP UNICEL DXH 800 .............................................................. 33
1.1.7.4. STATISTIEK ........................................................................................ 34
1.2. RESULTATEN .............................................................................................. 34
1.2.1. PARAMETERS PER GROEP ......................................................................... 35
1.2.1.1. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP (NORMAAL) ............................... 35
1.2.1.2. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP (MALARIA) ................................. 35
1.2.1.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE ................... 36
1.2.1.4. GROEP TERUGKERENDE MILITAIREN VAN BUITENLANDSE MISSIE ............ 36
1.2.2. MALARIA DISCRIMINANT FACTOR ............................................................. 37
1.2.3. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME LYMFOCYTEN .......................... 38
1.2.4. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME MONOCYTEN ........................... 39
1.2.5. BLOEDPLAATJES ..................................................................................... 40
1.2.6. HISTOGRAM ........................................................................................... 41
1.2.7. DATAPLOTS ............................................................................................ 42
1.2.7.1. 5PD1 ................................................................................................. 42
1.2.7.2. NRBC1 ............................................................................................... 44
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 V | P a g i n a
1.2.8. SENSITIVITEIT / SPECIFICITEIT / CUTT-OFF WAARDE ................................. 46
1.3. DISCUSSIE ................................................................................................ 47
2. SNELTEST (SD P.F./PAN) ..................................................................................... 49
2.1. MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................... 49
2.1.1. APPARATUUR .......................................................................................... 49
2.1.2. MONSTER ............................................................................................... 49
2.1.3. MEETPRINCIPE ........................................................................................ 49
2.1.4. PROCEDURE ........................................................................................... 51
2.2. RESULTATEN .............................................................................................. 52
2.2.1. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP ...................................................... 52
2.2.2. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP ..................................................... 53
2.2.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE ....................... 53
2.2.4. GROEP MILITAIREN TERUGKEREND VAN BUITENLANDSE MISSIE .................. 53
2.3. CONCLUSIE ............................................................................................... 54
3. MICROSCOPIE .................................................................................................... 55
3.1. MATERIAAL EN METHODEN .......................................................................... 55
3.1.1. APPARATUUR .......................................................................................... 55
3.1.2. REAGENTIA ............................................................................................ 55
3.1.3. PRINCIPE ............................................................................................... 55
3.1.3.1. BLOEDUITSTRIJKJE ............................................................................. 55
3.1.3.1. DIKDRUPPEL ...................................................................................... 56
3.1.3.2. MAY GRÜNWALD GIEMSA ..................................................................... 56
3.1.3.3. GIEMSA ............................................................................................. 57
3.1.4. PROCEDURE ........................................................................................... 57
3.1.4.1. BLOEDUITSTRIJKJE MET MAY GRÜNWALD GIEMSA KLEURING .................. 57
3.1.4.2. DIKDRUPPEL ...................................................................................... 57
3.1.4.3. MICROSCOPIE .................................................................................... 58
3.2. RESULTATEN .............................................................................................. 60
3.3. CONCLUSIE ............................................................................................... 61
VI. CONCLUSIE ........................................................................................................... 62
VII. DISCUSSIE ........................................................................................................... 64
VIII. REFERENTIES ..................................................................................................... 65
IX. APPENDIX ............................................................................................................. 69
X. BIJLAGE ................................................................................................................ 87
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 VI | P a g i n a
FIGURENLIJST
Figuur 1: Proefopstelling studie .............................................................................................................. 3
Figuur 2: Plasmodium species verdeling van 210 malariagevallen in België in 2005 (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007).................................................. 4
Figuur 3: VCS-data (V: volume, C: conductiviteit, S: scattering) met het gemiddelde (Mean) en de standaarddeviatie (SD) van de populatie witte bloedcellen (NE: neutrofielen, LY: lymfocyten, MO: monocyten en EO: eosinofielen) na telling en differentiatie op de UniCel DxH 800. Links de VCS-data van een persoon in goede gezondheid. Rechts de VCS-data van een persoon met een malaria-infectie die een duidelijk hoger gemiddeld volume en een grotere standaarddeviatie van de monocyten en lymfocyten weergeeft. (Briggs et al., 2006) ................................................................................................................................................. 12
Figuur 4: Histogram van de witte bloedcellen met op de x-as de grootte of volume (fL) en op de y-as de celfrequentie. Links een histogram van een persoon in goede gezondheid en rechts van een persoon met een malaria-infectie met een extra piek voor de drempelwaarde van 35 fL. (Briggs et al., 2006) ......................... 13
Figuur 5: 2D-dataplot van de bloedcepopulaties met op de x-as de lichtverstrooiing en op de y-as het volume. Links een persoon in goede gezondheid met een goede scheiding in de celpopulaties en een geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. Rechts een persoon met een malaria-infectie met geen goede scheiding tussen de celpopulaties en een heterogene minder geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie. (Briggs et al., 2006) ............................................................................................................................ 13
Figuur 6: ROC-analyse voor de malariafactor. Een cut-off waarde of grenswaarde van 3,7 vertoont een sensitiveit van 98% en een specificiteit van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een lagere specificiteit, een hogere factor in een lagere sensitiviteit. (Briggs et al., 2006) ............................................ 14
Figuur 7: NRBC 2D-plot (y-as RLALS, x-as AL2) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn groen, NRBC-signalen rood en de WBC signalen blauw. (Lee at al, 2012) ................................................... 15
Figuur 9: NRBC 2D-plots van een patiënt met P.vivax-infectie. Links de dataplot op dag 0 van de behandeling, in het midden de dataplot na 2 dagen behandeling en rechts de dataplot na 12 dagen behandeling. Naarmate de parasitemie afneemt, neemt ook het aantal malariasignalen af. (Lee at al, 2012) .................................... 16
Figuur 8: Differentiatie 2D-plot (y-as volume, x-as RLS) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen zijn rood (inclusief rode bloedcellen, neutrofielen zijn roze, de blauwe signalen zijn lymfocyten , de groene signalen zijn monocyten , de gele signalen zijn eosinofielen en de witte signalen zijn basofielen. (Lee at al, 2012) ........................................................................................................................................ 16
Figuur 10: De 2D-dataplots en WBC-histogrammen van een normaal bloedmonster (links) en een bloedmonster met een malaria-infectie (rechts). De dataplot van malaria toont een extra populatie aan onder de populatie lymfocyten en een extra populatie (piek voor 35 fL grenswaarde) voor de lymfocyten op het histogram. (Simon-Lopez, 2013) ........................................................................................................... 17
Figuur 11: ROC-analyse van de malariafactor toont een cutt-off waarde van 5,06 met een sensitiviteit van 69,9% en een specificiteit van 82,5%. (Simon-Lopez, 2013) ..................................................................... 18
Figuur 12: Herhaalbaarheid. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters na elke run. Voor de lymfocyten is de gemiddelde variatiecoëfficiënt 4,4% en voor de monocyten 5,5%.(Simon-Lopez, 2013) ................................................................................................................... 19
Figuur 13: De invloed van de leeftijd van het monster op de SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten. Het gemiddelde SD V volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van 10 monsters gedurende een tijdspanne van 77u. Het monster is stabiel voor deze parameter gedurende 11 uur na de bloedafname. (Simon-Lopez, 2013) ........................................................................................................................... 19
Figuur 14: Coulter-methode in de Beckman Coulter DxH voor de celtelling van bloedcellen in een bloedmonster (Beckman Coulter Ireland, 2013) ........................................................................................................... 22
Figuur 15: Meting van het volume in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) ......................................... 24
Figuur 16: Meting van de conductiviteit in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) .................................. 24
Figuur 17: Lichtverstrooiing meting in de MTM, simultaan met de meting van volume en conductiviteit (Beckman Coulter Ireland, 2013) ........................................................................................................... 24
Figuur 18: Meting van het volume door gelijkstroom (DC) impedantie in de MTM (Beckman Coulter Ireland, 2013) ................................................................................................................................................. 24
Figuur 19: Meting van de intracellulaire inhoud van de cel door radiofrequentie (RF) impedantie in de MTM. . 24
Figuur 20: Multitransducermodule (MTM) in de UniCel DxH 800 die gebruikt wordt voor de meting van volume, conductiviteit en lichverstrooiing of scattering (VCS technologie). De onderdelen van deze module worden uitgelegd in tabel 7 en 8. (Beckman Coulter Ireland, 2013)....................................................................... 25
Figuur 21: ‘Patient Results’ scherm die de rapportering van de resultaten (grijze kaders) weergeeft van een bloedmonster na een ‘complete blood count’ (CBC) en een differentiatie. ................................................... 27
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 VII | P a g i n a
Figuur 22: Supplementaire data van de differentiatie (DIFF) geeft voor elke meting (volume, conductiviteit en lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven. ....... 28
Figuur 23: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie. ...................................................................................................................................... 29
Figuur 24: Histogram van de rode bloedcellen (RBC) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie. ...................................................................................................................................... 29
Figuur 25: Histogram van de bloedplaatjes (PLT) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie. ...................................................................................................................................... 29
Figuur 26: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie en de situering van de populaties witte bloedcellen op de x-as. (Beckman Coulter Ireland, 2013) ......................................................................................................................................................... 29
Figuur 27: Celpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weergegeven op de 2D-dataplots na differentiatie. Links de 5PD1-dataplot met op de x-as de ‘rotated light scattering’ (RLS) en op de y-as het volume (V). Rechts de 5PD2 dataplot met op de x-as het de ondoorzichtigheid (OP) en op de y-as het volume (V). ................................. 30
Figuur 28: Celpopulaties nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) weergegeven op de 2D-dataplot na differentiatie. Links de NRBC1-dataplot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de ‘rotated light angle scatter’ (RLALS). Rechts de NRBC2-dataplot met op de x-as het volume (RUMALS) en op de y-as het doorgelaten licht (ALS2). ............................................. 30
Figuur 29: 3D-dataplot met de assen volume, lichtverstrooiing en het doorgelaten licht geeft de elpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weer. ............................................................................................................... 31
Figuur 30: Surface-plot van de 5PD1-plot met op de x-as de ‘rotated light scattering’ (RLS) en op de y-as het volume (V). Lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) ..................................................................................................... 31
Figuur 31: Surface-plot van de NRBC1-plot met op de x-as het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de ‘rotated light angle scatter’ (RLALS). Nucleated red blood cells (rood), witte bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) ............................................................................................................................... 31
Figuur 32: Boxplot voor de evaluatie van de malaria discriminant factor met n= het aantal monsters. .......... 37
Figuur 33: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters. ................................................................................................................ 38
Figuur 34: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten) met n= het aantal monsters. ................................................................................................................ 39
Figuur 35: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van de bloedplaatjes met n= het aantal monsters. ..... 40
Figuur 36: WBC-histogrammen van de malaria positieve monsters. Histogrammen A, B, D en E vertonen geen mooie afgescheiden piek op de 35 fL genswaarde. Het begin van een extra piek of populatie is zichtbaar ter hoogte van de 35 fL grenswaarde. ......................................................................................................... 41
Figuur 37: WBC-histogrammen van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Histogrammen A t.e.m.H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en histogrammen I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Deze histogrammen vertonen geen extra piek voor de 35 fL grenswaarde .......................................................... 41
Figuur 38: Differentiatie 5PD1-dataplot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden en persoon in goede gezondheid). .............................................................................................................. 42
Figuur 39: Differentiatie 5PD1-dataplots van malaria positieve monsters. ................................................. 43
Figuur 40: Differentiatie 5PD1-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. .................... 43
Figuur 41: NRBC1 data-plot van een normaal monster (parameters binnen referentiewaarden). .................. 44
Figuur 42: NRBC-dataplots van malaria positieve monsters. .................................................................... 45
Figuur 43: NRBC-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. ................................ 45
Figuur 44: ROC-analyse van de malaria disciminant factor geeft een ideale cut-off waarde van 5,0 op basis van de data in deze studie. ......................................................................................................................... 46
Figuur 45: Immunochromatografisch principe voor de malariadetectie van de SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest (World Health Organization, 1999) .................................................................................. 50
Figuur 46: Werkwijze voor de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) .................................. 51
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 VIII | P a g i n a
Figuur 47: Een P.ovale trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ........................................................................................................... 61
Figuur 48: Een P.ovale geparasiteerde rode bloedcel met meerdere trofozoïeten (polyparasitisme, zeldzaam) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop . 61
Figuur 49: Een P.ovale schizont die op uitbarsten staat in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ..................................................................... 61
Figuur 50: Een P.falciparum trofozoiët in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ........................................................................................... 61
Figuur 51: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ..................................................................... 61
Figuur 52: Een P.falciparum trofozoiët (oudere vorm) in een bloeduitstrijkje gekleurd met May-Grünwald Giemsa op een vergroting 100x10 onder de lichtmicroscoop ..................................................................... 61
Figuur 53: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) op de dag van diagnose ........................................................................................... 78
Figuur 54: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie (later geconfirmeerd als P.ovale infectie) vier dagen na de dag van diagnose en na behandeling met chloroquine. ........................ 78
Figuur 55: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een abnormale verdeling en een extra populatie op de 35 fL volume grenswaarde (hoge celfrequentie). .......................................................................................... 79
Figuur 56: WBC (witte bloedcel) histogram vertoont een goede verdeling en geen extra populatie op de 35 fL volume grenswaarde. ........................................................................................................................... 79
Figuur 57: NRBC dataplot van een militair met een P.ovale infectie vertoont een groene extra populatie links onderaan. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw. ................................... 80
Figuur 58: NRBC dataplot van de militair met een P.ovale infectie na 4 dagen behandeling met chloroquine. De groene extra populatie is verdwenen. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw. ......................................................................................................................................................... 80
Figuur 59: NRBC surface plot van een militair met een P.ovale infectie vertoont een groene extra populatie links onderaan. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw. ............................ 80
Figuur 60: NRBC dataplot van de militair met een P.ovale infectie na 4 dagen behandeling met chloroquine. De groene extra populatie is verdwenen. Nucleated red blood cells (NRBC) zijn rood en de witte bloedcellen blauw ......................................................................................................................................................... 80
Figuur 61: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor. ...................................... 83
Figuur 62: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V monocyten ..................................................... 83
Figuur 63: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V lymfocyten...................................................... 83
Figuur 64: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ....................................................................... 84
Figuur 65: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ...................................................................................... 84
Figuur 66: De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname)................................................................. 84
Figuur 67 : De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ....................................................................... 84
Figuur 68: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ............................................... 85
Figuur 69: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname). ....................................................................... 85
Figuur 70: Correlatie malaria discriminant factor met de standaarddeviatie van de lymfocyten. ................... 86
Figuur 71: Correlatie malaria discriminant factor met de standaarddeviatie van de monocyten . .................. 86
Figuur 72: Correlatie SD V lymfocyten met SD V monocyten3 .................................................................. 86
Figuur 73: Correlatie bloedplaatjes met de malaria discriminant factor ..................................................... 86
Figuur 74: Stadia van de P.falciparum parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-18: Trofozoïeten (2-10 ringstadia); 19-26: Schizonten; 27-28: Vrouwelijke gametocyten (macrogametocyten); 29-30 Mannelijke gametocyten (microgametocyten). ........................................................................................................ 88
Figuur 75: Stadia van de P.ovale parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-5: Jonge trofozoïeten (ringstadia); 6-15: Trofozoïeten; 16-13: Schizonten; 24: Vrouwelijke gametocyt ; 25: Mannelijke gametocyt. ..................... 90
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 IX | P a g i n a
TABELLENIJST
Tabel 1: Parameters op de UniCel DxH 800 die gebruikt werden in deze studie. ........................................... 3
Tabel 2: Malariaprofylaxe (www.itg.be, 2010) .......................................................................................... 8
Tabel 3: Behandeling malaria aanval (www.itg.be, 2010) .......................................................................... 8
Tabel 4: Significante verschillen tussen de malaria positieve en malaria negatieve groep na een Wilcoxon rank test. (Simon-Lopez, 2013) .................................................................................................................... 18
Tabel 5: Beschrijving, eenheid en meetprincipe per parameter bij analyse op de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) .......................................................................................................................... 20
Tabel 6: Baden voor het mengen van reagens met monster in de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) ................................................................................................................................................. 22
Tabel 7: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die het volume en de conductiviteit meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) .......................................................................................................................... 25
Tabel 8: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die de lichtverstrooiing meten. (Beckman Coulter Ireland, 2013) ..................................................................................................................................... 26
Tabel 9: Flags bij de rapportering van de resultaten (UniCel DxH 800) (Beckman Coulter Ireland, 2013) ....... 28
Tabel 10: Codes op de UniCel DxH800 (Beckman Coulter Ireland, 2013) ................................................... 32
Tabel 11: Parameters op de Beckman Coulter DxH80 die in deze studie worden geëvalueerd. ...................... 32
Tabel 12: Het aantal monsters met een malariafactor hoger dan 4,5 en lager dan 4,5 per groep na analyse op de UniCel DxH 800............................................................................................................................... 34
Tabel 13: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria negatieve controlegroep. ............................................................... 35
Tabel 14: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de malaria positieve controlegroep.................................................................. 35
Tabel 15: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie. ...................................... 36
Tabel 16: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse op de UniCel DxH 800 voor de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. ................................ 36
Tabel 17: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de malaria discriminant factor .... 37
Tabel 18: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten). ......................................................................................................... 38
Tabel 19: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten). ......................................................................................................... 39
Tabel 20: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de bloedplaatjes....................... 40
Tabel 21: Sensitiviteit/specificiteit malaria discriminant factor berekend op de resultaten van de monsters uit de vier groepen (positieve controlegroep, negatieve controlegroep, groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en de groep patiënten met een infectie). .................................................................... 46
Tabel 22: Significante verschillen malaria discriminant factor (Malaria D factor). ........................................ 47
Tabel 23: Interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013) ................................. 51
Tabel 24: Resultaten van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep. . 52
Tabel 25: Resultaten, foto’s en interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep. ....................................................................................................................... 52
Tabel 26: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria). ............................................................................................... 53
Tabel 27: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. ...................................................................................................................... 53
Tabel 28: Som van de resultaten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. ............................................................................................................................ 54
Tabel 29: Resultaten, specificiteit en sensitiviteit van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie. ...................................................................................... 54
Tabel 30: Resultaten van de microscopie (dikdruppel en bloeduitstrijkje). ................................................. 60
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 X | P a g i n a
Tabel 31: Het aantal geparasiteerde rode bloedcellen per µl (AP/µl), de Plasmodium species en de verschillende stadia dat werd vastgesteld bij elk monster in de malaria positieve controlegroep. ................... 60
Tabel 32: Vergelijking van de sneltest SD Biolone Malaria p.f./pan met de malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 en de ‘gouden standaard’ microscopie. ............................................................................ 63
Tabel 33: Beschrijvende statistiek van de malaria discriminant factor voor de vier groepen. ........................ 70
Tabel 34: T-test voor de vergelijking van de malaria discriminant factor tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). .......... 70
Tabel 35: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) voor de vier groepen. .................................................................................................................................. 72
Tabel 36: T-test voor de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten)tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). ....................................................................................... 72
Tabel 37: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) voor de vier groepen. .................................................................................................................................. 74
Tabel 38: T-test voor de vergelijking van de van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). ............................................................................................................... 74
Tabel 39: Beschrijvende statistiek van de spreiding van de bloedplaatjes voor de vier groepen. ................... 76
Tabel 40: T-test voor de vergelijking van de van de bloedplaatjes tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**). .............. 76
Tabel 41: De invloed van kamertemperatuur en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten) ......................................................................................................................................................... 81
Tabel 42: De invloed van koelkasttemperatuur (4°C) en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten) ........................................................................................................................................ 82
Tabel 43: Kenmerken P.falciparum (ITG) ............................................................................................... 87
Tabel 44: Kenmerken P.ovale (ITG) ...................................................................................................... 89
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 XI | P a g i n a
LIJST AFKORTINGEN
Afkorting Beschrijving Afkorting Beschrijving
# Absoluut aantal MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration
µl microliter MCV Mean corpuscular volume
2D 2 dimensionaal Mean Gemiddelde
3SD 3 keer de standaarddeviatie MHKA Militair Hospitaal Koningin Astrid
5PD 5 scatterkanalen MLT Medische laboratoriumtechnologie
AL2 Axial light loss MO Monocyten
AP Aantal parasieten MPV Mean platelet volume
Apr. Apotheker MTM Multitransducermodule
AUC Area under the curve n Aantal
BA Basofielen NE Neutrofielen
CBC Complete blood count NRBC Genucleërde rode bloedcellen
CRP C-reactief proteïne p p-waarde
d.w.z. dit wil zeggen P. Plasmodium
DC Gelijkstroom P.f. Plasmodium falciparum
DIFF Differentiatie PCR Polymerase chain reaction
EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur pLDH parasiet- Lactaat dehydrogenase
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay PLT Platelet
EO Eosinofielen RBC Rode bloedcellen
fL Femtoliter RDT Rapid Diagnostic Test
HCT Hematocriet RDW Red cell distribution width
HGB Hemoglobine RDW-SD Red cell distribution width- standaarddeviatie
HIV HIV- infectie RF Radiofrequentie
HRP Histidine-rich-proteïne RLALS Rotated low angle light scatter
ID Identificatie RLS Rotate light scatter
ITG Instituut voor Tropische Geneeskunde SAM Sample aspiration module
LDH Lactaat dehydrogenase SD V Standaarddeviatie van het volume
LMALS Lower M axial light scatter SMS Slidemaker stainer
LY Lymfocyten t.o.v. ten opzichte van
m.b.v. met behulp van UMALS Upper M axial light scatter
MALS LMALS +UMALS V Volume
MCH Mean corpuscular hemoglobin VCS Volume Conductiviteit Scattering
Vsd Standaarddeviatie van het volume
WBC Witte bloedcellen
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 XII | P a g i n a
SAMENVATTING
Malaria is een tropische ziekte die uitgezonden militairen in risicogebieden kan treffen. Er
is noodzaak naar een snelle diagnose wanneer er een vermoeden is van een malaria-
infectie om de juiste behandeling toe te passen. Een gecalculeerde malaria discriminant
factor ((standaarddeviatie volume lymfocyten * standaarddeviatie volume
monocyten)/100) op een automatische hematologische celteller (UniCel DxH 800) zou
een additionele test kunnen zijn om de aanwezigheid van een malaria-infectie aan te
tonen. De malaria dicriminant factor op de automatische celteller werd vergeleken met
de malaria antigen P.f./pan sneltest en de lichtmicroscopie als referentiemethode. Deze
studie heeft als doel vast te stellen of de factor kan worden toegepast in de routine van
het Militair Hospitaal Koningin Astrid. In deze studie werd gebruik gemaakt van een
negatieve controlegroep (296 monsters negatief voor malaria afkomstig van 296 gezonde
personen) en een positieve controlegroep (6 monsters van 6 patiënten die
gediagnosticeerd werden met malaria). Daarnaast werd gebruik gemaakt van 2 andere
groepen; 178 monsters afkomstig van 52 gehospitaliseerde patiënten met een infectie en
136 monsters afkomstig van 136 personen die terugkeerden van buitenlandse missie.
Er is een groot significant verschil tussen malaria negatieve monsters en malaria
positieve monster wanneer de malaria discriminant factor, SD V monocyten, SD V
lymfocyten en de bloedplaatjes werden vergeleken (**p<0.01). Echter kunnen andere
infecties ook een verhoogde malaria discriminant factor vertonen door de aanwezigheid
van grotere monocyten en lymfocyten als reactie op de infectie. De waarden van de
malaria discriminant factor, de SD V monocyten en de SD V lymfocyten bij enkele
monsters met een ‘valspositieve’ indicatie voor malaria kunnen de resultaten van deze
waarden bij de monsters met een ‘echt positieve’ malaria discriminant factor overlappen.
De overlapping is vooral op te merken bij de SD V monocyten en in mindere mate bij de
SD V monocyten. In deze studie is een cut-off waarde van 5,0 beter geschikt voor
malaria indicatie dan de gebruikte 4,5 cut-off waarde, omdat het aantal monsters met
een valspositieve indicatie voor malaria werd gereduceerd met ongeveer 48% en de
specificiteit steeg zonder een daling van de sensitiviteit.
Het witte bloedcellen- (WBC) histogram en de nucleated red blood cells (NRBC) dataplots
kunnen geraadpleegd worden wanneer een hoge malaria dicriminant factor wordt
aangegeven om eventuele malariasignalen op te merken. Echter is de NRBC dataplot
enkel nuttig om een indicatie te geven van een eventuele P.ovale-infectie.
De sneltest kan een tweede indicatie geven voor een malaria-infectie wanneer een hoge
malariafactor wordt aangegeven, maar de microscopie blijft de gouden standaard omwille
van de hoogste sensitiviteit en specificiteit in de routine laboratoria.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2013-2014 XIII | P a g i n a
ABSTRACT
Malaria is a tropical disease that can affect military people on mission in high-risk areas.
There is need for a rapid diagnosis when there is a suspicion of malaria infection to apply
the appropriate treatment. A malaria calculated discriminant factor ((standard deviation
volume lymphocytes * standard deviation volume monocytes)/100) to an automatic
hematology cell counter (UniCel DxH 800) may be an additional test in order to detect
the presence of a malaria infection, but the specificity of this parameter is uncertain. The
factor in the automatic cell counter was compared with the malaria antigen P.f./pan
sneltest test (RDT) and light microscopy as the reference method. This study aims to
determine whether the factor can be used in the routine of the Military Hospital Royal
Astrid. In this study, a negative control group consisted 296 samples negative for malaria
from 296 healthy individuals and a positive control group consisted 6 samples from 6
patients who were diagnosed with malaria. In addition two groups were examined in the
same way as the positive and the nagative control group; the first group consisted 178
samples from 52 hospitalized patients with an infection and the second group consisted
136 samples form military people who were returning from a mission abroad.
There is a significant difference between the malaria negative samples and malaria
positive samples when the malaria discriminant factor, SD V monocytes, SD V
lymphocytes, and platelets were compared (** p < 0.01). However, other infections may
also have an increased malaria discriminant factor due to the effects of the presence of
larger monocytes and lymphocytes in response to the infection. The values of the malaria
discriminant factor, SD V monocytes and SD V lymphocytes in some samples with a
"false positive" indication for malaria had an overlap with these values in the samples
with a “real positive” indication for malaria. This overlap is particularly noticeable in the
SD V monocytes and to a lesser extent in the SD V monocytes. In this study, a cut-off
value of 5,0 for malaria indicaton was better than the 4.5 cut-off value wich was used in
this study, because the number of samples with a false positive indication for malaria
was reduced by approximately 48 % and specificity was increased without a decrease in
sensitivity.
The white blood cell (WBC) histogram and the nucleated red blood cells (NRBC) data plot
can be evaluated when a high malaria discriminant factor is been detected to notice
malaria signals. However, the NRBC dataplot is only useful to give an indication of a
possible P.ovale infection.
The rapid diagnostic test can provide a second indication of a malaria infection when a
high malaria discriminant factor is been detected but the microscopy remains the ‘gold
standard’ of its high sensitivity and specificity in routine laboratories.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 1 | P a g i n a
I. INLEIDING
Het Militair Hospitaal Koningin Astrid is een hospitaal dat de medische bijstand voorziet
van de Belgische militairen. Een aantal van deze militairen wordt onderzocht alvorens ze
op missie vertrekken en bij terugkeer van missie. De overige monsters zijn afkomstig
van militairen die een medische keuring ondergaan. Deze monsters kunnen zowel
afkomstig zijn van kandidaten als van huidig militair personeel. Daarnaast beschikt het
hospitaal over een brandwondencentrum en een hospitalisatieafdeling voor patiënten met
een infectie. Deze patiënten zijn gehospitaliseerd of komen op geregelde basis langs voor
hun nodige verzorging.
Het labo Hematologie onderzoekt interne bloedmonsters en externe bloedmonsters. De
interne bloedmonsters zijn afkomstig van militair personeel, patiënten die een onderzoek
ondergaan of van gehospitaliseerde patiënten. Externe monsters zijn afkomstig van
militair personeel op de verschillende legerbasissen in België. Onlangs werd een nieuw
hematologische automatische celteller (UniCel DxH 800) aangekocht om de celtelling en
de differentiatie van bloedmonsters te kunnen bepalen. Dit toestel biedt de mogelijkheid
om een malaria discriminant factor te laten bepalen op de monsters die door het toestel
onderzocht worden voor een differentiatie en een celtelling. Dit is een gecalculeerde
factor die afhankelijk is van de spreiding van het volume van de monocyten en de
spreiding van het volume van de lymfocyten in een bloedmonster. Hoe groter de
spreiding (SD: standaarddeviatie) van het volume tussen de monocyten en de spreiding
van het volume tussen de lymfocyten, hoe groter de waarde van de factor. Een hoge
factor zou wijzen op een vermoeden van een malariainfectie.
Deze bachelorproef begint met een korte samenvatting van de uitgevoerde studie.
Vervolgens wordt de algemene achtergrond van malaria geschetst gevolgd door een
literatuurstudie van de Beckman Coulter UniCel DxH800. In het experimenteel gedeelte
wordt het materiaal, de procedure, de resultaten en de discussie voor elke experiment in
deze studie weergegeven, gevolgd door de vergelijking met de bevindingen in de
literatuur. In de conlusie wordt de studie besproken aan de hand van de doelstellingen.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 2 | P a g i n a
II. PROBLEEMSTELLING
Deze factor is interessant voor het Militair Hospitaal Koningin Astrid omdat dit de
mogelijkheid biedt om een malariaroutinescreening uit te voeren op bloedstalen
afkomstig van militair personeel die terugkeerden van malariarisicogebieden.
Er moet echter nagegaan worden of de gehospitaliseerde patiënten met een infectie ook
een verhoogde malaria discriminantfactor hebben. Wanneer dit het geval is, zullen een
groot aantal monsters een valspositieve indicatie voor malaria vertonen. Bovendien moet
worden nagegaan of de cut-off waarde van 4,5 voldoende sensitiviteit en specificiteit
biedt om malaria te detecteren.
Deze studie heeft als doel deze factor te bestuderen aan de hand van een groep
negatieve malaria monsters afkomstig van gezonde personen, een groep stalen
afkomstig van gehospitaliseerde patiënten met een infectie, een groep stalen afkomstig
van militairen die terugkeerden van buitenlandse missie en een groep stalen van malaria
positieve patiënten om vast te stellen of deze factor gebruikt kan worden in het
Hospitaal.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 3 | P a g i n a
Malaria discriminant factor
>4,5
SD Bioline Malaria p.f./pan sneltest
Microscopie
Bloeduitstrijkje
Dikdruppel
III. PROEFOPSTELLING
Gedurende 12 dagen werden EDTA-volbloed
stalen van de malaria negatieve
controlegroep, de groep patiënten met een
infectie en de groep terugkerende militairen
van buitenlandse missie geanalyseerd op de
UniCel DxH 800. Van elk staal binnen de groep werden de resultaten van enkele
parameters bijgehouden (tabel 1). Wanneer een malaria factor hoger dan 4,5 door het
toestel werd berekend, werd een Malaria antigen P.f./pan sneltest uitgevoerd om een
eventuele malaria-infectie te kunnen bevestigen.
Tabel 1: Parameters op de UniCel DxH 800 die gebruikt werden in deze studie.
Complete blood count (CBC) Differentiatie Additionele gegevens
Rode bloedcellen count Neutrofielen SD V lymfocyten
Bloedplaatjes count Lymfocyten SD V monocyten
Witte bloedcellen count Monocyten Malaria discriminant factor
Eosinofielen
Basofielen
Van deze bloedmonsters werd ook een geautomatiseerd of manueel bloeduitstrijkje
gemaakt en gekleurd met May-Grünwald Giemsa door de Beckman Coulter SMS. Een
dikdruppel preparaat werd bereid en gekleurd met Giemsa. Beide werden onder de
lichtmicroscoop bekeken om na te gaan of er effectief sprake was van malaria. Indien er
Plasmodium-parasieten op te merken waren in het bloeduitstrijkje of in de dikdruppel,
werd een telling uitgevoerd om het aantal parasieten of het aantal geïnfecteerde RBC per
µl volbloed te bepalen. Vanaf er één parasiet in het bloeduitstrijkje of dikdruppel
aanwezig is, werd het monster als positief voor malaria bevonden, maar wel ter
confirmatie opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde. Stalen met een
malariafactor hoger of gelijk 4,5 met een negatieve sneltest, een negatieve dikdruppel en
een negatief bloeduitstrijkje werden als vals positief aangenomen. Stalen met een
malariafactor lager dan 4,5 met een negatieve sneltest, een negatieve dikdruppel en een
negatief bloeduitstrijkje werden als negatief aangenomen.
Vervolgens werd aangetoond of er een significant verschil is tussen de 4 groepen op vlak
van de malaria discriminant factor, de SD V lymfocyten, de SD V monocyten en de
bloedplaatjes door deze resultaten statistisch te verwerken in een boxplot en de
significante verschillen aan te tonen met een t-test. Een ROC-analyse werd uitgevoerd
om de ideale cut-off waarde in deze studie te bepalen.
Figuur 1: Proefopstelling studie
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 4 | P a g i n a
Malariagevallen gediagnosticeerd in België (2005) (n=210)
P.malariae
P.ovale
P.vivax
P.falciparum
IV. THEORIE
1. ACHTERGROND
1.1. MALARIA
Malaria is een parasitaire infectieziekte die overgedragen wordt door de Anopheles mug
die de vector is voor de protozoa van het geslacht Plasmodium. Er zijn een 146 tal
verschillende soorten Plasmodium die verschillende gastheren kunnen infecteren,
bijvoorbeeld mensen, apen, vogels, knaagdieren, enzovoort. Er zijn vier Plasmodium
species die de mens infecteren en malaria kunnen veroorzaken. P.falciparum kan
potentiëel dodelijk zijn omdat het zich kan ophopen in de bloedvaten van de hersenen.
(Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)
(Guillaume, 2009)
1.2. MALARIA IN BELGIË
Malaria treedt in België vooral op bij
patiënten die verbleven hebben in een
malaria risicogebied en daar een malaria-
infectie hebben opgelopen, hiervoor
gebruikt men de term importmalaria.
Vroeger kwam malaria wereldwijd voor,
maar de infectieziekte werd in Europa
uitgeroeid waardoor de infectiehaarden
verdwenen. Tot 2000 steegde de
‘importmalaria’ door de groei van migratie,
missies en reizen naar tropische streken.
Na 2000 was er een daling door het nemen
van van nieuwe profylaxe.
Malaria kan buiten de risicogebieden ook optreden in de omgeving van luchthavens, men
spreekt in deze gevallen over airportmalaria. De geïnfecteerde Anopheles mug kan
bijvoorbeeld meereizen in de bagageruimte van een vliegtuig of in containers vanuit de
malaria risicogebieden. Wanneer de mug de reis overleeft kan deze nog in staat zijn om
een mens te infecteren. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische
Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)
Figuur 2: Plasmodium species verdeling van 210
malariagevallen in België in 2005 (Instituut voor
Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 5 | P a g i n a
In Europa werden 64 gevallen van airportmalaria vastgesteld tussen 1969 en 1996. In de zomer van 1995
werden zelfs 6 malariagevallen gedetecteerd in de luchthaven van Brussel bij personen die nooit in het
buitenland geweest waren, waarvan zelfs één met dodelijke afloop. Drie van deze patiënten waren personeel
van de luchthaven en de overige 3 patiënten waren bezoekers van de luchthaven. (Instituut voor Tropische
Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)
Malaria kan ook overgedragen worden via transplantatatie van organen (hart, nieren,
lever), via bloedtransfusie of per ongeluk door het personeel in de laboratoria en
zorginstellingen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007)
1.1. PARASIET
Er zijn vier Plasmodium species die de mens infecteren en malaria kunnen veroorzaken;
P.falciparum, P.vivax, P.ovale en P.malariae. Meer info en afbeeldingen over deze
parasieten in ‘Bijlage 1: Plasmodium Falciparum’ en ‘bijlage 2: Plasmodium Ovale’
De cyclus bevat een seksuele cyclus (sporogenie) met vermenigvuldiging in bepaalde
Anopheles soorten en een aseksuele cyclus (schizogenie) met vermenigvuldiging in de
gewervelde gastheer. De levenscyclus is voor de vier species van Plasmodium
gelijkaardig met slechts enkele verschillen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische
Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009)
1.1.1. ASEKSUELE CYCLUS IN DE MENS
De besmette Anopheles mug steekt de mens en zuigt bloed op. Tijdens het steken
worden de sporozoïeten geïnjecteerd in de bloedstroom van de mens met een beetje
speeksel van de mug dat een anticoagulans bevat. De sporozoïeten in de bloedstroom
migreren naar de lever waar ze de levercellen (hepatocyten) binnen dringen waarin de
parasiet zich aseksueel zal vermenigvuldigen (schizogenie in de lever, pre-erytrocytaire
fase) tot een schizont ontstaat. Deze schizont leidt uiteindelijk tot duizenden merozoïten.
De fase in de lever is de incubatieperiode van de parasiet en verloopt asymptomatisch.
Uiteindelijk barst de levercel die de schizont bevat open waardoor al de merozoïeten
vrijkomen in de bloedbaan. Elke merozoït infecteert een rode bloedcel. Wanneer de
parasiet in de rode bloedcel zit, spreekt men van een trofozoïet. In de rode bloedcel zal
de parasiet zich opnieuw vermenigvuldigen tot een schizont (schizogenie in de rode
bloedcel, erytrocytaire fase). Deze schizont voedt zich met het hemoglobine in de rode
bloedcel wat leidt tot het metabolisatieproduct hemozoïne. Dit hemozoïne bestaat
voornamelijk uit ijzercomponenten en toont zich onder de vorm van een pigment. Op het
einde van de vermenigvuldiging barst ook hier de schizont open en komen de
merozoïeten vrij die opnieuw nieuwe rode bloedcellen kunnen infecteren, wat gepaard
gaat met symptomen (koortsige aanvallen).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 6 | P a g i n a
Sommige leverschizonten kunnen blijven voortbestaan in de levercellen tot jaren na de
infectie, namelijk hypnozoïeten. Hypnozoïeten worden alleen teruggevonden bij P.ovale
en P.vivax. Hypnozoïeten kunnen de oorzaak zijn van een nieuwe malaria aanval tot zelfs
jaren nadat de persoon teruggekeerd is uit de streek waar hij besmet raakte. Na de
verschillende cycli in de rode bloedcellen zullen sommige parasieten zich differentiëren in
seksuele vormen, namelijk gametocyten. Wanneer een Anopheles mug deze persoon
terug steekt zal de mug deze gametocyten opnemen. Deze mug is de vector waarin de
seksuele cyclus van de parasiet plaats vindt. Gametocyten geven geen symptomen bij de
geïnfecteerde personen. Deze kunnen zelfs tot meerdere dagen of weken na de
behandeling teruggevonden worden in het perifere bloed omdat deze niet gevoelig zijn
aan de behandeling. Door de opeenvolging van de erytrocytaire cycli zal de parasitemie
zich steeds verhogen. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009) (World Health Organization, 1999)
1.1.2. SEKSUELE CYCLUS IN DE ANOPHELES MUG
Er zijn 60 soorten Anopheles muggen die een belangrijke vector zijn voor malaria.
Aangezien enkel de vrouwelijke muggen een bloedmaaltijd nemen, komen ook enkel
deze muggen in aanmerking voor de overdracht van malaria. Wanneer de vrouwelijke
Anopheles mug een bloedmaaltijd neemt bij een mens met malaria, zuigt deze zowel de
aseksuele vormen op als de gametocyten. Enkel de gametocyten overleven de vertering
in de mug en kunnen zich verder ontwikkelen. Mannelijke gameten delen zich in
gameten die de vrouwelijke gameten kunnen bevruchten wat tot het voortbrengen van
zygoten leidt. Deze zygoten vormen zich om tot mobiele oökineten. Oökineten migreren
door de maagwand van de mug en nestelen zich in de buitenwand van de maag. Deze
genestelde oökineten worden oöcysten genoemd. Een oöcyst kan duizenden sporozoïten
produceren en loslaten rond de maag van de mug. De losgelaten sporozoïten migreren
naar de speekselklieren van de mug. De ontwikkeling in de mug is afhankelijk van het
Plasmodium species, maar ook van de buitentemperatuur. Hoe lager de
buitentemperatuur, hoe trager de cyclus en zelfs bij een temperatuur onder de 18°C is
de ontwikkeling zo traag dat de levensduur van de mug overschreden wordt. (Instituut voor
Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Guillaume, 2009)
(Simon-Lopez, 2013)
1.2. IMMUNITEIT
Malaria komt in bepaalde streken vaak voor, deze streken worden ‘endemische’ streken
genoemd. Omdat de lokale bevolking in deze streken frequent geïnfecteerd werd hebben
sommige personen na enkele jaren een natuurlijke immunisatie verwoven voor de
parasiet. Echter komt deze immuniteit langzaam op gang en verschijnt dit pas 2 tot 5
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 7 | P a g i n a
jaar na blootstelling. Door deze ‘verworven’ immuniteit kunnen deze personen de
parasiet asymptomatisch dragen. Dit betekent echter niet dat deze personen een totale
bescherming hebben voor malaria, ze kunnen nog steeds geïnfecteerd worden maar
vertonen echter geen symptomen. Deze immuniteit is labiel en verdwijnt tussen de 12
en 24 maanden in afwezigheid van herinfectie. Het biedt dus zeker geen garantie tot een
totale en levenslage immuniteit. In deze streken worden vooral jonge kinderen en
zwangere vrouwen getroffen door malaria. Jonge kinderen hebben nog geen voldoende
immuniteit opgebouwd en. Bij zwangere vrouwen is de immuniteit verzwakt en kan de
parasiet zich manifesteren in de placenta. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische
Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (Lee et al, 2012) (World Health
Organization, 1999) (World Health, Organization, 2012)
Niet-endemische gebieden zijn gebieden waar malaria helemaal niet frequent voorkomt.
Bijgevolg is deze bevolking ook niet geïmmuniseerd. Personen uit deze bevolking hebben
een grotere kans op malaria omdat ze geen verwoven immuniteit hebben. (Instituut voor
Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (World Healt Organiztion,
2012)
1.3. THERAPIE
1.3.1. PROFYLAXIE
De muggen in de risicogebieden zijn vooral ’s avonds en ’s nachts actief, door
beschermende kledij te dragen en te slapen onder een muskietennet kan een beet van
een Anopheles mug al vermeden worden
Malaria-infectie bij reizigers in de risicogebieden wordt voorkomen door het innemen van
malariaprofylaxe (chemoprofylaxe) middelen. Profylaxe middelen voorkomen geen
besmetting maar wel een uitbraak van een malaria aanval, maar kunnen wel de aanval
uitstellen. Afhankelijk van het gebied, het seizoen, de verblijfsduur en eerder ingenomen
profylaxe wordt voor een bepaalde profylaxe gekozen. (www.itg.be, 2010) (World Health
Organization, 2012)
Er wordt volop onderzoek verricht naar de ontwikkeling van een vaccin tegen malaria
door het opsporen en onderzoeken van de verschillende antigenen. Maar tot nu toe is er
nog steeds geen efficiënt vaccin werkzwaam. Het doel van vaccinatie is om in het
lichaam antistoffen te vormen die specifiek binden aan de antigenen van de parasiet.
(Strien, 2002)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 8 | P a g i n a
Tabel 2: Malariaprofylaxe (www.itg.be, 2010)
Actieve stof Beschrijving
Chloroquine P.vivax, P.ovale en P.malariae, P.falciparum is vaak resistent
Voor reizigers: één week voor vertrek innemen tot weken na terugkomst ( 3
tabletten per week)
Atovaquon + proguanil P.vivax, P.ovale en P.malariae en P.falciparum
Voor reizigers: één dag voor vertrek innemen tot 1 week na terugkomst
(1 tablet/dag)
Mefloquine P.vivax, P.ovale, P.malariae en P.falciparum
Voor reizigers: twee weken voor vertek innemen tot 4 weken na terugkomst
(1 tablet/week)
Doxycycline P.vivax, P.ovale, P.malariae en P.falciparum
Voor reizigers: één dag voor vertek innemen tot 4 weken na terugkomst
(1 tablet/dag)
1.3.2. BEHANDELING
Om een acute malaria-aanval te behandelen komen verschillende actieve stoffen in
aanmerking.
Tabel 3: Behandeling malaria aanval (www.itg.be, 2010)
Actieve stof(fen) Beschrijving
Atovaquon + Proguanil 4 tabletten éénmaal per dag
Artemether + Lumefantrine
24 tabletten (6x 4 tabletten) in een periode van 60 uur
Kinine + Doxycyxline Minimum 3 dagen inname van kininesulfaat (500mg) om de 8 uur en op
dag 3 of 2 wordt doxycycline gestart (200mg) en de dag erna wordt de
dosis gehalveerd (100mg) gedurende de komende 6 dagen.
Artemsinine combinaties Artesunaat (dag 1 200mg, dag 2 100 mg) altijd in combinatie met
doxycycline of mefloquine.
Chloroquine 25 mg per kg lichaamsgewicht op drie dagen (enkel bij verlaten van een
gebied waar P.falciparum of choroquine resistentie zeer laag is of
onbestaand).
1.4. RESISTENTIE
Bij de Plasmodium-parasiet kunnen ook toevallige mutaties van het parasitaire genoom
optreden. Wanneer deze mutaties optreden wanneer antimalariatherapie wordt
toegepast, zullen parasieten zonder mutatie vernietigd worden, maar parasieten met een
mutatie kunnen de parasiet resistent maken tegen de behandeling waardoor deze de
therapie overleven. Zo zullen deze ‘resistente’ parasieten zich verder vermenigvuldigen
waardoor de reeds toegepaste therapie niet meer effectief zal zijn. Op deze manier is er
voor vele antimalariamedicatie langzaam een resistentie ontstaan. Vandaar is het
belangrijk om steeds op zoek te gaan naar nieuwe therapieën. De keuze voor een
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 9 | P a g i n a
therapie waar twee actieve stoffen gecombineerd worden, vermindert de kans op
resistentie. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen,
2007) (World Health Organization, 1999)
1.5. RECIDIVITEIT
Naast resistentie kan ook recidiviteit optreden. Wanneer een therapie niet de
interhepatische parasieten (hypnozoïeten) bij P.vivax, P.ovale en P.malariae infecties
treft, kunnen deze ook lang in de lever verblijven en de oorzaak zijn van een herval.
(Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007)
1.6. SYMPTOMEN
De symptomen van een malaria-infectie zijn moeilijk te definiëren en heel aspecifiek. Een
hoge parasitemie gaat niet steeds gepaard met sterkere symptomen. De meest
voorkomende symptomen zijn koorts, rillingen, gewrichtspijn, soms overgeven en
diarree. Deze symptomen lijken erg op een griep waardoor malaria soms hiermee
verward. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen,
2007) (Castrynck, 2013) (World Health Organization, 2003)
1.7. KLINISCHE VERSCHIJNSELEN
1.7.1. HEMATOLOGIE
In sommige gevallen van een malaria-infectie wordt een verlaagd aantal bloedplaatjes of
trombocyten teruggevonden (trombopenie). Zowel leukopenie als leukocytose kunnen
optreden bij een infectie met de Plasmodium parasiet. Bij een malaria-infectie kunnen
ook grote lymfocyten en monocyten waargenomen worden omdat deze cellen de infectie
willen bestrijden door fagocytose. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization, 2003)
1.7.2. BIOCHEMIE
Bij malaria kan ook het C-reactief proteïne (CRP) verhoogd zijn omwille van de infectie.
Ook kan het gehalte billirubine verhoogd zijn door de lyse van de levercellen. Een
verhoogd gehalte lacaat dehydrogenase (LDH) en hypoglycemie worden ook soms
teruggevonden bij een malaria-infectie. (Paugam & Yera, 2005) (Nicolas et al., 1998)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 10 | P a g i n a
1.8. DIAGNOSE
De diagnose van malaria kan vastgesteld worden door microscopie (onderzoek
bloeduitstrijkje en dikdruppelpreparaat), immunochromatografische sneltesten, serologie,
moleculaire technieken (PCR) en automatische celtellers.
1.8.1. MICROSCOPIE
Microscopisch onderzoek kan uitgevoerd worden op een bloeduitstrijkje of een
dikdruppelpreparaat. Als monster wordt volbloed gebruikt dat wordt afgenomen via een
vingerprik of via een veneuze punctie. Het bloeduitstrijkje wordt gekleurd met May-
Grünwald Giemsa en het dikdruppelpreparaat met Giemsa. Het bloeduitstrijkje wordt
vooral gebruikt om de Plasmodium species te differentiëren. (Instituut voor Tropische
Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World
Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999)
1.8.2. IMMUNOCHROMATOGRAFIE (SNELTEST)
Commerciële malariasneltesten zijn gebaseerd op het immunochromatografisch principe.
Deze testen detecteren de parasitaire antigenen in een bloedhemolysaat. Deze testen
bevatten monoklonale antilichamen gericht tegen één of meerdere Plasmodium
antigenen. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007)
1.8.2.1. HRP-2
HRP-2 is een wateroplosbaar proteïne, namelijk een glycoproteïne dat geproduceerd
wordt door de aseksuele vormen en de jonge gametocyten van P.falciparum. Dit proteïne
wordt in grote hoeveelheid teruggevonden op de oppervlakte van de geparasiteerde rode
bloedcellen omdat het uitgescheiden wordt doorheen de celwand van de geïnfecteerde
rode bloedcel. Momenteel wordt steeds HRP-2 gedetecteerd samen met een panmalaria
antigen, dit is een antigen dat geproduceerd wordt door alle vier species van
Plasmodium. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007) (Hopkins et al., 2007) (Hänscheid, 199)
1.8.2.2. PLDH
Het panmalaria antigen pLDH, parasietspecifiek lactaat dehydrogenase is een enzyme dat
betrokken is bij de glycolyse en wordt geproduceerd door de aseksuele vormen en de
gametocyten van de levende parasieten en in mindere mate door de sexuele vormen.
(Paugam & Yera, 2005) (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007) (Hopkins et al., 2007) (Hänscheid, 199)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 11 | P a g i n a
1.8.3. SEROLOGIE
De antilichamen in het bloed kunnen ook aangetoond worden en een hulp zijn bij de
diagnose. Maar deze zijn pas aantoonbaar minstens één week na het begin van de
symptomen. Onderzoek voor deze fase zou tot vals negatieve vastellingen leiden en
bovendien kunnen reeds genezen patiënten tot enkele maanden vals positief reageren.
Deze opsporing kan wel van belang zijn om aan te tonen of een persoon in het verleden
een malaria-infectie heeft doorgemaakt. Deze antilichamen geven geen bescherming
tegen en volgende besmetting. De meest gebruikte technieken zijn de indirecte
immunofluorescentie en de ELISA-test. Deze methode gebruikt de antigenen voor de
detectie van antilichamen tegen Plasmodium. De parasitemie die nog te laag is om in een
dikdruppel zichtbaar te zijn, is de subpatente parasitemie. Deze parasitemie kan echter
wel al gedetecteerd worden door de serologische technieken. (Paugam & Yera, 2005) (Instituut
voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) Deze techniek
wordt toegepast voor de screening van bloeddonoren en voor de bevestiging van een
vroegere vermoedde malaria-aanval. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging
van LaboratoriumTechnologen, 2007)
1.8.4. MOLECULAIRE TECHNIEKEN
Deze technieken worden toegepast in de referentielaboratoria voor malaria. Deze
techniek heeft de grootste gevoeligheid en de grootste specificiteit en wordt niet
toegepast in de routine omdat dit een tijdrovende en dure techniek is. De techniek is het
beste voor de identificatie van twijfelachtige species en ook voor de vaststelling van een
menginfectie. De test wordt toegepast als confirmatie van de microscopie. De subpatente
parasitemie kan echter wel al gedetecteerd worden met de PCR-techniek. (Instituut voor
Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005)
(Hänscheid, 199)
1.8.5. HEMATOLOGISCHE ANALYSERS
Hematologische analysers kunnen ook bijdragen in de detectie van malaria. De Abott
Cell-Dyn 3000 en 4000 kunnen het hemozoïne in de monocyten en neutrofielen
detecteren door depolarisatie van licht. De Abott Cell-Dyn 4000 kan ook het aanwezige
DNA van de parasiet in de geïnfecteerde rode bloedcellen detecteren door de
fluorescentiekleuring die normaal wordt gebruikt voor de telling van reticulocyten. De
UniCel DxH 800 meet de standaarddeviatie van het volume van de lymfocyten en
monocyten en berekent hieruit een discriminant factor voor de indicatie van malaria. Dit
laatste toestel wordt gedetailleerd besproken in het experiment ‘1. Beckman Coulter
UniCel DxH 800’. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen, 2007) (Campuzona-Zulunga, 2010) (Briggs et al., 2006)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 12 | P a g i n a
2. LITERATUUR
Het menselijk lichaam reageert op een malaria-infectie door een stijging van het aantal
monocyten en de activering van monocyten wat resulteert in grotere monocyten.
Mononuclaire fagocyterende cellen zullen bij een malaria-infectie trachten de
geïnfecteerde rode bloedcellen te fagocyteren. Hemozoïne is een bruin pigment dat
geproduceerd wordt wanneer de parasieten het hemoglobine in de rode bloedcellen
verteren. Hemozoïne wordt gefagocyteerd door neutrofielen en monocyten. Het is ook
bewezen dat de lymfocyten een belangrijke rol spelen in de afweerreactie op malaria.
Door de activatie van de lymfocyten zijn deze cellen ook groter dan de gewone
lymfocyten. (Pierce & Miller, 2009) (Chua et al., 2013) (Fourcade et al., 2004) (Briggs et al., 2006) (Lee at
al, 2012) (Simon-Lopez, 2013)
Studies hebben aangetoond dat de spreiding (standaarddeviatie: SD) van het volume
(grootte) van de populatie monocyten en de populatie lymfocyten significant verschillend
is bij een malaria-infectie t.o.v. normaal. Beckman Coulter UniCel DxH 800 is een
automatische hematologische celteller die deze grootte of volume van de cellen in deze
populaties meet en een standaarddeviatie op deze populatie berekent met behulp van de
VCS technologie. De VCS technologie laat toe om het volume, conductiviteit en de
scattering van een cel simultaan te meten. Meer informatie over deze technologie wordt
vermeld in ‘1.1.3. Meetprincipe’. Het volume van een cel wordt volgens het impedantie
principe gemeten. Uit de standaarddeviatie van het volume van de monocyten (SD V
monocyten) en de standaarddeviatie van het volume van de lymfocyten (SD V
lymfocyten) wordt een malaria discriminant factor berekend. Wanneer deze factor hoger
is dan een bepaalde cut-off waarde, wijst dit op een indicatie van een malaria-infectie.
(Fourcade et al., 2004) (Briggs et al., 2006) (Lee at al, 2012) (Simon-Lopez, 2013)
Figuur 3: VCS-data (V: volume, C: conductiviteit, S: scattering) met het gemiddelde (Mean) en de
standaarddeviatie (SD) van de populatie witte bloedcellen (NE: neutrofielen, LY: lymfocyten, MO: monocyten
en EO: eosinofielen) na telling en differentiatie op de UniCel DxH 800. Links de VCS-data van een persoon in
goede gezondheid. Rechts de VCS-data van een persoon met een malaria-infectie die een duidelijk hoger
gemiddeld volume en een grotere standaarddeviatie van de monocyten en lymfocyten weergeeft. (Briggs et al.,
2006)
Een witte bloedcelhistogram (WBC histogram) onderscheidt na analyse de witte
bloedcellen van de gekernde rode bloedcellen (erytroblasten) en puin (apoptotische
cellen, celmembranen, infectieuze organismen,…) op basis van hun grootte uitgedrukt in
fL. Vanaf de drempelwaarde van 35 fL worden cellen als witte bloedcellen geïdentificeerd.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 13 | P a g i n a
Een WBC histogram geeft een grootteverdeling weer van de witte bloedcellen. Een WBC
histogram van een monster met een malaria-infectie vertoont een kleine extra piek voor
de drempel van 35 fL die afwezig is bij personen in goede gezondheid. (Briggs et al., 2006)
(Simon-Lopez, 2013)
Figuur 4: Histogram van de witte bloedcellen met op de x-as de grootte of volume (fL) en op de y-as de
celfrequentie. Links een histogram van een persoon in goede gezondheid en rechts van een persoon met een
malaria-infectie met een extra piek voor de drempelwaarde van 35 fL. (Briggs et al., 2006)
Voor de differentiatie van de verschillende celpopulataties wordt een 2D-dataplot
weergegeven die het volume (y-as) uitzet t.o.v. geroteerde lichtverstrooiing (x-as). Door
de aanwezigheid van geactiveerde monocyten en geactiveerde monocyten in monsters
met Plasmodium parasieten, is de populatie monocyten en lymfocyten op de dataplot
minder geconcentreerd dan bij monsters van gezonde personen. Door de heterogeniteit
in volume (grootte) van cellen binnen de populatie, liggen de dots ook meer verspreid en
minder geconcentreerd. (Briggs et al., 2006) (Simon-Lopez, 2013)
Figuur 5: 2D-dataplot van de bloedcepopulaties met op de x-as de lichtverstrooiing en op de y-as het volume.
Links een persoon in goede gezondheid met een goede scheiding in de celpopulaties en een geconcentreerde
lymfocyten en monocyten populatie. Rechts een persoon met een malaria-infectie met geen goede scheiding
tussen de celpopulaties en een heterogene minder geconcentreerde lymfocyten en monocyten populatie.
(Briggs et al., 2006)
Studie Briggs et al.
Een studie in Zuid-Afrika en Londen onderzocht een groep monsters afkomstig van
gezonde personen met bloedwaarden binnen de referentiewaarden (n=1079), een groep
monsters waar een malaria onderzoek door de dokters is aangevraagd (n=275) en een
groep monsters afkomstig van personen met een HIV-infectie (n=51). Deze groepen
werden geanalyseerd met de VCS technologie en werden vergeleken met de microscopie
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 14 | P a g i n a
en immunologische diagnostische technieken. De monsters bestonden uit perifeer bloed
in K3EDTA tubes. Uit de groep waarop een malaria onderzoek werd aangevraagd bleken
147 monsters echt positief voor een malaria-infectie, de overige stalen waren afkomstig
van personen met koorts, virale of besmettelijke ziektes. De monsters werden
geanalyseerd op de Beckman Coulter analyser en microscopisch onderzocht ter
referentie. De resultaten van de SD volume van de lymfocyten en monocyten, het
gemiddelde volume van monocyten, de malaria discriminant factor, het aantal
bloedplaatjes en het aantal eosinofielen werden met behulp van de Mann-Whitney U test
onderzocht om statistische verschillen vast te stellen tussen de malaria positieve
monsters verdacht op malaria-infectie, malaria negatieve monsters verdacht op malaria-
infectie, HIV positieve monsters en de monsters uit de controlegroep (gezond). De HIV
positieve groep, de malaria negatieve groep en de malaria positieve groep hadden
significant hogere waarden dan de controlegroep bij de variabelen malaria discriminant
factor, SD V monocyten, SD V lymfocyten en gemiddeld volume van de monocyten
(p<0.0001). De malaria negatieve monsters en de HIV positieve monsters waren ook
significant verschillend van de malaria positieve monsters bij deze variabelen
(p<0.0001). De malaria positieve monsters en de malaria negatieve monsters hadden
een lager aantal bloedplaatjes dan de controlegroep (p<0.05). De malaria positieve
monsters hadden een significant lager aantal bloedplaatjes dan de malaria negatieve
groep (p<0.001). De malaria positieve monsters hadden ook een lager aantal
bloedplaatjes dan HIV positieve monsters (p<0.001). (Briggs et al., 2006)
Een ROC-analyse werd ook uitgevoerd op de
malariafactor om een grenswaarde of cutt-off value in te
stellen voor de detectie van malaria. De ROC-curve
toonde aan dat de grenswaarde van 3,7 voor de malaria
factor een sensitiviteit had van 98% en een specificiteit
van 94%. Een lagere cut-off waarde resulteert in een
lagere specificiteit (hoger aantal vals waarden), een
hogere factor in een lagere sensitiviteit (hoger aantal vals
negatieve waarden). De UAC (area under the curve)
bedraagde 0,983. (Briggs et al., 2006)
In deze studie werd echter geen relatie gevonden tussen
het percentage parasitemie en de waarde van de
malariafactor. Een hoge parasitemie gaat dus niet
gepaard met een hoge malariafactor. Het type
Plasmodium species beïnvloedde ook niet de
malariafactor. (Briggs et al., 2006)
Figuur 6: ROC-analyse voor de
malariafactor. Een cut-off waarde of
grenswaarde van 3,7 vertoont een
sensitiveit van 98% en een
specificiteit van 94%. Een lagere
cut-off waarde resulteert in een
lagere specificiteit, een hogere
factor in een lagere sensitiviteit.
(Briggs et al., 2006)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 15 | P a g i n a
De valspositieve monsters waren vooral afkomstig van personen met andere infecties.
Een virale infectie zoals bijvoorbeeld HIV kan de SD V lymfocyten verhogen wat kan
resulteren in vals positieve waarden van de malariafactor. Deze studie moet herhaald
worden op monsters afkomstig van kinderen omdat kinderen verschillend van
volwassenen reageren op infecties wat kan resulteren in verschillende veranderingen in
de VCS-data. (Briggs et al., 2006)
Studie H.K. Lee et al.
De volledige bloedbeeld- (CBC) telling werd uitgevoerd op de UniCel DxH 800 tussen juli
2009 en april 2011 in Seoul in St. Mary's Hospital, Korea. Deze analyse werd uitgevoerd
op een groep personen met P.vivax infectie (84 tot 67980 AP/μL en gemiddeld 6532
AP/μL) (AP= aantal parasieten), een malaria negatieve groep (inclusief personen met
sepsis, hematologische aandoeningen en gezonde personen) en een groep monsters met
leukopenie (<2000 WBC/µl). Microscopie was de referentiemethode om malaria te
diagnosticeren en werd uitgevoerd door experts. De patiënten met een malaria-infectie
werden behandeld met hydroxychloroquine en primaquine. Enkele patiënten werden ook
opgevolgd. De dataplots van de genucleëerde rode bloedcellen (NRBC) werden
gescreend. (Lee at al, 2012)
De monsters positief voor P.vivax vertoonde karakteristieke, geaggregeerde ronde
signalen die laag gelegen waren op de RLALS-as (y-as, lichtverstrooiing) en op de AL2-as
(x-as, doorgelaten licht). De malariasignalen waren groen, de NRBC-signalen rood en de
WBC-signalen blauw op de 2D-plot. Op de differentiatie-dataplots waar het volume werd
uitgezet t.o.v. de geroteerde lichtverstrooiing (x-as, RLS) lagen de malariasignalen
horizontaal gelegen op de bodem onder de witte bloedcelpopulaties en waren rood. Deze
rode plots waren echter inclusief de rode bloedcellen die ook rode signalen geven. (Lee at
al, 2012)
Figuur 7: NRBC 2D-plot (y-as RLALS, x-as AL2) van een patiënt met een P.vivax infectie. Malariasignalen
zijn groen, NRBC-signalen rood en de WBC signalen blauw. (Lee at al, 2012)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 16 | P a g i n a
De NRBC 2D-plots van patiënten met P.vivax infectie werden verzameld in het begin van
de behandeling en gedurende enkele dagen na de behandeling. Naarmate de behandeling
vorderde, daalde het aantal malariasignalen op de dataplots. Vier tot twaalf dagen na de
behandeling verdwenen de parasieten uit het bloed en waren geen malariasignalen
zichtbaar op de plots. De grootte van de malariasignalen was ruw gecorreleerd met de
parasitemie. (Lee at al, 2012)
Figuur 9: NRBC 2D-plots van een patiënt met P.vivax-infectie. Links de dataplot op dag 0 van de behandeling,
in het midden de dataplot na 2 dagen behandeling en rechts de dataplot na 12 dagen behandeling. Naarmate
de parasitemie afneemt, neemt ook het aantal malariasignalen af. (Lee at al, 2012)
Alle monsters uit de malaria (P.vivax) positieve groep vertoonden de karakteristieke
malariasignalen op de NRBC-dataplots en waren makkelijk te identificeren, de
sensitiviteit was 100%. Slechts één monster vertoonde licht gelijkaardige signalen maar
deze signalen konden makkelijk onderscheden worden van die van de P.vivax monsters,
de specificiteit werd hierdoor 100%. Men is echter onzeker welke cellen verantwoordelijk
zijn voor deze malariasignalen. Men beweert dat de gametocyten verantwoordelijk zijn
voor deze signalen. De gametocyten zijn groter dan andere stadia en werden in alle
monsters van de malaria positieve groep teruggevonden. De rode bloedcellen worden
Figuur 8: Differentiatie 2D-plot (y-as volume, x-as RLS) van een patiënt met een P.vivax infectie.
Malariasignalen zijn rood (inclusief rode bloedcellen, neutrofielen zijn roze, de blauwe signalen zijn
lymfocyten , de groene signalen zijn monocyten , de gele signalen zijn eosinofielen en de witte signalen zijn
basofielen. (Lee at al, 2012)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 17 | P a g i n a
gelyseerd om de differentiatie uit te voeren waardoor shizonten tijdens de lyse zullen
barsten in kleine merozoiëten en bovendien zijn de trofozoëten veel te klein. Hierdoor
zijn enkel de gametocyten potentiëel verantwoordelijk voor deze signalen op de plots van
de UniCel DxH 800. (Lee at al, 2012)
Studie R. Simon-Lopez
Ook deze studie toonde aan dat in malaria positieve monsters de SD V lymfocyten
verhoogd is door de aanwezigheid van grote lymfocyten, namelijk reactieve en
geactiveerde lymfocyten en dat de SD V monocyten verhoogd is door de aanwezigheid
van geactiveerde monocyten, macrofagen en pigment-dragende monocyten. Er werden
in deze studie klinische bloedmonsters onderzocht, namelijk monsters waarvan de arts
een onverklaarde koorts vaststelde of monsters van personen afkomstig uit malaria
endemische gebieden of van personen die gereisd hebben in deze gebieden (n=89). Er
waren 32 monsters positief voor P.falciparum (n=28) en P.vivax (n=4) en 57 monsters
negatief op basis van microscopisch onderzoek van het bloeduitstrijkje. Het aantal
geïnfecteerde rode bloedcellen werd geteld en er werd een range van 0,1% tot 4,65%
geïnfecteerde rode bloedcellen bij de positieve monsters waargenomen. De monsters
waren afkomstig van zowel kinderen als volwassenen (8 maand tot 72 jaar). Alle
monsters werden geanalyseerd op de hematologische analyser Coulter GEN*STM van
Beckman Coulter. De dataplots bij malaria positieve monsters gaven een grotere
heterogeniteit in de populatie lymfocyten en monoyten en een extra populatie onder de
populatie lymfocyten weer. In het WBC histogram was een extra populatie aanwezig aan
de linkerzijde van de lymfocyten wat zichtbaar is als een extra piek voor de grenswaarde
van 35 fL. (Simon-Lopez, 2013)
Figuur 10: De 2D-dataplots en WBC-histogrammen van een normaal bloedmonster (links) en een
bloedmonster met een malaria-infectie (rechts). De dataplot van malaria toont een extra populatie aan onder
de populatie lymfocyten en een extra populatie (piek voor 35 fL grenswaarde) voor de lymfocyten op het
histogram. (Simon-Lopez, 2013)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 18 | P a g i n a
De onderzochte parameters werden onderworpen aan een statistische analyse m.b.v. de
Wilcoxon rank test. De parameters die verantwoordelijk waren voor een significant
verschil tussen de positieve en de negatieve malariagroep werden onderworpen aan een
ROC-analyse om een cut-off waarde te bepalen voor de detectie van malaria. Deze studie
toonde aan dat er een significant verschil verschil was tussen de twee groepen wanneer
het gemiddeld volume van de neutrofielen, de SD V lymfocyten, het gemiddeld volume
van de monocyten en de SD V monocyten. De ROC analyse van de malaria factor toonde
aan dat een cut-off waarde van 5,06 een sensitiviteit gaf van 96,9% en een specificiteit
van 82,5%. Een sensitiviteit van 100% gaf echter een specificiteit van 77,2%.
Omdat de SD V volumes van de monocyten en de lymfocyten significant verschillend zijn
tussen de malaria positieve bloedmonsters en de malaria negatieve bloedmonsters ,
werden op deze paramers additionele testen uitgevoerd. (Simon-Lopez, 2013)
De herhaalbaarheid, de stabiliteit en de invloed van de leeftijd van de monsters op de
parameters werden onderzocht. Enkele monsters werden meerdere malen op de analyser
geplaatst en de variatiecoëfficiënt van de twee parameters werden berekend voor elk
monster. De gemiddelde variatiecoëfficiënt van de monsters werd berekend om de
herhaalbaarheid uit te drukken, dit bedroeg voor de SD V lymfocyten 4,4% en voor de
SD V monocyten 5,5%. De invloed van de leeftijd van het monster werd geevalueerd
door 15 monsters op geregelde tijdstippen op hetzelfde toestel te analyseren (5, 8, 11,
17, 29, 53 en 77 uur na de bloedafname). De gemiddelden van het volume en de SD V
van de monocyten en lymfocyten werden berekend. Deze test toonde aan dat de SD V
lymfocyten en SD V monocyten stabiel blijven gedurende een tijdsperiode van 11u,
nadien is er een stijging. (Simon-Lopez, 2013)
Positieve Negatieve Significantie
Gemiddeld V
neutrofielen 151,8 ± 11,9 145,7 ± 12,4 p = 0.0059
Gemiddeld V
monocyten 186,6 ± 12,1 170,4 ± 11,9 p = 0.0000
SD V
monocyten 24,7 ± 3,6 20,1 ± 4,1 p = 0.0000
SD V
lymfocyten 27,6 ± 4,2 20,3 ± 4,4 p =0.0000
Tabel 4: Significante verschillen tussen de malaria positieve
en malaria negatieve groep na een Wilcoxon rank test.
(Simon-Lopez, 2013)
Figuur 11: ROC-analyse van de malariafactor
toont een cutt-off waarde van 5,06 met een
sensitiviteit van 69,9% en een specificiteit van
82,5%. (Simon-Lopez, 2013)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 19 | P a g i n a
De stabiliteit werd onderzocht door regelmatig een groep monsters van 10 testpersonen
op de Coulter Gen*STM te analyseren en ook op een ander toestel met hetzelfde VCS
detectiesysteem (LH750) gedurende een maand. Het gemiddelde van de volumes en de
SD V van de monocyten en lymfocyten werd berekend voor elke groep. Gedurende een
maand werd een range van 18,6-20,6 waargenomen voor de SD V lymfocyten en een
range van 15,3-16,9 voor de SD V monocyten met een variatiecoëfficiënt gelijk aan 4%
voor beide parameters. (Simon-Lopez, 2013)
Conclusie
Microscopie blijft de gouden standaard voor de malariadiagnose. De PCR-techniek is
bewezen gevoeliger om de 4 species te identificeren maar is vooral duur en niet praktisch
in de routinelabo’s. De malariafactor mag niet dienen als vervanging van de microscopie
maar dient om het laboratoriumpersoneel te waarschuwen om aandachtig te zijn voor
malaria in bepaalde monsters en bloeduitstrijkjes.
Figuur 13: De invloed van de leeftijd van het
monster op de SD V volume (Vsd) van de
monocyten en lymfocyten. Het gemiddelde SD V
volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten
van 10 monsters gedurende een tijdspanne van
77u. Het monster is stabiel voor deze parameter
gedurende 11 uur na de bloedafname. (Simon-
Lopez, 2013)
Figuur 12: Herhaalbaarheid. Het gemiddelde SD V
volume (Vsd) van de monocyten en lymfocyten van
10 monsters na elke run. Voor de lymfocyten is de
gemiddelde variatiecoëfficiënt 4,4% en voor de
monocyten 5,5%.(Simon-Lopez, 2013)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 20 | P a g i n a
V. EXPERIMENTEN
1. BECKMAN COULTER UniCel DxH 800
1.1. MATERIAAL EN METHODEN
1.1.1. APPARATUUR
De automatische celteller UniCel DxH 800 van Beckman Coulter werd gebruikt om de
celtelling en de differentiatie van de bloedmonsters uit te voeren.
1.1.2. MONSTER
Als monster werd gebruik gemaakt van een volbloed K3EDTA-tube. Een minimumvolume
van 200µl monster is vereist. Het monster mag maximaal 48u na afname op het toestel
geanalyseerd worden (zie Appendix 7) (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.3. MEETPRINCIPES
Beckman Coulter heeft een patent op de ‘Coulter methode’. Deze methode wordt
toegepast om de de ‘Complete Blood Count’ op een monster uit te voeren. De VCS
technologie wordt gebruikt voor de differentiatie van de witte bloedcellen. Deze
technologie steunt op 3 meetprincipes; volume, conductiviteit en laserlichtverstrooiing
(scattering). Tabel 5 geeft per parameter de beschrijving, de eenheid en het
meetprincipe weer. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Tabel 5: Beschrijving, eenheid en meetprincipe per parameter bij analyse op de UniCel DxH 800 (Beckman
Coulter Ireland, 2013)
Parameter Meetprincipe Eenheid
WBC White Blood Cell Count Coulter principe 10³ cells/μL
RBC Red Blood Cell Count Coulter principe 106 cells/μL
HGB Hemoglobine Spectrofotometrie g/dL
MCV Mean Corpuscular Volume
Gemiddeld volume van de rode bloedcellen Afgeleid uit RBC histogram fL
PLT Platelet Count Coulter principe 10³ cells/μL
MPV Mean Platelet Volume
Gemiddeld volume van de bloedplaatjes Afgeleid uit PLT histogram Fl
NE Neutrofielen percentage
[NE /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %
LY Lymfocyten percentage
[LY /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %
MO Monocyten percentage
[MO /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 21 | P a g i n a
EO Eosinofielen percentage
[EO /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %
BA Basofielen percentage
[BA /(NE+LY+MO+EO+BA events)] x 100 VCSn technologie %
NRBC Nucleated Red Blood Cell percentage
Erytroblasten VCSn technologie /100 WBC
HCT
Hematocriet
The relative volume of packed erythrocytes
to whole blood
Berekening
Hct (%) = (RBC X MCV)/10 %
MCH
Mean Corpuscular Hemoglobin
Gemiddelde hoeveelheid hemoglobine in de
RBC
Berekening
MCH (pg) = (Hgb/RBC) x 10 Pg
MCHC
Mean Corpuscular Hemoglobin
Concentration
Gemiddelde concentratie hemoglobine in de
RBC
Berekening
MCHC (g/dL) = (Hgb/Hct) x 100 g/dL
RDW
Red Cell Distribution Width
De grootteverdeling spreiding van de RBC
(Variatiecoefficiënt)
Afgeleid uit RBC histogram %
RDW-
SD
Red Cell Distribution Width – SD
De grootteverdeling spreiding van de RBC
(Standaarddeviatie)
Afgeleid uit RBC histogram fL
NE# Neutrofielen (absoluut aantal) Berekening
NE# (10³/μL) = (NE/100) x WBC 10³ cells/μL
LY# Lymfocyten (absoluut aantal) Berekening
LY# (10³/μL) = (LY/100) x WBC 10³ cells/μL
MO# Monocyten (absoluut aantal) Berekening
MO# (10³/μL) =(MO/100) x WBC 10³ cells/μL
EO# Eosinofielen (absoluut aantal) Berekening
EO# (10³/μL) = (EO/100) x WBC 10³ cells/μL
BA # Basofielen (absoluut aantal) Berekening
BA# (10³/μL) = (BA/100) x WBC 10³ cells/μL
NRBC
#
Nucleated red blood cells
(absoluut aantal)
Berekening
NRBC (10³/μL) = (NRBC/100) x WBC 10³ cells/μL
1.1.3.1. COMPLETE CLOOD COUNT (COULTER PRINCIPE)
De ‘complete blood count’ (CBC) bevat de telling van de witte bloedcellen, de rode
bloedcellen en de bloedplaatjes. De naald aspireert 165 µl monster uit de tube en een
pomp zorgt ervoor dat het monster naar het WBC- en het RBC-bad getransporteerd
wordt. Hierin wordt diulent onderaan het bad via aan opening onder een spiraalstroom in
het bad aangevoerd. In het WBC-bad wordt WBC-diluent en lyse toegevoegd, aan het
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 22 | P a g i n a
RBC-bad enkel RBC-diluent. Door deze spiraalstroom worden luchtbellen voorkomen en
ontstaat een goed mengsel. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Tabel 6: Baden voor het mengen van reagens met monster in de UniCel DxH 800 (Beckman Coulter Ireland,
2013)
WBC bad RBC bad
Monster 28 µl 1,6 µl
DxH Diluent 6 ml 10 ml
DxH Cell Lyse 1,08 ml /
Finale dilutie 1:251 1:6250
De suspensie (reagens en de cellen) wordt doorheen een meetopening geleid. Alle cellen
passeren één voor één door de meetopening. Achter de opening stroomt een extra
hoeveelheid diluent in één richting (sweep flow) die de cel meeneemt in de stroom
waardoor voorkomen wordt dat de cellen opnieuw door de opening passeren
(recirculatie) en worden geteld als bloedplaatjes. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
De coulter methode telt en meet de cellen door het meten en detecteren van
veranderingen in elektrische weerstand wanneer een partikel in een conductieve diluent
passeert doorheen een smalle opening. Aan beide kanten van de opening bevindt zich
een elektrode, deze elektroden
zorgen voor een bepaalde spanning
in de opening. Wanneer een cel of
partikel doorheen deze opening
passeert, zal dit een hogere
weerstand genereren. Dit resulteert
in een meetbare elektrische puls. De
grootte van de elektrische puls is
proportioneel aan het celvolume en
de het aantal pulsen is een waarde
voor de celtelling. (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
Om foute waarden te voorkomen (bijvoorbeeld als gevolg van een geblokkeerde
opening), wordt voor elke staalverdunning drie metingen in 3 verschillende
meetopeningen geanalyseerd. Het gemiddelde van deze metingen wordt weergegeven
als het resultaat. Er moeten minstens twee metingen zijn die binnen elkaars bereik liggen
om een resultaat te kunnen rapporteren. Een meting die volledig afwijkt van de twee
andere metingen wordt automatisch geëxcludeerd. Wanneer er voor een parameter
geen twee metingen binnen elkaars bereik liggen, geeft het systeem geen waarde voor
Figuur 14: Coulter-methode in de Beckman Coulter DxH
voor de celtelling van bloedcellen in een bloedmonster
(Beckman Coulter Ireland, 2013)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 23 | P a g i n a
deze parameter en voor de parameters die hiervan afhankelijk zijn (bijvoorbeeld de
berekende parameters). Een resultaat is dus minstens het gemiddelde van twee
metingen. Wanneer na de celtelling te weinig elektrische pulsen werden waargenomen,
zal het toestel automatisch de telling verlengen. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.3.2. HEMOGLOBINE (SPECTROFOTOMETRISCH PRINCIPE)
Vanuit de verdunning voor de WBC-telling wordt het hemoglobine in een aparte
meetkamer (cuvet) bepaald. Het lysereagens lyseert de rode bloedcellen waardoor het
hemoglobine vrij komt en met het reagens een gekleurd complex vormt
(hemochromogeen) dat gemeten kan worden. De absorptie van het gekleurd complex is
recht evenredig met het hemoglobinegehalte van het monster. Hemoglobine wordt
fotometrisch gemeten bij een golflengte van 525 nm. Een optische lichtbundel schijnt
door de cuvet en een fotodetector meet de absorptie van de lichtbundel. Hoe meer licht
geabsorbeerd wordt, hoe meer gekleurd complex aanwezig in de verdunning en hoe
hoger het hemoglobinegehalte. Bij elke analyse wordt eerst een blancometing uitgevoerd
op diluent waarmee het monstersignaal wordt vergeleken. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.3.3. DIFFERENTIATIE (VCS PRINCIPE)
Deze technologie steunt op 3 meetprincipes; volume, conductiviteit en
laserlichtverstrooiing (scattering). Beckman Coulter ontwierp een module waarin deze 3
metingen simultaan uitgevoerd kunnen worden, namelijk de multitransducermodule
(MTM). De differentiatie, de NRBC en de reticulocyten worden bepaald in de VCS-module
van het toestel. Deze module zorgt voor de dilutie van het monster in de mengkamers.
De module en reagentia staan onder gecontroleerde temperatuur zodat de lyse steeds
een correcte werking heeft. Het lyse reagens wordt eerst toegevoegd en zal de rode
bloedcellen lyseren. Nadien wordt de stabilisator toegevoegd die de activiteit van het lyse
reagens stopt door neutralisatie waardoor de vorm van de witte bloedcellen behouden
wordt. Monster en reagentia worden gemengd door een gereguleerde gerichte
luchtstroom van 4 psi. Vervolgens worden de mengsels via een valve tot in de multi-
transducing module (MTM) gebracht. Deze MTM laat één cel tegelijk passeren doorheen
de flowcel door hydrodynamische focussering. Wanneer een cel door de flowcel passeert
worden tegelijkertijd verschillende metingen uitgevoerd. Een diodelaser zal de cellen
belichten. In deze flowcel wordt het volume, de conductiviteit en de lichtverstrooiing
(onder 5 bepaalde hoeken) gemeten. Er worden steeds 8192 cellen geanalyseerd. Bij
stalen met veel interferenties, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van lyse-resistente
rode bloedcellen, worden de 8192 evenementen uitgebreid tot 50.000 evenementen. Zo
bekomt men steeds, zelfs in aanwezigheid van interferenties, een accurate formule.
(Beckman Coulter Ireland, 2013)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 24 | P a g i n a
Figuur 18: Meting van het
volume door gelijkstroom (DC)
impedantie in de MTM
(Beckman Coulter Ireland,
2013)
1.1.3.3.1. VOLUME
Het volume wordt in de MTM gemeten door gebruik te maken
van gelijkstroom (DC) impedantie. De DC impedantie is een
maat voor het celvolume van de cel. Wanneer de cel
doorheen de flowcel in het geleidend medium van de MTM
passeert zal er een verandering zijn in elektrische weerstand.
Aan beide kanten van de flowcel opening bevinden zich
elektrodes die een spanning genereren in de flowcel. De
passage van een cel zal een hogere weerstand geven wat
resulteert in een meetbare elektrische puls en de grootte van
de puls is proportioneel aan het celvolume. (Beckman Coulter
Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013)
1.1.3.3.2. CONDUCTIVITEIT
Conductiviteit is de eigenschap die een component heeft om
elektrische stroom te geleiden. De conductiviteit in de MTM
wordt gemeten door gebruik te maken van radiofrequentie
(RF) impedantie. De RF-impedantie is een maat voor de
intracellulaire inhoud. Celwanden kunnen een geleidende
functie hebben voor hoogfrequente stroom. De stroom kan
doorheen de celwand en detecteert het verschil in de
isolerende eigenschappen van de celcomponenten.
De stroom karakteriseert de nucleaire, chemische en
granulaire bestanddelen van de cel. (Beckman Coulter Ireland,
2013)
Figuur 17: Lichtverstrooiing
meting in de MTM, simultaan met
de meting van volume en
conductiviteit (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
Figuur 16: Meting van de
conductiviteit in de MTM
(Beckman Coulter Ireland,
2013)
Figuur 15: Meting van het
volume in de MTM (Beckman
Coulter Ireland, 2013)
Figuur 19: Meting van de
intracellulaire inhoud van de cel
door radiofrequentie (RF)
impedantie in de MTM.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 25 | P a g i n a
1.1.3.3.3. LICHTVERSTROOIING
Een laser zal de cel in de flowcel belichten waardoor de cel een deel van de lichtbundel
zal absorberen en een deel zal verstrooiien. Sensoren zijn onder bepaalde hoeken
geplaatst die dit licht kunnen detecteren. Een sensor die in dezelfde richting als de laser
gesitueerd is, meet het licht dat door de cel gaat. Zo kan waargenomen worden hoeveel
licht verstrooid wordt. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.3.3.4. MTM
Figuur 20: Multitransducermodule (MTM) in de UniCel DxH 800 die gebruikt wordt voor de meting van volume,
conductiviteit en lichverstrooiing of scattering (VCS technologie). De onderdelen van deze module worden
uitgelegd in tabel 7 en 8. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Tabel 7: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die het volume en de conductiviteit meten. (Beckman
Coulter Ireland, 2013)
Kanaal Electrode
1 Lower electrode (RF en DC)
2 Higher electrode(RF en DC)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 26 | P a g i n a
Tabel 8: Kanalen in de MTM module (UniCel DxH 800) die de lichtverstrooiing meten. (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
Kanaal Sensor Hoek Meting
3 AL2 0° Axial Light Loss Schaduw/absorptie
4 LALS 5°-1° Low Angle Light Scatter Grootte en structuur van de cel
5 LMALS 10°-20° Granulariteit
6 UMALS 20°-42°
7 MALS LMALS + UMALS
1.1.3.4. NRBC (VCS METHODE)
De metingen van de ‘Rotaded angle light scatter’ (RLALS) versus het licht dat door de cel
wordt doorgelaten (AL2) in de flowcel in de MTM bieden het beste onderscheid tussen
NRBC en WBC en de beste detectie van reuzeplaatjes en plaatjesaggregaten. (Beckman
Coulter Ireland, 2013)
1.1.4. REAGENTIA
1.1.4.1. DXH DILUENT
Deze isotonische bufferoplossing verdunt de monsters, spoelt de modules tussen de
verschillende analyses en zorgt voor een ‘sheat’ vloeistofstroom wanneer de
monsteroplossing door de flowcel passeert. Het wordt gebruikt voor de telling van de
WBC, RBC, bloedplaatjes en NRBC. (Beckman Coulter Ireland, 2013) (Simon-Lopez, 2013)
1.1.4.2. DXH CELL LYSE
Dit is een reagens die de rode bloedcellen lyseert om de witte bloedcellen te kunnen
tellen en om het hemoglobine gehalte te kunnen meten. Het zet het hemoglobine om in
een hemochromogeen dat fotometrisch gemeten kan worden. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
(Simon-Lopez, 2013)
1.1.4.3. DXH DIFF PACK
Dit pack bevat een erytrocytaire lysereagens die de rode bloedcellen lyseert en een
stabilisatiereagens die ervoor zorgt dat de witte bloedcellen hun vorm behouden wordt.
Deze twee reagentia verdunnen samen het monster dat nadien door de flowcel zal
passeren. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.4.4. DXH CLEANER
Deze oplossing reinigt het toestel door de residuele componenten te degraderen zodat ze
kunnen worden weggespoeld met de DxH Diluent. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 27 | P a g i n a
1.1.5. RAPPORTERING
De rapportering ven de resultaten na de analyse van een bloedmonster kan gebeuren op
verschillende manieren. Deze resultaten en rapporteringen kunnen geraadpleegd worden
op de software van het toestel (UniCel DxH 800).
1.1.5.1. CBC EN DIFFERENTIATIE
Na een complete blood count en differentiatie van een bloedmonster op de UniCel DxH
800 worden de parameters met hun eenheden gerapporteerd in het ‘Patient Results’
scherm.
Figuur 21: ‘Patient Results’ scherm die de rapportering van de resultaten (grijze kaders) weergeeft van een
bloedmonster na een ‘complete blood count’ (CBC) en een differentiatie.
1.1.5.2. FLAGS
Naast het resultaat van een parameter kunnen flags weergegeven worden. Deze flags
maken diegene die de resultaten interpreteert alert op enkele overschreden limieten of
problemen. Indien de waarde van de parameter buiten de referentiewaarden valt wordt
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 28 | P a g i n a
deze aangeduid rechts van het resultaat met een flag (H: high of L: low). (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
Tabel 9: Flags bij de rapportering van de resultaten (UniCel DxH 800) (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Flag Beschrijving
+ Resultaat boven de meetrange
- Resultaat onder de meetrange
R ‘Review’ van een resultaat vereist. Verschijnt ook bij een ‘System message’
C L Lage kritische limiet overschreden
C H Hoge kritische limiet overschreden
a L Lage actie limiet overschreden
a H Hoge actie limiet overschreden
H Hoge referentierange overschreden
L Lage referentierange overschreden
P Partiele of gedeeltelijke opzuiging gedetecteerd gedurende de monsteranalyse
N Non-bloedmonster gedetecteerd
1.1.5.3. SUPPLEMENTAIRE DATA
Door in het ‘Patient results’ scherm onderaan het tabblad ‘Additional data’ te selecteren,
verschijnt een pop-up venster waarin supplementaire data van de analyse geraadpleegd
kunnen worden. In het tabblad ‘DIFF’ wordt voor elke meting (volume, conductiviteit en
lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD)
weergegeven. Door de veranderingen in deze waarden kunnen abnormale popultaties of
heterogeniteiten van populaties opgespoord worden. De malariafactor is een
automatische regel die berekend wordt op basis van de waarde van de spreiding van het
volume van de lymfocyten (LY SD op het V kanaal) en die van de monocyten (MO SD op
het V kanaal). (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Figuur 22: Supplementaire data van de differentiatie (DIFF) geeft voor elke meting (volume, conductiviteit en
lichtverstrooiing) een gemiddelde waarde (M) en een standaarddeviatie of spreiding (SD) weergegeven.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 29 | P a g i n a
1.1.5.4. HISTOGRAM
In het ‘Patient results’ scherm worden ook 3 histogrammen weergegeven. De x-as van
het histogram geeft de relatieve celfrequentie weer t.o.v. de grootte van de cel (fL). Voor
de witte bloedcellen, de rode bloedcellen en de bloedplaatjes wordt een histogram
uitgezet en weergegeven in dit scherm. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.5.5. 2D-DATAPLOTS
Er worden 2 dataplots weergegeven om de celpopulaties na differentiatie weer te geven.
5PD1/5PD2
Een eerste dataplot 5PD1 zet volume (y-as) uit t.o.v. geroteerde lichtverstrooiing of
‘rotated light scattering’ (RLS, x-as). De tweede dataplot 5PD2 zet volume uit (y-as)
t.o.v. de ondoorzichtigheid (OP, x-as). (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Figuur 26: Histogram van de witte bloedcellen (WBC) met op de x-
as het celvolume (fL) en op de y-as de celfrequentie en de situering
van de populaties witte bloedcellen op de x-as. (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
Figuur 25: Histogram van de
bloedplaatjes (PLT) met op de x-
as het celvolume (fL) en op de y-
as de celfrequentie.
Figuur 24: Histogram van de
rode bloedcellen (RBC) met op de
x-as het celvolume (fL) en op de
y-as de celfrequentie.
Figuur 23: Histogram van de
witte bloedcellen (WBC) met op
de x-as het celvolume (fL) en
op de y-as de celfrequentie.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 30 | P a g i n a
NRBC1/NRBC2
Voor de NRBC worden ook 2 dataplots weergegeven. Deze dataplot geeft twee populaties
weer , de WBC en de NRBC. De eerste dataplot NRBC1 ze het licht dat doorgelaten wordt
door de cel (AL2, x-as) uit t.o.v. van de ‘rotaded angle light scatter’ (RLALS, y-as). De
tweede dataplot NRBC2 geeft het volume (RUMALS, y-as) weer t.o.v. van het licht dat
door de cel wordt doorgelaten (AL2, x-as). (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Figuur 28: Celpopulaties nucleated red blood cells (rood), witte
bloedcellen (blauw), en andere populaties (groen) weergegeven op de
2D-dataplot na differentiatie. Links de NRBC1-dataplot met op de x-as
het doorgelaten licht (AL2) en op de y-as de ‘rotated light angle
scatter’ (RLALS). Rechts de NRBC2-dataplot met op de x-as het
volume (RUMALS) en op de y-as het doorgelaten licht (ALS2).
Figuur 27: Celpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen),
neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje), basofielen (wit) en non-
witte bloedcellen (rood) weergegeven op de 2D-dataplots na
differentiatie. Links de 5PD1-dataplot met op de x-as de ‘rotated
light scattering’ (RLS) en op de y-as het volume (V). Rechts de 5PD2
dataplot met op de x-as het de ondoorzichtigheid (OP) en op de y-as
het volume (V).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 31 | P a g i n a
1.1.5.6. 3D-DATAPLOTS
Deze dataplot plaats 3 assen ten opzichte van elkaar waardoor een 3D structuur in de
vorm van een kubus gecreërd wordt. Deze dataplots geven de populaties weer op basis
van densiteit volume, lichtverstrooiing (RLS) en het doorgelaten licht (OP) waardoor een
3D-structuur onstaat. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.5.7. SURFACE-PLOTS
Deze hebben dezelfde assen zoals de 2D plots maar bevatten nog de densiteit op een z-
as. Deze z-as wordt weergegeven als een piekhoogte. Hoe meer cellen van een bepaalde
populatie aanwezig, hoe hoger de piek op de oppervlakte. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Figuur 31: Surface-plot van de
NRBC1-plot met op de x-as het
doorgelaten licht (AL2) en op de y-as
de ‘rotated light angle scatter’
(RLALS). Nucleated red blood cells
(rood), witte bloedcellen (blauw), en
andere populaties (groen)
Figuur 30: Surface-plot van de
5PD1-plot met op de x-as de ‘rotated
light scattering’ (RLS) en op de y-as
het volume (V). Lymfocyten (blauw),
monocyten (groen), neutrofielen
(paars), eosinofielen (oranje),
basofielen (wit) en non-witte
bloedcellen (rood)
Figuur 29: 3D-dataplot met de assen volume, lichtverstrooiing en het doorgelaten licht geeft de
elpopultaties lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje),
basofielen (wit) en non-witte bloedcellen (rood) weer.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 32 | P a g i n a
1.1.5.8. CODES
Wanneer het toestel geen resultaten kan genereren door bijvoorbeeld problemen tijdens
de analyse, wordt een code weergegeven in plaats van het resultaat. (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
Tabel 10: Codes op de UniCel DxH800 (Beckman Coulter Ireland, 2013)
Code Beschrijving
===== De analyse werd stopgezet door het systeem
::::: In de flow cel is een klonter gedetecteerd
….. De berekende parameter kan niet worden berekend omdat een van de primaire
parameters buiten de meetrange ligt. Of verschijnt wanneer de klep van het toestel
werd geopend tijdens de analyse.
+++++ Resultaat overschrijdt de operatierange
????? Resultaat ligt buiten de range van waarden die op het scherm kunnen worden
weergegeven
##### Resultaat werd verworpen
1.1.5.9. SUSPECT/SYSTEM/DEFINITIVE MESSAGES
De ‘suspect’, ‘system’ en ‘definitive’ berichten worden weergegeven in het vak
Susp/Sys/Def net onder de patiëntgegevens aan de bovenkant van het scherm. ‘Suspect’
berichten zijn rood; ‘System’ berichten zijn groen, en ‘definitive’ berichten zijn blauw.
Berichten zijn alfabetisch gerangschikt in hun soort. (Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.6. PROEFOPSTELLING
Gedurende 12 dagen werden 296 EDTA-volbloed monster van de malaria negatieve
controlegroep, 178 monsters van de groep patiënten met een infectie, 136 monsters van
de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie en 6 monsters van de malaria
positieve controlegroep geanalyseerd op de UniCel DxH 800. Van elk staal in deze
groepen werden de resultaten van enkele parameters geëvalueerd (tabel 8).
Tabel 11: Parameters op de Beckman Coulter DxH80 die in deze studie worden geëvalueerd.
Complete blood count (CBC) Differentiatie Additionele gegevens
Rode bloedcellen count Neutrofielen SD V lymfocyten
Bloedplaatjes count Lymfocyten SD V monocyten
Witte bloedcellen count Monocyten Malaria discriminant factor
Eosinofielen
Basofielen
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 33 | P a g i n a
1.1.7. METHODE
1.1.7.1. MONSTERAFNAME
Volbloed werd veneus afgenomen in paarse K3EDTA tubes. Deze tubes werden in het
trieercentrum gelabeld a.d.h.v. de aangevraagd analyses. Het was uitermate belangrijk
dat in deze monsters geen bloedstolsels aanwezig waren omdat dit resulteert in vals lage
waarden van de bloedplaatjes. De bloedmonsters in deze studie waren maximaal 48
dagen oud.
1.1.7.2. CONTROLES
Elke ochtend werden 2 controlereeksen met het toestel geanalyseerd alvorens er werd
gestart met de routinetubes. De Coulter 6C Cell controlereeks geeft de mogelijkheid om
na te gaan of het toestel nog een correcte werking heeft voor alle gemeten en
gecalculeerde parameters (CBC, differentiatie en NRBC parameters). De Coulter Retic-X
Cell controlereeks wordt toegepast om de reticulocyten parameters te controleren. Elke
controlereeks bevat 3 controletubes; een monster met hoge, normale en lage waarden
voor de parameters. Wanneer deze controles geen afwijkende waarden vertoonden (niet
boven 3SD) konden de resultaten binnen de tijdspanne van twee opeenvolgende
controles vrijgegeven worden, d.w.z. deze monsters waren correct geanalyseerd.
(Beckman Coulter Ireland, 2013)
1.1.7.3. ANALYSE OP UNICEL DXH 800
De routine EDTA-tubes werden na triage met hun dop in de casettes (rekjes) geplaatst
die compatibel zijn met de DxH 800 en de SMS en met de tubes. Dit rek heeft een
capaciteit voor 5 tubes. Elke plaats in de cassette heeft een eigen ID-barcode, de tubes
werden zodanig geplaatst dat de 2D-barcode leesbaar is langs de opening van de
cassette.
De cassette werd vervolgens op het toestel geplaatst. De transportband detecteerde het
rekje en plaatste via een transportband het rekje tot voor de barcodereader. De laser
scande de barcodes van de tubes en van de plaatsen op het rek. Op deze manier kon het
toestel weten welke tube zich waar bevindt. Het rekje werd doorgeschoven naar een
mengonderdeel, waar het hele rekje 11 keer gekanteld werd waardoor alle tubes samen
gemengd werden. Vervolgens daalde de naald en detecteerde automatisch de hoogte van
de tube om op deze manier te weten hoe diep de naald moet aspireren. Vervolgens werd
een volume van 165µl bloed geaspireerd en via tubings en valven naar de analysekamers
van het toestel geleid. Tussen de aspiratie van 2 tubes werd het rekje nogmaals 4 maal
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 34 | P a g i n a
gekanteld. Na analyse van alle tubes in het rekje, werd het rekje doorgeschoven naar de
output bufferruimte.
De aspiratienaald (SAM : Sample aspiration module) transporteerde het monster naar
een valve waar het monster werd gesegmenteerd voor een CBC analyser (Complete
blood count). Wanneer ook een differentiatie, een NRBC analyse of een reticulocyten
analyse werd aangevraagd, werd via dezelfde naald ook monster verdeeld over
verschillende dilutie of mengkamers.
1.1.7.4. STATISTIEK
De onderzochte parameters en de factor van de vier groepen werden grafisch
weergegeven als een boxplot die de verdeling van de data voorstelde. Vervolgens werd
ook met behulp van een t-test de parameter tussen alle groepen vergeleken om
significante verschillen waar te kunnen nemen. Er werd gebruik gemaakt van een t-test
op het gemiddelde van 2 reeksen ongepaarde metingen (twee verschillende groepen)
met ongelijke varianties. De outliers werden opgespoord door gebruik te maken van de
Grubb’s outlier test.
1.2. RESULTATEN
Tabel 12: Het aantal monsters met een malariafactor hoger dan 4,5 en lager dan 4,5 per groep na analyse op
de UniCel DxH 800.
Malaria discriminant factor
< 4,5
Malaria discriminant factor
> 4,5
NORMAAL (296 monsters)
Malaria negatieve
controlegroep
296 monsters 0 monsters
MALARIA (6 monsters)
Malaria positieve controlegroep 0 monsters 6 monsters
INFECTIE (178 monsters)
Groep patiënten met een
infectie
150 monsters 27 monsters
TRAVEL (136 monsters)
Groep militairen terugkerend
van buitenlandse missie
133 monsters 3 monsters
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 35 | P a g i n a
1.2.1. PARAMETERS PER GROEP
1.2.1.1. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP (NORMAAL)
Tabel 13: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse
op de UniCel DxH 800 voor de malaria negatieve controlegroep.
Complete blood count
(CBC) / differentiatie Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde
Standaard-
deviatie (SD)
Rode bloedcellen 3,78 106/mm³ 6,05 106/mm³ 5,00 106/mm³ 0,36 106/mm³
Bloedplaatjes 130 103/mm³ 391 103/mm³ 227,46 103/mm³ 45,39 103/mm³
Witte bloedcellen 3,0 103/mm³ 14,8 103/mm³ 6,80 103/mm³ 2,09 103/mm³
Neutrofielen 32 % 81% 56,77 % 8,97 %
Lymfocyten 12,3 % 57 % 30,94 % 7,96 %
Monocyten 2 % 19 % 8,95 % 2,11 %
Eosinofielen 0 % 9,4 % 2,66 % 1,78 %
Basofielen 0 % 2,1 % 0,69 % 0,36 %
SD V lymfocyten 11,27 20,46 13,90 1,21
SD V monocyten 13,62 23,55 16,86 1,58
Malaria discriminant
factor 1,6720 4,4235 2,3498 0,3646
1.2.1.2. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP (MALARIA)
Tabel 14: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse
op de UniCel DxH 800 voor de malaria positieve controlegroep.
Complete blood count
(CBC) / differentiatie Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde
Standaarddeviatie
(SD)
Rode bloedcellen 3,56 106/mm³ 6,14 106/mm³ 4,77 106/mm³ 0,94 106/mm³
Bloedplaatjes 42 103/mm³ 160 103/mm³ 106,83 103/mm³ 43,64 103/mm³
Witte bloedcellen 3,8 103/mm³ 13,4 103/mm³ 6,68 103/mm³ 3,54 103/mm³
Neutrofielen 16,9 % 87 % 63,6 % 24,23 %
Lymfocyten 9,4 % 61,5 % 23,55 % 19,80 %
Monocyten 2,3 % 20,5 % 11,25 % 7,46 %
Eosinofielen 0,4 % 1,6 % 0,93% 0,45 %
Basofielen 0,1 % 1 % 0,67 % 0,36 %
SD V lymfocyten 19,29 42,94 29,51 9,32
SD V monocyten 12,8 33,97 26,13 7,82
Malaria discriminant
factor 5,2835 9,0469 7,2485 1,7555
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 36 | P a g i n a
1.2.1.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE (INFECTIE)
Tabel 15: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse
op de UniCel DxH 800 voor de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie.
Complete blood count
(CBC) Minimum waarde Maximum waarde Gemiddelde
Standaarddeviatie
(SD)
Rode bloedcellen 2,33 106/mm³ 5,74 106/mm³ 3,60 106/mm³ 0,81 106/mm³
Bloedplaatjes 65 103/mm³ 1006 103/mm³ 363,20 103/mm³ 187,18 103/mm³
Witte bloedcellen 4,2 103/mm³ 33,7 103/mm³ 11,44 103/mm³ 5,43 103/mm³
Neutrofielen 24,90 % 94,00 % 67,4551 % 13,63 %
Lymfocyten 24,0 % 68,70 % 20,9557 % 12,18 %
Monocyten 1,00 % 16,40 % 8,5749 % 3,11 %
Eosinofielen 0,00 % 8,00 % 2,1204 % 1,73 %
Basofielen 0,00 % 1,80 % 0,391% 0,36 %
SD V lymfocyten 12,1 29,54 17,1766 2,92
SD V monocyten 14,33 29,2 20,3218 2,81
Malaria discriminant
factor 2,0180 7,0364 3,5251 0,9225
1.2.1.4. GROEP TERUGKERENDE MILITAIREN VAN BUITENLANDSE MISSIE (TRAVEL)
Tabel 16: Evaluatie van de parameters van een complete blood count (CBC) en een differentiatie na analyse
op de UniCel DxH 800 voor de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie.
Complete blood
count (CBC)
Minimum
waarde
Maximum
waarde Gemiddelde
Standaarddevia
tie (SD)
Rode bloedcellen 3,83 106/mm³ 5,71 106/mm³ 4,96 106/mm³ 0,33 106/mm³
Bloedplaatjes 82 103/mm³ 335 103/mm³ 221,03 103/mm³ 42,87 103/mm³
Witte bloedcellen 3,3 103/mm³ 15,7 103/mm³ 6,72 103/mm³ 2,13 103/mm³
Neutrofielen 37,60 % 83,80 % 57,17 % 9,40 %
Lymfocyten 10,00 % 53,00 % 31,58 % 8,41%
Monocyten 3,00 % 14,50 % 8,22 % 2,09 %
Eosinofielen 0,00 % 12,00 % 2,37 % 1,86 %
Basofielen 0,00 % 1,40 % 0,66 % 0,30 %
SD V lymfocyten 11,8 21,90 14,0404 1,43
SD V monocyten 14,17 29,11 17,0016 1,94
Malaria discriminant
factor 1,8948 5,8307 2,4024 0,5230
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 37 | P a g i n a
1.2.2. MALARIA DISCRIMINANT FACTOR
Figuur 32: Boxplot voor de evaluatie van de malaria discriminant factor met n= het aantal monsters.
Tabel 17: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de malaria discriminant factor
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL
& TRAVEL
NORMAAL &
MALARIA
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
TRAVEL &
MALARIA
Significant
verschil
**p < 0.01 p > 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 **p < 0.01 **p < 0.01
4,4235**
7,0364*
5,8307**
4,3367**
5,1859**
3,8980*
4,6494**
1,0000
1,5000
2,0000
2,5000
3,0000
3,5000
4,0000
4,5000
5,0000
5,5000
6,0000
6,5000
7,0000
7,5000
8,0000
8,5000
9,0000
9,5000
10,0000
Monsters van personen in goede
gezondheid (n=296)
Monsters van 52 personen met een
infectie (n=178)
Monsters van personen
terugkerend van missie (n=136)
Monsters van personen met een
malaria infectie (n=6)
Mal
aria
fact
or
(SD
vo
lum
e ly
mfo
cyte
n x
SD
vo
lum
e m
on
ocy
ten
) / 1
00
)
Groep
Studie malaria discriminant factor (Beckman Coulter DxH800)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 38 | P a g i n a
1.2.3. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME LYMFOCYTEN (SD V LYMFOCYTEN)
Figuur 33: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten)
met n= het aantal monsters.
Tabel 18: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor
de lymfocyten (SD V lymfocyten).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL
& TRAVEL
NORMAAL &
MALARIA
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
TRAVEL &
MALARIA
Significant
verschil
**p < 0.01 p> 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 *p < 0.05 **p < 0.01
20,4600**
29,5400**
21,9000**
20,0400**
28,5800**
20,0300**
19,0000** 19,4700*
10,0000
12,0000
14,0000
16,0000
18,0000
20,0000
22,0000
24,0000
26,0000
28,0000
30,0000
32,0000
34,0000
36,0000
38,0000
40,0000
42,0000
44,0000
46,0000
Monsters van personen in goede
gezondheid (n=296)
Monsters van personen met een
infectie (n=179)
Monsters van personen
terugkerend van missie (n=136)
Monsters van personen met een
malaria infectie (n=5)
SD V
Lym
focy
ten
Groep
Studie SD V Lymfocyten (Beckman Coulter DxH800)
(n=6)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 39 | P a g i n a
1.2.4. STANDAARDDEVIATIE VAN HET CELVOLUME MONOCYTEN (SD V MONOCYTEN)
Figuur 34: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van het volume van de lymfocyten (SD V lymfocyten)
met n= het aantal monsters.
Tabel 19: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de spreiding van het volume voor
de monocyten (SD V monocyten).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL
& TRAVEL
NORMAAL &
MALARIA
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
TRAVEL &
MALARIA
Significant
verschil
**p < 0.01 p > 0.05 *p < 0.05 **p < 0.01 p > 0.05 *p < 0.05
23,5500**
29,1100**
23,1200* 23,8800* 23,6800*
10,0000
12,0000
14,0000
16,0000
18,0000
20,0000
22,0000
24,0000
26,0000
28,0000
30,0000
32,0000
34,0000
36,0000
Monsters van personen in goede
gezondheid (n=296)
Monsters van personen met een
infectie (n=179)
Monsters van personen terugkerend
van missie (n=136)
Monsters van personen met een
malaria infectie (n=5)
SD V
Mo
no
cyte
n
Groep
Studie SD V monocyten (Beckman Coulter DxH800)
(n=6)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 40 | P a g i n a
1.2.5. BLOEDPLAATJES
Figuur 35: Boxplot voor de evaluatie van de spreiding van de bloedplaatjes met n= het aantal monsters.
Tabel 20: Significante verschillen tussen de groepen bij de vergelijking van de bloedplaatjes.
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL
& TRAVEL
NORMAAL &
MALARIA
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE
& MALARIA
TRAVEL &
MALARIA
Significant
verschil
**p< 0.01 p > 0.05 **p < 0.01 **p < 0.01 *p < 0.05 **p < 0.01
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Monsters van personen in goede gezondheid
(n=295)
Monsters van 52 personen met een
infectie (n=178)
Monsters van personen terugkerend van missie
(n=136)
Monsters van personen met een malaria
infectie (n=6)
Blo
ed
pla
atje
s (
.10
³/m
m³)
Groep
Studie Bloedplaatjes (Beckman Coulter DxH800)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 41 | P a g i n a
1.2.6. HISTOGRAM
Vier van de zes malaria positieve monsters vertoonden vermoedelijk een extra
celpopulatie kleiner dan de lymfocyten. Het histogram op dit toestel toonde de piek voor
de 35 fL grenswaarde niet, maar een hoge celfrequentie op de 35 fL grens en geen goede
afgescheiden piek voor deze grens wees op de aanwezigheid van de extra piek of
celpopulatie kleiner dan 35 fL. De celfrequentie bij de malaria positieve monsters op deze
grenswaarde is veel hoger dan die bij normale (niet malaria) monsters. Alle
histogrammen van de monsters met een vals positieve malariafactor (hoger dan >4,5)
vertoonden een lagere celfrequentie op de 35 fL grenswaarde, waardoor geconcludeerd
werd dat er geen extra celpopulatie of piek aanwezig was voor de 35 fL grenswaarde.
Figuur 36: WBC-histogrammen van de malaria positieve monsters. Histogrammen A, B, D en E vertonen geen
mooie afgescheiden piek op de 35 fL genswaarde. Het begin van een extra piek of populatie is zichtbaar ter
hoogte van de 35 fL grenswaarde.
Figuur 37: WBC-histogrammen van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5).
Histogrammen A t.e.m.H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en histogrammen I
t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie. Deze
histogrammen vertonen geen extra piek voor de 35 fL grenswaarde
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 42 | P a g i n a
1.2.7. DATAPLOTS
1.2.7.1. 5PD1
De 5PD1-dataplots van de malaria positieve monsters en de monsters met een vals
positieve malaria factor werden geëvalueerd. Deze dataplot onderscheidt de populaties
lymfocyten (blauw), monocyten (groen), neutrofielen (paars), eosinofielen (oranje),
basofielen (wit) van elkaar.
Op de dataplots van de malaria positieve monsters was een meer verspreidde populatie
monocyten en lymfocyten aanwezig op de dataplots en was er geen optimale scheiding
tussen de populaties t.o.v. een normaal monster (figuur 38 met parameters binnen de
referentiewaarden en een goede scheiding tussen de populaties). Links onderaan lagen
bij alle malaria positieve monsters een opmerkelijk grotere rode populatie t.o.v. van een
normaal monster. Deze rode populatie bevat het ‘puin’ dat niet als een witte bloedcel
werd gedefiniëerd. Volgens de literatuur zijn deze rode dots de malariasignalen.
Echter toonden enkele monsters (figuur 40: monsters A, G, I, J en K ) met een vals
positieve malaria discriminant factor (>4,5) ook een rode populatie en een meer
verspreidde populatie monocyten en lymfocyten op de 5DP1 dataplot. Bij deze monsters
was de populatie met rode dots minder dens dan bij de malaria positieve monsters.
Figuur 38: Differentiatie 5PD1-dataplot van een
normaal monster (parameters binnen
referentiewaarden en persoon in goede
gezondheid).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 43 | P a g i n a
Figuur 39: Differentiatie 5PD1-dataplots van malaria positieve monsters.
Figuur 40: Differentiatie 5PD1-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor
(>4,5). Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I
t.e.m. K zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 44 | P a g i n a
1.2.7.2. NRBC1
De NRBC1 dataplots van de malaria positieve monsters en de monsters met een vals
positieve malaria factor (>4,5) werden geëvalueerd. Deze dataplot onderscheidt de
populatie witte bloedcellen (blauw) van de gekernde rode bloedcellen of erytroblasten
(NRBC, rood) en de non-witte bloedcellen (groen).
Op de dataplots van twee monsters met een P.ovale infectie (figuur 46, monsters A en F)
was linksonder op de dataplots een duidelijke groene populatie zichtbaar t.o.v. een
normaal monster (figuur 41 met parameters binnen de referentiewaarden). Volgens de
literatuur zouden deze groene dots de malariasignalen voorstellen. De groene dots
linksboven op de dataplot waren mogelijk bloedplaatjesaggregaten. De overige malaria
positieve monsters met een P.falciparum infectie (figuur 42, monsters B, C, D en E)
vertonen echter geen groene populatie links onderaan de dataplot.
De monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5) (figuur 43)
vertoonden geen groene populatie links onderaan de dataplot.
Figuur 41: NRBC1 data-plot van een normaal
monster (parameters binnen referentiewaarden).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 45 | P a g i n a
Figuur 42: NRBC-dataplots van malaria positieve monsters.
Figuur 43: NRBC-dataplots van de monsters met een vals positieve malaria discriminant factor (>4,5).
Dataplots A t.e.m. H zijn monsters afkomstig uit de groep patiënten met een infectie en dataplots I t.e.m. K
zijn monsters afkomstig uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 46 | P a g i n a
1.2.8. SENSITIVITEIT / SPECIFICITEIT / CUTT-OFF WAARDE
Van de negatieve controlegroep en de groep patiënten met een infectie (andere infectie
dan malaria) is gekend dat deze groep negatief is voor een malaria-infectie, en bij de
positieve controlegroep dat ze positief is voor een malaria-infectie.
Wanneer de cut-off waarde voor malaria werd ingesteld op 4,5 is een sensitiviteit van
100% en een specificiteit van 94,30% waar te nemen. Op basis van deze data zou de
cut-off waarde voor de malariafactor verhoogd kunnen worden naar 5,0 wat het aantal
vals positieve monsters in deze studie met ongeveer 48% reduceert zonder het aantal
vals negatieve te induceren, dit resulteert in een sensitiviteit van 100% en een
specificiteit van 97,26%.
Tabel 21: Sensitiviteit/specificiteit malaria discriminant factor berekend op de resultaten van de monsters uit
de vier groepen (positieve controlegroep, negatieve controlegroep, groep terugkerende militairen van
buitenlandse missie en de groep patiënten met een infectie).
4,0 4,5 5,0
5,5 6,0
6,5
9,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 2 4 6 8 10 12
Sen
siti
vite
it (
%)
100-Specificiteit(%)
ROC analyse Malariafactor Beckman Coulter UniCell DxH800
Plasmodium in bloed
(Microscopie postief)
Geen Plasmodium in het bloed
(Microscopie negatief)
Malariafactor > 4,5 6
(TP: True Positive)
27
(FP: False Positive)(11 patiënten)
Malariafactor < 4,5
0
(FN : False Negative)
480
(TN: True Negative)
Totaal 6 507
Sensitiviteit ( in deze studie) 100 %
Specificiteit (in deze studie) 94,30 %
Figuur 44: ROC-analyse van de malaria disciminant factor geeft een ideale cut-off waarde van 5,0 op basis
van de data in deze studie.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 47 | P a g i n a
1.3. DISCUSSIE
Er is een significant verschil waar te nemen in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van
het volume van de lymfocyten (p<0.01) en in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van
het volume van de monocyten (p<0.05) tussen de malaria negatieve en de malaria
positieve controlegroep.
Er is een significant verschil waar te nemen in de standaarddeviatie (SD of spreiding) van
het volume van de lymfocyten (p<0.05), maar geen significant verschil in de
standaarddeviatie (SD of spreiding) van het volume van de monocyten (p>0.05) tussen
de malaria negatieve en de malaria positieve controlegroep. De spreiding van het
celvolume van de monocyten bij de malaria positieve monsters en de monsters met een
andere infectie dan malaria zijn beide verhoogd en overlappen elkaar.
De malaria discriminant factor is berekend op basis van de standaarddeviatie van het
volume van lymfocyten en van de monocyten ((SD V lymfocyten*SD V monocyten)/100).
Deze factor is significant verschillend (p<0.01) tussen de vergelijkingen van deze drie
groepen (malaria positieve controlegroep, malaria negatieve controlegroep en de groep
patiënten met een infectie). Wanneer de cut-off waarde van de malariafactor op 4,5 werd
ingesteld, worden in de groep patiënten met een infectie 27 vals positieve monsters
vastgesteld door gebruik te maken van microscopie als referentiemethode (zie later). Er
een overlapping waar te nemen van de laagste waarden van de malaria positieve
controlegroep met de hoogste waarden van de onderzoeksgroep gehospitaliseerde
patiënten met een infectie. De malariafactor is onderhevig aan de veranderingen in de
celpopulaties van andere infecties wat resulteert in vals positieve malaria indicaties.
Tabel 22: Significante verschillen malaria discriminant factor (Malaria D factor).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL &
TRAVEL
NORMAAL &
MALARIA
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
TRAVEL &
MALARIA
Malaria D factor p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01
SD V lymfocyten p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.05 p < 0.01
SD V monocyten p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05 p < 0.01 p > 0.05 p < 0.05
Bloedplaatjes p < 0.01 p > 0.05 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01 p < 0.01
Op basis van deze data zou de cut-off waarde voor de malariafactor verhoogd kunnen
worden naar 5,0 wat het aantal vals positieve monsters met ongeveer 48% reduceert
zonder het aantal vals negatieve te induceren, dit resulteert in een sensitiviteit van 100%
en een specificiteit van 97,25%. De omvang van de monsters in de malaria positieve
controlegroep is echter klein (6 monsters) waardoor de studie best herhaald wordt met
een groter aantal monsters om deze conclusie te bekrachtigen
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 48 | P a g i n a
Het aantal bloedplaatjes kan een indicatie zijn voor een malaria-infectie, maar er kunnen
even goed monsters afkomstig van malaria geïnfecteerde patiënten een normaal aantal
bloedplaatjes bevatten. Het enkel focussen op deze parameter zou het aantal
valsnegatieve monsters verhogen. Deze parameter is niet specifiek genoeg om een
malaria-infectie vast te stellen.
De extra celpopulatie voor de 35 fL grenswaarde die zichtbaar was als een hogere
celfrequentie op de 35 fL grens t.o.v. van een normaal staal kan een indicatie zijn voor
een malaria-infectie. Deze extra celpopulatie was bij de patiënten met een andere
infectie dan malaria en een malaria dicriminant factor > 4,5 afwezig, wat het onderscheid
kan maken tussen deze twee groepen. Maar het is ook bekend dat
bloedplaatjesaggregaten deze extra piek ook kunnen genereren.
De rode populatie links onderaan de differentiatie 2D-dataplots van de lichtverstrooiiing
(5PD1) was zowel bij de malaria positieve monsters als bij sommige monsters met een
andere infectie dan malaria en een malaria discriminant factor > 4,5 aanwezig. Hierdoor
is deze dataplot het niet ideaal om een indicatie voor malaria aan te geven.
De groene populatie links onderaan, de ‘malariasignalen’ op de NRBC 2D-dataplots waren
enkel aanwezig bij de positieve malaria monsters met een P.ovale infectie. Deze signalen
waren bij de patiënten met een andere infectie dan malaria en een malaria dicriminant
factor > 4,5 afwezig
Deze dataplot kan een bevestiging zijn van een P.ovale-infectie maar niet voor alle
Plasmodium species.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 49 | P a g i n a
2. SNELTEST (SD p.f./pan)
2.1. MATERIAAL EN METHODEN
2.1.1. APPARATUUR
Er wordt gebruik gemaakt van de SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan sneltest-kit. Deze kit
bevat capillairen, een bufferoplossing en sneltestcassettes.
2.1.2. MONSTER
Als monster kan zowel vers veneus bloed als veneus bloed in een EDTA-, citraat- of
heparinetube gebruikt worden. Stalen ouder dan 3 dagen kunnen resulteren in een
aspecifieke reactie. Wanneer de stalen bewaard worden in de koelkast, moeten ze binnen
de 3 dagen gebruikt worden voor de sneltest. (Alere, 2013)
2.1.3. MEETPRINCIPE
Deze sneltest maakt de detectie van het antigen HRP-2 specifiek voor Plasmodium
falciparum en het antigen pLDH pan specifiek voor Plasmodium species in een humaan
bloedmonster mogelijk. Pan specifiek betekent dat de vier species van Plasmodium
gedetecteerd kunnen worden. (Alere, 2013)
De sneltestcassette bevat een membraanstrip met 3 regio’s. Op de P.f.-regio werden
monoklonale muisantilichamen geïmmobiliseerd die specifiek zijn voor HRP-2
(P.falciparum). Dit antigen is een glycoproteïne dat massaal wordt geproduceerd door te
trofozoïeten en de jonge gametocyten van het species P.falciparum. Het antigen kan tot
28 dagen na het verdwijnen van de parasieten in het bloed aanwezig blijven. Op de pan
regio werden muis monoklonale antilichamen geïmmobiliseerd die specifiek zijn voor LDH
van de vier Plasmodium species. Dit antigen is een lactaat dehydrogenase dat
geproduceerd wordt door de aseksuele vormen van alle Plasmodium species. Op de
controleregio werden geit-anti-muis monoklonale antilichamen gebonden die binden met
de vije niet-gebonden muisantilichamen. In deze regio moet steeds een zichtbare lijn
verschijnen om te concluderen dat de migratie van de componenten correct gebeurde en
om de sneltest als geldig aan te nemen. (Alere, 2013) (World Health Organization, 1999)
Daarnaast zijn er ook niet gebonden muisantilichamen (HRP-2 en pLDH) aanwezig op het
membraan en deze zijn met colloïd goud geconjugeerd en kunnen een reactie aangaan
met de malaria antigenen in het bloedstaal. Volgens het chromatografisch principe zullen
deze migreren over het membraan tot de verschillende regio’s. Op de regio’s zal het
antigen-antilichaam complex specifiek voor het geïmmobiliseerde antilichaam op het
membraan binden en een zichtbare lijn induceren. De colloïd goud geconjugeerde vrije
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 50 | P a g i n a
antilichamen op het membraan migreren verder tot de controlelijn waar ze binden met
de geïmmobiliseerde antilichamen en ook een zichtbare lijn induceren. (Alere, 2013) (World
Health Organization, 1999)
Tijdens het aanbrengen van het monster wordt ook een buffer toegevoegd. Deze buffer
bevat runderalbumine die dient als blokkeerstof om aspecifieke bindingen te voorkomen,
maar bevat ook Triton X-100 die de rode bloedcellen lyseert. (Alere, 2013) (World Health
Organization, 1999)
Echter is er een kans op valsnegatieve RDT’s door het prozone-effect. Het prozone-effect
of het hoge-dosis ‘Hook’ effect treedt op wanneer er een overmaat te detecteren
antilichamen of antigenen aanwezig zijn in het te onderzoeken monster. Een studie van
het Instituut Tropische Geneeskunde te Antwerpen en de faculteit ‘Health, medicine and
Life Sciences’ van de Universiteit te Maastricht toonde aan dat het prozone-effect een
oorzaak is van valsnegatieve P.falciparum bij RDT’s die HRP-2 antigenen detecteren.
Terwijl het pLDH, en pan specifiek-LDH geen prozone-effect vertoonden.
Hyperparasitemie van P.falciparum kan resulteren in valsnegatieve resultaten bij een
HRP-2 sneltest. (World Health Organization, 1999) (Gillet et al., 2009)
SD Bioline beweert dat deze sneltest een sensitiviteit heeft van 99,7% bij P.falciparum
monsters, 95,5% bij non-P.falciparum monsters en een specificiteit van 99,5%. (Alere,
2013)
Figuur 45: Immunochromatografisch principe voor de malariadetectie van de SD SD BIOLINE
Malaria Ag P.f/Pan sneltest (World Health Organization, 1999)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 51 | P a g i n a
2.1.4. PROCEDURE
Elk bloedmonster met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 na analyse op de
UniCel DxH 800 en elk bloedmonster uit de malaria positieve controlegroep, werd
aangebracht op een sneltestcasette en geinterpreteerd.
Na analyse op de UniCel DxH 800 werd bij 28 bloedmonsters van de 178 bloedmonsters
uit de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie, een malaria discriminant factor
hoger dan 4,5 waargenomen. Dit waren 28 bloedmonsters afkomstig van 8
gehospitaliseerde patiënten op de infectie-afdeling. Wegens de hoge kostprijs van de
sneltest werd geopteerd om slechts één positief bloedmonster per patiënt te
onderzoeken. De 6 bloedmonsters uit de malaria positieve controlegroep, die ook een
malaria discriminant factor hadden hoger dan 4,5 na analyse op de UniCel DxH 800
werden onderzocht met de sneltest. Tenslotte werden de 3 bloedmonsters met een
malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de groep militairen terugkerend van
buitenlandse missie ook onderzocht met de sneltest.
Er werd een volume van 5 µl bloed op de cassette aangebracht in de ‘sample’ opening en
5 druppels buffer in de bufferopening. Na 15 minuten werd de testregio van de
sneltestcassette geïnterpreteerd.
Figuur 46: Werkwijze voor de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013)
Tabel 23: Interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan (Alere, 2013)
Sneltestcassette Interpretatie
Positief: Plasmodium falciparum-infectie
Positief: Plasmodium falciparum-infectie positief of menginfectie
van Plasmodium falciparum met een andere Plasmodium species
Positief: Andere Plasmodium species (niet P.falciparum) infectie
Negatief
Ongeldig: Controlelijn is niet zichtbaar
Ongeldig: Controlelijn is niet zichtbaar
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 52 | P a g i n a
2.2. RESULTATEN
2.2.1. MALARIA POSITIEVE CONTROLEGROEP
Vijf onderzochte bloedmonsters met een discriminant factor hoger dan 4,5 gaven een
postivieve sneltest. Slechts één bloedmonster van een patiënt gediagnosticeerd met
malaria (P.ovale) gaf een negatieve sneltest, dit is dus een vals-negatief resultaat van de
sneltest.
Vier van de 6 bloedmonsters gaven na de interpretatie van de sneltest een positief
resultaat voor een Plasmodium falciparum-infectie of een menginfectie van Plasmodium
falciparum met de andere Plasmodium species. Eén van de 6 bloedmonsters gaf na de
interpretatie van de sneltest het resultaat van een infectie met Plasmodium ovale,
Plasmodium vivax of Plasmodium malariae. Echter werd ook na de sneltest vastgesteld
dat één bloedmonster een negatief resultaat gaf voor Plasmodium, terwijl dit monster
afkomstig is van een patiënt gediagnosticeerd met malaria.
Tabel 24: Resultaten van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep.
Aantal personen met een
positieve malaria sneltest
Aantal personen met een
negatieve malaria sneltest
Aantal patiënten met een malaria discriminant
factor hoger dan 4,5 na analyse op UniCel DxH
800 (6 monsters)
5 1
Tabel 25: Resultaten, foto’s en interpretatie van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria
positieve controlegroep.
Bloedmonster Regio’s Interpretatie Confirmatie
ITG
Gekleurd bandje:
- Controleregio Negatief = Vals-negatief P.ovale
Gekleurd bandje:
- Controleregio
- Pan regio
- P.f. regio
Positief: P.falciparum-infectie
positief of menginfectie van P.
falciparum met een andere
Plasmodium species
P.falciparum
Gekleurd bandje:
- Controleregio
- Pan regio
- P.f. regio
Positief: P.falciparum-infectie
positief of menginfectie van P.
falciparum met een andere
Plasmodium species
P.falciparum
Gekleurd bandje:
- Controleregio
- Pan regio
- P.f. regio
Positief: P. falciparum-infectie
positief of menginfectie van P.
falciparum met een andere
Plasmodium species
P.falciparum
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 53 | P a g i n a
Gekleurd bandje:
- Controleregio
- Pan regio
- P.f. regio
Positief: P.falciparum-infectie
positief of menginfectie van
P.falciparum met een andere
Plasmodium species
P.falciparum
Gekleurd bandje:
- Controleregio
- Pan regio
Positief: Plasmodium species
infectie positief P.ovale
2.2.2. MALARIA NEGATIEVE CONTROLEGROEP
Er werden geen bloedmonsters uit deze groep onderzocht omdat geen enkel monster een
malaria discriminant factor hoger dan 4,5 had na analyse op de Beckman Coulter DxH.
2.2.3. GROEP GEHOSPITALISEERDE PATIËNTEN MET EEN INFECTIE (NIET-MALARIA)
De 8 onderzochte bloedmonsters van de 8 patiënten waarvan de 27 bloedmonsters met
een discriminant factor hoger dan 4,5 afkomstig waren gaven een negatieve sneltest.
Tabel 26: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria).
Aantal patiënten met een
positieve malaria sneltest
Aantal patiënten met een
negatieve malaria sneltest
Aantal patiënten met een malaria
discriminant factor hoger dan 4,5 na
analyse op UniCel DxH 800 (8 patiënten)
0 8
2.2.4. GROEP MILITAIREN TERUGKEREND VAN BUITENLANDSE MISSIE
Uit de groep militairen terugkerend van buitenlandse missie bleken na de sneltest de 3
bloedmonsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 een negatieve sneltest
te vertonen.
Tabel 27: Resultaten van de sneltest SD SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de groep militairen terugkerend
van buitenlandse missie.
Aantal personen met een
positieve malaria sneltest
Aantal personen met een
negatieve malaria sneltest
Aantal personen met een malaria
discriminant factor hoger dan 4,5 na
analyse op UniCel DxH 800 (3 monsters)
0 3
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 54 | P a g i n a
2.3. CONCLUSIE
Er werd de som gemaakt van de bloedmonsters uit de 3 onderzoeksgroepen die een
malaria discriminant factor hoger dan 4,5 gaven, namelijk 36 bloedmonsters. Van de 36
bloedmonsters bleken uit de sneltest slechts 5 bloedmonsters een echt positieve sneltest
te vertonen voor een Plasmodium-infectie (true positive) op basis van de sneltest, de
malaria discriminant factor, de microscopie en de malaria diagnose van het ITG. Op basis
van de sneltest en de malaria discriminant factor én de gekende malariadiagnose bleek
echter één bloedmonster een vals negatieve sneltest te vertonen (false negative). De
overige 30 bloedmonsters bleken op basis van de microscopie vermoedelijk een echte
negatieve sneltest te vertonen voor een Plasmodium-infectie (true negative).
Tabel 28: Som van de resultaten SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria positieve controlegroep, de
groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep militairen terugkerend van
buitenlandse missie.
Positieve sneltest Negatieve sneltest
5 bloedmonsters
(True positive)
1 bloedmonster
(False negative)
Diagnose van malaria bekend
(confirmatie ITG)
0 bloedmonsters
(False positive)
11 bloedmonsters
(True negative)
Diagnose van malaria onbekend
(confirmatie ITG)
Tabel 29: Resultaten, specificiteit en sensitiviteit van de sneltest SD BIOLINE Malaria Ag P.f/Pan bij de malaria
positieve controlegroep, de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria) en de groep
militairen terugkerend van buitenlandse missie.
Plasmodium in bloed
(Microscopie positief)
Geen Plasmodium in het bloed
(Microscopie negatief)
Sneltest positief 5 0
Sneltest negatief 1 11
Totaal 6 11
Sensitiviteit 83,3%
Specificiteit 100%
Op basis van deze studie heeft de sneltest SD Bioline Malaria Antigen P.f./Pan een
sensitiviteit van 83,3% en een specificiteit van 100%. De firma beweert dat de sneltest
een sensitiviteit heeft van 99,7% bij P.falciparum-monsters, 95,5% bij non-P.falciparum
monsters en een specificiteit van 99,5%. Op basis van de resultaten in deze studie is de
sensitiviteit van de sneltest 16,7% lager en de specificiteit 0,5% hoger dan wat men
beweert.
Door enkel een sneltest uit te voeren op de bloedmonsters met een factor hoger dan 4,5
kan onvoldoende bevestiging gegeven worden voor een malaria-infectie. Dit is te
concluderen uit één bloedmonster uit de malaria positieve controlegroep (P.ovale) die
een malaria factor hoger dan 4,5 had, maar een negatieve sneltest.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 55 | P a g i n a
3. MICROSCOPIE
De microscopie blijft de ‘gouden standaard’ op vlak van malaria diagnose. De dikdruppel
en het bloeduitstrijkje worden altijd onderzocht om eerdere screeningstesten te
confirmeren. Voor de groep patiënten met een infectie en de groep militairen
terugkomend van buitenlandse missie werd een bloeduitstrijkje en dikdruppel onderzocht
wanneer de malaria discriminant factor hoger of gelijk was aan 4,5. Voor de malaria
positieve controlegroep werd voor elk monster een bloeduitstrijkje en een dikdruppel
onderzocht.
3.1. MATERIAAL EN METHODEN
3.1.1. APPARATUUR
Voor de groep patiënten met een infectie en de groep militairen terugkomend van
buitenlandse missie werd steeds een automatisch bloeduitstijkje gemaakt en gekleurd
door de Beckman Coulter SMS. Wegens het beperkt monstervolume van de monsters uit
de malaria positieve controlegroep werden deze bloeduitstrijkjes manueel bereid maar
gekleurd met de Beckman Coulter SMS. De dikdruppel werd voor alle groepen manueel
bereid en gekleurd.
3.1.2. REAGENTIA
Methanol 96%
May Grünwald
Giemsa
Hemato-buffer pH 6,8
Malaria-buffer pH 7,5
3.1.3. PRINCIPE
3.1.3.1. BLOEDUITSTRIJKJE
Veneus afgenomen volbloed in een tube met anticoagulans K3EDTA of een druppel
volbloed afgenomen via een vingerprik werd uitgestreken op een objectglaasje tot een
dun laagje bloed werd bekomen. Een bloeduitstrijkje bestaat uit een dik gedeelte in het
begin van de vlam en een dun gedeelte in het uitlopend einde van de vlam. Hierdoor is
het bloed minder geconcentreerd in het einde van de vlam waardoor een monolayer van
rode bloedcellen na kleuring microscopisch kan waargenomen worden. Het
bloeduitstrijkje werd gefixeerd om de rode bloedcellen intact te houden en vervolgens
gekleurd met May-Grünwald Giemsa. Aangezien het bloed minder geconcentreerd is, is
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 56 | P a g i n a
de gevoeligheid van een bloeduitstrijkje lager dan die van het geconcentreerde
dikdruppel preparaat. Hierdoor wordt het bloeduitstrijkje voornamelijk gebruikt om de
Plasmodium species te identificeren in de rode bloedcellen. De rode bloedcellen in het
uitstrijkje zijn intact wat de identificatie makkelijker maakt. (Instituut voor Tropische
Geneeskunde & Belgische Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World
Health Organization 1999) (World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999)
(www.parasitologie.nl, 2006) (www.cdc.gov, 2011)
3.1.3.1. DIKDRUPPEL
Een druppel volbloed veneus afgenomen in een tube met anticoagulans K3EDTA of een
druppel volbloed afgenomen via een vingerprik werd aangebracht op een objectglaasje.
Deze druppel bloed werd gedefibrineerd door met een scherp voorwerp in de druppel
bloed te draaien. Dit gebeurde onmiddellijk en lang genoeg om een goed
dikdruppelpreparaat te bekomen. Het preparaat werd niet gefixeerd zodat de rode
bloedcellen lyseerden. Doordat de druppel bloed op een kleine oppervlakte
geconcentreerd werd, heeft dit preparaat een grotere sensitiviteit voor de Plasmodium
opsporing dan het bloeduitstrijkje. De detectielimiet is sterk afhankelijk van de
microscopist die het preparaat onderzoekt. (Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische
Vereniging van LaboratoriumTechnologen, 2007) (Paugam & Yera, 2005) (World Health Organization 1999)
(World Health Organization 2009) (Guillaume, 2009) (De Jonge et al., 1999) (www.parasitologie.nl, 2006)
3.1.3.2. MAY GRÜNWALD GIEMSA
De May-Günwald Giemsa kleuring werd toegepast om de componenten van
hematologische uitstrijkjes te kleuren. De zure kleurstof eosine en de basische kleurstof
methyleenblauw in de May-Grünwald kleurstof hebben een affiniteit voor de basische
respectievelijke zure celcomponenten. Eosine bindt aan de positief geladen groepen in
hemoglobine of positief geladen korrels (alkalische derivaten) van de eosinofiele
granulocyten waardoor ze roze kleuren. Methyleenblauw kleurt het RNA en DNA doordat
het bindt aan de negatief geladen fosfaatgroepen, maar het kleurt ook de negatief
geladen korrels (heparine) in het cytoplasma van de basofiele granulocyten en het
primitieve cytoplasma waardoor deze blauw tot paars kleuren. De May-Grunwald
oplossing bevat ook methanol die de bloedcellen zal fixeren. Giemsa bevat naast eosine,
methyleenblauw en methanol ook het oxidatie product van methyleenblauw, namelijk
methyleenazuur. Methyleenazuur bevat polychrome (veelkleurige) kleureigenschappen
waardoor het de details van de kernen van de witte bloedcellen en de granulatie van de
bloedplaatjes beter en duidelijker zal kleuren. Vandaar dat Giemsa toegevoegd wordt aan
de May-Grünwald kleuring om een nog optimalere kleuring te bekomen en een beter
onderscheid te kunnen maken tussen de morfologie van de verschillende bloedcellen.
(Guillaume, 2009) (www.avantormaterials.com) (at.vwr-cmd.com)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 57 | P a g i n a
3.1.3.3. GIEMSA
Zoals reeds vermeld bevat Giemsa eosine, methyleenblauw, methanol en
methyleenazuur. Methyleenazuur bevat polychrome (veelkleurige) kleureigenschappen
waardoor het de details van de kernen van de witte bloedcellen en de granulatie van de
bloedplaatjes beter en duidelijker zal kleuren. (Guillaume, 2009)
3.1.4. PROCEDURE
3.1.4.1. BLOEDUITSTRIJKJE MET MAY GRÜNWALD GIEMSA KLEURING
Er werd 5 µl volbloed (van K3EDTA tube of van een vingerprik afgenomen) en
aangebracht op een objectglaasje. Onmiddellijk na het aanbrengen van het bloed werd
een tweede objectglaasje met de smalle rand in een hoek van 45° geplaatst vlak voor de
druppel bloed. Door het objectglaasje naar achter te trekken tot tegen de druppel, vult
de contactoppervlakte tussen de twee objectglaasjes zich voor 2/3 met het bloed.
Vervolgens werd met een vloeiende en snelle beweging het objectglaasje naar voren
getrokken te om het bloed uit te strijken. (www.parasitologie.nl, 2006) (Deluol, 2004)
Het bloeduitstrijkje werd gedroogd aan de lucht maar bloeduitstrijkjes die bereid werden
met volbloed uit K3EDTA tubes moesten extra lang drogen omdat de adhesie aan de
objectglaasjes moeilijker verloopt. Het uitstrijkje werd manueel aangeboden aan de
Beckman Coulter SMS en doorliep een automatisch kleurproces doordat het objectglaasje
verschillende baden doorliep (methanol 96%, May-Grünwald ½ verdund met
hematobuffer pH 6,8, Giemsa ½ verdund met hematobuffer pH 6,8). (Beckman Coulter
Ireland, 2013)
3.1.4.2. DIKDRUPPEL
Er werd 5 µl volbloed (van K2EDTA tube of van een vingerprik afgenomen) en
aangebracht op een objectglaasje. Onmiddellijk na het aanbrengen van het bloed werd
met de niet-afgeronde hoek van een tweede objectglaasje de druppel plaatselijk
uitgesmeerd door continu met de hoek van het glaasje in de druppel te draaien
gedurende 2 minuten. (www.parasitologie.nl, 2006) (Deluol, 2004) (Van Haute, 2013)
Het objectglaasje werd 10 minuten gedroogd in een droogoven bij een temperatuur van
80°C. (Van Haute 2013)
De Giemsa kleuring werd steeds vers bereid door aan 40 ml malaria buffer (pH 7,2) 50
druppels Giemsa kleurstof toe te voegen en te homogeniseren (Van Haute, 2013). Deze
malaria buffer werd bereid door een buffertablet (Kaliumdiwaterstoffosfaat 0,7 g
(KH2PO4), Dinatriumwaterstoffosfaat 1,04 g (Na2HPO4)) op te lossen in 1 L water en de
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 58 | P a g i n a
pH te controleren met een pH meter (Guillaume, 2009). De pH van deze buffer is zeer
belangrijk omdat anders de kleuring van de granulatie niet correct verloopt, wat
resulteert in valse microscopische beelden. (Guillaume, 2009)
Het gedroogde objectglaasje werd met de bloedoppervlakte naar onderen gericht op een
deksel met een holte naar boven gericht geplaatst. Vervolgens werd de kleurstof
voorzichtig in het deksel gegoten tot de kleurstof contact heeft met de volledige
oppervlakte van het objectglaasje. Het objectglaasje werd gedurende 35 minuten op
deze manier gekleurd. Deze methode werd voorgesteld op een congres in Amsterdam en
nu toegepast in de routine van het Militair Hospitaal. Deze methode heeft het voordeel
dat mogelijke vervuiling van de kleurstof niet op het objectglaasje terechtkomt maar
naar de bodem van het deksel zakt. Vervolgens werd het objectglaasje voorzichtig
afgespoeld met water. De dikdruppel werd nogmaals 10 minuten bij 80°C gedroogd en
nadien microscopisch afgelezen. (Van Haute, 2013)
3.1.4.3. MICROSCOPIE
Om de Plasmodium-parasieten microscopisch op te sporen in het bloed werd de
dikdruppelpreparaat onder een vergroting van 50x10 globaal gescreend en nadien op een
vergroting van 100x10 met immersieolie grondig gescreend. Deze screening diende
ongeveer 15 minuten te duren. (Van Haute, 2013)
Indien een preparaat vermoedelijk negatief leek te zijn, werd nog 30 minuten verder
gezocht alvorens ‘negatief’ geantwoord werd. In gevallen waar men malaria vermoedde
(omwille van de symptomen en verblijf patiënt) kon een tweede microscopist
ingeschakeld worden voor een tweede opinie of bij een zeer sterk vermoeden kon op een
later tijdstip een tweede bloedstaal van de verdachte patiënt onderzocht worden. (Van
Haute, 2013)
Wanneer een preparaat positief is voor Plasmodium parasieten, werd nagegaan hoe groot
de densiteit was van de parasitemie. Wanneer het aantal parasieten in het preparaat
veel te groot was om nauwkeurig te tellen, werd geteld op het bloeduitstrijkje. Wanneer
het aantal parasieten niet te hoog was, kon de parasitemie bepaald worden op het
dikdruppel preparaat.
DIKDRUPPEL
In het dikdruppelpreparaat werd op een 100x10 vergroting het aantal parasieten geteld
per 200 witte bloedcellen. Wannneer men minder dan 10 parasieten telde per 200 witte
bloedcellen werd de telling verdergezet tot 500 witte bloedcellen. Wanneer er
gametocyten of schizonten werden waargenomen, werden deze niet meegeteld maar wel
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 59 | P a g i n a
vermeld als commentaar bij de telling. Wanneer het aantal parasieten per 200 witte
bloedcellen en het totaal aantal witte bloedcellen per µl in het bloed (door CBC analyse
op de Beckman Coulter DxH) gekend was kon het aantal parasieten per µl berekend
worden. (Van Haute, 2013) (World Health Organization, 2003)
Bijvoorbeeld:
250 parasieten waargenomen bij het tellen van 200 witte bloedcellen en de concentratie witte
bloedcellen in het staal is 4,5.10³/mm³ (4,5.10³/µl) dan is de parasitemie 5625 AP/µl.
Wanneer een dikdruppel positief was voor de Plasmodium parasieten, werd een
ongekleurd dikdruppelpreparaat van dit monster opgestuurd naar het Instituut voor
Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor de confirmatie van de parasitemie. Het
ITG is het nationaal referentiecentrum voor malaria.
BLOEDUITSTRIJKJE
In het uitstrijkje werd het aantal geparasiteerde rode bloedcellen op 5000 rode
bloedcellen geteld. De beste methode hiervoor is het aantal rode bloedcellen in één veld
te tellen en hier het aantal geparasiteerde rode bloedcellen te tellen, vervolgens werd er
overgegaan tot een naastgelegen veld met dezelfde densiteit rode bloedcellen tot een
totaal van 5000 rode bloedcellen werd geteld. Deze telling kon het best herhaald worden
tot verschillende velden geteld werden en hiervan werd het gemiddelde genomen.
Gametocyten en schizonten werden niet meegeteld maar wel vermeld als commentaar.
Wanneer het aantal geparasiteerde rode bloedcellenparasieten per 5000 rode bloedcellen
en het totaal aantal rode bloedcellen per µl in het bloed ook (door CBC analyse op de
Beckman Coulter UniCel DxH 800) gekend was, kon het aantal parasieten per µl
berekend worden. (Van Haute, 2013) (World Health Organization, 2003)
Bijvoorbeeld:
Op 5000 rode bloedcellen (10 velden) werden 10 geparasiteerde rode bloedcellen getelt en de
concentratie rode bloedcellen in het staal is 4,5.106/mm³ (4,5.106/µl) dan is de parasitemie 9000
AP/µl of 0,2%.
In het bloeduitstrijkje werd ook de Plasmodium species geïdentificeerd, omdat de
trofozoïeten en schizonten van de verschillende species bepaalde specifieke
veranderingen van de rode bloedcellen induceren. Gametocyten zijn het meest specifiek
per species, de aanwezigheid van gametocyten vergemakkelijkt de identificatie. In het
bloeduitstrijkje kon ook een eventuele menginfectie waargenomen worden.
Wanneer een bloeduitstrijkje positief was voor een Plasmodium-infectie, werd een
ongekleurd maar wel gefixeerd bloeduitstrijkje van dit monster opgestuurd naar het
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 60 | P a g i n a
Instituut voor Tropische Geneeskunde te Antwerpen voor de confirmatie van de
parasitemie en de identificatie. In het ITG werd de PCR-techniek toegepast om met
zekerheid een menginfectie of een species te bevestigen. De correcte species identificatie
is belangrijk voor de behandeling en in geval van resistentie.
3.2. RESULTATEN
In alle monsters uit de malaria positieve controlegroep werd na microscopisch onderzoek
(dikdruppel en bloeduitstrijkje) Plasmodium-parasieten, namelijk trofozoiëten
waargenomen. Twee van de zes monsters werden vastgesteld als een P.ovale infectie, en
de overige vier als P.falciparum. Alle monsters met een malaria discriminant factor hoger
dan 4,5 uit de groep gehospitaliseerde patiënten met een infectie hadden geen
parasieten zichtbaar in hun bloed. De drie monsters met een malaria discriminant factor
hoger dan 4,5 uit de groep terugkerende militairen van buitenlandse missie hadden geen
Plasmodium parasieten zichtbaar in het bloed bij microscopisch onderzoek, waarvan één
monster afkomstig was van een patiënt die drie dagen eerder gediagnosticeerd was met
malaria (P.ovale) en in die 3 dagen een behandeling onderging.
Tabel 30: Resultaten van de microscopie (dikdruppel en bloeduitstrijkje).
Geen parasieten in bloed
Microscopie negatief
Parasieten in bloed
Microscopie positief
Malaria factor < 4,5 / /
Malaria factor > 4,5 30 (11 patiënten) 6
Sneltest - 30 (11 patiënten) 1
Sneltest + 0 5
Tabel 31: Het aantal geparasiteerde rode bloedcellen per µl (AP/µl), de Plasmodium species en de
verschillende stadia dat werd vastgesteld bij elk monster in de malaria positieve controlegroep.
Monster AP/µl Plasmodium species Stadia
1 4192 P.ovale Trofozoïeten, schizonten en gametocyten
2 6089 P.falciparum Trofozoïeten
3 2082 P.falciparum Trofozoïeten
4 91250 P.falciparum Trofozoïeten
5 2854 P.falciparum Trofozoïeten
6 Parasitemie
niet gekend
P.ovale Trofozoïeten
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 61 | P a g i n a
3.3. CONCLUSIE
Alle 6 monsters uit de malaria positieve controlegroep werden malaria positief bevonden
op basis van microscopisch onderzoek. Er werden dus geen valsnegatieve monsters
vastgesteld. Bovendien werden dankzij de microscopie de overige 30 monsters afkomstig
van 11 patiënten met een malaria factor hoger dan 4,5 negatief bevonden. Microscopie
blijft de gouden standaard voor de malaria diagnose in routine laboratoria.
Figuur 52: Een P.falciparum
trofozoiët (oudere vorm) in
een bloeduitstrijkje gekleurd
met May-Grünwald Giemsa
op een vergroting 100x10
onder de lichtmicroscoop
Figuur 51: Een P.falciparum
trofozoiët (oudere vorm) in
een bloeduitstrijkje gekleurd
met May-Grünwald Giemsa
op een vergroting 100x10
onder de lichtmicroscoop
Figuur 50: Een P.falciparum
trofozoiët in een
bloeduitstrijkje gekleurd met
May-Grünwald Giemsa op
een vergroting 100x10 onder
de lichtmicroscoop
Figuur 49: Een P.ovale
schizont die op uitbarsten
staat in een bloeduitstrijkje
gekleurd met May-Grünwald
Giemsa op een vergroting
100x10 onder de
lichtmicroscoop
Figuur 48: Een P.ovale
geparasiteerde rode bloedcel
met meerdere trofozoïeten
(polyparasitisme, zeldzaam)
in een bloeduitstrijkje
gekleurd met May-Grünwald
Giemsa op een vergroting
100x10 onder de
lichtmicroscoop
Figuur 47: Een P.ovale
trofozoiët in een
bloeduitstrijkje gekleurd met
May-Grünwald Giemsa op
een vergroting 100x10 onder
de lichtmicroscoop
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 62 | P a g i n a
VI. CONCLUSIE
De malaria discriminant factor kan een hulp zijn in de screening van malaria. Wanneer
een monster op de UniCel DxH 800 een celtelling en differentiatie (CBC+DIFF) ondergaat
wordt automatisch deze malaria factor berekend. Deze methode is snel en vereist geen
extra expertise of extra hoeveelheid monster. Er is een groot significant verschil tussen
malaria negatieve monsters en malaria positieve monster. Echter kunnen andere
infecties ook een verhoogde malaria discriminant factor vertonen door de aanwezigheid
van grotere monocyten en lymfocyten als reactie op de infectie. De waarden van de
malaria discriminant factor, de SD V monocyten en de SD V lymfocyten bij monsters met
een ‘vals positieve’ malaria discriminant factor kunnen de resultaten van deze waarden
bij de monsters met een ‘echt positieve’ malaria discriminant factor overlappen. De
spreiding van het celvolume van de lymfocyten toonde meer significante verschillen aan
tussen de groepen dan de spreiding van het celvolume van de monocyten. In deze studie
is de een cut-off waarde van 5,0 voor malaria indicatie ideaal. Het aantal monsters met
een vals positieve indicatie voor malaria werd gereduceerd met ongeveer 48% en de
specificiteit steeg zonder een daling van de sensitiviteit.
Het witte bloedcelhistogram (WBC-histogram) kan geraadpleegd worden wanneer door
het toestel een hoge malaria discriminant factor wordt aangegeven. Echter vertonen niet
alle malaria positieve monsters een hogere celfrequentie op de 35 fL grens t.o.v. een
normaal monster. Een WBC-histogram met een hogere celfrequentie op de 35 fL grens
kan echter wel het vermoeden van malaria bij een hoge malaria discriminant factor
bevestigen.
De differentiatie 2D-dataplots van de lichtverstrooiing (5PD1) vertoonden een extra
populatie of malariasignalen bij de zes monsters van de malaria positieve controlegroep.
Echter waren deze niet karakteristiek aanwezig en verscheen deze populatie ook bij
enkele monsters van de gehospitaliseerde patiënten met een infectie (niet-malaria). De
interpretatie van de dataplots is niet specifiek genoeg om bij een hoge malaria
discriminant factor het vermoeden van een malaria-infectie te bevestigen.
De NRBC-dataplots vertoonden enkel een groene populatie links onderaan bij de
monsters met een P.ovale infectie. De interpretatie van deze dataplots voor het
bevestigen van een vermoeden van malaria-infectie bij een hoge malaria discriminant
factor is niet specifiek en sensitief genoeg aangezien 4/6 van de monsters deze populatie
niet vertoondde.
De sneltest van de gekende malaria positieve monsters was bij 5 van de 6 monsters
positief met de juiste interpretatie van Plasmodium species. De sneltest was negatief bij
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 63 | P a g i n a
alle monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 maar een negatief
microscopisch onderzoek.
De microscopie kon de malaria-infectie bij alle gekende malaria positieve monsters
bevestigen. De monsters met een malaria discriminant factor hoger dan 4,5 uit de
overige 3 groepen waren negatief voor microscopisch onderzoek.
Tabel 32: Vergelijking van de sneltest SD Biolone Malaria p.f./pan met de malaria discriminant factor op de
UniCel DxH 800 en de ‘gouden standaard’ microscopie.
Diagnose malaria bekend Diagnose malaria onbekend
maar negatief bij microscopie
Malaria factor < 4,5 0 / (580)
Malaria factor > 4,5 6 30 (11 patiënten)
Sensitiviteit: 100%
Specificiteit: 94,30%
Sneltest - 1 11
Sneltest + 5 0
Sensitiviteit: 83,33 %
Specificiteit: 100%
Microscopie - 0 11
Microscopie + 6 0
Sensitiveit: 100 %
Maximale specificiteit: 100%
Deze studie toont aan dat de automatische detectie van malaria met behulp van de
malaria discriminant factor op de UniCel DxH 800 interessant kan zijn voor een eerste
screening van malaria wanneer er geen vermoeden is van een malaria-infectie. Een
hogere malaria discriminant factor kan de laborant of onderzoeker alert maken op een
potentiële malaria-infectie. Een sneltest kan additioneel uitgevoerd worden om een
tweede screening uit te voeren, maar het microscopisch onderzoek dient steeds
uitgevoerd te worden voor de confirmatie van de potentiële malaria-infectie.
Wanneer men een monster positief voor malaria heeft ontdekt of een monster heeft
waarvan men een malaria-infectie sterk vermoedt, moet het monster opgestuurd worden
naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te Antwerpen voor de confirmatie
met de moleculaire technieken zoals PCR die de grootste gevoeligheid hebben voor de
malaria detectie.
Deze screening kan bijdragen tot de detectie of indicatie van malaria-infecties wanneer
de symptomen afwezig zijn en de dokter geen vermoeden heeft van malaria. Hierdoor
zou het aantal ‘niet ontdekte’ malaria-infecties kunnen dalen.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 64 | P a g i n a
VII. DISCUSSIE
In deze studie was de omvang van de malaria positieve monsters erg klein. Gedurende
de periode februari-april waren er slechts 6 monsters van patiënten met een malaria-
infectie beschikbaar voor de studie. Bovendien waren enkel de species P.falciparum en
P.ovale vertegenwoordigd en niet P.vivax en P.malariae.
De studie zou herhaald moeten worden met een groter aantal malaria positieve monsters
om een betere conclusie te vormen over de geautomatiseerde detectie van malaria. Ook
zouden alle species vertegenwoordigd moeten zijn om te evalueren of de detectie
mogelijk is voor alle Plasmodium species.
De groep monsters van militairen die terugkeerden van buitenlandse missie hoefde niet
in deze studie toegevoegd te worden. Maar deze groep werd toch onderzocht om een
eventuele onvermoedde malaria-infectie te kunnen detecteren.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 65 | P a g i n a
VIII. REFERENTIES
Alere. (2013). SD Bioline Malaria Antigen P.f/Pan test procedure.
Beckman Coulter Ireland, Inc. (2013a). Unicel DxH800 Coulter Cellular Analysis System
and UniCel DxH 600 Coulter Cellular Analysis System: Instructions for Use. USA.
Beckman Coulter Ireland, Inc. (2013b). UniCel DxH Slidemaker Stainer, Coulter Cellular
Analysis System Slidemaler Stand-Alone for Hematology Specimen Processing:
Instructions for Use. USA.
Briggs, C., Da Costa, A., Freeman, L., Aucamp, I., Ngubeni, B. & Machin S.J. (2006).
Development of an Automated Malaria Discriminant Factor Using VCS Technology.
Journal of clinical pathology, 126, nr.5, pp. 691-698. Geraadpleegd op 18 januari 2014
via http://ajcp.ascpjournals.org/content/126/5/691.long
Campuzano-Zuluanga, G. Grobusch, M.P. & Hänscheid, T. (2010). Automated
haematology analysis to diagnose malaria. Malaria Journal, 9, nr.346. Geraadpleegd op
19 januari 2014 via http://www.malariajournal.com/content/9/1/346
Castrynck, H., Meensel, Van B. & Lontie, M. (2013). Diagnose van malaria. Labo-mailing,
nr.209. Geraadpleegd op 19 januari 2014 via
http://www.mcharts.be/artsen/Documenten/Labomailing/062013lm.pdf
Chua, C.L. Brown, G. Hamilton, J.A. Rogerson, S. & Boeuf, P. (2013). Monocytes and
macrophages in malaria: protection or pathology?. Trends in parasitology, 29, pp 26-34.
Geraadpleegd op 15 februari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23142189
Coatney, G.R., Collins, W.E., Warren, M. & Contacos, P.G. (1971). The Primate Malarias.
U.S. Department of Health, Education and Welfare. Betesha.
De Jonge, N., Polderman, A.M. & Verhave, J.P. (1999). Diagnose van malaria. Nederlands
tijdschrift Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde, nr.24, pp. 34-37.
Geraadpleegd op 19 januari 2014 via
https://www.nvkc.nl/tijdschrift/content/1999/nr%201/p34/1999-1-p34.pdf
Deluol, A.M. (2004). Colour Atlas of parasitology vol.4: Blood and tissue parasites. Saint-
Maur: Éditions Varia.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 66 | P a g i n a
Donati, D., Mok, B., Chêne, A., XU, H., Thangarajh, M., Glas, R., Chen, Q., Wahlgren, M.
& Bejarano, M.T. (2006). Increased B Cell Survival and Preferential Activation of the
Memory Compartment by a Malaria Polyclonal B Cell Activator. International Journal of
Immunology, 177, nr.5, pp.3035-3044. Geraadpleegd op 8 februari 2014 via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16920940
Everdingen, van J.J.E., Glerum, J.H. & Wiersma T. (2001). Praktische
huisartsgeneeskunde: Diagnose en therapie. Houten: Bohn Stafleu van Loghum.
Fourcade, C., Casbas, M.J., Belaouni, H., Duran Gonzalez, J.J., Sassier, P., Jiminze
Garcia, P.J. & Esteban Pepio, M.A. (2004). Automated detection of malaria by mean of
the haematology analyser Coulter® GEN.S™. International Journal of Laboratory
Hematology, 26, pp. 367-372. Geraadpleegd op 8 februari 2014 via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15595992
Gillet, P., Mori, M., Esbroeck, Van E., Ende, Van den J. & Jacobs, J. (2009). Assessment
of the prozone effect in malaria rapid diagnostic tests. Malaria Journal, 8, nr.271.
Geraadpleegd op 10 mei 2014 via http://www.malariajournal.com/content/pdf/1475-
2875-8-271.pdf
Guillaume, V. (2009, april). Parasitologie sanguin. (1e druk). Brussel: De Boeck.
Hänscheid, T. (1999). Diagnosis of malaria: a review of alternatives to conventional
microscopy. Clinical & Laboratory Haematology,21, 4, pp. 235-245. Geraadpleegd op 2
februari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10583325
Hedley, B.D., Keeney, M., Chin-YEE, I. & Brown, W. (2010). Initial performance
evaluation of the UniCel DxH 800 Coulter cellular analysis system. International Journal
of laboratory hematology, 33, pp.45-56. Geraadpleegd op 1 februari 2014 via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3044820/
Hoffman, R., Benz, E.J., Shattil, S.J., Furie, B. & Cohen, H.J. (1991). Hematology: Basic
principles and practice. (1e druk). New York: Churchill Livingstone.
Hopkins, H., Kambale, W., Kamya, M.R., Staedke, S.G., Dorsey, G. & Rosenthal, P.J.
(2007). The comparison of HRP2- and pLDH-based rapid diagnostic tests for malaria with
longitudinal follow-up in Kampala, Uganda. The Amarican Society of Tropical Medicine
and Hygiene, 76, nr.6, pp. 1092-1097. Geraadpleegd op 18 januari 2014 via
http://www.ajtmh.org/content/76/6/1092.long
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 67 | P a g i n a
Instituut voor Tropische Geneeskunde & Belgische Vereniging van
LaboratoriumTechnologen. (2007, juni). Laboratoriumdiagnose van malaria en andere
bloedparasieten, voortgezette beroepsopleiding in de parasitologie.
Lee, H.K., KIM, S.I., CHAE, H., Kim, M., LIM, J., OH, E.J., KIM, Y., PARK, Y.J., LEE, W., &
HAN, K. (2012). Sensitive detection and accurate monitoring of Plasmodium vivax
parasites on routine complete blood count using automatic blood cell analyzer
(DxH800TM). International Journal of Laboratory Hematology, 34, pp. 201-207.
Nicolas, X., Hugard, L., Desemerie, F., Nicolas, F. & Floch, J.J. (1998). Paludisme: Apport
diagnostique des modifications biologiques chez l’expatrié. Feuillets de biologie, xxix,
nr.223, pp. 45-48.
Paugam, A. & Yera, H. (2005). Diagnostic biologique du paludisme. Biologiste et
practicien, 2, nr.142, pp. 28-53.
Pierce, S.K. & Miller, L.H. (2009). World Malaria Day 2009: What malaria knows about
the immune system that immunologists still don’t. International Journal of Immunology,
182, nr.9, pp.5171-5177. Geraadpleegd op 8 februari 2014 via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2779769/
Simon-Lopez, R. (2013). U.S Patent No. 7,256,048B2. Fullerton, Beckman Coulter, Inc.
Strien, van W. (2002). Malariakaarten helpen bij speurtocht naar vaccin. Cicero, nr. 16,
pp.12-13. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via
https://www.lumc.nl/rep/1040/att/811071156182556/811110022122556/81112114808
2556/811120003492556.pdf
Tangpukdee, N., Duangdee, C., Wilairatana, P. & Krudsood, S. (2009). Malaria diagnosis:
A Brief Review. Korean Journal of Parasitology, 47, nr.2, pp.93-102. Geraadpleegd op 1
februari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688806/pdf/kjp-47-
93.pdf
Van Haute (2013). Procedure: Frottis de sanguin et DDR. [SOP]. Labo Hematologie,
Militair Hospitaal Koninging Astrid.
Warhurst, D.C. & Williams, J.E. (1996). Laboratory diagnosis of malaria. Journal of
clinical pathology, 49, nr.7, pp. 533-538. Geraadpleegd op 18 januari via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC499897/
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 68 | P a g i n a
World Health Organization Geneva. (1999, oktober). New Perspectives: Malaria Diagnosis
, Report of a joint WHO/Usaid informal consultation. (WHO/MAL/2000.1091).
Geraadpleegd op 18 januari 2014 via
http://www.who.int/tdr/publications/documents/malaria-diagnosis.pdf
World Health Organization Geneva. (2003). Manual of basic techniques for a health
laboratory.(2de editie). Geraadpleegd op via 15 maart 2014 via
http://apps.who.int/iris/handle/10665/42295
World Health Organization Geneva. (2009, oktober). Parasitological confirmation of
malaria diagnosis: Report of a WHO technical consultation Geneva. (NLM classification:
WC 765). Geraadpleegd op 1 februari 2014 via
http://www.finddiagnostics.org/export/sites/default/resource-
centre/reports_brochures/docs/9789241599412_eng.pdf
World Health Organization. (2012). International travel and health. Hoofdstuk 7.
Geraadpleegd op 2 februari 2014 via http://www.who.int/ith/en/
Websites:
May Grünwald’s stain for microscopy. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via www.at.vwr-
cmd.com
Product Information May-Grünwald Giemsa. Geraadpleegd op 2 februari 2014 via
www.avantormaterials.com
Laboratory diagnosis of malaria: Preparation of blood smears (2011). Geraadpleegd op
18 januari 2014 via http://www.cdc.gov/dpdx/
Malariabehandeling in geval van nood (2010). Geraadpleegd op 26 april 2014 via
www.itg.be
Standard Operating Procedure voor het maken van grotere hoeveelheden
malariapreparaten (2006). Geraadpleegd op 20 januari 2014 via
http://www.parasitologie.nl
Clinical manifestations of malaria (2013). Geraadpleegd op 18 januari 2014 via
www.uptodate.com
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 69 | P a g i n a
IX. APPENDIX
Appendix 1: Schema malaria discriminant factor in de onderzochte groepen ................69
Appendix 2: Beschrijvende statistiek en t-test analyse (malaria discriminant factor) .....70
Appendix 3 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V lymfocyten) ..................72
Appendix 4 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V monocyten) ..................74
Appendix 5 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (bloedplaatjes) .......................76
Appendix 6: ‘Case study’ P.ovale infectie .................................................................78
Appendix 7: Invloed temperatuur en leeftijd van het bloedmonster op de malaria discriminant factor, de dataplots en het WBC histogram. ...........................................81
Appendix 8: Correlatie ..........................................................................................86
Appendix 1: Schema malaria discriminant factor in de onderzochte groepen
STUDIE
296 monsters
Gezonde personen (296)
Geen bezoek aan risicogebied, geen
symptomen
0 monsters
met een malaria discriminant factor > 4,5
178 monsters
Gehospitaliseerde patiënten met een
infectie (52)
Geen bezoek aan risicogebieden, geen
symptomen
27 monsters (8 patiënten)
met een malaria discriminant factor > 4,5
27 monsters
vals positief (geen malaria) op basis van de lichtmicroscopie
en/of sneltest
6 monsters
Personen met malaria diagnose (6)
6 monsters
met een malaria discriminant factor > 4,5
6 monsters
echt positief (malaria infectie) op basis van de lichtmicroscopie
en/of sneltest
132 monsters
Militairen terugkerend van buitenlandse missie
(132)
3 monsters
met een malaria discriminant factor > 4,5
2 monsters
vals positief (geen malaria) op basis van de lichtmicroscopie
en/of sneltest
1 monster
afkomstig van een patiënt met malaria na 4 dagen behandeling
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 70 | P a g i n a
Appendix 2: Beschrijvende statistiek en t-test analyse (malaria discriminant factor)
Tabel 33: Beschrijvende statistiek van de malaria discriminant factor voor de vier groepen.
NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA
Gemiddelde 2,3306 3,5052 2,3388 7,2485
Standaardfout 0,0182 0,0692 0,0260 0,7167
Mediaan 2,2797 3,4026 2,2930 7,4641
Modus 2,1168 3,0400 #N/B #N/B
Standaarddeviatie 0,3122 0,9234 0,2995 1,7554
Steekproefvariantie 0,0975 0,8527 0,0897 3,0816
Kurtosis 0,9666 0,5270 4,8427 -2,9458
Scheefheid 0,9676 0,7612 1,5639 -0,1075
Bereik 1,7442 5,0184 1,9151 3,7633
Minimum 1,6720 2,0180 1,8948 5,2835
Maximum 3,4162 7,0364 3,8099 9,0469
Som 682,8723 623,9190 311,0570 43,4910
Aantal (zonder outliers)
293 178 133 6
CI (95%) 0,0359 0,1366 0,0514 1,8422
CI (99%) 0,0473 0,1802 0,0679 2,8897
Tabel 34: T-test voor de vergelijking van de malaria discriminant factor tussen de groepen. Significant verschil
op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL &
TRAVEL
NORMAAL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens -16,4099 -0,2569 -6,8600
P (T<=t) 5,09973.10-39 0,797471 0,000503
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9718 1,9690 2,0150
Kritiek gebied van T-toets 98,75%
(Bonferroni correctie van 95%) 2,5203 2,5149 3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,6004 2,5945 3,3649
Kritiek gebied van T-toets 99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
3,0617
3,0525
4,7733
Conclusie
T > Kritische T
Significant
verschil**
(µ1≠µ2)
p(5,09973 10-39)
< α
T < Kritische T
Geen significant
verschil
(µ1=µ2)
p(0,797471) > α
T > Kritische T
Significant verschil**
(µ2>µ1)
p(0,000503) < α
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 71 | P a g i n a
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
(eenzijdig)
TRAVEL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens 15,7783 -5,1991 -6,8464
P (T<=t) 3,25048.10-38 0,001735 0,000508
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9706 2,0150 2,0150
Kritiek gebied van T-toets 98,75%
(Bonferroni correctie van 95%) 2,5180 3,1634 3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5980 3,3649 3,3649
Kritiek gebied van T-toets 99,75%
(Bonferroni correctie van 99%) 3,0579 4,7733 4,7733
Conclusie
T > Kritische T
Significant
verschil**
(µ1≠µ2)
p(3,25 10-38) < α
T > Kritische T
Significant
verschil**
(µ2>µ1)
p(0,001735) < α
T > Kritische T
Significant verschil**
(µ2>µ1)
p(0,000508) < α
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 72 | P a g i n a
Appendix 3 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V lymfocyten)
Tabel 35: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V lymfocyten) voor
de vier groepen.
NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA
Gemiddelde 13,84 17,04 13,94 29,49
Standaardfout 0,061 0,20 0,10 3,79
Mediaan 13,75 16,82 13,80 25,77
Modus 13,57 16,63 13,43 #N/B
Standaarddeviatie 1,05 2,64 1,15 9,29
Steekproefvariantie 1,10 6,98 1,32 86,36
Kurtosis -0,10 -0,58 3,81 -1,28
Scheefheid 0,46 0,40 1,27 0,74
Bereik 5,81 11,49 7,67 23,65
Minimum 11,27 12,16 11,8 19,29
Maximum 17,08 23,65 19,47 42,94
Som 4054,90 2999,33 1867,57 176,91
Aantal 293 176 134 6
CI (95%) 0,1205 0,3930 0,1963 9,7523
CI (99%) 0,1588 0,5186 0,2593 15,2971
Tabel 36: T-test voor de vergelijking van de spreiding van het volume voor de lymfocyten (SD V
lymfocyten)tussen de groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant
verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL &
TRAVEL
NORMAAL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens -15,3716 -0,8391 -4,1235
P (T<=t) 3,5459.10-36 0,402275 0,004571
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9714 1,9700 2,0150
Kritiek gebied van T-toets
98,75%
(Bonferroni correctie van 95%)
2,2577 2,2557
3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5996 2,5966 3,3649
Kritiek gebied van T-toets
99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
2,8371 2,8334
4,7733
Conclusie
T > Kritische T
Significant verschil** (µ1≠µ2) p(3,5459.10-36) < α
T < Kritische T
Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,402275) > α
T > Kritische T
Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,004571) < α
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 73 | P a g i n a
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
(eenzijdig)
TRAVEL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens 13,9540 -3,2754 -4,0968
P (T<=t) 3,56124.10-33 0,011033 0,004692
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9694 2,0150 2,0150
Kritiek gebied van T-toets
98,75%
(Bonferroni correctie van 95%)
2,5158
3,1634 3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5955 3,3649 3,3649
Kritiek gebied van T-toets
99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
3,0540
4,7733 4,7733
Conclusie
T > Kritische T Significant verschil** (µ1≠µ2) p(3,56124.10-33) < α
T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,011033) < 0.05
T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1) p(0,004692) < α
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 74 | P a g i n a
Appendix 4 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (SD V monocyten)
Tabel 37: Beschrijvende statistiek van de spreiding van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) voor
de vier groepen.
NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA
Gemiddelde 16,83 20,22 16,91 26,13
Standaardfout 0,09 0,20 0,14 3,19
Mediaan 16,57 20,06 16,63 26,65
Modus 16,00 19,00 16 #N/B
Standaarddeviatie 1,53 2,66 1,63 7,82
Steekproefvariantie 2,35 7,10 2,67 61,13
Kurtosis 1,75 -0,52 4,23 0,97
Scheefheid 1,10 0,16 1,62 -0,94
Bereik 9,50 12,67 9,71 21,17
Minimum 13,62 14,33 14,17 12,8
Maximum 23,12 27 23,88 33,97
Som 4965,85 3559,41 2283,11 156,78
Aantal 295 176 135 6
CI (95%) 0,1756 0,3964 0,2783 8,2052
CI (99%) 0,2313 0,5231 0,3676 12,8704
Tabel 38: T-test voor de vergelijking van de van het volume voor de monocyten (SD V monocyten) tussen de
groepen. Significant verschil op een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05
betrouwbaarheidsniveau (**).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL &
TRAVEL
NORMAAL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens -15,4265 -0,4714 -2,9114
P (T<=t) 5,63425.10-38 0,6378 0,0167
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9697 1,9697 2,0150
Kritiek gebied van T-toets
98,75%
(Bonferroni correctie van 95%)
2,5163 2,5163
3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5960 2,5960 3,3649
Kritiek gebied van T-toets
99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
3,0549 3,0549
4,7733
Conclusie
T > Kritische T
Significant verschil** (µ1≠µ2) p(5,63425.10-
38) < α
T < Kritische T
Geen significant verschil (µ1=µ2) p(0,637759) > α
T > Kritische T
Significant verschil* (µ2>µ1) p(0,016673) < 0.05
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 75 | P a g i n a
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
(eenzijdig)
TRAVEL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens 13,5053 -1,8467 -2,88511
P (T<=t) 1,03733.10-32 0,0620 0,0172
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9680 2,0150 2,0150
Kritiek gebied van T-toets
98,75%
(Bonferroni correctie van 95%)
2,5131
3,1634 3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,5925 3,3649 3,3649
Kritiek gebied van T-toets
99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
3,0494
4,7733 4,7733
Conclusie
T > Kritische T Significant verschil**
(µ1≠µ2) p(1,03733.10-
32) < α
T > Kritische T Geen significant verschil
(µ2>µ1) p(0,062041) > 0.05
T > Kritische T Significant verschil* (µ2>µ1)
p(0,034382) < 0.05
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 76 | P a g i n a
Appendix 5 : Beschrijvende statistiek en t-test analyse (bloedplaatjes)
Tabel 39: Beschrijvende statistiek van de spreiding van de bloedplaatjes voor de vier groepen.
NORMAAL INFECTIE TRAVEL MALARIA
Gemiddelde 227 363 221 107
Standaardfout 2,64 14,03 3,68 17,82
Mediaan 225 332 218 111
Modus 190 214 201 #N/B
Standaarddeviatie 45,39 187,18 42,87 43,64
Steekproefvariantie 2060,64 35034,63 1838,01 1904,57
Kurtosis 0,09 1,76 0,44 -0,77
Scheefheid 0,47 1,21 0,003 -0,38
Bereik 261 941 253 118
Minimum 130 65 82 42
Maximum 391 1006 335 160
Som 67102 64649 30060 641
Aantal 295 178 136 6
CI (95%) 5,2015 27,6864 7,2705 45,7988
CI (99%) 6,8523 36,5310 9,6051 71,8387
Tabel 40: T-test voor de vergelijking van de van de bloedplaatjes tussen de groepen. Significant verschil op
een 0.01 betrouwbaarheidsniveau (*) en significant verschil op 0.05 betrouwbaarheidsniveau (**).
NORMAAL &
INFECTIE
NORMAAL &
TRAVEL
NORMAAL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens -9,5076 1,4213 6,6975
P (T<=t) 8,84395.10-18 0,156368 0,000561
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9725 1,9686 2,0150
Kritiek gebied van T-toets
98,75%
(Bonferroni correctie van 95%)
2,5217 2,5141 3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,6020 2,5937 3,3649
Kritiek gebied van T-toets
99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
3,0642 3,0512 4,7733
Conclusie
T > Kritische T Significant verschil**
(µ1≠µ2) p(8,84395.10-
18) < α
T < Kritische T Geen significant verschil
(µ1=µ2) p(0,156368) > α
T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1)
p(0,000561) < α
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 77 | P a g i n a
INFECTIE &
TRAVEL
INFECTIE &
MALARIA
(eenzijdig)
TRAVEL & MALARIA
(eenzijdig)
T- statistische gegevens 9,8026 11,3049 6,2773
P (T<=t) 8,6385. 10-19 2,13015.10-8 0,000753
Kritiek gebied van T-toets 95% 1,9718 1,7709 2,0150
Kritiek gebied van T-toets
98,75%
(Bonferroni correctie van 95%)
2,5204 2,5326 3,1634
Kritiek gebied van T-toets 99% 2,6005 2,6503 3,3649
Kritiek gebied van T-toets
99,75%
(Bonferroni correctie van 99%)
3,0619 3,3725 4,7733
Conclusie
T > Kritische T Significant verschil**
(µ1≠µ2) p(8,6385. 10-19) < α
T > Kritische T Significant verschil*
(µ2>µ1) p(2,13015.10-8) < 0.05
T > Kritische T Significant verschil** (µ2>µ1)
p(0,000753) < α
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 78 | P a g i n a
Appendix 6: ‘Case study’ P.ovale infectie
In het Militair Hospitaal Koningin Astrid melde een man zich aan op de spoedafdeling. De
man had sinds twee weken last van koorts, een lopende neus en hoofdpijn. Hij
constulteerde de huisarts die hem antibiotica voorschreef. Zijn toestand verslechterde en
hij consulteerde de spoedgevallen afdeling van het Militair Hospitaal.
De man was militair en verbleef in 2011 gedurende 2 maanden in Kindu (buitenlandse
zending) en verliet Kindu in december 2011. Hij nam toen mefloquine als profylaxe tot
twee weken na het verlaten van Kindu. Sinds de zendig is hij niet ziek geweest of
vertoonde hij geen symptomen van malaria. Er was geen enkel vermoeden van malaria
en de dokter vroeg ook geen malaria onderzoek aan.
Er werd veneus bloed afgenomen in een K3EDTA-tube en geanalyseerd op de UniCel DxH
800. Er werd een leukopenie van 3,8 10³/mm³ vastgesteld (referentiewaarde 4,30-
10,60 10³/mm³) met 87% neutrofielen, 9,4% lymfocyten en 2,3% monocyten, maar ook
een trombopenie van 102 10³/mm³ (referentiewaarde 140-400 10³/mm³). Tijdens de
analyse van het bloed in een heparine tube werd een CRP van ongeveer 49 mg/L
(referentiewaarde 0,0-5,0 mg/L) waargenomen.
Het toestel gaf na de celtelling en differentiatie en malaria discriminant factor van 8,7360
aan. Na raadpleging van de supplementaire data werd een spreiding van het celvolume
van de monocyten van 33,60 waargenomen en een spreiding van het celvolume van de
lymfocyten van 26,00. Ook het witte boedcellen histogram (WBC) vertoonde de extra
populatie (hoge celfrequentie) op de 35 fL grenswaarde. De NRBC dataplot vertoonde
ook de groene populatie links onderaan, wat mogelijk malariasignalen kunnen zijn.
Omwille van het laag aantal plaatjes, de leukopenie, de verhoogde CRP, het WBC
histogram, de NRBC dataplot en de hoge malaria discriminant factor werd een sneltest
uitgevoerd. De sneltest gaf echter een negatief resultaat.
Figuur 54: Negatieve SD Bioline P.f/Pan
sneltest bij een vermoeden van malaria-infectie
(later geconfirmeerd als P.ovale infectie) vier
dagen na de dag van diagnose en na
behandeling met chloroquine.
Figuur 53: Negatieve SD Bioline P.f/Pan sneltest bij
een vermoeden van malaria-infectie (later
geconfirmeerd als P.ovale infectie) op de dag van
diagnose
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 79 | P a g i n a
Vervolgens werd een dikdruppel en een bloeduitstrijkje bereid en microscopisch
onderzocht. Bij het bekijken van het eerste veld van het bloeduitstrijkje werd meteen al
een geparasiteerde rode bloedcel teruggevonden. Het bloeduitstrijkje bevatte trofozoïten
en schizonten. Sommige rode bloedcellen hadden polyparasitisme. Omwille van de
aanwezigheid van schizonten en de vorm van de trofozoiëten werd P.ovale infectie
vermoed. Er werden 0,1% geïnfecteerde rode bloedcellen aangetroffen in het
bloeduitstrijkje. In de dikdruppel werden ook parasieten aangetroffen en werd een
parasitemie van 3951 parasieten/µl geteld (209 parasieten per 201 witte bloedcellen en
een celtelling van 3800 witte bloedcellen per µl op de UniCel DxH 800). Er werd
onmiddellijk een behandeling gestart van 100 mg chloroquine (6 tabletten per dag op de
eerste dag van de behandeling en de daaropvolgende 3 dagen 3 tabletten per dag).
Het monster werd opgestuurd naar het Instituut voor Tropische Geneeskunde (ITG) te
Antwerpen voor confirmatie. Ook hier bevond men de dikdruppel en het bloeduistrijkje
positief en werd de infectie van P.ovale geconfirmeerd. Ook hier was de test op het pLDH
antigen en het HRP-2 negatief. Er werd een parasitemie van 4192 aseksuele parasieten
(AP)/µl vastgesteld.
Na vier dagen behandeling met Chloroquine kwam de man opnieuw op controle en
werden opnieuw dezelfde analyses en testen uitgevoerd. De man had geen leukopenie
meer (6,5 10³/mm³) met 54,2% neutrofielen, 35,1% lymfocyten en 8,6% monocyten.
Ook was de trombopenie verdwenen (229 10³/mm³). De malaria discriminant factor was
gedaald tot 5,8307 maar nog steeds hoger dan de cut-off waarde van 4,5. Na
raadpleging van de supplementaire data werd een spreiding van het celvolume van de
monocyten van 29,11 waargenomen en een spreiding van het celvolume van de
lymfocyten van 20,03. Het witte boedcellen histogram (WBC) vertoonde niet meer de
extra populatie (hoge celfrequentie) op de 35 fL grenswaarde. De groene populatie
linksonderaan op de NRBC dataplot was ook verdwenen.
Figuur 56: WBC (witte bloedcel)
histogram vertoont een goede verdeling en
geen extra populatie op de 35 fL volume
grenswaarde.
Figuur 55: WBC (witte bloedcel) histogram
vertoont een abnormale verdeling en een
extra populatie op de 35 fL volume
grenswaarde (hoge celfrequentie).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 80 | P a g i n a
Figuur 60: NRBC dataplot van de
militair met een P.ovale infectie na
4 dagen behandeling met
chloroquine. De groene extra
populatie is verdwenen. Nucleated
red blood cells (NRBC) zijn rood en
de witte bloedcellen blauw.
Figuur 59: NRBC surface plot van
een militair met een P.ovale infectie
vertoont een groene extra populatie
links onderaan. Nucleated red blood
cells (NRBC) zijn rood en de witte
bloedcellen blauw.
Figuur 58: NRBC dataplot van de
militair met een P.ovale infectie na 4
dagen behandeling met chloroquine.
De groene extra populatie is
verdwenen. Nucleated red blood cells
(NRBC) zijn rood en de witte
bloedcellen blauw.
Figuur 57: NRBC dataplot van een
militair met een P.ovale infectie
vertoont een groene extra populatie
links onderaan. Nucleated red blood
cells (NRBC) zijn rood en de witte
bloedcellen blauw.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 81 | P a g i n a
Appendix 7: Invloed temperatuur en leeftijd van het bloedmonster op de malaria
discriminant factor, de dataplots en het WBC histogram.
Er werden 5 normale bloedmonsters bewaard op kamertemperatuur en op bepaalde
tijdstippen geanalyseerd op de UniCel DxH 800 (na afname, na 24u, na 48u, en na 72u).
Er werden ook 5 andere normale bloedmonsters bewaard op koelkasttemperatuur (4°C)
en op bepaalde tijdstippen geanalyseerd op de UniCel DxH 800 (na afname, na 24u, na
48u, en na 72u).
Tabel 41: De invloed van kamertemperatuur en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V lymfocyten)
KAMERTEMPERATUUR
Malaria discriminant factor 0u 24u 48u 72u
Staal 1 3,230136 4,571072 6,99545 8,390916
Staal 2 2,094825 3,577338 7,82565 13,2896
Staal 3 2,144214 3,845844 9,96815 15,43803
Staal 4 2,466975 3,368907 5,544105 12,8271
Staal 5 2,1168 2,822796 6,685206 10,06505
Gemiddelde 2,41059 3,637191 7,403712 12,00214
SD 0,482652 0,643131 1,650412 2,78104
SD 0,867338 (van 0u tot 24u)
3,530671 (van 0u tot 48u)
6,78225 (van 0u tot 72u)
SD V Lymfocyten 0u 24u 48u 72u
Staal 1 15,08 18,92 27,65 38,21
Staal 2 13,25 16,74 35,98 46,91
Staal 3 12,51 19,02 36,5 48,87
Staal 4 12,95 16,49 27,79 44,85
Staal 5 13,5 15,93 30,54 42,83
Gemiddelde 13,458 17,42 31,692 44,334
SD 0,978862 1,445458 4,312606 4,100083
SD
2,801557 (van 0u tot 24u)
12,89339 (van 0u tot 48u)
21,83263 (van 0u tot 72u)
SD V Monocyten 0u 24u 48u 72u
Staal 1 21,42 24,16 25,3 21,96
Staal 2 15,81 21,37 21,75 28,33
Staal 3 17,14 20,22 27,31 31,59
Staal 4 19,05 20,43 19,95 28,6
Staal 5 15,68 17,72 21,89 23,5
Gemiddelde 17,82 20,78 23,24 26,796
SD 2,426675 2,322294 2,986436 3,963601
SD
2,093036 (van 0u tot 24u)
3,832519 (van 0u tot 48u)
6,34699 (van 0u tot 72u)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 82 | P a g i n a
Tabel 42: De invloed van koelkasttemperatuur (4°C) en tijd op de malariafactor (SD V monocyten en SD V
lymfocyten)
KOELKAST
Malaria discriminant factor 0u 24u 48u 72u
Staal 6 2,2425 3,1277 3,5577 3,9406
Staal 7 2,7621 3,2588 3,8431 4,6756
Staal 8 2,4670 3,2303 4,2372 4,3643
Staal 9 2,0699 2,8963 3,5980 3,1932
Staal 10 2,0489 2,7394 3,3211 3,9628
Gemiddelde 2,3181 3,0505 3,7114 4,0273
SD 0,2996 0,2248 0,3473 0,5570
SD 0,5179 (van 0u tot 24u)
0,9852 (van 0u tot 48u)
1,2086 (van 0u tot 72u)
SD V Lymfocyten 0u 24u 48u 72u
Staal 6 13,03 15,03 15,23 16,15
Staal 7 14,85 15,43 16,68 19,17
Staal 8 13,93 16,72 20,43 20,28
Staal 9 12,56 15,53 16,31 13,92
Staal 10 12,87 14,32 15,44 15,16
Gemiddelde 13,448 15,406 16,818 16,936
SD 0,934783 0,875117 2,106198 2,6945
SD 1,384515 (van 0u tot 24u)
2,38295 (van 0u tot 48u)
2,466388 (van 0u tot 72u)
SD V Monocyten 0u 24u 48u 72u
Staal 6 17,21 20,81 23,36 24,4
Staal 7 18,6 21,12 23,04 24,39
Staal 8 17,71 19,32 20,74 21,52
Staal 9 16,48 18,65 22,06 22,94
Staal 10 15,92 19,13 21,51 26,14
Gemiddelde 17,184 19,806 22,142 23,878
SD 1,045911 1,091343 1,079546 1,738626
SD 1,854034 (van 0u tot 24u)
3,505835 (van 0u tot 48u)
4,733373 (van 0u tot 72u)
De monsters worden het best bewaard op koelkasttemperatuur omdat deze temperatuur
minder invloed heeft op de onderzochte factoren. Hoe ouder het staal , hoe groter de SD
V monocyten en lymfocyten en dus hoe groter de malaria discriminant factor. In één van
de 5 monsters werd zelfs 72 uur na de bloedafname een malaria indicatie aangegeven
(malaria discriminant factor >4,5). De SD V lymfocyten lijkt het meeste onderhevig aan
de invloed van tijd en stijgt met de leeftijd van het monster. De monsters dienen zo snel
mogelijk na afname op het toestel geanalyseerd te worden om de meest betrouwbare
resultaten en de juiste waarschuwing voor malaria te kunnen bekomen.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 83 | P a g i n a
Figuur 61: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor.
Figuur 62: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V monocyten
Figuur 63: Grafiek invloed tijd en temperatuur op de SD V lymfocyten.
0
1,5
3
4,5
6
7,5
9
10,5
12
13,5
15
0 24 48 72 96
Mal
aria
fact
or
Tijd (uur)
Invloed tijd en temperatuur op de malaria discriminant factor (Beckman Coulter DxH800)
Malariafactor (Kamertemperatuur)
Malariafactor (Koelkasttemperatuur)
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96
Mal
aria
fact
or
Tijd (uur)
Invloed tijd en temperatuur op de SD V Monocyten (Beckman Coulter DxH800)
Malariafactor (Kamertemperatuur)
Malariafactor (Koelkasttemperatuur)
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 24 48 72 96
SD V
Lym
focy
ten
Tijd (uur)
Invloed tijd en temperatuur op de SD V Lymfocyten (Beckman Coulter DxH800)
Malariafactor (Kamertemperatuur)
Malariafactor (Koelkasttemperatuur)
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 84 | P a g i n a
Figuur 64: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links naar
rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).
Figuur 65: De dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar rechts: na
afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).
Figuur 66: De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur (4°C)(links
naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).
Figuur 67 : De NRBC-dataplots die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar
rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 85 | P a g i n a
Figuur 68: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op koelkasttemperatuur
(4°C)(links naar rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).
Figuur 69: De WBC histogrammen die de monsters vertoonden na bewaring op kamertemperatuur (links naar
rechts: na afname, na 24u, na 48u en na 72u na afname).
Voor de interpretatie van de histogrammen en de dataplots wordt het staal het beste op
koelkasttemperatuur bewaard. Hoe ouder het staal, hoe slechter de scheiding van de
populaties op de 5PD1 dataplots en verschijnt er ook een extra rode populatie horizontaal
onderaan de dataplot wat volgens de literatuur ook waargenomen wordt bij monsters
met een malaria-infectie. Op de NRBC dataplots wordt de blauwe populatie witte
bloedcellen wijder en verschijnen meer nucleated red blood cells (NRBC). Het histogram
op koelkasttemperatuur toont aan dat hoe ouder het staal hoe lager de celfrequentie van
de neutrofielen wat resulteert in geen mooie verdeling. Het histogram op
kamertemperatuur toont aan dat hoe ouder het staal hoe lager de celfrequentie van de
neutrofielen, eosinofielen en hoe groter de celfrequentie van monocyten. Deze
veranderingen in de histograms worden veroorzaakt door de slechtere differentiatie van
de witte bloedcellen met het tellen van cellen bij de verkeerde populatie.
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 86 | P a g i n a
Appendix 8: Correlatie
De malariafactor is een gecalculeerde parameter die berekend wordt uit de SD V
lymfocyten en de SD V monocyten. Door de correlatie van de malariafactor met de SD V
lyfmocyten van monsters uit de onderzoeksgroep gehospitaliseerde patiënten met een
infectie uit te zetten wordt een correlatie van 89,06% waargenomen, en met de SD V
monocyten 86,36%. De spreiding van het volume van de lymfocyten heeft een iets
betere correlatie met de malariafactor dan de spreiding van het volume van de
monocyten.
Om na te gaan of een grote spreiding van het volume van de lymfocyten gepaard gaat
met een grote spreiding van het volume de monocyten worden deze tegenover elkaar
uitgezet in een grafiek. Er wordt een correlatie waargenomen van 56,87%, d.w.z. dat er
geen groot verband is tussen deze twee variabelen. Er is geen verband tussen de
malariafactor en het aantal bloedplaatjes, dit geeft slechts een correlatie van 23,51%.
0
10
20
30
40
50
0,0000 5,0000 10,0000
SD V
lym
focy
ten
Malaria discriminant factor
Correlatie Malaria factor en SD V lymfocyten
0
10
20
30
40
50
0,0000 5,0000 10,0000
SD V
mo
no
cyte
n
Malariafactor
Correlatie Malaria factor en SD V monocyten
0
10
20
30
40
0 20 40 60
SD V
mo
no
cyte
n
SD V lymfocyten
Correlatie SD V lymfocyten en SD V monocyten
0
500
1000
1500
0,0000 2,0000 4,0000 6,0000 8,0000 10,0000
Blo
ed
pla
atje
s
Malaria discriminant factor
Correlatie Malaria factor en bloedplaatjes
Figuur 73: Correlatie bloedplaatjes met de malaria
discriminant factor
Figuur 72: Correlatie SD V lymfocyten met SD V
monocyten3
Figuur 71: Correlatie malaria discriminant factor
met de standaarddeviatie van de monocyten (SD V
monocyten).
Figuur 70: Correlatie malaria discriminant factor
met de standaarddeviatie van de lymfocyten (SD V
lymfocyten).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 87 | P a g i n a
X. BIJLAGE
Bijlage 1 : Plasmodium falciparum ..........................................................................87
Bijlage 2: Plasmodium ovale ..................................................................................89
Bijlage 1 : Plasmodium falciparum
Tabel 43: Kenmerken P.falciparum (ITG)
P.falciparum
Geografie Tropisch Amerika, Tropisch Afrika, Tropisch Azië en luchthavens
Aandoening Malaria tropica (kwaadaardig)
Biologische
verschijnselen
Koorts, haemolytische anemie, trombocytopenie, hypoglycemie, verhoogd LDH
(lactaat dehydrogenase) en billirubine.
Incubatieperiode 7-21 dagen
Maximale parasitemie 2.000.000/µl
Duur schizogenie 24-48 uur
Hypnozoïeten Neen, geen herval mogelijk
BLOEDUITSTRIJKJE
Geïnfecteerde RBC Normaal met Maurer-vlekken
Stadia Trofozoïeten en jonge gametocyten, zelden schizonten.
Trofozoïeten
Ringvormig, meestal aan de rand van de RBC
Vacuole zichtbaar (1 of meer bij oude trofozoïeten
1 tot 2 chromatine korrels als kern (jonge vormen) en 1 tot 2 ‘uitgerokken’
kernen (ouder vormen)
Vaak meerdere parasieten per RBC (polyparasitisme)
Schizonten
Weinig ontwikkeld onregelmatig cytoplasma (jonge vormen), neemt 2/3 van
de RBC in (rijpe vormen).
2 tot 4 kernen (jonge vormen) en 8 tot 24 kernen (rijpe vormen)
Pigment geconcentreerd op de parasiet
Mannelijke
gametocyten (Micro)
Roze, banaanvormig, geparasiteerde RBC niet zichtbaar
Een grote chromatine vlek als kern
Donkere zwart tot goud-gele granulatie verspreid over parasiet
Vrouwelijke
gametocyten
Grijs-blauw, banaanvorming, geparasiteerde RBC niet zichtbaar
Een goed afgelijnde chromatine korrel als kern
Donkere granulatie gelegen op de kern
DIKDRUPPEL
Trofozoïeten Klein tot gemiddeld, ringvormig meestal als ‘komma’vorm, 1-2 chromatine korrels,
geconcentreerd pigment
Schizonten Klein en compact, 8-24 kernen, pigment geconcentreerd in één massa
Gametocyten Banaanvormig, een duidelijk afgelijnde vlek en donkere versprijde granulatie van het
pigment
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 88 | P a g i n a
Figuur 74: Stadia van de P.falciparum parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-18: Trofozoïeten (2-10
ringstadia); 19-26: Schizonten; 27-28: Vrouwelijke gametocyten (macrogametocyten); 29-30 Mannelijke
gametocyten (microgametocyten).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 89 | P a g i n a
Bijlage 2: Plasmodium ovale
Tabel 44: Kenmerken P.ovale (ITG)
P.ovale
Geografie Tropisch en sub-tropsich Afrika, enkele gebieden in Zuid-Amerika
Aandoening Malaria tertiana
Biologische
verschijnselen
Koorts
Incubatieperiode 11-16 dagen
Maximale
parasitemie
160.000/µl
Duur schizogenie 48 uur
Hypnozoïeten Ja, herval mogelijk
BLOEDUITSTRIJKJE
Geïnfecteerde RBC Vergroot, normaal of verkleind, ovaal of uitgerokken
Stadia Alle
Trofozoïeten Compacte ringvorm (jonge vormen), neemt RBC niet volledig in (oude vormen)
Een chromatinekorrel als kern (jonge vormen), een tot twee grote kernen
(oude vormen)
Pigment zeldzaam
Polyparasitisme zeldzaam
Schizonten compact (jonge vormen), neemt niet de volledige RBC in (rijpe vormen).
2 tot 4 kernen (jonge vormen) en 4 tot 16 kernen aan de rand van de RBC
(rijpe vormen)
Donkere stippeling op de parasiet (jonge vormen) en een geconcentreerde
pigmentmassa in 1 of 2 massa’s in parasiet (oude vormen)
Mannelijke
gametocyten
(Micro)
Roze tot kleurloos, rond of ovaal, neemt de RBC niet volledig in
Een grote chromatine vlek
Donkere stippeling verspreid over parasiet
Vrouwelijke
gametocyten
Grijs-blauw, rond , neemt de RBC volledig in
Een goed afgelijnde chromatine korrel
Bruine stippeling verspreid over parasiet
DIKDRUPPEL
Trofozoïeten Klein tot gemiddeld, ringvormig of rond, een chromatinekorrel (kern), pigment verspreid
in grove korrels
Schizonten Gemiddelde grote, 4 tot 16 kernen met geconcentreerd pigment
Gametocyten Rond en gemiddeld groot, een duidelijk afgelijnde vlek (kern) pigment verspreid in
grove korrels
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 90 | P a g i n a
Figuur 75: Stadia van de P.ovale parasiet. 1: Normale rode bloedcel; 2-5: Jonge trofozoïeten (ringstadia); 6-
15: Trofozoïeten; 16-13: Schizonten; 24: Vrouwelijke gametocyt (macrogametocyt); 25 Mannelijke gametocyt
(microgametocyt).
Geautomatiseerde malariadetectie; vergelijkende studie tussen Coulter UniCel DxH 800, de manuele sneltest en de lichtmicroscopie.
WILKE VANDENSANDE 91 | P a g i n a