Приложенияметода проточнойцитометрии...

Хайдуков С.В.

Приложения методапроточной цитометрии

наиболее часто используемыев медицине и биологии.

Хайдуков С.В., д.б.н.-- Институт биоорганической химии им. акад. М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва.- ФГУ Федеральный Научно-Клинический Центр детской

гематологии, онкологии и иммунологии МЗиСР РФ, Москва.

Семинар 5-7 октября 2011 г.


1. Иммунный статус2. Регуляторные Т клетки3. Стволовая клетка (гемопоэтическая и мезенхимальная)4. Определение Th1 и Th2 (внутриклеточные цитокины)5. Тестирование натуральных аллергенов6. Типирование лейкозов7. Быстрый тест на сепсис (CD14/HLA-DR на моноцитах)8. Тестирование сепсиса у новорожденных (CD64 на

нейтрофилах)9. Фагоцитоз и «кислородный взрыв»10. Апоптоз (Аннексин V)11. Анализ ДНК12. Flow Cytometry Crossmatch13. Технология МНС тетрамеров14. Анализ пролиферации Т клеток в ответ на различные

стимулы при помощи CFSE15. Мультиплексное определение наличия и концентрации

цитокинов в сыворотке на основе микросфер


Иммунный статус

Анализ иммунного статуса пациентовопределяют при помощииммунофенотипирования.

Иммунофенотипирование этохарактеристика клеток при помощи

моноклональных антител или других зондов, позволяющая судить об их типе и

функциональном состоянии по наличию тогоили иного набора клеточных маркеров.


Градация реагентов для медико-биологических исследований

Эти продукты могут использоватьсядля клинический диагностики..

Утвержденные Советом Европыпродукты для in vitro диагностики имогут быть использованы свободновсюду по ЕС.

Использование этого реагентавозможно для лабораторного анализа, но ответственность за это лежит налаборатории.

Эти продукты не могутиспользоваться для клиническогоанализа, прогноза илитерапевтического диагноза.

Не предназначен для идентификациизаболевания или состояния пациентов.

In Vitro Diagnostic (IVD)

CE-marked (CE) “ConformitéEuropéenne.”

Analyte Specific Reagents

(ASR)

Research Use Only (RUO)

Laboratory Use Only (LUO)


Реагенты для лизиса эритроцитов вручном и автоматичаском режимах• Whole Blood Lysing Reagents

Лизис эритроцитов за счет муравьиной кислоты с последующей ее нейтрализацией ификсацией клеток параформальдегидом.

• IOTest® 3 Lysing SolutionРаствор на основе хлорида аммония (NH4Cl), который является активнымингредиентом лизирующего раствора.

• OptiLyse CЛизис эритроцитов за счет сапонина и последующей фиксацией клетокпараформальдегидом.

• VersaLyseФерментативный лизис эритроцитов. Основным активным ингредиентом реактиваVersaLyse является циклический амин; в присутствии карбоангидразы эритроцитовон превращается в соединение, обладающее высокой литической активностью вотношении этих клеток

• ImmunoPrep®

Реагент для автоматического лизиса эритроцитов для безотмывочной технологии. Качественный лизис эритроцитов. Отсутствие морфологических изменений в клеткахдругих типов. Высокий уровень стандартизации. Лизис эритроцитов за счетмуравьиной кислоты с последующей ее нейтрализацией и фиксацией клетокпараформальдегидом.


Рекомендации по

иммунофенотипированию

лимфоцитов

периферической крови

методом проточной

цитометрии


CDC-панель

FITCIgGCD45CD3CD3CD3CD3

PE IgG КонтрольCD14 ГэйтCD19 T/B-клеткиCD4 T-хелперыCD8 T-цитотокс.CD56 (+/-CD16) NK-клетки


FITCIgGCD45CD3CD3CD3CD3CD3

PE IgG КонтрольCD14 ГэйтCD19 T/B-клеткиCD4 T-хелперыCD8 T- цитотоксическиеCD56 (+/-CD16) NK-клеткиHLA-DR активированные Т-кл.

Наиболее часто используемаяпанель для определенияиммунного статуса


Рекомендации CDC для гейтирования по CD45


Трехцветная панельИспользуется для:

Мониторинг прихроническихвирусныхзаболеваниях (HIV, CMV и т.д.)Мониторинг при

трансплантацииПервичный и

вторичныйиммунодефицитыАутоиммунные

заболевания

FITC PE PE-Cy5

CD3 HLA-DR CD45

CD3 CD25 CD45

CD8 CD38 CD45

CD57 CD8 CD45

CD4 CD45RA CD45

CD4 CD45RO CD45

CD3 TcRab CD45

CD3 TcRgd CD45

CD19 CD5 CD45


Четырехцветная панель моноклональныхантител для определения иммунного статусаFITC PE ECD (или APC) PC5 (или PerCP)

1. IgG IgG IgG CD45изотипический контроль

2. CD19 CD5 CD27 CD45В1, В2, В-клетки памяти

3. CD16 CD56 CD3 CD45T-NK-клетки и субпопуляции NK-клеток

4. CD8 CD4 CD3 CD45субпопуляции Т-клеток

5. CD4 CD25 HLA-DR CD45активированные Т хелперы

7. CD45RA CD45RO CD4 CD45наивные и активированные Т хелперы, Т-клетки памяти

8. TcR-αβ TcR-γδ CD3 CD45αβ- и γδ-Т-клетки

9. CD4 CD25 CD127 CD45регуляторные Т-клетки

Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009 Т. 11, № 2-3, стр. 227-238


Почему такой интерес к Treg?• Treg играют важную роль в иммуносупрессиии их изучают в таких областях как:• Аутоиммунные заболевания,• Трансплантационная иммунология,• Противоопухолевый ответ и• Иммуногомеостаз

Treg понижающие регуляторыПОЛЬЗА•Регулируют Т клеточный гомеостаз•Предотвращают аутоиммунные заболевания•Предотвращают аллергии•Предотвращают гиперчувствительность•Толерантность после трансплантации•Предотвращают РТПХ

С ДРУГОЙ СТОРОНЫ•Снижают противоопухолевый иммунитет•Снижают иммунитет к инфекциям


Поверхностный маркеррегуляторных T клеток!

• Самый точный маркер для идентификации Tregклеток - FoxP3• Однако, это требует пермебилизации клеток

• Недавние публикации продемонстрировали, чтоэкспрессия CD127 (IL-7 рецептор) снижается наTreg клетках


Недавнее достижение в характеристикеповерхностных маркеров Treg!

• Новая стратегия дляанализа CD4+CD25hi Tregс использованиемCD127

• Treg представляютсобой CD127neg

Источник:Liu et al., JEM, 203:1701-1711 (2006)


Гемопоэтическая стволовая клетка:анализ клеток после афереза (CD34)


Гемопоэтическая стволовая клетка: анализфенотипа стволовых клеток полученных из

пуповинной крови.


Мезенхимальная плюрипотентная клетка: анализфенотипа клеток полученных из тканей.


Внутриклеточные цитокины

TNFTNF--ααILIL--4, IL4, IL--5,5,

ILIL--6, IL6, IL--10, IL10, IL--1313

ILIL--22IFNIFN--γ, γ, ILIL--1212

ILIL--22ILIL--44IFNIFN--γγTTHH00

TTHH11 TTHH22

TTHHPP ILIL--22

Короткаяантигенная стимуляция

Хроническаяантигенная стимуляция

IL-4, IL-10

Interferon-γ

Ингибирование

Ингибирование

Тип 1 Тип 2

CD4+ IL-2, IFN-γ, IL-12 IL-4, IL-5, IL-6,IL-10, IL-13

Физиологическиефункции

Цитотоксичность, проитвовирусная защита, противоопухолевая защита, продукция IgG и IgM

Защита от паразитови аллергий, продукцияIgE и IgA


Профилипродукциицитокиновпосле

стимуляции


Локализация Th1/Th2 клеток

Внутриклеточное окрашивание цитокинов и иханализ методом проточной цитометрии.


Базофилы

CD203c (E-NPP3)Не активированная цельная кровь

Активированная цельная кровь

Область использования:Тестирование натуральных аллергенов


Характеристика CD4+ Т клеток 2-го типа (Th2)

CRTH2-PE (СD294)

В нормальной периферической кровиCRTH2 экспрессируется:

• CD4+ хелперными Т клетками (Th2) иCD8+ цитотоксическими Т клетками(Tc2), но НЕ тип 1 T клетками

• Базофилами, • Эозинофилами• Про-воспалительными моноцитами сфенотипом:

CD14dimCD16+HLA-DR+CD33+

Эозинофилы

Базофилы

Про-воспалительныемоноциты

Th2 клетки


Характеристика CD4+ Т клеток 2-го типа (Th2)

Локализация Th2 клеток при помощи CD294 (CRTH2). Анализ клеток периферической крови с использованием

CD3-PC5, CD203c-PE и CRTH2-FITC (Boumiza R., et al., 2005)


Активация базофиловКлеточный анализ аллергии

Негативный контроль Позитивный контроль Аллерген (пыльца)

% активир. базофилов

% активир. базофилов

95-98%


Развитие нашего знания о заболевании

50 Лет назад

Лейкемия или Лимфома40 Лет назад

Хроническая лейкемияОстрая лейкемияПрелейкемия

Вялотекущая лимфомаАгрессивная лимфома

60 Лет назад

“Болезнь крови”

Сегодня

∼ Идентифицировано 38 типов лейкемий :Острая миелоидная лейкемия (∼12 типов)Острая лимфобластная лейкемия (2 типа)Острая промиелоцитарная лейкемия (2 типа)Острая моноцитарная лейкемия (2 типа)Острая эритроидная лейкемия (2 типа)Острая мегакариобластная лейкемияОстрая миеломоноцитарная лейкемия (2 типа)Хроническая миелоидная лейкемияХроническое миелопролиферативное расстройство (5 типов)Миелодиспластические синдромы (6 типов)Смешанные миелопролиферативные/миелодиспластическиесиндромы (3 типа)

∼ Идентифицирована 51 лимфома :Зрелые B-клеточные лимфомы (∼14 типов)Зрелая Т-клеточные лимфомы (15 типов)Неоплазмии плазматических клеток (3 типа)Незрелые (предшественники) лимфомы (2 типа)Ходжкинские лимфомы (5 типов)Иммунодефицит ассоциированные лимфомы (∼5 типов)Другие гематолимфоидные неоплазмии (∼7 типов)

Выживание втечении 5 лет

~ 0%

70%

Заболевание лучше поняли, сегментировали и персонифицировалиЗаболевание лучше поняли, сегментировали и персонифицировали


Типирование лейкозов


Т III (Кортикальный Т-клеточный острыйлимфобластный лейкоз)

Про-Т-ALL Пре-T-ALL Корт.Т-ALL Зрел.T-ALLcyCD3CD7CD2CD5CD4CD8CD1 αCD3

экспрессируетсяэкспрессируется

негативныенегативные

вариабельныевариабельные


Набор Solastra™

A66286 B Lineage Kit 25tA66287 T Lineage Kit 25t A66288 Myelomono Lineage Kit 25tA66256 Neg. Control Vial 25t


Набор Solastra™

7 флаконов + 1 негативный контроль

1 набор для компенсации


Острая миелоидная лейкемия (костный мозг)

T-линейные Пробирка 1:

CD2 / CD56 / CD7 / CD5 / CD45

T-линейные Пробирка 2:

CD8 / CD4 / - / CD3 / CD45



В-линейные Пробирка 1:

Kappa/ Lambda / CD19/ CD5 / CD45

В-линейные Пробирка 2:

CD20/ CD10/ CD19 / CD38 / CD45


Миеломоноцитарное происхождениеПробирка 1:

CD15 / CD11b / CD16 / CD14 / CD45


HLA-DR / CD56 / CD34 / CD117 / CD45


CD7/ CD13 / CD34 / CD33 / CD45

АМЛ с фенотипом:CD34+ 117+ Dim13+ 33+ 15+ 11b-16- 14- 56- 2- 7+

АМЛ с фенотипом:CD34+ 117+ Dim13+ 33+ 15+ 11b-16- 14- 56- 2- 7+



Образцы периферическойкрови, окрашеныантителами (HLA-DR)-PE.Логическое ограничениевведены по моноцитарнойзоне на гистограммераспределения клеток поморфологии. Критическоезначение <42% позитивныхмоноцитов.

Быстрый тест для мониторинга сепсиса(HLA-DR на моноцитах)


Сепсис: экспрессия HLA-DR на моноцитахМатериал: периферическая кровь с K3EDTAЛизис: ImmunoPrep™ или OptiLyse CРеагенты: CD14-FITC (Маркер для выбора зоны

моноцитов)HLA-DR-PE (Функциональный маркер)IgG1-PE (Изотипический контроль)

HLA-DR+ 93,2%1,0%

Контроль

Сепсис

1,0% HLA-DR+ 12,0%


Тестирование сепсиса у новорожденных (CD64 на нейтрофилах)

Обоснование выбора CD64 для количественного определенияэкспрессии данного маркера в диагностике инфекции/сепсисаЭкспрессия CD64 незначительна в здоровом состоянии (<2 000

молекул на клетку) - низкий ложно-позитивный уровень.

Экспрессия CD64 повышается под действием цитокинов, связанных своспалением: IFN-γ (3-4 часа), G-CSF (4-6 часов), IL-12.

Увеличение экспрессии CD64 приводит к повышению антитело-зависимых функций (фагоцитоз, окислительный взрыв, бактерицидная активность) – существенным изменениям втечение воспаленения.

Экспрессия CD64 повышается в присутствии инфекции или сепсисе.

Высокая специфичность - экспрессия CD64 не повышается при:• Терапия любыми препаратами (отличными от цитокинов)• Клинические состояния с ограниченным повреждением ткани (миокардиальная

ишемия, несложные хирургические вмешательства и травмы)• Аутоиммунные расстройства (ревматоидный артрит, СКВ) • Беременность


Тестирование сепсиса у новорожденных (CD64 на нейтрофилах)

Использование CD64 индекса позволяет отличить инфицированныхноворождённых (с 95%-тным достоверным прогнозом) от неинфицированных (с 93%-тным достоверным прогнозом).

CD64 в образцах от новорожденных

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 1 2 3 4 5 6

Без инфекции С инфекцией

CD

64 Инд

екс


Фагоцитоз


Снижение фагоцитарнойактивности нейтрофилов

1. Дисфункция актина2. Дефицит рецептора комплемента C3bi3. Дефекты, связанные с изменением фагоцитарной

активности, обнаруживаются при травмах4. Диабет5. Почечная недостаточность6. Различные инфекции (M. tuberculosis ). 7. Бактериальные инфекции кожи и легких8. Инфицирование ожоговых ран9. СПИД10. Нарушение работы печени. Фагоцитарный

потенциал нейтрофилов значительно ниже упациентов с циррозом печени


Анализ «кислородного взрыва» у клеток-фагоцитов периферической крови

А – негативный контроль; Б – «кислородный взрыв»у клеток-фагоцитов. Однопараметрические

гистограммы гейтированы по зоне В.


«Кислородный взрыв»

1. Данный процесс усилено протекает при остромвоспалении и, в меньшей степени, при хроническомтечении воспалительных заболеваний

2. Спонтанный «кислородный взрыв» нейтрофиловнаблюдался у новорождённых с признакамиинфекции

3. Понижение или отсутствие «кислородного взрыва»наблюдается при некоторых врожденных дефектах, например, хроническом гранулематозе

4. Данные нарушения также наблюдаются послетрансплантаций

5. У пациентов со СПИД


Клеточная гибель

Некроз 1,5,6 / Апоптоз 1-4

1. Нормальная клетка2. Сжатие клеток и конденсация

хроматина3. Формирование апоптотичских телец4. Фагоцитоз апоптотичских телец

моноцитами/макрофагами5. Разрушение ДНК6. Некроз – набухание и разрушение

цитоплазматической мембраны. Разрушение клеток.

From Kerr J.F.R., et. al. (1994) Cancer 73:2013-2026


Апоптоз: окрашиваниеAnnexin V


CD95 на Т клетках

CD95 необходимое, но не достаточное условие входаклеток в апоптоз


Принципы окрашивания ДНК

Анализ позволяет определить наличиеклеток с измененным количеством ДНК

ДНК может быть окрашено различными красителями, которые встраиваются в двойную спираль

Окрашивание – стехиометрическое, то естьколичество связанного красителя пропорциональноколичеству ДНК находящегося в клетке

Краситель должен войти в ядро, чтобы окраситьспираль ДНК


Клеточный цикл иокрашивание ДНК

G1

S

G2M


Красители для ДНК

Красители ДНК можно разделить на двеосновные категории:

Легковозбудимые лазером 488nm:Propidium iodide Acridine OrangeCoriphosphine O7-AAD

Легковозбудимые ультрафиолетом:DAPIHoechst


Анализ клеточного цикла


Анализ ДНК содержащегося вхромосомах методом

проточной цитометрии


Flow Cytometry CrossMatchАнтитела к чужеродным антигенам HLA

могут присутствовать в сыворотке реципиентадо трансплантации. Выявление их в сывороткереципиента может свидетельствовать овысоком риске сверх-острого отторжениятрансплантата.

Таким образом FCCM является методомконтроля совместимости донор-реципиент впроцессе подбора донора, пост-операционногомониторинга антител к тканям донора исущественно снижает риск отторжениятрансплантата.


Схема Flow Cytometry Crossmatch (для Т клеток)

Используется метод непрямойиммунофлуоресценции с мечеными (Fab’)2 фрагментами антител против Ig человека

HLAHLA--class Iclass I


Схема Flow Cytometry Crossmatch (для В клеток)

Используется метод непрямойиммунофлуоресценции с мечеными (Fab’)2 фрагментами антител против Ig человека

HLAHLA--class IIclass II

HLAHLA--class Iclass I


Flow Cytometry Crossmatch

Готовится три пробы:1. Лимфоциты донора с негативной сывороткой.2. Лимфоциты донора с позитивной сывороткой.3. Лимфоциты донора с тестируемой сывороткой

реципиента.Вычисляется индекс флуоресценции (FI)

MEAN (реципиента) – MEAN (нег. контроль) FI = ------------------------------------------------------------------------ X 100%

MEAN (поз. контроль) – MEAN (нег. контроль)

MEAN – максимум пика флуоресценции распределенияклеток на гистограмме

Оценка FCCM

Тест считается позитивным, если FI>10%


Комплекс TcR-пептид-MHC


Получение MHC тетрамера


Анализ наличия CMVпозитивных клеток припомощи MHC тетрамера

Негативный пациент Позитивный пациент


Анализ пролиферации Т клеток в ответ наразличные стимулы при помощи CFSE


Мультиплексное определение наличияи концентрации цитокинов в

сыворотке на основе микросфер• иммуноанализ типа „сэндвич“, в которомантитело связанно с поверхностьюмикрочастицы

• микрочастицы различного размера (частицы сдиаметром 4,4 и 5,5 мкм)

• отдельные виды микрочастиц можноидентифицировать как по интенсивностифлюоресценции, так и по размеру


Мультиплексное определениеналичия и концентрации цитокиновв сыворотке на основе микросфер


СПАСИБО ЗАВНИМАНИЕ

Приложенияметода проточнойцитометрии...

Documents

Transcript of Приложенияметода проточнойцитометрии...