Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης
-
Upload
meropi-karakioulaki -
Category
Documents
-
view
56 -
download
4
Transcript of Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης
![Page 1: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/1.jpg)
Μοριακή διάγνωση μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR
με RT-PCR και ARMS-PCR
Καρακιουλάκη ΜερόπηΕπόπτρια Καθηγήτρια: Δροσοπούλου Ελένη
Μονάδα Εκτέλεσης: LabNET Εκπαιδευτής Μονάδας: Χατζηδημητρίου Δημήτριος
Θεσσαλονίκη, Ιούλιος 2016
![Page 2: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/2.jpg)
• Τρόπος λειτουργίας
• Τρόπος οργάνωσης
• Υποστήριξη πολλών βιοπαθολογικών εργαστηρίων
• Αναλύσεις σε πάνω από 1000 δείγματα την ημέρα
![Page 3: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/3.jpg)
• σύστημα “slis”
• Προετοιμασία δειγμάτων για αυτόματους αναλυτές
• μοριακές αναλύσεις
Μεταλλάξεις θρομβοφιλίας
Αντιγόνο ιστοσυμβατότητας HLA-B27
Μεταλλάξεις κυστικής ίνωσης
Ιός ηπατίτιδας Β
• Εlisa (17 υδροξυ-προγεστερόνη, κυτταρομεγαλοϊός)
• Ανοσοφθορισμός (αυτοάνοσα)
• γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη, ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης
• πήξη αίματος, γενικές εξετάσεις αίματος
• ταυτοποίηση μικροβίων
• αιματολογικοί έλεγχοι
![Page 4: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/4.jpg)
ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ
![Page 5: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/5.jpg)
Κυστική Ίνωση
• Αυτοσωμική υπολειπόμενη γενετική ασθένεια
• Η πιο συχνή στον Καυκάσιο πληθυσμό
• Ασθενείς 1:2500
• Φορείς 1:25
• Μεταλλάξεις στο γονίδιο CFΤR
![Page 6: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/6.jpg)
Γονίδιο CFTRCystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
Ρυθμιστής Διαμεμβρανικής Διακίνησης Ιόντων
• Μακρύς βραχίονας χρωμοσώματος 7 (περιοχή 7q31-32)
• 230kb
• Κωδικοποιεί CFTR πρωτεΐνη
![Page 7: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/7.jpg)
Πρωτεΐνη CFTR• κανάλι ιόντων χλωρίου
• 2 επαναλαμβανόμενα τμήματα, καθένα:
διαμεμβρανική περιοχή (MSD1, MSD2) 6 διαμεμβρανικά τμήματα
περιοχή δεύσμευσης ATP (NBD1, NBD2) ενέργεια
• Ενώνονται μέσω ρυθμιστικής περιοχής (R) θέσεις φωσφορυλίωσης
ρύθμιση καναλιού
![Page 8: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/8.jpg)
• Kανάλια CFTR έξοδος ιόντων
χλωρίου από επιθηλιακά κύτταρα
προς αεραγωγό
• Μόρια νερού εισέρχονται στον
αεραγωγό λόγω ώσμωσης
• Βλέννη ενυδατωμένη
![Page 9: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/9.jpg)
• Δυσλειτουργία αναστέλλεται έξοδος
ιόντων χλωρίου από επιθηλιακά
κύτταρα προς αεραγωγό
• Μόρια νερού δεν εισέρχονται στον
αεραγωγό
• Βλέννη πηκτή, κολλώδης, δυσκίνητη
• βακτήρια που δεν απομακρύνονται
από το κροσσωτό επιθήλιο
![Page 10: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/10.jpg)
• κύκλοι λοιμώξεων, φλεγμονής και
ιστικής καταστροφής
• Μείωση ποσοστού λειτουργικού
πνευμονικού ιστού
• αναπνευστική ανεπάρκεια
![Page 11: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/11.jpg)
Θεραπεία?
• Δεν υπάρχει αποτελεσματική
θεραπεία σήμερα
• Πρωτόκολλα αντιμετώπισης
συμπτωμάτων αύξηση
μέσου όρου ζωής στα 30-40
χρόνια
![Page 12: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/12.jpg)
2000 διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο CFTR
• Συχνότητα διαφέρει πληθυσμιακά και γεωγραφικά
• Φορείς νόσου φυσιολογικοί
• Ομοζυγώτες ετερογένεια μεγάλος αριθμός μεταλλάξεων
διαφορετικές επιπτώσεις στη λειτουργία της πρωτεΐνης
![Page 13: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/13.jpg)
ΔF508• έλλειμα 3 βάσεων (CTT) απώλεια φαινυλαλανίνης στο κωδικόνιο 508
(περιοχή σύνδεσης με το ATP)
• 70% των περιστατικών κυστικής ίνωσης σε Καυκάσιους
• Παραγωγή CFTR πρωτεΐνης που δεν ωριμάζει φυσιολογικά
• Επικράτηση της μετάλλαξης απόδοση πλεονεκτήματος επιβίωσης:
αντίσταση στο Salmonella typhi
κανάλι CFTR για να εισέλθει στα επιθηλιακά κύτταρα
μετάλλαξη ΔF508 η είσοδός παρεμποδίζεται
![Page 14: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/14.jpg)
2 μέλη ζευγαριού φορείς
• Προγεννητική Διάγνωση λήψη τροφοβλάστης
χοριακών λαχνών
αμνιακού υγρού
•Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση μεταφορά στη μήτρα μόνο υγιών εμβρύων
λήψη και εξέταση ενός κυττάρου από το έμβρυο στο στάδιο των 6-8 κυττάρων
![Page 15: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/15.jpg)
ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ
![Page 16: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/16.jpg)
MULTIPLEX PCR
• εξέταση πολλών αλληλουχιών στόχων σε ένα δείγμα
• χρήση πολλών διαφορετικών ζευγαριών εκκινητών σε μία μόνο
αντίδραση
• χρήση πολλαπλών ιχνηλατών με διαφορετικές φθορίζουσες
χρωστικές για τη διάκριση κάθε προϊόντος που θα παραχθεί από
τους διάφορους εκκινητές
![Page 17: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/17.jpg)
PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ
•φθορίζουσες ουσίες
• εκπέμπουν φθορισμό μετράται σε κάθε κύκλο
•ποσοτικοποίηση προϊόντος
![Page 18: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/18.jpg)
• Ένταση φθορισμού αυξάνεται σε
συνάρτηση με την αύξηση των
αντιγράφων
• Threshold σήμα ξεχωρίζει έντονα
από το φόντο
• Threshold cycle (Ct) κύκλος που το
σήμα φτάνει στο σημείο Threshold
• Μεγαλύτερη ποσότητα αρχικού DNA
τόσο νωρίτερα φτάνει την τιμή
Threshold μικρότερη τιμή Ct
![Page 19: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/19.jpg)
Ολιγονουκλεοτίδια-ιχνηλάτες (probes)
• φθορίζουσα χρωστική (fluorophore)
• μόριο-αποσβέστης φθορισμού (quencher)
• Δεν υβριδίζονται φθορίζουσα χρωστική και αποσβέστης παραμένουν
ενωμένοι αποσβέστης απορροφά φθορισμό της χρωστικής
• Υβριδίζονται με αλληλουχία στόχο αποχωρισμός φθορίζουσας
χρωστικής από αποσβέστη φθορισμός
![Page 20: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/20.jpg)
ΓΡΑΜΜΙΚΟΙ ΙΧΝΗΛΑΤΕΣ - TAQMAN PROBES
![Page 21: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/21.jpg)
ΙΧΝΗΛΑΤΕΣ ΜΕ ΔΕΥΤΕΡΟΤΑΓΗ ΔΟΜΗ -MOLECULAR BEACONS
![Page 22: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/22.jpg)
IΧΝΗΛΑΤΕΣ ΤΥΠΟΥ ΣΚΟΡΠΙΟΥ - SCORPION PROBES
![Page 23: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/23.jpg)
IΧΝΗΛΑΤΕΣ ΤΥΠΟΥ FRET - FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER
![Page 24: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/24.jpg)
ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ
![Page 25: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/25.jpg)
ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ
• Πρωτεϊνάση Κ, διάλυμα λύσης-απορρυπαντικό (λύση κυττάρων)
• Απόλυτη αιθανόλη στήλη φυγοκέντρηση (DNA συδνέεται στο
φίλτρο)
• Πλύσεις DNA στο φίλτρο
• Έκλουση DNA
![Page 26: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/26.jpg)
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ ΔF508 ME TH ΒΟΗΘΕΙΑ ΤΗΣ RT-PCR
• 2 ιχνηλάτες:
Σύνδεση σε αγρίου τύπου γονίδιο CFTR ROX
Σύνδεση σε γονίδιο CFTR με μετάλλαξη ΔF508 VIC
Δείγμα ομόζυγο για το αγρίου τύπου αλληλόμορφο ισχυρό σήμα
φθορισμού από τη χρωστική ROX
Δείγμα ομόζυγο για τη μετάλλαξη ΔF508 ισχυρό σήμα φθορισμού από τη
χρωστική VIC
Δείγμα ετερόζυγο δύο μέσης έντασης σήματα φθορισμού (VIC, ROX)
![Page 27: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/28.jpg)
ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ 29 ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΤΗΣ ΚΥΣΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΜΕ ΤΗ ΒΟΗΘΕΙΑ ΤΗΣ PCR
![Page 29: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/29.jpg)
Στρατηγική ενίσχυσης ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
• Εκκινητές διάκριση μεταξύ δειγμάτων DNA που μπορεί να
διαφέρουν μεταξύ τους εώς και 1 νουκλεοτίδιο
• Ενισχύουν διαφορετικά αλληλόμορφα που διαφέρουν το ένα από το
άλλο εώς και μία βάση
• Eντοπισμός σημειακών μεταλλάξεων και απωλειών μικρού αριθμού
βάσεων στην αλληλουχία κάποιου γονιδίου
![Page 30: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/30.jpg)
• 4 multiplex PCR αντιδράσεις με διαφορετικά μίγματα εκκινητών• ηλεκτροφορούνται σε πηκτή αγαρόζης • UV
![Page 31: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/32.jpg)
Αποτελεσματικός έλεγχος για όλες τις μεταλλάξεις που έχουν εντοπιστεί
στο γονίδιο CFTR
ανάλυση αλληλουχίας γονιδίου (sequencing)
![Page 33: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/33.jpg)
Μοριακή διάγνωση μεταλλάξεων κυστικής ίνωσης
• μοριακή ανίχνευση των φορέων και ομοζυγωτών απογόνων μείωση της συχνότητας εμφάνισης της νόσου
γένεση υγιών απογόνων από ζευγάρια φορέων (Προεμφυτευτική Γενετική
Διάγνωση)
• πιο ακριβείς και γρήγορες μέθοδοι ανίχνευσης μεταλλάξεων στους
διάφορους πληθυσμούς
πιο ακριβής και έγκαιρη διάγνωση
αποτελεσματική θεραπεία
![Page 34: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/34.jpg)
σχέση μεταξύ φαινοτύπου και γενοτύπου
Συσχέτιση μεταλλάξεων με συμπτώματαεγκυρότερη διάγνωση της νόσου
έγκαιρη θεραπεία των συμπτωμάτων
Αύξηση προσδοκώμενου ορίου ηλικίας ασθενών
![Page 35: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/35.jpg)
ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΠΟΛΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ!
![Page 36: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/36.jpg)
![Page 37: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/37.jpg)
Σε άλλους ιστούς…
• παχύρρευστες και δυσκίνητες παγκρεατικές εκκρίσεις φράσσουν
παγκρεατικούς αγωγούς
κατακράτηση ενζύμων (λιπάσες, θρυψίνη, χυμοθρυψίνη)
Καταστροφή παρεγχύματος (παγκρεατίτιδα)
ατελή πέψη
παγκρεατική ανεπάρκεια (85% ασθενών)
• Ήπαρ παχύρρευστη βλέννη εμποδίζει έκκριση της χολής
• στειρότητα σε άνδρες (96%) έλλειψη σπερματικού πόρου
![Page 38: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/38.jpg)
• Τεράστιος αριθμός μεταλλάξεων
• Διαφορετική συχνότητα στους διάφορους πληθυσμούς
• συγκεκριμένη ομάδα μεταλλάξεων που θα ελέγχεται παγκοσμίως δεν
υπάρχει
• ευρωπαϊκές κατευθυντήριες οδηγίες έλεγχος για το 75-85% των
μεταλλάξεων του πληθυσμού
• Ελλάδα μεγάλη μοριακή ετερογένεια μοριακός έλεγχος ιδιαίτερα
ακριβός και δύσκολος
![Page 39: Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022021506/588473631a28ab5e248b508b/html5/thumbnails/39.jpg)
Ομάδες υψηλού κινδύνου
1. μέλη οικογενειών με κυστική ίνωση
2. μέλος ζευγαριού, στο οποίο 1 άτομο είναι φορέας
3. άντρες με στειρότητα λόγω έλλειψης του σπερματικού πόρου
4. άτομα με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια και χρόνια παγκρεατίτιδα
(παθογένεια δεν έχει διευκρινιστεί)
5. εγκυμοσύνες με υπερηχογένεια εντέρου στο έμβρυο (υπερηχογραφικός
έλεγχος)