生物科学科生物科学科 (( 高分子機能学高分子機能学 ))

• 生体高分子解析学講座（第 3 ）スタッフ• 教授　新田勝利 • 助教授　出村誠• 助手　相沢智康

http://altair.sci.hokudai.ac.jp/

タンパク質工学：キーワード• タンパク質工学の利用分野　学術、工学、農学、医薬

• タンパク質工学とは　 遺伝子組換え技術、遺伝子化学合成技術、新しいタンパク質の人工合成

• ゲノム・遺伝子・タンパク質　 ゲノム遺伝子 >遺伝子

• DNA 分子の塩基配列とアミノ酸配列　 コドン、アミノ酸の一次配列

• タンパク質分子とアミノ酸配列　 ペプチド結合、ヘリックス、シート

• 立体構造解析と NMR　ノーベル化学賞 K.Wüthrich

タンパク質工学の利用分野　

• 学術

• 工学

• 農学

• 医・薬

Protein Engineering タンパク質工学の利用分野

学術：タンパク質の立体構造、生物進化

工学：安定化酵素、ナノテクノロジー

農学：遺伝子組換え作物、クローン家畜

医・薬：病気の治療、遺伝子診断 ( 遺伝病 )

JournalProtein Engineering

この学術雑誌は、タンパク質の機能を理解するために重要な構造と生化学的知見の最新研究を紹介する専門誌

　遺伝子組換え技術

　 遺伝子化学合成技術

　 新しいタンパク質の人工合成

タンパク質工学とはタンパク質工学とは？？

◎ タ ン パ ク 質 工 学 とは？遺伝子組換え技術と遺伝子

化学合成技術を使い、設計した新しいタンパク質を人工的に合成すること。

課題：転写、翻訳は生物の力を借りるしかない

タンパク質工学に重要な２つの技術

ゲノム遺伝子　 > 　遺伝子

ゲノム・遺伝子・タンパク質ゲノム・遺伝子・タンパク質　

ゲノム・遺伝子・タンパク質● 遺伝情報（ゲノム）の伝達　

　　　　　ヒト細胞 1 個あたり　　 　染色体数 46 (22+X)+(22+Y)　　 　遺伝子数 約 10 万 (105)　　 　塩基対数 30 億 (3 x 109) 全長約 1m　 大腸菌ゲノム　　塩基対 (4 x 106) 全長約 1.4mm● 遺伝情報（遺伝子）の発現　 ヒト　　 →発生・分化 約 60 兆個 (6 x 1013)　　 セントラルドグマ　　　 (DNA→RNA→ タンパク質 )　　 ゲノムの 5 ％だけタンパク質として発現　　 発現時間（一生）： 7x105 hr　 大腸菌　　ゲノムの 90 ％がタンパク質として発現

　　　　　　発現時間（一生）　： 0.3 〜 0.7 hr

　 コドン

　 アミノ酸の一次配列

DNADNA 分子の塩基配列とアミノ酸配列分子の塩基配列とアミノ酸配列

DNA の構造遺伝情報は塩基 (Base)(Base) 配列として記録されているA: 　 　アデニン C: シトシン　 G: 　グアニン T: チミ　ン

３つの塩基配列で１つのアミノ酸を表す（コドン）

DNA 二重らせんはA ＝ T 、 G ≡ C の塩基対でのみ水素結合できる

DNA コドンとアミノ酸

1st 2nd 3rd

5'-end U C A G 3'end

U Phe Ser Tyr Cys U

U Phe Ser Tyr Cys C

U Leu Ser Stop Stop A

U Leu Ser Stop Trp G

C Leu Pro His Arg U

C Leu Pro His Arg C

C Leu Pro Gln Arg A

C Leu Pro Gln Arg G

A Ile Thr Asn Ser U

A Ile Thr Asn Ser C

A Ile Thr Lys Arg A

A Met Thr Lys Arg G

G Val Ala Asp Gly U

G Val Ala Asp Gly C

G Val Ala Glu Gly A

G Val Ala Glu Gly G

アミノ酸の表記； 3 文字、 1 文字

タンパク質分子とアミノ酸配列

アミノ酸の結合：ペプチド結合

アミノ酸残基の配列：一次構造

局所的な規則構造：二次構造

　　　　　　　ヘリックス、シートなど

タンパク質は折り畳まれて二次構造・立体構造ができあがる

ヘリックス

シート

二次構造ペプチド結合

タンパク質の一次構造のちがいがタンパク質の一次構造のちがいが立体構造のちがいとなる立体構造のちがいとなる

一次構造 立体構造

立体構造のわずかな違いだけで機能が異なる場合もある！

立体構造と NMR

原子核の磁気的性質を非破壊で観測でき

る装置 (NMR) を用いて、生体高分子（タ

ンパク質、核酸、糖質など）の立体構造

が水溶液に溶けたままの状態で決定でき

るようになってきた。

生体高分子の構造解析2002 NMR と MS

John B. Fenn Koichi TanakaKurt Wuthrich1/4　of　the　prize1/4　of　the　prize1/2　of　the　prize

NMR MS2002 年ノーベル化学賞

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/2002/index.html

NMR 分野のノーベル賞

Felix Bloch (1905 - 1983)Stanford UniversityUSA

Edward Mills Purcell(1912 - 1997)Harvard UniversityUSA

Richard R. Ernst(1933 - )ETH, Switzerland

　　　　　　物理学賞 (1952)for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith.

化学賞 (1991)for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.

化学賞 (2002)for his development of NMR spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution

Kurt Wuthrich(1938 - )ETH, SwitzerlandScripps Research Inst., USA

1952 1952 1991 2002

http://www.nobel.se/

核磁気共鳴Nuclear Magnetic Resonance NM

R

原子核の磁気モーメントを超電導磁石の安定原子核の磁気モーメントを超電導磁石の安定磁場中で観測磁場中で観測　　↓　　↓原子核の距離、化学結合の角度、分子運動な原子核の距離、化学結合の角度、分子運動などが解析できる。どが解析できる。∴∴立体構造解析可能立体構造解析可能

1H, 13C, 15N, 31P

NMR 用超電動磁石のしくみタンパク質試料溶液量 30~300 μl濃度0.3~3 mM

磁場強度いろいろ磁場強度いろいろ 1 Tesla=10000 Gauss

4 x 10-1 T

3 x 10-1 T

10-2 T

10-4 T

3 x 10-5 T

3 x 10-10 T 2 T

2 ~ (25) T

33 T

60 T

850 T

研究中実用化

SunSun

NMRNMR

MRIMRI

NMR装置の発展 MHzから GHzヘ磁場強度 (Tesla)0.8 常電導 (1957)1.4 2.12.3 4.7 超電導6.37.08.211.7 14.1 17.618.8 (1998)21.1 (2001)23.4 24.6 (1997*) * T.A. Cross et al., J. Magn. Reson., 125, 212 (1997).

21.6 T (2002)

21.1 T

1H共鳴周波数 (MHz)32 CW型6090100 FT型20027030035040060075080090010001046

原子核固有の NMR周波数

磁場強度： 9.4テスラ　 1H 共鳴周波数 =400MHz磁場強度： 18.8テスラ　 1H 共鳴周波数 =800MHz化学シフト（微細構造による共鳴周波数の変化）

1H:0〜 10 ppm, 13C:0〜 20 ppm, 31P:0〜 600 ppm

NMR データから立体構造情報の収集

R1 O O O

N N NCα Cα CαC C C

H H H H H H

R 2 R 3

R1 O O O

N N NCα Cα CαC C C

H H H H H H

R 2 R 3

化学結合による 1H-1H相互作用の測定 (COSY)→アミノ酸残基の同定、化学結合の回転角度情報の収集

空間の近距離 1H-1H相互作用(<5Å) の測定 (NOESY)→アミノ酸残基の連鎖帰属、原子間距離情報の収集

COSY

NOESY

NMR でわかる距離・角度情報

アミノ酸の一次配列から立体構造を決定するために、 NMR からわかる原子間距離、結合の回転角度が利用可能

すべての NMR距離・角度情報を満たす構造 = 立体構造

ヒトとウシの正常型プリオンタンパク質 (23-230) の NMR 立体構造

(K. Wüthrich et al., )

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(1), 145-150 (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15), 8334-8339 (2000).

ま と め

タンパク質工学の利用分野　学術、工学、農学、医薬

タンパク質工学とは　 遺伝子組換え技術、遺伝子化学合成技術、新しいタンパク質の人工合成

ゲノム・遺伝子・タンパク質　 ゲノム遺伝子 >遺伝子

DNA 分子の塩基配列とアミノ酸配列　 コドン、アミノ酸の一次配列

タンパク質分子とアミノ酸配列　 ペプチド結合、ヘリックス、シート

立体構造解析と NMR　ノーベル化学賞 K.Wüthrich