第十五章   核酸的研究方法

一、核酸的分离、提纯和定量测定

二、核酸的超速离心

三、核酸的凝胶电泳

四、核酸的核苷酸序列测定

五、 DNA 聚合酶链反应（ PCR ）六、 DNA 的化学合成

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国

一、核酸的分离、纯化和定量测定尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。

（一） DNA 分离真核 DNA 以核蛋白（ DNP ）形式存在， DNP 溶于水或高盐溶液（ 1mol/L NaCl ），但不溶于低盐溶液（ 0.14mol/L NaCl ），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将 DNP 与 RNA 核蛋白分开，提取出 DNP 。

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DNP 可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的 DNA 可被 0.3M NaAC-70% 乙醇沉淀。

（二） RNA 的分离RNase 的灭活：玻璃器皿： 140-200℃， 8h塑料器皿： 0.1%DEPC ， 37 ，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加 RNasin 等特异的 RNase 抑制剂

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★用 0.14mol/L NaCl 使 DNP 沉淀，上清中即为 RNA核蛋白（ RNP ）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。

★异硫氰酸胍 /苯酚 /氯仿法

★异硫氰酸胍 /氯化铯密度梯度离心法蛋白质：＜ 1.33g/mlDNA ： 1.71g/ml 左右RNA ：＞ 1.89g/ml

★mRNA 的制备：oligo(dT) 纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法

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（三）核酸含量的测定方法

核酸纯度的鉴定可通过测定样品在 260 nm 和 280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

① 磷的测定 RNA 中含磷量为 9.0 ％， DNA 中含磷量为 9.2 ％，因此每测得 1g 磷就相当于含有 11g 核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在 660nm 比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。

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②核糖和脱氧核糖的测定

RNA 中核糖的测定用苔黑酚（ 3， 5- 二羟甲苯）法，利用 RNA 与浓盐酸和 3 ， 5- 二羟甲苯作用生成绿色物质，在 670 nm 比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的 RNA 的含量。

DNA 中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用 DNA 在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在 595 nm 比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的 DNA 的含量。

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③紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样品在 260 nm 和 280 nm 的光吸收值（ A 值），从 A260

／ A280 的比值可判断样品的纯度。纯 DNA 的 A260/A280 应为 1.8 ，纯 RNA 应为 2.0 。样品中如含有杂蛋白及苯酚， A260/A280 比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出 260mm 的 A 值即可算出含量。通常以 1A 值相当于 50μg/mL双螺旋 DNA 或 40μg/mL单链 DNA （或 RNA ）或 20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。

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二、核酸的超速离心

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用 CsCl 密度梯度离心可以将不同构象DNA 、 RNA 与蛋白质区分开来

这一方法常用于质粒 DNA 的纯化。

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（一）核酸密度的测定

8M CsCl ， 45000rpm ， 16h密度梯度： 1.80g/ml （底部）～ 1.55g/ml （顶部）平衡时：浮力密度 =CsCl 密度 =离心力ρ=ρ0 +4.2ω2（ r2 - r02） × 10-10

ρ ：浮力密度ω ：角速度（弧度 /秒）r：样品到转轴的距离

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（二）测定 DNA 的 G-C 含量

G-C 含量与 DNA 的浮力密度之间呈正比关系

ρ=0.100xG-C + 1.658xG-C = （ ρ-1.658 ）× 10

但含 5-甲基胞嘧啶多的 DNA ，其实际浮力密度会降低，低于理论值。

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（三）溶液中核酸构象的研究

浮力密度：RNA ＞ DNA变性 DNA ＞双链 DNA ＞蛋白质，

变性程度越大，浮力密度越大

超螺旋DNA或

三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖电泳

影响迁移率的因素：① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比② 凝胶浓度③ DNA 的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢④ 电流，不大于 5V/cm

染色： 0.5μg/ml EB（溴化乙锭）

RNA 的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛

用于大片段 DNA 的分离，精度低，但分离范围广。

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琼脂糖电泳可以用于 DNA分子量的测定

琼脂糖电泳还可以用于 DNA 的制备与纯化

（二） PAGE 电泳

用于小片段 DNA 的分析，精度非常高

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四、核酸的核苷酸序列测定（一）双脱氧终止法

英国 Sanger1955 确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖

1975 设计出 DNA 测序法， 1980 获诺贝尔化学奖

合成一段与待测 DNA 序列互补的 DNA片段群。

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双脱氧核苷酸测序法（ MOV）

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DNA序列分析仪：

四色荧光基团标记的 dNTP

（二）化学裂解法 Maxam-Gilbert， 1977

原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。

32P-GCTACGTA ：在 A处： 32P-GCT 和 32P-GCTACGT在 G 处： 32p ， 32p-GCTAC在 C处： 32P-G和 32P-GCTA在 T处： 32P-GC 和 32P-GCTACG

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G反应：硫酸二甲酯G+A 反应：甲酸 /哌啶C 反应：肼 /NaCl/哌啶C+T ：肼 /哌啶

哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂

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硫酸二甲酯（ G）： *ACTTCG*ACTTCGACAG

甲酸（ G+A ）：*A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG

肼 /Nacl （ C）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（ C+T ）： *AC *ACT *ACTT *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG

从下往上读： CTACGTA ，末端 G不能读出。

32P *ACTTCGACAG

（三） RNA 的测序

（ 1）酶裂解法 胰 RNase A ：嘧啶结尾米曲霉 RNase T1 ：鸟苷酸结尾黑粉菌 RNase U2 ：腺苷酸结尾多头黏菌 RNase Phy I： A、 G、 U 结尾

（ 2）化学裂解法

（ 3）逆转录成 cDNA 法

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五、 DNA 聚合酶链式反应（ PCR）

①模板 DNA （单链）

②引物

③DNA 聚合酶（ Taq）

④dNTP

⑤Mg2+

PCR （ MOV）

六、 DNA 的化学合成

固相合成法（亚磷酸三酯法）合成 DNA

合成方向： 3′→5′ 端5′-OH用二对甲氧三苯甲基（ DMT ）保护。3′-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护

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