Учреждение Российской академии наук Институт общей...

Учреждение Российской академии наукИнститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Индуцированный мутагенез (количественные аспекты)

А.В. Рубанович

[email protected]

История

1925 – Г. А. Надсон (и его сотрудник Г. С. Филиппов) - Ленинградский Институт рентгенологии и радиологии: после воздействия рентгеновых лучей вырастали колонии дрожжей, отличавшиеся величиной, формой и окраской.

XIX век – Август Вейсман: безуспешные попытки изменить наследственность используя температуру, влажность и механические воздействия.

1927 - Герман Джозеф Меллер - V Международный генетический конгресс в Берлине: первые удачные опыты по искусственному вызыванию рецессивных мутаций с помощью рентгеновых лучей у дрозофилы.

1927 - Л. Стадлер: искусственные мутации у ячменя и кукурузы после воздействия рентгеновых лучей.

Нобелевская премия - 1946

Расстрелян - 1939

Биологическое действии радиации осознали значительно раньше!

1936 - Обелиск в Гамбурге: имена 115 исследователей, погибших в результате действия радиации

1901 - Первый описанный случай радиационного ожога кожи

1906 - Первый летальный исход (США)

1911 - Первый описанный случай радиационно- индуцированной лейкемии

1946 – Первое описание «клинического синдрома обусловленного атомной бомбардировкой»

Радиобиологический парадокс: ничтожная энергия вызывает драматический

биологический эффект!

1920 - Фридрих Дессауер – «теория точечной теплоты»: радиация отдает энергию порциями, вызывая нагревание отдельных точек до очень высокой температуры. Далее локальное свертывание белков, что к ведет биологическому поражению.

Полулетальная доза для человека = 4 Гр = 270 Дж = 67 кал

=

1 чайная ложка горячего кофе

=

2 секунды на пляжегибель в 50% случаев

По энергетическим затратам:

Теория мишеней и принцип попадания (1946-1947)

Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде

Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению

Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз

Карл Циммером (Гемания)

Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский (Россия)

Дуглас Ли (Великобритания) Откуда взялись эти положения?

В основном из характера дозовых зависимостей…

Зависимость «доза-эффект» в радиобиологии

Частота, %

Время гибели

100

50

Среднее время гибели

Выживаемость, %

Время воздействия, концентрация

100

50

Токсические воздействия:


Доза облучения

100

50

Радиация:

S(D)=e-D

Экспонента - порога нет!

Порог

Кривая выживания – это функция распределения дозы (времени воздействия), вызывающей гибель

Частота, %

Доза, вызывающая

гибель

100

50

Средняя убивающая

доза

Плотности распределений

Забудем на время о дозах – будем говорить о распределениях продолжительности жизни


Возраст

100

50

75

ЧеловекВыживаемость, %

Возраст

100

50

Некоторые насекомые

Экспоненциальная продолжительность жизни - это распределение «без памяти о прошлом»

Вероятность умереть в следующемгоду не зависит от возраста

Вероятность умереть в следующемгоду увеличивается с возрастом

4000

Распределение продолжительности жизни

для бессмертных! Единственная причина смерти – попадание под

колеса автомобиля. Средняя продолжительность

жизни 4000 лет

Вернемся к зависимостям «доза-эффект»



100

50

Экспоненциальная зависимость:вероятность наступления эффекта при

следующей порции облучения не зависит от предыдущей дозы




Положения теории попаданий в мишени

Не только дозовые зависимости! Многое проясняет физика

взаимодействия излучений с веществом

-частиы

-лучи

X-лучи(рентгеновское излучение)

-частицы-Рентгеновское излучение

не связано с радиоактивностью

Виды ионизирующих излученийт.е. способных производить ионизации атомов (выбивать электроны с орбит )

Ядро атома

-

-

-

--

-

-

-

Вильгельм Конрад Рентген и рука его жены (1895)

Эрнест Резерфорд (1899)

Природа ионизирующих излучений

-частицы:

-частицы:

-лучи:

Pb +

-

Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов

нестабильны за счет избытка нейтронов

Число протонов

Чи

сло

нейт

роно

в

Излучение, тип радиации Масса Заряд Защита

Ядра гелия 4 +2 Бумага, одежда

Электрон 1/1836 -1 Пластик, стекло

ЭМ-волны 0 0 Свинец, бетон

n Частица 1 0 Вода, парафин

Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов

нестабильны за счет избытка (или дефицита) нейтронов

++

-

4Не

е-

2

Фотон

Частота, Гц

-лучи X-лучи УФ

Длина волны, м

Ионизирующая способность

Ионизации и линейная передача энергии (ЛПЭ)

Низкая ЛПЭ < 7 кэв/мкм(-лучи, X-лучи, -частицы)

Высокая ЛПЭ > 20 кэв/мкм (- частицы, протоны, нейтроны)

ЛПЭ = потери энергии ионизирующей частицы на единицу пути в веществе (E/s)

Ионизированный атом-

-

-

--

-

Ионизирующее излучение

Бумага Бетон

-частицы

-частицы

Прохождение излучений через вещество

Источники опасны только при

поступлении в организм

-лучи

Пробег в ткани 0.1 – 3 мкм

Единицы измерения доз Поглощенная доза – энергия, выделенная в 1 кг вещества: 1 Грей (Гр) =1 Дж/1 кг

Экспозиционная доза – мера ионизации (только для - и X-лучей) - заряд (одного знака), образующийся в 1 см3 воздуха

1 Рентген (Р) = 0,0088 Гр

Эффективная или эквивалентная доза – доза с учетом ОБЭ и радиочувствительности пораженного органа

1 зиверт (Зв) = 100 бэр

Только для личного пользования!1 Гр = 100 рад 100 Р 100 бэр 1 Зв

Единицы измерения радоактивности

Cкорость распада атамов: 1 беккерль (Бк) = 1 распад/сек 1 Кюри (Кю) = 3,71010 Бк

Дозиметры меряют не дозу, а мощность дозы, т.е. поглощенную дозу в единицу времени (Гр/c)

Рентген, грей, бэр, рад, зиверт, рем…?

0.1 1 10 100 1000

1

2

3

4

ЛПЭ, кэвмкм-1 ткани

ОБ

Э

Относительная биологическая эффективность излучения (ОБЭ)

- p+

Положения теории попаданий в мишени




Что является «мишенью»?

Идентификация мишени: ядро, хромосомы, ДНК Микропучки -частиц с пробегом 40 мкм (210Ро):

избирательное облучение ядра Микроразрезы: перенос необлученного ядра в облученную цитоплазму

Уридин (РНК, цитоплазма) и тимин (ДНК, ядро), помеченные тритием 3Н

(-излучатель, пробег 1-2 мкм) Сенсибилизация клеток 5-бромдезоксиуридином

(BUdR подобен, но не идентичен тимину) Радиочувствительность содержание ДНК в клетках:

растения, насекомые, амфибии (объем интерфазных хромосом)

Ядро в 100 раз более чувствительно, чем цитоплазма

Облучение хромосом в 200-300 эффективней, чем облучение цитоплазмы

Прямое и непрямое действие радиации

Непрямое действие - радиолиз воды и возникновение свободных радикалов при прохождении излучения через цитоплазму:

- наиболее активен радикал OH (75% повреждений ДНК) - преобладает при низких ЛПЭ (- и X-лучи)

Прямое действие - непосредственная ионизация атомов ДНК - преобладает при высоких ЛПЭ (-частицы, нейтроны)

Свободный радикал OHэлектрически нейтрален, но имеет

неспаренный электрон на внешней орбите - высокая реакционная способность

(время жизни 10-10 с)

В любом случае речь идет о попадании в ДНК-мишень

2 мкм

Действие ионизирующих излучений

«Интерфазная гибель» - мгновенное прекращение метаболизма и разрушение клетки: большие дозы (> 20 Гр) «Репродуктивная гибель» - потеря способности к неограниченному делению: низкие дозы (< 10 Гр):

Однонитевые разрывы ДНК (низкое ЛПЭ) Двунитевые разрывы ДНК (высокое ЛПЭ) Повреждение оснований (особенно пиримидиновых).

На хромосомы:

На клетку:

Репарация Хромосомные аберрации, мутации генов в половых и соматических клетках (рак)

Дальнейшие события:

Попадания в мишени: распределение Пуассона

- среднее число попаданий при дозе D

Распределение «редких событий»:- число рыбок, пойманных за «время» D- число изюминок в кексе «объема» D- число голосов за Жириновского в квартале с D жителями

…………

Вероятность отсутствия поражений, т.е. выживаемость при

«одноударном» механизме гибели

объем мишени

Модель гибели «одна одноударная мишень»



100

50S(D)=e-D



1

0.1

0.01

Удобен «полулогарифмический» масштаб:

- доза, вызывающая 63% гибели:

1-2 Гр для клеток млекопитающих500 Гр - вирусы

По оси ординат ln S(D)=-D

D37

0.37

Первые правильные оценки размера генов в хромосомах.

Задолго до «двойной спирали»!

Модель гибели «несколько одноударных мишеней»

S(D)=1 – (1-e-D)m

0.01



1

0.1

Пусть для инактивации клетки небходимо попадание в m

мишеней, например при m=2 :

Вероятность попасть в одну мишень (хотя бы раз!)

m«Плечо»

Жива Жива Погибла

Оценка «числа мишеней»!

Численные оценки радиочувствительности


D

100

50

- средняя доза, вызывающая

гибель

_D

=

Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек, по сравнению с алгоритмами вычисления D50 или D37


D

100

D50 D37

3750

D


100

50

_D

D37 - в радиобиологии

D50 - в токсикологии

D - в теории вероятностей_

D = Площадь под кривой выживания в линейном масштабе

_

Одноударные и многоударные эффекты

………… и т.д. – распределение Пуассона

Одноударный эффект

Двухударный эффект


Эффект (мутации, аберрации)

1 удар2 удара

Радиационно-специфические аберрации хромосом

Центрические кольца + фрагменты (2 разрыва в одной хромосоме)

Дицентрики + фрагменты (2 разрыва в разных хромосомах)

Одноударные и многоударные эффекты

2 4 60

0.4

0.8

1.2

1.6

Доза, Гр

Чис

ло д

ицен

трик

ов

на к

летк

у

2 разрыва за 1 удар

D

2 разрыва за 2 удара

D2

При увеличении ЛПЭ кривая становится

одноударной

Доза, Гр

Час

тота

ди

цент

рико

в

50

1.5

Xn

Выход дицентриков D+ D2

Биодозиметрия

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Доза, Гр

Час

тота

ди

цен

три

ков

и

цет

ри

чес

ки

х к

олец

на

кл

етк

у

Калибровочная регрессия зависимости частоты дицентриков и центрических колец на дозу -облучения (облучение лимфоцитов in vitro)

y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2

Доза, полученная пациентом

Частота аберраций у

пациента

Минимальная доза, которую можно выявить при анализе лимфоцитов составляет 0.1 – 0.2 Гр

Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах крови – доказательство недавнего облучения организма

Возможны более точные оценки индивидуальной дозы по данным, полученным при облучении лимфоцитов in vitro

В.А. Шевченко, 2002

Репарация

Повреждения ДНК Частота на Гр Доля летальных

Изменение оснований 500/Гр 0.01

Однонитевые разрывы 1000/Гр 0.01

Сшивки ДНК-белок 150/Гр ?

Двунитевые разрывы 50/Гр 0.95

Влияние мощности дозы на частоту микроядер

0

1

2

3

4

5

Контроль 10 cГр(острое)

10 cГр/2 ч 10 cГр/24 ч 10 cГр /48 ч

Час

тота

мик

рояд

ер/1

00 к

лето

к

de Toledo et al. 2006

При уменьшении мощности дозы

Ацентрические фрагменты хромосом исключенные из клеточных ядер в момент

деления клеток

Репарация – зависимость выживаемости от мощности дозы

X-лучи: 0,01 Гр/мин

2 4 6 8 100

10-3

10-4

10-2

10-1

1

X-лучи: 1 Гр/мин

Доза, ГрНейтроны: 0.01 Гр/мин

Нейтроны: 1 Гр/мин

При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения

Репарации обнаруживается по изменению наклона кривых «доза-эффект»:

при изменении мощности дозы

при фракционированном облучении

Репарация – зависимость выхода дицентриков от мощности дозы

D.C. Lloyd (1981)

X-лучи: 1Гр/мин

X-лучи: 0,003 Гр/мин

543210

0.5

1.0

1.5

2.0

Доза, Гр

Час

тота

диц

ентр

иков

на

клет

ку

При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения

Нейтроны, энергия 0.714.7 Мэв

Выход Х-сцепленных рецессивных леталей у дрозофилы не зависит от мощности дозы

в диапазоне 0.03 - 100 Гр/час

Принцип «беспороговости» и «кумулятивности» мутационного процесса

Проект «MegaMouse» супругов L. B. Russell & W. L. Russell (1955-1965)

Пять главных выводов

Выход различных мутаций на 1 Гр различается в 30 раз.

Эффект мощности дозы существенен. Хроническое облучение вызывает меньше мутаций, чем острое (в отличии от Drosophila)

Самцы более радиочувствительны, чем самки.

Генетические эффекты существенно уменьшаются, если увеличивается время между облучением и спариванием.

Удваивающая доза для частоты мутаций равна 1 Gy.

Индукция морфологических мутаций в потомстве облученных родителей

7 морфологических мутаций7 миллионов мышей!

1 Гр

The frequency of radiation-induced mutations is not, as the classical view holds, independent of dose rate. W. L. Russell, L. B. Russell. Science, 19, 1958

Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен: www.vigg.ru

Всем спасибо, и еще раз напомню:

Экспоненциальная зависимость выживаемости от дозы означает гибель от случайных и независимых актов поражения

Квадратичная зависимость от дозы указывает на двухударный механизм формирования эффекта

Для млекопитающих доза, удваивающая частоту мутаций в потомстве 1 Гр

1 Гр 100 рентген, хотя это разные вещи

Биологические эффекты ионизирующих излучений в основном связаны с воздействием на ядерное ДНК

Зависимость кривой «доза-эффект» от мощности дозы указывает на присутствие репарации

Учреждение Российской академии наук Институт общей...

Documents

Transcript of Учреждение Российской академии наук Институт общей...