Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и...
description
Transcript of Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и...
![Page 1: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/1.jpg)
Проблемы пострадиационного
восстановления:вчера и сегодня
![Page 2: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/2.jpg)
• В 1958 г. Владимир Иванович Корогодин обнаружил явление пострадиационного восстановления клеток дрожжей в непитательной среде. Такое восстановление осуществляется медленно (в течении 24-48 час) и зависит от плоидности клеток (проявляется у диплоидных и отсутствует у G1-гаплоидных клеток), что указывает на участие в этом процессе гомологичной рекомбинации.
• Система пострадиационного восстановления в непитательно среде представляет уникальные возможности для молекулярно генетического анализа рекомбинационных процессов в их кинетике без вмешательства репликации ДНК.
![Page 3: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/3.jpg)
Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте концентраций нейтральной15-30% сахарозы
(Luchnik, Glaser and Shestakov, 1977)
Необлученный контроль
Облучение в дозе 1000 Gy
Облучение в дозе + выдерживание в непитательной среде, 48 часов.
![Page 4: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/4.jpg)
Выживаемость облученных рентгеновскими лучами клеток диплоидного и гаплоидного штаммов S. cerevisiae
до и после выдерживания в непитательной среде
Штамм Облучение (Gy)Выдерживание в непитательной
среде, ч
Выживаемость, %
Диплоид
0
0
1000
1000
0
48
0
48
100
103,6
6,0
27,5
Гаплоид
0
0
1000
1000
0
48
0
48
100
96,1
0,03
0,01
![Page 5: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/5.jpg)
Схема репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму «разрыв и копирование»
(break-induced replication, BIR)
(Luchnik, Glaser, Shestakov, 1977; Voelkel-Meiman and Roeder, 1990; Malkova, Ivanov and Haber, 1996; Morrow, Connelly and Hieter, 1997)
![Page 6: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/7.jpg)
• Два пути репарации ДНР ДНК в условиях инкубации в непитательной среде: быстрая и медленная.
![Page 8: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/9.jpg)
Профили седиментации ДНК из клеток Saccharomyces cerevisiae в градиенте концентрации нейтральной 15-30% сахарозы.
Протопласты получали стандартным методом (А) и в присутствии 10 % KCl (В)(Glasunov, Glaser and Kapultsevich, 1989)
ДНК из необлученных клеток
Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток сразу после облучения
Облучение в дозе 570 Gy, лизис клеток после выдерживания в непитательной среде при 280С в течение 1 ч.
![Page 10: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/10.jpg)
Рекомбинантные структруры ДНК, выделенные из Х-облученныхдиплоидных G1-клеток Saccharomyces сerevisiae.
Клетки инкубировали в непитательной среде в течении 2-4 часов(Глазер, Самадашвили и Гаузе, 1982)
![Page 11: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/11.jpg)
Белки, кодируемые генами эпистатической группы RAD52, и их основные функции.
• Rad50, Mre11, Xrs2 – формирование и процессинг ДНР ДНК.• Rad51 – ключевой белок рекомбинации, осуществляет
формирование нуклеопротеинового филамента, синапсис и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК.
• Rad52 – связывается с однонитевой ДНК и обеспечивает формирование Rad51-ДНК-филамента.
• Rad53 – белок check-point контроля клеточного цикла, осуществляет задержку клеточного цикла в случае повреждения ДНК и обеспечивает время необходимое для репарации ДНР до вступления в следующую фазу цикла ДНК.
• Rad54 и его паралог Rdh 54 – участвуют в изменении структуры хроматина, стимулируют обмен цепями, осуществляемый Rad51.
• Rad55, Rad57 – паралоги Rad51, функционируют в виде гетеродимера, стабилизируют Rad51-ДНК-филамент.
• Rad59 – связывается с однонитевой ДНК, функционально перекрывается с Rad52.
![Page 12: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/12.jpg)
Модель рекомбинации на основе репарации двунитевых разрывов ДНК
(Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)
![Page 13: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/14.jpg)
Схема репарации двунитевых разрывов путем зависимого от репликации отжига цепей ДНК (synthesis-dependent strand annealing, SDSA)
(Nassif, Penney, Pal, Engels and Gloor, 1994; Ferguson and Holloman, 1996; Paques and Haber, 1999)
![Page 15: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/16.jpg)
5’3’
3’5’
Rad52, RPA, Rad59Rad1/Rad10
Повторяющаяся последовательность
Деградация 5’-концов ДНК
Отжиг комплементарныхучастков
Exo1, ДНК-лигаза Репарация дуплекса
делеция участкамежду повторами
Схема репарации двунитевых разрывовпутём отжига комплементарных цепей ДНК
(single-strand DNA annealing, SSA)(Lin, Sperle and Sternberg, 1984, 1985; Fishman-Lobell, Rudin and Haber, 1992)
![Page 17: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/17.jpg)
Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путем
non-homologous end-joining (NHEJ)
• DNA-PKCS – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы;NBS1 – Nijmegen breakage syndrome I;MRE11 – meiotic recombination 11;XRCC4 – X-ray-repair-cross-complementing defective repair in Chinese hamster mutant 4.ДНК-лигаза IV XRCC4ЛигированиеRAD50MRE11NBS1Процессинг концовDNA-PKCSГетеродимер KU80/KU70Репарация двунитевых разрывов (ДНР) ДНК путемnon-homologous end-joining (NHEJ)
Соединение концов
ДНР
DNA-PKCS
Гетеродимер KU80/KU70
Процессинг концов
NBS1MRE11
RAD50
ЛигированиеДНК-лигаза IV XRCC4
![Page 18: Проблемы пострадиационного восстановления: вчера и сегодня](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022062409/56814902550346895db63336/html5/thumbnails/18.jpg)
Белок Rad51
Белок RPA
RPA
5’3’
3’
Rad52
5’3’
3’
Rad51
5’3’
3’
5’3’
3’
5’3’
3’
Белок Rad52
Порядок сборки пресинаптическогокомплекса у дрожжей
Процессированная онДНКс выступающим 3’-OH-
концом
RPA-онДНК-комплекс
Rad52 связывается с SSB-онДНК-комплексом
Rad52 “загружает” Rad51
Rad51 полностью покрываетонДНК, в результате
образуется пресинаптическийфиламент
New et al., 1998. Nature, 391, 407-410Kowalczykowski, 2000. Nature Struct. Biol., 7, 1087-1089