טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני :...
description
Transcript of טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני :...
שילוב ל ידיטיפול במחלות גנטיות ע: שיבוט וריפוי גנישל
החזון והמציאות
תאי גזע עובריים בתרבית
1981עכבר –
1998אדם –
גזע • תאי של העיקריים המאפייניםעובריים:
מוגבלת בלתי עצמית התחדשות פלוריפוטנטיות
תנאים בסיסים למחקר בתאי גזע עובריים
בתרבית ממוין בלתי במצב התאים גדילת על שליטה
התאים על ספציפית התמיינות השריית יכולת
תאי גזע עובריים
גידול בתרבית - גופיפים
עובריים
הזרקה לעכברים -טרטומות
תאי גזע עובריים לא
ממוינים
התמיינות סטוכסטית
אנדודרם
מזודרם
אקטודרם
התמיינות תאי גזע עובריים
התמיינות תאי גזע עובריים
תאי גזע עובריים לא ממוינים
אקטודרם
התמיינות מושרה
אנדודרם
הנדסה גנטית
הוספת פקטורים ספציפים
לתרבית
( של תאים reprogrammingתכנות מחדש )סומאטיים
“The reversal of the differentiation state of a mature cell to one that is characteristic of the undifferentiated
embryonic state”
Gurdon, 1962
שיבוט למטרת ריפוי Therapeutic Cloning
Gene & cell therapy
Cloning
ES cells isolation
הפריית מבחנה
בלסטוציסט
בידוד תאי המסה הפנימית
גידול בתנאים מתאימים ליצירת תאי גזע עובריים
שיבוט
שיבוט למטרות ריפוי לעומת שיבוט למטרות רבייה
לא באדם!
cloning
First somatic cloning in mammals
Wilmut I. et al, Nature, 1997
Lamb 6LL3 - Dolly
כבשה
1996
מינים משובטים
עכבר
1996
עז
1999
פרה
1998
חזיר
2000
חתול
2002
zebra-fish
2002
ארנב
2002
פרד
2003
סוס
2003
כלב
2005
חולדה
2003
שיבוט בבני אדם
Science. 2005 Jun 17;308(5729):1777
Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669
מאמר הבית
William M. Rideout, III 6, , 1, Konrad Hochedlinger 6, , 1, , 2, Michael Kyba 6, , 1, George Q. Daley 1, 3 and Rudolf Jaenisch , , 1, 4
-/- Rag2עכברי
לא , recombinase RAG2, ללא האנזים•
.VDJ rearrangement-ה מתבצע
, SCID הם עכברי -/-RAG2עכברי •
.B תאי Tללא תאי
בתנאים סטריליים העכברים חיים בצורה •
נורמאלית
ניתן לתקן את מערכת החיסון של •
העכברים ע"י הזרקת תאי גזע
WTהמטופואטים מעכברי
Proof of principle for therapeutic cloning combined with gene therapy
Tetraploid embryo complementationtwo cell embryos (diploid) one cell embryos (teraploid)
teraploid blastocysts injection of ES cells
Eakin GS et al. Dev Dyn. 2003; 228: 751
electrofusion
הם אכן פלוריפוטנטיםntES תאיההוכחה ש
Tetraploid embryo complementation
והתאים ES- העובר נוצר מתאי ה•. הצליחו הטטרפלואידים תורמים ליצירת השלייה
(4/14 )28% עכברונים חיים 4לקבל
ע"י RAG2-תיקון המוטציה ברקומבינציה הומולוגית
האלל המוטנטי, מכיל 3מחדר בתוך אקסון
הקונסטרוקט לצורך תיקון המוטציה
תוצר הרקומבינציה ההומולוגית
האלל המתוקן לאחר הוצאת סמן
הסלקציה Rag2+R-/
LoxPLoxP
) יוצר מערכת /-Rag2 +Rהאלל המתוקן (חיסון תקינה
•Tetraploid embryo complementation הזרקת תאיntES Rag2+R -/
T ותאי B בתאי rearrangements לזיהוי PCRאנליזת •T ותאי B עם נוגדנים כנגד תאי FACSאנליזת •
) יוצר מערכת חיסון תקינה/-Rag2 +Rהאלל המתוקן (in-vivoתיקון --/- Rag2בעכברי
HSCכתורמים של /-Rag2+Rשימוש בעכברי •(Hematopoietic stem cells) לעכברי Rag2-/-
T ותאי B עם נוגדנים כנגד תאי FACSאנליזת –
ntES cells מתוקנים" מעכברי" Rag2 -/- יכולים ליצור תאי מח עצם נורמאלים.
Repaired ntES EBs
hematopoietic stem cells
Hematopoietic cytokinesHOXB4
GFP
Rag2 -/-
WT
והשתלתם ntES על תאי in vitroהשריית התמיינות -/- Rag2בעכברי
6מים
14 י
מים י
Rag2עכברי במדוע התאים נדחו -/-?
העמידות כנגד ההשתלה היא תכונה •-/-Rag2ספציפית של עכברי ה
MHCהתאים מבטאים רמה נמוכה של •
הורגים תאים המבטאים רמה NKתאי •MHCנמוכה של
מבטאים רמה -/-Rag2יתכן שעכברי • NK cellsגבוהה של
האם הדחייה נובעת מתגובה של תאי NK?
NKלא תאי להשתלת התאים לעכברים •
hematopoietic stem cells
Rag2-/- ,C null
Rag2 +/- ES
Rag2 -/- ,γCתוצאות ההשתלה בעכברי null
התאים לא נדחו•95% מהתאים בדם הפריפרי ביטאוGFP
וכמות )גרנולוציטים( תאים מילואידיםבעיקר•T ותאי Bקטנה מאד של תאי
Bתאי Bתאי גרנולוציטיםTתאי
-/-NK סיכום1) VDJ recombination restored
2) Low level of T/B cells in blood.
3) High level of granulocytes.
סיכום ומסקנותמטרת העבודה – תיקון פגמים גנטים בעכבר ע"י שילוב •
gene therapy" ו therapeutic cloningשל " מוטנטים ntES משוחזרת בתאי Rag2פעילות האנזים •
שתוקנו ע"י רקומבינציה הומולוגית- התקבל שחזור מסויים של מערכת החיסון בעכברי ה•
SCID שתי בעיות עיקריות:•
NK cellsדחייה ע"י –התמיינות לימפואידית נמוכה ביותר–
תמילואידי"דוחף" לכיוון התמיינות שHoxB4 מביטוי שליתכן שזה נובע •
פרוטוקולים משופרים של התמיינות יפתרו כנראה את הבעיה.
אסטרטגיות שונות "לתכנת מחדש" תאים
Jaenisch R & Young R., Cell 2008
תכנות מחדש ע"י הדבקה רטרו-ויראלית של iPS-induced pluripotentפקטורים ידועים )
stem cells)
Jaenisch R & Young R., Cell 2008
Morphological Changes Following Infection with the 4 Factors
WT-MEFsMorphological changes (Day 7)
mIPS colonies at Day>20
Mouse iPS- First reported 2006
Fibroblasts Human iPS
Human iPS- First reported December 2007
שילוב ל ידיטיפול במחלות גנטיות ע( וריפוי iPS"תכנות מחדש" )“ של
:גני החזון והמציאות
Treating Sickle-Cell Anemia with iPS Cells
Hanna J et al., Science 2007
The future ?
L.C
) בשעה שתיים 29.12.08שבוע הבא- הרצאה של יעקוב ביום שני|(בחדר סמינרים- מומלץ!