Иммунологические маркеры развития перинатальных инфекций

Долгих Т.И., Шелев М.В., Тирская Ю.И., Белкова Т.Н.

Инфекционная перинатальная патология

За последние 7 лет в г. Омске: Отмечается рост перинатальных потерь с увеличением доли инфекций в их структуре (увеличение показателя несостоявшегося выкидыша с 7,3 до 8,8 на 100 родов)

Отмечается высокий уровень антенатальной смертности (среднемноголетний показатель 4,9 на 1000 родившихся живыми и мертвыми).

На фоне снижения младенческой смертности остается высокой младенческая заболеваемость. Отмечается выраженный рост заболеваемости внутриутробными инфекциями доношенных новорожденных (Тпр.=9,0%; р<0,05).

Возросла частота случаев задержки внутриутробного развития плода (ЗВУР) .

В формирование перинатальной патологии значительный вклад вносят герпесвирусы с повышением значимости ВЭБ, ВГЧ 6 типа, вирусно-бактериальных ассоциаций.

Преобладание малосимптомного течения перинатальной инфекции осложняет постановку диагноза.Продолжается поиск эффективных маркеров реализации внутриутробной инфекции у плода и новорожденногоНеобходимо разработать методологическую основу регионально ориентированной программы эпидемиологического мониторинга за инфекционной перинатальной патологией.Целесообразна разработка тактики ведения женщины и новорожденного на основе персонифицированного подхода к мониторингу и терапии.

Цель: разработка диагностических и прогностических критериев развития внутриутробной инфекции для оптимизации диагностики и лечения женщин и новорожденных с данной патологией

Инфекционная перинатальная патология

1. Работать вместе над решением клинических задач;

2. Знать и рационально использовать потенциал лаборатории.

Клиницисту надо решить: что исследовать, для чего и каким методом?

КАЖДОМУ ТЕСТУ – СВОЕ МЕСТО!

Медицинской сестре и лаборанту – обеспечить преналитическйи этап

Специалисту КДЛ – предложить оптимальный алгоритм, обеспечить достоверность и быстроту выполнения анализа, оказать помощь в интерпретации результатов

Консенсус между специалистами

по вопросам диагностики: как его достичь?

Возможности лаборатории Использование микробиологических

методов:

- Бактериологический посев на микрофлору

- Бакпосев на грибы с определением чувствительности

Внедрение новых лабораторных технологий:- ПЦР, ИФА, РИФ, в т.ч. на основе биочипов

- Иммунохимические метод

- Иммуноблот (Line-blot) Широкое внедрение бесприборных методов

диагностики Возможность одновременной и оперативной

комплексной диагностики группы инфекций Оценка иммунорезистентности с помощью

проточной цитометрии и уровня цитокиновФенотипирован

ие клеток

Метод (Цель) Оборудование РеагентыМетоды, направленные на этиологическую расшифровку

ПЦР (ДНК) Терцик - «ДНК-технология» АЛА-1/4 - «Biosan» (Латвия)

«Амплисенс», ФГУН ЦНИИЭ Эпидемиологии (Россия)

РИФ (антигены, «ранние белки»)

Микроскоп люминесцентный «Carl Zeiss» (Германия)

«VIRCELL microbiologists» (Испания)

ИФА (специфические IgA,

IgM, IgG, IgG-ИА), ИБ

ИФА -анализатор «Elisys Quattro» - (HUMAN, Германия); планшетный спектрофотометр «Multiscan EX» (Финляндия)

ЗАО «Вектор-Бест» и НПО «Диагностические системы» (Россия),

«EUROIMMUN»

(Германия)

Бактериологический Спектрофотометр «Multiscan EX» (Финляндия)

Genital system® и Vagicult®, (Италия)

Иммунологические методы Проточная цитофлюориметрия

Проточный цитофлюориметр «FC-500» (США)

«Beckman-Coulter» (США)

Нефелометрия Анализатор белков «Turbox Plus» (Финляндия)

«Orion Diagnostica» (Финляндия)

Определение уровня цитокинов

ИФА (IL) Планшетный спектрофотометр «Multiscan EX» (Финляндия)

ООО «Протеиновый контур», ЗАО «Вектор-Бест» (Россия)

Проточная флюориметрия (IL-27 plex)

Проточный лазерный иммуноанализатор «BIO-PLEX 200»

«Human Cytokine 27-plex», («BioRad», США)

Степень активации клеточного иммунитета

HLA-DR – активация иммунных клеток.

Возможные комбинации: CD3+/ HLA-DR, CD4+/ HLA-DR, CD8+/ HLA-DR, CD14+/ HLA-DR, CD5+/19+/ HLA-DR

Степень активации клеточного иммунитета

Герпесвирусные инфекции: лабораторная диагностика

- IgM, IgG, ИА- IgG- IgA (!)- Антитела к белкам вируса (ИБ)- В ликворе IgG (LSQ/CSQ)

ИФАИммуноблот

Выявление антигеновВирусов

РИФ

Детекция ДНК вирусов

ПЦР

- Соскобы из очага инфекции (глаза, зев, уретра, цервикальныйканал, кожные покровы)

- Лейкоцитарная взвесь

- Ликвор (при поражении мозга)

- Ткани элиминированных плодов

- Плацента

_________________________

- Сыворотка крови (ИФА, ИБ)

Этиологическая расшифровка HSV-1\2-, CMV-, EBV-, HHV-6 -инфекций

Назначение методаМетодИсследуемый материал

Токсоплазмоз (лабораторная диагностика)

Этиологическая расшифровка

Назначение методаМетодИсследуемый

материал

- IgG

- LSQ/CSQ = IgG/(ликвор) / IgG (сыворотка) (>1,5 !)

ИФА(ликвор)

Выявление антител: - IgM, IgA, IgG

- IgG низкоавидные

- IgA и IgG-avidity к ROP1, MAG1, GRA7,GRA8, SAG1

ИФА,

Иммуноблот

(фазы I, II, III,IV)

Детекция ДНК /антигеновПЦР

или РИФ

Кровь,ликвор, биоптаты,ткани погибших плодов, плацента

Парвовирусная инфекция В19

Парвовирус В19 – это малого размера ДНК вирус, который быстро размножается и в основном поражает незрелые формы эритроцитов.

Исследуемый материал – кровь, ликвор. Основные методы – ПЦР и ИФА

Заболевание вызывает яркие высыпания на коже (краснухоподобный синдром) и артропатии,, анемию и апластический криз.

Трансплацентарная передача возможна в 33% случаев формирует многоводие, водянку плода, тяжелые анемии, поражение миокарда. Возможна внутриутробная гибель плода(в 25% случаев)

Может приводить к прогрессирующей гидроцефалии (из ликвора выделяется ДНК парвовируса В19) (журнал «Детские инфекции», 2010. - № 4).

Объем исследований

I . Исследование плаценты женщин, родивших детей с ВУИ (n=598)

II . Исследование тканей погибших эмбрионов/плодов (n=746)

III. Комплексное поэтапное обследование женщин с внутриутробной гибелью плода

IV. Обследование женщин с преэклампсией различной степени тяжести с наличием инфекции (n=115)

V . Обследование новорожденных с ВУИ и гипоксией мозга (n=104)

V I. Обследование пар «мать-ребенок» (n=302)

Женщины, родившие детей с ВУИ: результаты

исследования плаценты (ПЦР; %)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90 Str.pyogenes

Str.agalact.

Listeria

T.gondii

Rotavirus

PV B19

EBV

CMV

HSV1,2

Rubella

Внутриутробная гибель плода

1. В формировании патологии плода в I триместре беременности установлена наиболее важная роль принадлежит бактериальной микрофлоры (Staph., E.coli), во II триместре – U.urealyticum (в виде микст-инфекции), в III триместре – вирусам.

2. Listeria встречается с частотой 17% и 20% при гибели плода в I и во II триместрах.

3. Во II триместре микст-инфекция вызывает гибель плода в 60,05% случаев (в 1,6 раза чаще, чем в I триместре).

4. Установлена роль вирусов: EBV (22,5% и 16,7%), CMV (16,2% и 13,5), HSV-1/2 (12,3% и 10,3%), Rotavirus (28,5% и 15,6%), Rubella (14,6% и 9,8%), PV B19 (3,2% и 9,5%) – в I и во II триместрах

5. ДНК T.gondii обнаружена в 12,4% и в 17,5%.

Женщины с внутриутробной гибелью плода

1 этап – оказание неотложной помощи и установление

факторов риска* (стационар):

Прогностические критерии развития системной воспалительной реакции:снижение уровня РАИЛ, ИЛ-10 и бактерицидного гуморального фактора лактоферрина (при вирусной и вирусно-бактериальной инфекции) при неизмененном уровне провоспалительных цитокинов - ФНО-α и ИЛ-1β.

Повышение концентрации РАИЛ в течение первых суток после элиминации погибшего эмбриона/плода является критерием гнойно-воспалительного поражения плодного яйца и децидуальной ткани, что требует проведения адекватной стандартной терапии с учетом биотопа половых путей женщины. __________________________________________* - Утверждена медицинская технология

Женщины с внутриутробной гибелью плода

1 этап – оказание неотложной помощи и установление факторов риска* (продолжение):

наличие мертвого плода 5 недель и более (ведущий фактор); наличие вирусно-бактериальной или бактериальной инфекции; повышенное содержание D-димера и гомоцистеина.

Разработана тактика ведения женщин, основанная на применении неинвазивных методов удаления внутриутробно погибших плодов с использованием препаратов (простагландин Е2 и F2α), что позволило снизить количество органоуносящих операций в 5 раз и предотвратить материнскую смертность__________________________________________________

Клинико-лабораторный мониторинг и прегравидарная подготовка

2 этап (амбулаторно-поликлинический)•Выявление причинно-факторных связей у женщин с

невынашиванием.•Расширенная этиологическая расшифровка.•Клинико-лабораторный мониторинг с оценкой системы

гемостаза и определением полиморфизмов генов системы гемостаза и врожденного иммунитета.

•Оценка интерфероновой системы (при герпесвирусных инфекциях)

•Коррекция нарушений и адекватная прегравидарная подготовка.

Результаты: Привело к снижению преждевременного прерывания

беременности в 3,7 раза (до 18,7%), антенатальной гибели плода – в 79 раз (до 0,8%).

_________________________________* - Утверждена медицинская технология «Тактика ведения

беременных с синдромом потери плода (клинико-лабораторное обоснование)»

VI . Иммунологические факторы при преэклампсии

При обследовании 115 беременных с преэклампсией установлено наличие достоверной прямой связи уровня провоспалительного цитокина TNF-α и IFN-γ:

со степенью тяжести преэклампсии (r = 0,38 и r = 0,46 соответственно);

с уровнем панкреатической амилазы (r = 0,35 и r = 0,53 соответственно);

с уровнем панкреатической липазы (r = 0,37 для TNF-α);

с уровнем D-димеров (r = 0,37 и r = 0,41 соответственно);

с активностью АЛТ и АСТ (r = 0,39, r = 0,37 и r = 0,59, r = 0,43 соответственно).

При вирусно-бактериальной микст-инфекции имеются более выраженные нарушения со стороны цитокиновой системы, системы гемостаза, печени и поджелудочной железы

Дополнительные лабораторные тесты при преэклампсии

Резюме:

1. Одним из факторов, способствующих усугублению преэклампсии, является повреждение поджелудочной железы за счет усиления процессов перекисного окисления липидов и оксидативного стресса, что может быть обусловлено падением антиоксидантной защиты.

2. Усугублению панкреатической дисфункции и, возможно, панкреатита с ферментативной токсемией, по-видимому, способствует и сдвиг продукции цитокинов в сторону провоспалительных.

3. У беременных с тяжелой степенью уровень TNF-α и IFN-γ имеет достоверную связь с основными клинико-лабораторными показателями и уровнем панкреатической амилазы и липазы на фоне снижения антиоксидантной защиты

IV. Женщины, родившие детей с ВУИ

Состояние иммунной системы женщин данной группы характеризовалось:

достоверным повышением содержания лимфоцитов с фенотипом CD3+/ CD16+ CD56+, CD3+/CD4+ и снижением CD3+/CD8+

Высокий уровень Т-NK отмечался у женщин при гематогенном пути инфицирования герпевирусами

Повышением уровня провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1β)

Снижением уровня противовоспалительных цитокинов (IL-10)

Доказано наличие напряженности иммунитета у детей с верифицированной инфекцией уже в периоде внутриутробного развития, причем развитие иммунного ответа формируется в основном за счет компонентов врожденного иммунитета – цитокинов. Наиболее значимыми критериями реализации внутриутробной инфекции у новорожденных независимо от срока гестации является уровень активированных моноцитов и хемокина интерлейкина-8.

V. Реализация ВУИ у новорожденных

Уровень цитокинов в плазме крови новорожденных с ВУИ (2А) и новорожденных с перинатальным поражением мозга гипоксического генеза

(2Б), пг/мл

Распределение лимфоцитов периферической крови с использованием моноклональных антител против СD14 и

CDHLA-DR, меченых FITC и PE, в группах 1А и 1Б (%).

Включает оценку прогностических факторов:1. Осложненный акушерско-гинекологический анамнез:

•самопроизвольные аборты, •неразвивающаяся беременность,

•рождение детей с врожденными аномалиями или ВУИ,•преждевременные роды,

•перинатальная гибель плода.

2. Наличие очагов экстрагенитальной инфекции: •мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит, цистит).

3. Наличие вирусно-бактериальной инфекции и активной герпесвирусной инфекции.

4. Осложненное течение гестационного процесса: •рецидивирующая угроза прерывания беременности,

•воспалительные заболевания нижнего отдела гениталий, •наличие хориоамнионита в родах

VI. Стратификация риска развития ВУИ

Стратификация риска развития ВУИ (продолжение)

Ультразвуковые маркеры ВУИ :задержка развития плода в сочетании с изменением количества околоплодных вод, множественные кальцинаты плаценты, утолщение плаценты, взвесь в околоплодных водах,нарушение плодово-плацентарного кровотока, многоводие/маловодие. 5. Иммунологические маркеры реализации ВУИ :

Повышение провоспалительных цитокинов (IL–1β, ФНО, IL–8, IL–6), Снижение продукции противовоспалительного цитокина IL–10, IFN-γ

6. Предикторы развития осложнений при беременности : • Нарушения в системе гемостаза• Повышение уровня цитокинов (IL–1β, ФНО, IL–8) и лактоферрина, • Снижение продукции противовоспалительного цитокина IL–10 и IFN-γ • Повреждение поджелудочной железы (ферментемия)

ВЫВОД: Наиболее значимыми критериями развития ВУИ (p*16<-0.05) являются: бактериальный вагиноз + воспалительные заболевания органов малого таза; утолщение плаценты + синдром задержки развития плода;вирусно-бактериальная микст-инфекция;повышение IL–1β >19,25 pg/ml и ФНО > 24,35 pg/ml.

Установлены маркеры риска развития ВУИ (данные по программе R_MED)Количественные:Т-лимф CD3+ p=0.052 Среднее: 64.45, 69.570 CТ-хел CD3+ CD4+ p=0.001 Среднее: 28.323, 37.558 M-УМолекулы адгезии p=0.019 Среднее: 51.85, 66.1 CИРИ p=0.001 Среднее: 0.9483, 1.4929 M-УIgG p=0.043 Среднее: 9.95, 13.333 M-УИЛ-10 p=0.065 Среднее: 2.2115, 5.3538 M-УИЛ-1β р=0.0019 Среднее: 507, 229 М-УИЛ-8 р=0,003 Среднее: 64.4, 52.5 М-УФНО р=0,001 Среднее: 61.1, 47.2 М-У

Категориальные:

Кольпит 0 1 Кольпит 0 1

ВУИ

ВУИ

0 8 8 0 -0,76 1,05

1 9 1 1 0,96 -1,32"p= 0.080Методыстатистического анализа: 1.построение «дерева решений»:2.линейного дискриминантного анализа

Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 2011614225 «Статистический анализ клинико-лабораторных данных для прогнозирования риска развития патологии (R_MED)»

3. метода опорных векторов

При отсутствии возбудителя: профилактика ПН

ВУИ Внутриутробноеинфицирование

Здоровый ребенок

Здоровый ребенок

При верификации возбудителя этиотропное лечение, профилактика ПН

Расширенный спектр лабораторных исследований

для верификации возможных патогенов

Профилактика плацентарной недостаточности

Низкий риск: ФНО<24,35 pg/ml; IL-1β<19,25 pg/ml

Высокий риск (ФНО>24,35 pg/ml ; IL-1β>19,25 pg/ml )

Исследование содержания цитокинов IL-1β, ФНО

Менее 13 баллов:низкий риск

Более 13 баллов – высокий риск

С помощью прогностической таблицы рассчитывается риск ВУИ в баллах

Алгоритм ведения недоношенных новорожденных(из группы высокого риска по ВУИ)

оценка уровня цитокинов в первые сутки после рождения (IL-8; IL-1β; лактоферрин)

IL-8: ↑34,92 pg/ml IL-8: ↓34,92 pg/ml отсутствие ВУИ

Лактоферрин IL-1β

Лактоферрин: ↑346,6 нг/л

риск инфицирования новорожденного

Лактоферрин: ↓346,6 нг/лриск ВУИ

IL-1β: ↓4,1 pg/mlриск ВУИ

IL-1β: ↑4,1 pg/ml

риск инфицирования новорожденного

этиологическая верификацияэтиотропное лечение

динамическое наблюдение

динамическое наблюдение

Алгоритм ведения доношенных новорожденных(из группы высокого риска по ВУИ)

оценка уровня цитокинов в первые сутки после рождения (IL-8; ФНО)

IL-8: ↑25,57 pg/mlВУИ

IL-8: ↓25,57 pg/ml

IL-8: ↓5,69 pg/mlотсутствие ВУИ

IL-8: 5,69-25,57 pg/ml

ФНО

ФНО: ↑14,37 pg/ml риск инфицирования

новорожденного

ФНО: ↓14,37 pg/mlотсутствие ВУИ

этиологическая верификацияэтиотропное лечение

динамическое наблюдение

Благодарю заБлагодарю завнимание !внимание !

Для контактов: 644001,г.Омск, 20 лет РККА, д.15.Телефон: 8(3812)36-23-11, 37-03-55, 37-03-43E-mail: dolgih-ti@mail.ru