基因 /细胞治疗策略：利用成熟干细胞的天然能力修复受损组织

Darwin J. Prockop, M.D., Ph.D., Director, Center for Gene Therapy, Tulane University

Health Sciences Center, New Orleans, LA

翻译者： violet39 (DXY)

• Cohnheim (1867) 年提出：可能是通过来自于血液中的细胞进行自身修复的。

• 最近的一些假设认为：可能最先是从许多组织中发现的干细胞样细胞开始的。然后这些细胞可能被骨髓中的干细胞耗尽。

机体是如何进行自身修复的？

我们并不在进化树的最高处：• 水蛭、涡虫等可以从很少的细胞复原完整的器官；

• 蜥蜴和类似的动物可以恢复断肢或断掉的尾巴；

• 大鼠和小鼠的大部分器官都不易发生永久性的伤害。

修复系统是如何较好的工作的？

• 利用骨髓中的干细胞样细胞使人类具有和啮齿类动物或者蜥蜴一样的修复能力；

• 我们的方法是扩增患者自身细胞；

基因 /细胞治疗策略

局部麻醉，抽取骨髓

运用基因工程手段大量扩增骨髓间质细胞

治疗同一个患者

骨骼及相关疾病 中枢神经系统疾病

问题

1、骨髓中确实含有非造血器官干细胞吗？2、如果有，是什么细胞呢？3、如果有，这些细胞是如何修复组织的呢？

问题

1、骨髓中确实含有非造血器官干细胞吗？ 已从下列实验得出一些结论性数据 a、观察细胞培养时的分化性； b、动物实验； c、骨髓移植和器官移植的患者。

（参见 Prockop et al. PNAS 100(1): 11917-23, 2003）

2、骨髓中有哪些细胞？

• 造血干细胞（ CD34* 或 CD133*）？• “ ”侧群 细胞？• 多功能成熟祖细胞？• 骨髓间充质干细胞 (MSCs)？

或是一些仍未确认的细胞？

骨髓中的一个候补的修补细胞

分离： ——将骨髓放置在塑料表面中；该种细胞有许多名字： ——“ ”骨髓间质细胞 ，由于它常被用作

HSCs的供给层 ——“ ”间质干细胞 ，由于它能分化成多种细胞类型

“两者折衷，这种细胞被称做： MSCs”

Friedenstein， 1976，指出粘附细胞 (MSCs)具有下述特点：

——有核细胞所占比例为： 1:10,000到100,000；

——能快速增殖； ——在体内或体外可分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞；

——容易克隆，得到的克隆可分化 没有融合

+/- 肌管

+/- 神经前体细胞单细胞克隆

软骨细胞成骨细胞

脂肪细胞

呼吁将MSCs用于治疗

1、相对容易： ——分离和扩增， ——由同一个患者获得；2、具有多向分化的潜能；3、不会形成肿瘤；4、倾向于定向于损伤组织和修复组织。

MSCs的扩增

由 2ml骨髓开始扩增 ——可得到 5 亿个以上的 MSCs； ——需要 2周的时间；

扩增密度效应

培养 12天后，细胞量变到原来的 2000倍。

(Colter, DiGirolamo, Prockop, 2000)

几种细胞

1、纺锤形细胞；

2、大而扁平的细胞；

3 “、很小，圆形， 迅”速自我恢复 细胞

（ RS 细胞）。

细胞在低密度和高密度时的分裂倍数。

扩增密度效应

但是为什么：

——有延滞期 ?

——培养之前的稳定期是同步的 ?

推测：

——需要合成和分泌生长刺激物。

合成和分泌的量

图1

MSC培养物用 35S标记的甲硫氨酸，柱状图分别表示 35S标记蛋白在细胞 (C)和培养基中的量(M)。当细胞生长进入平台期时，蛋白合成减少。

11111111111

cm2

细胞密度

放射自显影观察培养基状态

放射自显影 银染

纯化、浓缩的 35kDa提取物

新合成并被 35S标记的细胞分泌蛋白有纤维结合蛋白 (F)、层粘连蛋白(L)和一个未知蛋白 (*)。这个未知蛋白从含有大量胎牛蛋白的培养基中纯化出来。

胰蛋白酶酶解 16小时，SELDI TOF

= Dickkopf-1, Wnt 信号转导通路的抑制剂

从这个 35kDa的蛋白中酶解得到的七个肽段与从一个先前鉴定的Wnt信号转导通路抑制剂中酶解的七个肽段具有相同的分子量。

重组 Dkk-1缩短MSCs培养过程中的延滞期（重复实验）

每个微量测试孔中的细胞数量 每个微量测试孔中的细胞数量

处理时间 处理时间

Dkk-1 ——抗体 延长延滞期

细胞数量

天

Wnt抑制剂， Dkk-1在快速扩增的hMSCs细胞中表达

Dkk-1：Wnt信号传导通路的抑制剂

接触抑制，粘附，连接

MSCs培养过程中特殊的增殖动力学

a、细胞在低密度培养时维持在延滞期，直到大量合成Wnt信号传导通路抑制剂Dkk-1。

b、当 Dkk-1的合成停止，细胞表达Wnt促进信号转导通路的配体Wnt-5α时，细胞进入稳定期；

c、当把细胞再次传代，这个过程会重复进行，直到传 4-6代，细胞进入衰亡阶段为止。

稀释细胞密度 (4 - 6Xs)

细胞 /集落

Dickkopf-1(Dkk-1)

• Wnt 信号传导通路抑制因子 ；• 在大多数系统中抑制Wnt信号传导，使细胞增殖停止；

一个可能性：用于MSCs培养另一个可能性： Dkk-1可用于扩增病人自身MSC细胞的疾病治疗中。

随培养状态变化的MSCs系统RS前体细胞——扩增缓慢——长端粒

RS细胞—— “ ”快速扩增， 短暂扩增

MSC成熟细胞

滋养层细胞

成骨细胞

脂肪细胞

软骨细胞

上皮细胞

其它细胞（肌细胞，内细胞，肝细胞）

神经前体细胞

问题：MSCs细胞能用于临床试 验吗？

• 2ml骨髓能否在 2周内扩增到 5亿个以上的细胞；

• 培养条件很苛刻；• 在这个领域中，易变性是一个严重的问题 ——NIH花费 430万美元资助 tulane中心，使其为其它的研究者提供标准化的标本。

问题

1、骨髓组织确实含有非造血组织干细胞吗？

2、如果有，那么是什么细胞？3、如果有，这些细胞又是怎样修复组织的呢？

小气管上皮细胞(SAE)

GFP+/MSCs

热休克的 SAE+GFP+/MSCs

( × 20 )( × 40 )

当单层上皮细胞受到热休克处理受损后， GFP标记的MSCs细胞通过进入单层细胞，维持上皮细胞广而平的形态，修复受损细胞。

3. MSCs是如何修复受损组织的？Spees et al. PNAS 2003

培养MSCs

快速自我修复细胞

成熟的MSCs细胞(融合培养 )

举例：单层上皮细胞

损伤

1、分化2、细胞融合 (?)

3、生长因子

(Wnt 5a, VEGF, PDGF, BDNF, NT-3)

疾病的靶标是什么？

在一些特殊的的情况下： ——诊断疾病比较困难； ——心脏、肝脏、肾脏、代谢、中枢神经系统疾病。

我们的方法

• 由于毁坏所引起的疾病或者可预测下行过程的疾病；

• 没有有效的治疗方法以及从动物模型得到的合理的数据。

我们的研究对象：脊髓损伤

• 在美国， 3000多人身患永久性麻痹， 每 年所花费的医疗费用有 500,000美元。

• 没有有效的治疗方法。• 四个实验室已经在大鼠模型上取得了有前途的结果。

• 一些医疗机构采用MSCs治疗的研究进入四期，没有观察到毒性反应。

脊髓损伤大鼠模型• MSCs改善 ——运动功能； ——轴突再生能力； ——通过骨髓中的造血干细胞提供再生环境。

(Hoffstetter et al. PNAS 2002)

• 成年大鼠挤压损伤• 1周后将大鼠MSCs细胞注入脊髓 躯干伸展 行为测试

对照组 0/10 6.8 +/- 0.4 SEM

实验组 7/12* 9.2 +/- 0.4 SEM

(p=0.013)

* 2个进行间歇的步骤

脊髓损伤大鼠模型

hMSCs表达神经营养因子

我们的脊髓损伤实验• 尽管不是第一次实验，但我们希望最好 ——使用从患者身上中获得的，经过仔细地标准化处理的MSCs细胞进行治疗；

——需要国际委员会的监督； ——尽可能采用多通道实验；

(这是不是一个针对普通的中枢神经系统疾病的有用的方法呢？ )

最新的综述和参考文献

Prockop, D.J., C.A. Gregory and J.L. Spees. One strategy for cell and gene therapy: Harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.

Proceedings of the National Academy of Sciences 100(1):11917-11923(2003).