Организация и проведение сличительных испытаний

(грипп птиц, болезнь Ньюкасла), обзор результатов

2012-2013 гг.

Чвала Илья Александрович, зав. реф. лаб. вирусных болезней птиц,

ФГБУ «ВНИИЗЖ»

• ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025—2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

• ISO/IEC 17043:2010 “Conformity assessment—General requirements for proficiency testing,” «Оценка соответствия. Общие требования к проверке квалификации»,

• Межлабораторные сравнительные испытания при аккредитации и инспекционном контроле испытательных лабораторий. Методика и порядок проведения. Р 50.4.006-2002

• Правила организации проведения межлабораторных сличительных испытаний и профессионального тестирования специалистов учреждений, осуществляющих лабораторные исследования в области ветеринарии (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору 25 января 2010 г.)

Нормативные документы

Участие Референтной лаборатории вирусных болезней птиц в

международных МСИ• Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie,

Падуя, Италия (FAO/OIE референтная лаборатория),

• DEFRA, Animal Health and Veterinary Laboratories Agency, Вэйбридж, Великобритания (OIE референтная лаборатория),

• GD Animal Health Service, Дэвентер, Голландия,

С учетом Laboratory Proficiency Testing (OIE)http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference-laboratories/proficiency-testing/

Задачи МСИ Laboratory Proficiency Testing (OIE)

• Оценка способности лабораторий проводить исследования с использованием конкретного метода/тест-системы,

• Оценка достоверности исследований конкретного специалиста,

• Проверка точности калибровки оборудования,• Оптимизация используемого или аппробация

нового метода,• Приведение количественных результатов в

соответствие (устранение межлабораторных отличий)

Программа МСИ• Стандартные условия исследования (в т.ч.

методы, оборудование, диагностические тест-системы, и др.),

• Количество проб для каждого из методов исследования (раундов),

• Выбор штаммов для изготовления шифрованных проб,

• Гарантия качества: однородность, активность и специфичность, стабильность, надлежащая маркировка и условия хранения/транспортировки,

• Сбор и анализ результатов,• Оценка результатов (статистические методы?),• Корректирующие меры

•Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения от 30 июля 2009 г. N 02-03-48/563 •ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа •ГОСТ 25587-83: Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики болезни Ньюкасла•Ветеринарные правила лабораторной диагностики гриппа А птиц (Приказ Минсельхоза России от 3 апреля 2006 года N 105)•Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц) ГУВ МСХ СССР 1972 год•МУ по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации Департамент ветеринарии N 13-7-2/988 от 23.06.1997

Стандартные методы?

Полимеразная цепная реакция• Тест-система для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР,

НПО «Нарвак»,

• Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом ПЦР, НПО «Нарвак»,

• Тест-система для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции «ГРИПП», вариант EPh, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва,

• Тест-система для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции «ГРИПП» вариант FRT, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва,

• Тест-система для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР, ООО «Ветбиохим», г. Москва,

• Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом ПЦР, ООО «Ветбиохим», г. Москва,

в отдельных случаях наименования тест-систем приводились недостаточно полно, или без указания варианта проведения исследований (в режиме «реального времени» или ОТ-ПЦР).

Реакция торможения гемагглютинации• Набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц

подтипа Н5 в РТГА, ФГБУ «ВНИИЗЖ»,

• Набор для выявления антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА, ФГБУ «ВНИИЗЖ»,

• Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в РТГА, ОАО «Покровский завод биопрепаратов»,

• Набор компонентов для выявления антител к вирусу ньюкаслской болезни птиц в РТГА, ООО «Кронвет»,

• Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в РТГА, ООО «Щелковский завод фармацевтических и ветеринарных препаратов».

не все участники испытаний предоставили сведения по наименованиям и сериям использованных наборов

ОборудованиеОборудование

Laboratory Proficiency Testing (OIE):количество проб не менее 3/раунд

2013 год:ПЦР – 5 проб (антиген вируса гриппа

различных подтипов, «нормальный» (отрицательный) антиген),

РТГА – 4 сыворотки крови кур (гипериммунные сыворотки к вирусам гриппа и ньюкаслской болезни, нормальная (отрицательная) сыворотка)

A/tern/South Africa/61(H5N3)

H5N3 Antigen

CY015081 A/chicken/Scotland/1959 H5N1

M18450 A/duck/Ireland/113/1983 H5N8

CY120776 A/duck/Moscow/4182/2010 H5N

A/ostrich/S Africa/AI2114/2011H5N2

JQ737221 A/mallard/Czech/14602/11 H5N2

AB677936 A/duck/Mongolia/194/2011 H5N3

CY049756 A/gadwall/Altai/1202/2007 H5N2

GU228593 A/mallard/Crimea/224/2008 H5N2

AB241624 A/duck/Hokkaido/101/04 H5N3

AB558479 A/duck/Tsukuba/189/08 H5N2

AB241621 A/duck/Mongolia/500/01 H5N3

GQ162786 A/duck/Primorie/2621/2001 H5N2

GQ227604 A/duck/Primorie/2633/2001 H5N3

FJ654295 A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1

HQ630838 A/grebe/Tyva/2/2010 H5N1

A/chicken/Magelang/662-763/2007H5N1

CY105894 A/chicken/Ukraine/AV453/08 H5N1

FJ445017 A/chicken/Iran/53-3/08 H5N1

DQ864719 A/chicken/Volgograd/236/06 H5N1

DQ864711 A/duck/Novosibirsk/02/05 H5N1

100100

100

9882

100

100

100

100

100

100

99100

74

0.01

H5

A/chicken/Netherlands/1/03(N7) A/turkey/Italy/9289/2002 H7N3 A/mallard/Italy/199/01(N3)

A/turkey/Italy/251/2003(N3)

A/duck/Italy/4609/2003(N2)

A/turkey/Italy/4372/2004(N3)

A/duck/Italy/4692-9/2004(H7)

A/mallard/Georgia/2/2010 H7N7 A/mute swan/Hungary/5973/2007(N7)

A/mallard/Georgia/3/2010 H7N3 A/garganey/Crimea/2027/2008(N8) A/Anas crecca/Spain/1460/2008(N9)

A/turkey/Italy/2984/2000(N1) A/turkey/Italy/4580/1999 H7N1

A/swan/Shimane/42/99(N8)

A/ch/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(N9)

A/duck/Korea/A117/2010(N6)

A/chicken/Pakistan/1/2004(N3)

A/chicken/Japan/1925(H7N7)

A/chicken/FPV/Rostock/1934 H7N1

A/FPV/Dutch/27(H7N7) H7N7 Antigen A/FPV/Dutch/1927(H7N7)

A/fowl/Dobson/1927(H7N7)

A/chicken/Brescia/1902(H7N7)

A/fowl/Weybridge 1934 H7N3

A/FPV/Weybridge(H7N7)87

86

81

99

67

96

90

79

73

83

0.02

H7

Вирус ньюкаслской болезни

Положительная сыворотка АГ

Н5N1IZSVe

АГ Н5N2IZSVe

АГ Н5N3 IZSVe

АГ Н5N9

IZSVe

АГ Н5N3

Производитель 1

АГ Н5N3 Производите

ль 2

АГ Н5N1 «Новосибирск

ий»ФГБУ

«ВНИИЗЖ»

АГ Н5N2 Приморский

ФГБУ «ВНИИЗЖ»

Н5N1, IZSVe 1:2048 1:1024 1:1024 1:1024 1:1024 1:1024 1:256 1:512

Н5N2, IZSVe 1:1024 1:2048 1:1024 1:1024 1:512 1:512 1:128 1: 256

Н5N3, IZSVe 1:1024 1:1024 1:1024 1:1024 1:512 1:512 1:256 1:256

Н5N9, IZSVe 1:1024 1:1024 1:512 1:1024 1:256 1:512 1:128 1:256Н5N3, Производитель 1 1:32 1:32 1:16 1:32 1:64 1:128 1:8 1:16

Н5N3, Производитель 2 1:16 1:16 1:8 1:16 1:64 1:64 1:8 1:8

Н5N1,«Новосибирский»ФГБУ «ВНИИЗЖ»

1:1024 1:1024 1:512 1:1024 1:1024 1:512 1:512 1:256

Результаты РТГА (Н5) с использованием референтных

сывороток и антигенов, отечественных наборов

• A/mallard/Italy/3401/2005 H5N1• A/turkey/Italy/1980 H5N2• A/duck/Italy/775/2004 H5N3• A/chicken/Italy/22A/1998 H5N9

• A/chicken/Italy/1067/1999 H7N1• A/turkey/Italy/9289/2002 H7N3• A/macaw/England/628/1980 H7N7

THE 2011-2012 WHO INFLUENZA REAGENT KITFOR IDENTIFICATION OF INFLUENZA ISOLATES

Produced and distributed by:WHO COLLABORATING CENTER FOR

SURVEILLANCE,EPIDEMIOLOGY AND CONTROL OF INFLUENZA

Located at:Centers for Disease Control and Prevention

Influenza DivisionVirus Surveillance and Diagnosis Branch, G-16

1600 Clifton Road, NEAtlanta, Georgia 30333, U.S.A.

Telephone: 404-639-3591Fax: 404-639-0080

In Collaboration withInfluenza Reagent Resource (IRR) and American

Type Culture Collection (ATCC)http://www.influenzareagentresource.org

Технология изготовления шифрованных проб

• Изученные штаммы, свободные от контаминации,

• Получение высокоактивных, специфичных и стабильных образцов,

• Проверка показателей с использованием различных методов и тест-систем на всех этапах производства, сроках хранения

• Объем проб: антигены по 1мл, сыворотки по 0,5мл, т.е. в количестве, достаточном для тестирования испытуемым методом, возможно исследование дополнительными методами

Анализ результатов - качественныйСтатистическая обработка данных не проводится

ввиду:• использования тест-систем различных

производителей (особенности наборов и реагентов),

• особенностей методов РТГА и ПЦР (ОТ- или ОТ-реального времени),

• уровень оснащенности лабораторий (использование оборудования различных производителей).

Результат МСИ (для каждого образца): удовлетворительный, неудовлетворительный,

сомнительный

Корректирующие меры

• Стажировка специалистов лаборатории –участника МСИ в профильных лабораториях,

• Расширение перечня применяемых тест-систем и методов,

• Совместный анализ и устранение ошибок (организатор и участник)

Наиболее распространенные ошибки МСИ-2012

• ПЦР - техническая ошибка?, контаминация?

• РТГА (идентификация антигена и выявление антител) – низкая активность положительных сывороток (от 1:16-1:32), использование единственного набора (без последующего подтверждения), неспецифическая реакция.

Рекомендации Участникам МСИ• Использование тест-систем нескольких

производителей,• Использование дополнительных методов

(РДП, ИФА, варианты ПЦР),• Проведение исследований параллельно

несколькими специалистами,• Анализ полученных результатов до отправки

организатору,• Подробный отчет о результатах

исследований, с комментариями специалистов

Спасибо за внимание!

e-mail: chvala@arriah.ru