一 教学要求

• 掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理

• 学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操作

实验八 酶联免疫吸附试验（ ELISA ）

二 实验原理 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay

简称 ELISA) 是在免疫酶技术 (immunoenzymatic techniques)

上发展起来的一种新型免疫测定技术， ELISA 过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体 ,

再加相应酶标记抗体，生成抗原 -- 待测抗体 -- 酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。 ELISA 最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。

（ 1 ） 直接法测定抗原

A. 将抗原吸附在载体表面；

B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。

（ 2 ）间接法测定抗体

A. 将抗原吸附于固相载体表面；

B. 加抗体 , 形成抗原 - 抗体复合物 ;

C. 加酶标抗体；

D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。

（ 3 ）双抗体夹心法测定抗原

A. 将抗体吸附于固相表面 ;

B. 加抗原，形成抗原 - 抗体复合物 ;

C. 加酶标抗体 ;

E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。

（ 4 ）竞争法测定抗原

A. 将抗体吸附在固相载体表面 ;

B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原；

C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三 材料与器材（略）

（ 1 ）抗体包被：羊抗人 IgG

酶联板每孔加 100 µL ， 4 ℃ 过夜；甩净。

（ 2 ）封闭： 2% 小牛血清，每孔加 100 µL ， 37 ℃ 封闭 30 min ；封闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩； 第三次用洗液， 并静置 3 min ，甩）

（ 3 ）加待测抗原：正常人血清稀释成 ,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80 ,生理盐水作为对照，每孔加 100 µL ，注意从高稀释度到低稀释度加样， 37 ℃ 孵育 1h ；洗三次

（ 4 ）加酶标抗体： HRP-IgG （ PBS-Tween ， 5%BS ； 1 ： 800稀释）， 每孔加 100 µL ， 37 ℃ ， 30 min ；洗三次

四 操作 步骤

（ 5 ）酶催化反应：底物显色剂（ 0.2 mol/L Na2HPO4 加 1:1的 0.1M 柠檬酸， 3% H2O2 加 1.5µL/mL ， TMB （ DMSO溶， 10 mg/mL ）每孔加 50 µL ， 37 ℃ 闭光反应 15 min ；

（ 6 ）加 2mol/L H2SO4 50 µL 终止反应，观察颜色反应，并用酶标仪测量 OD 。

五 注意事项（ 1 ）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿

使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min 再弃去。

（ 2 ）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。

（ 3 ）底物应在临用前配制，同时注意避光。

六 思考题

（ 1 ）分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响（双抗夹心法）

（ 2 ）比较免疫荧光法和 ELISA 的最适检测对象。