4 + 3מעבדה מס'

הקדמה: בגלל ריבוי הניסויים במעבדות אלו, החלטנו לפתוח בהקדמה קצרה, שתבהיר קודם כל באופן

כללי מה הייתה מטרת העל של המעבדות וכיצד הניסויים השונים מוצגים ומנותחים בדוח זה. כל מעבדה מחולקת לתתי ניסויים, עוסקות בקינטיקה של האנזים טריפסין.4 ו 3מעבדות

כאשר כל ניסוי בודק פרמטר אחר בהקשר של קינטיקת האנזים, לדוגמה: ריכוז האנזים, טמפ' התגובה, ריכוז הסובסטראט ועוד. שוב, בעקבות ריבוי הניסויים במעבדות אלו, PHהתגובה,

לא כל הניסויים בוצעו על ידי כל הזוגות באופן מעשי, אך כולם נדנו בכיתה. לכן, את הניסויים שביצענו באופן מעשי נציג כאן באופן מפורט, תוך הצגה גרפית של הנתונים האמיתיים

שהתקבלו על ידינו בניסוי, ניתוחם ועמידה על מקורות השגיאה בניסוי. את הניסויים שלא בוצעו על ידינו נציג כאן באופן תאורטי תוך הצגה גרפית סכמתית של התוצאות שממחישה את

מהות הניסוי, גם כאן נתייחס למהות הניסוי, כלומר: "מדוע יש לצפות שיתקבל גרף דווקאכזה", ונעמוד על מקורות שגיאה אפשריים בניסויים אלו.

בתחילת ההצגה של כל אחד מהניסויים נציין אם הניסוי בוצע על ידינו באופן מעשי או לא.

3 מעבדה מס'

השפעת ריכוז האנזים – ניסוי א' )ניסוי זה בוצע על ידינו(

בדיקת קצב הריאקציה ע"י מדידת כמות התוצר, שנוצר ליחידת זמן, כפונקציה שלמטרה:כמות האנזים במבחנה.

תמיסות נפרדות בריכוזים5 ל ראשית הפכנו תמיסת אנזים בריכוז מהלך הניסוי:

מבחנות כאשר כל אחת6שונים על ידי מהילה, כפי שמצוין בדף המעבדה.* לאחר מכן הכנו בה לא רצינו שתתרחש6 מל' מריכוז שונה של אנזים )פרט למבחנה מס' 1מהן כוללת מל' בופר טריס. לאחר מכן, אך לפני התחלת הריאקציה, השהנו את המבחנות2ריאקציה( ו

מעלות צלסיוס על מנת להביאן לטמפ' האידאלית של30 דקות באמבט בטמפ' של 5למשך האנזים ולהביא לאחידות תנאים בין כל המבחנות, להלן יקרא פראינקובציה )פרק זמן מסוים,

שזו היא מטרתו והוא קודם לתחילת הריאקציה(. רק לאחר מכן הוספנו כמות זהה של דקות באותה טמפ',15סובסטרט לכל אחת מהמבחנות ואפשרנו לריאקציה להתרחש למשך הדקות הוספנו לכל15להלן יקרא אינקובציה )משך הזמן שמתייחס לראקציה עצמה(. בתום

המבחנות חצי מל' של חומצת חומץ על מנת להביא להפסקת הראקציה באופן מוחלט. כעתהוספנו

, בה לא התרחשה ראקציה, אך מכיוון שנשתמש בה6 מל' של תמיסת אנזים למבחנה מס' 1 vortexכבלנק, עליה להכיל את כל המרכיבים, כמו המבחנות האחרות. ערבבנו את המבחנות ב

. כיול הספקטרופוטומטר בוצע ע"י מים מזוקקים.nm 410וקראנו באורך גל של

1*ראה נספח מס' תוצאות:

V0פעילות אנזים A410nmבליעה מיהול אנזים מספר מבחנה0.0235 0.864 1:2.5 10.0153 0.563 1:5 20.0095 0.348 1:8 30.0096 0.354 1:10 40.0045 0.167 1:25 5

0 -0.002 1:2.5 6

על מנת לקבוע פעילות אנזימטית של אנזים ועל מנת להשוות תוצאות עם הספרות עלינו לכמות תוצר. לשם כך נשתמש במושג של בליעה ספציפית .410nmלהפוך את הבליעה ב

להלן הנוסחה המנחה:

Vml.נפח הראקציה = ε.מקדם בליעה =

Tmin.זמן הראקציה בדקות = A410nm.הבליעה שהתקבל באורך גל זה =

.התוצאה המתקבלת היא במיקרו מול תוצר לדקה -

: 1 דוגמת חישוב עבור מבחנה מס'

פרט לנקודה המסומנת בחץ, בה נדון בדיון ומסקנות, מבחינים בעליה בכמות התוצר עםהעלאת ריכוז האנזים.

דיון ומסקנות: כאשר בוחנים את מטרת הניסוי, ניתן לומר בהחלטיות, כי העלאת ריכוז האנזים במבחנה גורם

לעלייה בכמות התוצר לדקה. באשר לנקודה המסומנת בחץ...נקודה זו חורגת באופן ברור מהמגמה הכללית של הגרף, כלומר, למרות העלייה בריכוז האנזים פחתה פעילותו, דבר שהוא איננו הגיוני בריכוזים האלו, בעיקר בהתחשב במיקום הנקודה שלפני וזו שאחריי. אם כך, נוכל

רק לשער את מקור הטעות, שכנראה נפלה בהכנסת תמיסת אנזים במיהול זהה לזה שלהנקודה הקודמת, ומכאן הדמיון בכמות התוצר.

למרות המסקנה הברורה מהניסוי, קיימת שאלה מתבקשת אחרת, והיא: כיצד יראה הגרף אם נמשיך להעלאות את ריכוז האנזים. האם הגרף ימשיך במגמתו עד אין סוף? או האם צפוי

שינוי? ואם כן אז איזה, ומדוע? היות והראקציה המדוברת תלויה בשני מרכיבים, שהם האנזים והסובסטרט, העלאת ריכוזו של רק אחד מהם לא תניב העלאה בתוצרים עד אין סוף, היות

וקיימת מגבלה כמותית של המגיב השני. מכאן, ניתן להסיק, כי אם היינו ממשיכים להעלות את ריכוז האנזים עוד, בשלב מסוים הגרף היה מתיישר, כלומר, כמות התוצר הייתה מגיעה לשיא מסוים, שמעבר לו לא ניתן להתקדם, כל זאת בעקבות ההגבלה שבכמות הסובסטרט הנתונה.

בהמשך לשאלה זו, נשאל, ומה עם הסובסטרט יהיה בעודף? במקרה הזה יתקבל מצב, שבו , ולשבש אתPHכמות גדולה של תוצר עלולה להשפיע על תנאי סביבת הראקציה: טמפ',

מסוים ובטווח טמפ' מסוים, ובכךPHיכולת התפקוד של האנזים, שכידוע מסוגל לעבוד ב למנוע את המשך עליית הגרף ובעצם לגרום לנסיגה בכמות התוצר לדקה.

השפעת זמן הראקציה – ניסוי ב' )ניסוי זה לא בוצע על ידינו(

: בדיקת קצב הראקציה כפונקציה של זמן הראקציה.מטרה זוגות מבחנות, כאשר מבחנה אחת תעבור את הראקציה וזוגתה6 הכנה של מהלך הניסוי:

תשמש כבלנק. לכל המבחנות הוכנס סובסטרט ובופר בכמויות זהות, והן הוכנסו לפראינקובציה דקות. לאחר מכן, הוכנסה כמות זהה של אנזים לאחת מכל זוג5 מעלות צלסיוס למשך 30ב

דקות ועד0מבחנות והאינקובציה החלה. האינקובציה נמשכה פרקי זמן שונים עבור כל זוג מ דקות. לכל זוג מבחנות הוכנסה חומצת חומץ בזמן המתאים על מנת לסיים את הראקציה,30

.410nm וקריאה ב vortexוהוסף אנזים למבחנות הבלנק שלא עברו את הראקציה. ערבוב ב כיול הספקטרופוטומטר בוצע ע"י מים מזוקקים.

תוצאות: נציג כאן גרף סכמתי שיתאר את תוצאות הניסוי המצופים, )הנתונים בגרף אינם ניסויים(.

ניתן לראות בגרף עליה מתמדת בכמות התוצר עם העלייה בזמן האינקובציה, עד לנקודהמסוימת בה פעילות האנזים מגיעה לשיא אותו היא לא תעבור.

דיון ומסקנות: אם נרצה לענות על השאלה שהוצגה למעשה במטרת הניסוי, נאמר כי קצב הראקציה עולה כאשר משך האינקובציה עולה. אך, גם כאן, מתבקשת השאלה, כיצד יראה הגרף אם נמשיך

להעלות את משך זמן האינקובציה. בגרף שלפנינו, ניתן כבר לראות רמז לשאלה זו ולהבחין דקות20בעובדה, כי לא הייתה עליה משמעותית בקצב הראקציה ,בין אינקובציה של

דקות, דבר שמרמז על התיישרות הגרף, כלומר הגעה לשיא מסוים של30לאינקובציה של תוצר. נעמוד כעת על מספר גורמים, שהם אלו שמונעים מהגרף להמשיך ולטפס כלפי מעלה:

הגבלה בכמות הסובסטרט, כלומר, יכולה להיווצר רק כמות מוגבלת של תוצר בהתאםא.לכמות הסובסטרט.

התחזקות של ראקציה הפוכה בעקבות ריבוי תוצרים.ב.השפעת התוצרים על תנאי הסביבה של הראקציה.ג.

עניין נוסף...מכיוון שאנו מתבוננים בגרף, שמתאר כמות תוצר כפונקציה של זמן ניזכר לרגע

משוואה זו מתארת את המהירות ההתחלתית של הראציה. לכןבמשוואה הבאה:

אם נתאר )שוב באופן סכמתי( את גרף הנגזרת, נוכל לקבל אינפורמציה נוחה לגביי המהירותההתחלתית בכל אחת מהמבחנות.

בגרף זה ניתן לראות כי המהירות ההתחלתית קבועה עד לנקודה בה ראינו את התיישרות הקו

בגרף הקודם, שהריי בנקודה זו פוחתת המהירות ההתחלתית. אלמלא הייתה פוחתת המהירותההתחלתית בנקודה זו היינו רואים בגרף הקודם כי הקו ממשיך לטפס כלפי מעלה.

PH השפעת – ניסוי ג' )ניסוי זה לא בוצע על ידינו(

על קצב הראקציה.PH בדיקת השפעת ה מטרה: בחוברת המעבדה, כאשר44 מבחנות ע"פ הטבלה הנתונה בע"מ 22: הכנה של מהלך הניסוי

נבדוק גם את השפעת סוג הבופר15-18 וב 11-14 שונה. במבחנות PHכל זוג מבחנות ייבדק ב על פעילות האנזים. סה"כ כמות המרכיבים שהוכנסה לכל אחת מהמבחנות זהה. לפניי הכנסת

מעלות צלסיוס. בתום30 דקות פראינקובציה ב 5האנזים הכנסנו את המבחנות לתקופה של מל' של אנזים, ובכך התחלנו את שלב1תקופת הפראינקובציה, הכנסנו לכל מבנה אי זוגית

מעלות צלסיוס. על מנת לסיים את הראקציה30 דקות בטמפ' של 15האינקובציה שנמשך מל' של אנזים,1 מל' של חומצת חומץ, והוספנו לכל מבחנה זוגית 0.5הכנסנו לכל המבחנות

. כיול410nm וקריאה ב vortexעל מנת להשוות את כמות המרכיבים במבחנות. ערבוב ב הספקטרופוטומטר בוצע ע"י מים מזוקקים.

תוצאות::PHגרף סכמטי של בליעה כנגד שינויים ב

, כמו כן ניתןPH 9 ל PH 7ניתן לראות בגרף, כי טווח הפעילות האופטימלי של האנזים הוא בין

את ההבדלים בין הבופרים השונים בהם השתמשנו. להבדלים אלו נתייחס9 ו PH 8לראות ב בדיון ומסקנות.דיון ומסקנות:

האופטימלי של האנזים, שהואPHהמסקנה הברורה ביותר שמתקבלת מהניסוי היא טווח ה נמוך יותר או גבוה יותר, פוחתתPH, שנמצא בהתאמה עם הנתונים הספרותיים. בכל 9 ל 7בין

פעילותו של האנזים ממספר סיבות:מצב היינון של חומצות האמינו באתר הקטליטי, שלא מסוגלות לבצע את תפקידן..1מצב היינון של הסובסטרט שלא מאפשר קשירה לאנזים..2

,PHמסקנה ברורה אחרת היא לגביי עדיפות הבופר בו משתמשים. נוכל לראות כי באותו , התקבלו שתי נקודות שמצביעות על רמת פעילות שונה בהתאם לסוג הבופר שהיה8לדוגמה

הוא בופר טריס עלPH 8במבחנה. על סמך ניסויים של זוגות אחרים נאמר כי הבופר העדיף ב- נמצא כי בופר גליצין עדיף על בופר טריס.כמו כן ניתן לראות כי PH 9בופר פוספט ובמבחנות

אין פעילות של האנזים עקב אי ינון של החומצה האספרטית באתר הקושר. מצב זהPH 2ב-.PH 11קורה גם ב-

של חומצות- pKa ניתן לשער את ה) X )PH פעילות עם ציר ה-50%על ידי חיתוך הגרף ב- ו- pk1=10 ולכן PH=pKa פעילות 50%האמינו אשר קיימות באתר הקטליטי. ידוע לנו כי ב

pK2=6-מבדיקה עם טבלת ה. pKשל הח.אמינו הידועות לנו מן הספרות אשר קיימים באתר מתאים לח.אמינו pK1 מתאים לח. אמינו היסטדין ו- pK2הפעיל של הטריפסין עולה כי

אםפרטרט) בקרוב(.

השפעת טמפרטורה – ניסוי ד' )ניסוי זה בוצע על ידינו(

בדיקת השפעת הטמפרטורה על קצב הראקציה. מטרה: בחוברת המעבדה. כל זוג מבחנות נבדק45 מבחנות ע"פ טבלה בע"מ 16 הוכנו מהלך הניסוי:

בטמפ' שונה, כאשר כל המבחנות האי זוגיות שמשו כמבחנות בלנק והמבחנות הזוגיות הן אלו שבהן התבצעה הראקציה. בניסוי זה לא היתה תקופת פראינקובציה בגלל הבדלי הטמפ' בין המבחנות השונות. לאחר הכנסת כל המרכיבים הוכנסו המבחנות לאמבטיות בטמפ' שונות

דקות. בתום האינקובציה, הופסקה הראקציה ע"י הכנסת חומצת חומץ,15ולמשך זמן של vortexערבוב ב מל' אנזים לכל המבחנות הזוגיות שמשמשות כבלנק. 1ולאחריה הוכנס

. כיול הספקטרופוטומטר בוצע ע"י מים מזוקקים.410nmוקריאה ב תוצאות:

ה) של הפעילות את המתאר (30הגרף ניסויי ואיננו סכמתי הוא דקות

של זמן למשך האנזים לפעילות האופטימלית הטמפ' כי עולה הגרף 15מןהיא . 40דקות של פעילות למשך האופטימלית הטמפ' ואילו צלסיוס 30מעלות

בערך היא .35דקות צלסיוס מעלות

דיון ומסקנות:מהגרף שהתקבל ניתן להסיק מספר מסקנות:

ניתן לראות כי עם עליית הטמפרטורה, בהתאם להנחה שמספר ההתנגשויות הפוריות.1 עולה עם חמום המערכת בגלל עליית האנרגיה הקינטית, עלתה פעילותו של האנזים,

)עד לנקודה מסוימת(. מעלות40נוכל לראות כי האנזים מגיע לפעילותו האופטימלית בטמפרטורה של בערך .2

דקות.15צלסיוס. חשוב לציין כי מסקנה זו מתייחסת אך ורק למשך זמן פעילות של דוקת , כלומר, זמן30נוכל לראות כי בניסוי בו השהנו את המבחנות למשך

האינקובציה היה ארוך יותר, הגרף זז לכוון שמאלה ולמעלה, מה שגורם לנו לקבוע מעלות צלסיוס. הסיבה לכך היא, שככל35טמפ' אופטימלית אחרת, במקרה הזה כ

שנאריך את זמן האינקובציה יותר אנזים יעבור ) או לא יעבור, בהתאם לטמפ'( דנטורציה, ובהתאם לכך ישתנה היחס בין כמות התוצר שהתקבל לבין כמות האנזים

שעבר דנטורציה. מעלות צלסיוס הפעילות האנזימטית פוחתת, עד לנקודה40מעבר לטמפרטורה של .3

בה מתחיל תהליך של דנטורציה, כאשר בסופו של דבר כל האנזימים עובריםדנטורציה והפעילות נפסקת.

ה' האנזים – ניסוי יציבות מידת.מטרה האנזים: יציבות מידת על הטמפרטורה השפעת בדיקתהניסוי " 9הכנו: מהלך " מ בע הטבלה פ ע . 46מבחנות את המעבדה שבחוברת

למשך חשפנו מהמבחנות אחת . 30כל לאחר שונות בטמפרטורות דקותשל פראינקובציה ביצענו ב 5החשיפה . 30דקות בתום צלסיוס מעלות

למבחנה פרט המבחנות לכל וסובסטרט בופר הוספנו 9הפראינקובציהשנמשך האינקובציה את והתחלנו כבלנק ב 15שמשמת מעלות 30דקות

וסובסטרט. המבחנות לכל חומץ חומצת הוספנו הראקציה לסיום צלסיוס . הבלנק . כיול הספקטרופוטומטר בוצע ע"י410nm וקריאה ב vortexערבוב ב למבחנת

מים מזוקקים.תוצאות:

של חשיפה לאחר האנזים פעילות את המתאר סכמתי דקות 30גרף. שונות לטמפרטורות

של מטמפ' יציבותו את לאבד התחיל האנזים כי להסיק ניתן מעלות 30מהגרףשל אינקובציה גם 30בזמן מיציבותו איבד הוא מזו גבוהה טמפ' ובכל דקות

של .15באינקובציה דקות : ומסקנות דיון

את לשמור כדי בה האידאלית הטמפ' לגביי להסיק בעצם נוכל זה מניסוי . שהצבנו הסכמתים הנתונים מן לתפקד וביכולתו ביציבותו לפגום מבלי האנזים

על עולה שלא בטמפ' לאכסנו שכדאי לראות סמך. 30נוכל על מעלות , יותר מוקדם מתחילה הצניחה מדוע להבין ניתן הקודם הניסוי של המסקנות

הוא האינקובציה משך .30כאשר דקות - סובסטרט ריכוז ו' ניסוי

) ידינו) על בוצע זה ניסוי: הניסוי .מטרת האנזים פעילות על הסובסטרט ריכוז השפעת בדיקת: הניסוי , 15הכנו מהלך זהה כמות הוכנסה מבחנות שלוש בכל כאשר מבחנות

. , לכל זהה בכמות הוכנסו המרכיבים שאר שונים בריכוזים אך סובסטרט שלבמשך. פראינקובציה בצענו של 5המבחנות בטמפרטורה מעלות 30דקות

התחלנו ובכך שלוש כל מתוך מבחנות שתי לכל האנזים את הוספנו ולאחריהשנמשכה האינקובציה של 15את בטמפרטורה .30דקות בתוםמעלות

מל' אנזים לכל1האינקובציה, הופסקה הראקציה ע"י הכנסת חומצת חומץ, ולאחריה הוכנס . כיול הספקטרופוטומטר410nm וקריאה ב vortexערבוב ב המבחנות שמשמשות כבלנק.

בוצע ע"י מים מזוקקים.תוצאות:

V0

פעילותאנזימתית

בליעה ממוצעהפחתת לאחר

הבלנק

Aºבליעה ריכוזב סובסטרט

Mמהילה לאחר31פי

מבחנה מספר

0.0073 0.3135 0.311 6.45*10-5 10.324 6.45*10-5 20.002 6.45*10-5 3) בלנק )

0.0111 0.473 0.485 1*10-4 40.473 1*10-4 50.003 1*10-4 6) בלנק )

0.0169 0.7195 0.738 1.6*10-4 70.713 1.6*10-4 80.003 1.6*10-4 9) בלנק )

0.02254 0.957 0.967 2.1*10-4 100.959 2.1*10-4 110.003 2.1*10-4 12) בלנק )

0.28816 1.221 1.174 3.2*10-4 13

1.292 3.2*10-4 140.006 3.2*10-4 15) בלנק )

:Voדוגמת חישוב ל

/]1 כפונקציה של Vo/1על מנת לחשב את הקבועים הקינטים השונים נעזר בגרף שמתאר את s] .

את גם לחשב נוכל זה גרף שמבטא את ריכוז הסובסטרט בנקודת חצי Kmבעזרת שלו, שמבטא את מהירות הפעילותVmaxהמהירות המכסימלית של האנזים, וגם את

המכסימלית של האנזים, X ונקודת החיתוך עם ציר ה Vmax/1 שווה לYעל סמך הידיעה כי נקודת החיתוך עם ציר ה

-.Km/1שווה ל ריכוז הנתונים:

1/Vo 1/[s] 136.9863 1550090.09009 9393.93939459.1716 6200

44.36557 4696.9696973.470294 3100

: [ s /] 1 כפונקציה של Vo / 1 גרף המתאר את

, בטבלה) האחרונה הנקודה את השמטנו יותר מדויק רגרסיה קו לקבל מנת על) הישר מהקו במעט שחרגה

: Vmax ראשית נמצא את

, לכן Y=6.309 אז X=0כאשר

: Km כעת נמצא את

, לכן X=-742.23 , אז Y=0כאשר

Vmax=K2*ET

)מהווה את סה"כ כמות האנזים בראקציה(:ETאופן חישוב

, שמהווה את הקבוע הקטליטי של הראקציה:K2חישוב

ריכוז התוצאות:

PABA (P-amino benzmidine) השפעת מעכב – ניסוי ז'

V0

פעילותאנזימתית

בליעה ממוצעהפחתת לאחר

הבלנק

Aºבליעה ריכוזב סובסטרט

Mמהילה לאחר31פי

מבחנה מספר

0.0032 0.1375 0.135 6.45*10-5 10.146 6.45*10-5 20.003 6.45*10-5 3) בלנק )

0.0046 0.1995 0.203 1*10-4 40.204 1*10-4 50.004 1*10-4 6) בלנק )

0.0073 0.3105 0.290 1.6*10-4 70.335 1.6*10-4 80.002 1.6*10-4 9) בלנק )

0.0086 0.3675 0.420 2.1*10-4 100.331 2.1*10-4 110.008 2.1*10-4 12) בלנק )

0.0127 0.5415 0.586 3.2*10-4 130.505 3.2*10-4 140.004 3.2*10-4 15) בלנק )

גם כאן נשתמש באותו גרף על מנת למצוא את הקבועים הקינטיים של הניסוי הזה.ריכוז הנתונים:

1/Vo 1/s31312.5 15500

212.766 9393.93939136.9863 6200116.2791 4696.969778.74016 3100

: ) PABA ( בניסוי בו השתמשבנו במעכב תחרותי [ s /] 1 כפונקציה של Vo / 1 גרף המתאר את

את גם לחשב נוכל זה גרף שלו, על סמךVmax של האנזים וגם את Kmבעזרת/1 שווה ל X ונקודת החיתוך עם ציר ה Vmax/1 שווה לYהידיעה כי נקודת החיתוך עם ציר ה

Km.-:Vmaxראשית נמצא את

, לכן -Y=24.642 אז X=0כאשר

:Kmכעת נמצא את

, לכן - X=-1303.81 , אז Y=0כאשר

Vmax=K2*ET

ET=4.7*10-3μmole

:KIחישוב

Km` = Km בנוכחות מעכב PABA.

KI.קבוע אינאקטיבציה = I.ריכוז סופי של מעכב במערכת הראקציה =

KI יצא שלילי בגלל שגם היחס בין ה Km הוא הפוך, ה Kmעם המעכב אמור היה להיות גבוה יותר, בפועל יצא להיפך.

ריכוז התוצאות: