12.04.05

2 מעבדה דו"ח

ומרינה : חגית מדריכות

ב' ו'-יום מעבדההמבורגר דודי-זימוגן בכיף: מגישים

בוטבוליזין עמיר

2 מעבדה

במי-גבינה. וחלבון -סוכרים, שומנים החלב מרכיבי של :קביעה הניסוי מטרות

שונות. קבוצות ע"י שיבוצעו שונים ניסויים - תתי5ל יחולק הניסוי

1 ניסויבחלב. הלקטוז אחוז קביעת : הניסוי מטרת

העבודה: שיטת הלקטוז כמות את בעזרתו למדוד שנוכל ע"מ לספקטרופוטומטר כיול עקומת נכין

. שלנו בניסוי את יהוו2-5 ,מבחנותblankאיפוס- מבחנת הנה הראשונה כאשר מבחנות7 ניקח

את היטב לערבב הנבחן,יש החומר את יכילו6-7 מבחנות ואילו הכיול לעקומת הבסיס. -vortexב המרכיבים

כן. לפני מזוקקים מים עם1:20 של ביחס למהול יש הגבינה מי את

השונות המבחנות מרכיבי טבלת להלן

מבחנה

מס.

מים

מ"ל

לקטוז

0.25

מג/מ"ל

מ"ל

גבינה מי

) מהולים

מ"ל(1:20

ראגנט

סמנר

מ"ל

12.0--2.0

21.50.5-2.0

31.01.0-2.0

40.51.5-2.0

5-2.0-2.0

61.9-0.1002.0

71.9-0.1002.0

קרח בדלי ונצנן רותחים מים לאמבט בדיוק דקות5 למשך נכניס המבחנות שבע את ,נאפס 550nm של גל לאורך הספקטרו-פוטומטר את נכייל מס' דקות.כעת למשךהתוצאות. את ונמדוד1 מבחנה בעזרת

חומצה ע"י חמצון של בתהליך הסוכר את לצבוע ע"מ סמנר בריאגנט נעזרנודי-ניטרוסליצילית.

לסייע ע"מ בוצע הסוכר,החימום של הידרוליזה למנוע ע"מ בסיסית הינה הסביבה האנרגטי( המחסום של לפועל.)מעבר לצאת לתגובה

הניסוי: תוצאות

הכיול: עקומת למבחנות בספקטרו-פוטומטר הקריאה תוצאות

מבחנה

כמותמ"ג\מ"ל

בליעהA

20.0310.11030.0630.35040.0940.55050.1250.716

: המתקבלת הכיול עקומת

בליעה אופטית מול כמות הלקטוז

370.0 - x4416.1 = y

R 23399.0 =

000.0001.0

002.0003.0004.0

005.0006.0

007.0008.0

0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

כמות הלקטוז )מ"ג\מ"ל(

A -

ה ע

ליב

הת

מוכ

. שלנו הכיול עקומת ע"פ הניסוי במבחנות הלקטוז כמות את לחשב נוכל כעת

: הניסוי למבחנות הקריאה תוצאותA =0.468 א במבחנה בליעהA =0.547 ב במבחנה בליעה

A=0.507 במבחנות הבליעה ממוצע

mg\mlהישר משוואת ע"פ הלקטוז כמות חישוב

החישוב דרך פירוט 20 פי הגבינה מי את מהלנו כי20 פי כפלנו

. מ"ל1- ל להגיע רוצים ואנו גבינה מי מ"ל0.1 לקחנו כי10 פי כפלנו

משקלי. אחוז לחשב מנת על מ"ל100ל להגיע כדי100 פי כפלנו

לגרמים. ממ"ג לעבור מנת על1000ל החילוק

ומסקנות: דיון.5% הינו הנתון הספרותי הערך , כאשר בחלב % שומן 7.18 של ערך קיבלנו

אפשריים: שגיאה מקורות לא מדויקות, מהילה לא הנמדדות החומרים הניסוי: כמויות מבחנות בהכנת שגיאה

מדויקת.

ולהשפיע הנמדדים החומרים של מוגבר לפירוק לגרום המדידה: עלול לפני יתר חימוםהתוצאות. על

2 ניסוי

כרומטוגרפיה באמצעות החלב סוכר של איכותית קביעה: הניסוי מטרת

עבודה: שיטת

בשיטת שימוש על מתבססתההלקטוז, את המרכיבים הסוכרים של איכותית קביעה זו בשיטה(;TLC) דק רובד יתיגרפובכרומט השתמשנו במעבדה כרומטוגרפיה. ה

חומר של דקה בשכבה המכוסה אלומיניום לוחית גבי על הכרומטוגרפיה את מבצעים החומרים: גלקטוז, לקטוז, את מניחים קפילרות יותר. בעזרת טובה באיכות סופח

אחרי גבינה ומי הידרוליזה ללא גבינה )מי לבדוק שברצוננו הדגימות ושתי גלוקוז את סוכרים, מעבירים להרצת הנעה, סולבנט הפאזה הרצת הידרוליזה(. לאחר

צבע. על כתמי להופעת עד וממתינים הצבע לפיתוח ריאגנט עם מיכל לתוך הפלטה לכך, את ובהשוואה הסמנים של הנדידה מרחקי את לקבוע ניתן אלו כתמים סמך

הנבדקות. הדגימות מרכיבי

חומצת תחילה הוספה הראשונה גבינה. למבחנה מי בהן מבחנות שתי הוכנו תחילהHClלשבירת שגרם דבר, חומצית הידרוליזה להתרחשות גרמה חימומה בעת אשר

חימום הלקטוז. לאחר את המרכיבים סוכרים החד שני ולקבלת הגליקוזידי הקשר סתירתל שימש אשרNaOH חזק בסיס , הוסף110ºC של גבוה בחום דקות60 למשך

עברה לא יהיהשנ זו, המבחנה מבחנה נוספים. לעומת קשרים שבירת ומנע החומצה החומצה, דבר הוספה לאחריו ורקNaOH הבסיס הוסף - תחילה חומצית הידרוליזה חימום כי לוודא מנת עלהתגובה. התרחשות ומניעת החומצה של סתירה שהבטיח ההרצה נתוני קריאת את ישנו לא התמיסות וטמפרטורת ההידרוליזה מבחנת

זהה. באופן חוממה זו מבחנה בכרומטוגרפיה, גם

: החומרים עבורR f ערכי של החישוב אופןהבאה: במשוואה נשתמש החומרים שלRf ערכי את לחשב מנת על

הניסוי: תוצאות

52mm- הנוזל חזיתRf=0.57 30mm – גלוקוז Rf=0.38 20mm – לקטוז

Rf=0.48 25mm – גלקטוז 21mm Rf=0.40 פורק(- שלא )לקטוז בקרה חומר26mm Rf=0.50 – נמדד חומר

ומסקנות: דיון הידרוליזה, עברה שלא המבחנה אכן כי להסיק שהתקבלו, ניתן התוצאות סמך על

סמן ריצת למרחק עד זו נבדקת תמיסה בריצת ביטוי לידי הבא דבר לקטוז הכילההלקטוז.

כלומר וגלקטוז גלוקוז בתוכה הכילה הידרוליזה שעברה זאת, התמיסה לעומת סוכרים החד שני וליצירת הסוכר בדו הקשרים לפירוק הביאה אכן ההידרוליזה וזאת אלו סוכרים חד שני בין מוחלטת חלוקה התקבלה אותו. אולם, לא המרכיבים

שני לנוכחות אינדיקציה לקבל ציפינו מלא. באופן התרחש לא הלקטוז ופירוק היות ע"י המסומנים בתחומים ארוכה מריחה בצורת הנמדד, שתתבטא בחומר הסוכרים

, בלבד גלקטוז לנוכחות אינדיקציה קיבלנו בפועל והגלקטוז, אולם הגלוקוז סמני לפני הסופי שהערבוב כך ע"י זאת להסביר הגלוקוז. ניתן סמן לכיוון זליגה ללא

יתכן כן גלקטוז. כמו בעיקר הכילה הנמדדת והתמיסה אחיד היה לא ההרצההמונוסכרידים. לשני וברורה אחידה הפרדה קיבלנו לא ולכן מושלם היה לא שהפירוק

ב'( קבוצה ע"י )בוצע שומנים ניסוי

: 3 ניסוי

.חלב בדגימת השומן אחוז של כמותית הקביע : הניסוי מטרת

: העבודה שיטת מנת עלUltraturax- ה מכשיר ב Folch ראגנט עם החלב את ערבבנו כל ראשית.1

הראגנט. עם המגע שטח את ולהגדיל ניומהש המבנה את לשבורבצנטרפוגה. לסירכוז המבחנות את הכנסנו.2 התחתונה )מי-גבינה( מהפאזה העליונה הפאזה הפרדתהסירכוז: לאחר התוצאה.3

.Folch ראגנט הוספת לאחר פעמיים בוצעו2,3 תהליכים )שומן(.. ביכנר משפך ע"י התחתונה הפאזה את נווסינ האביק את לנושק.4.הראגנט את במנדף פנוניד.5 נק' את מוריד כךוב מולק' המים עם מימן קשרי יוצר האתנול) אתנול נוהוספ.6

(.C מעלות50 לכ- שלהם הרתיחה.במנדף נידוף המשך.7

. האביק+השומן שקילת.8

לא התקבלו תוצאות לניתוח ולכן רק מהלך הניסוי הוצג לעיל..

: 4 ניסוי

כרומטוגרפית באמצעות בחלב השומן מרכיבי של איכותי זיהוי: הניסוי מטרתTLC

: עבודה שיטת לקבל מנת על Folch ראגנט הוספנו הקודם בניסוי נשקל אשר הממוצה לשומן.1

נוזלית. פאזהוטריגליצרין. כולסטרול, לציטין סמני שכללה כרומטוגרפיה הרצת.2.שנבדקו השומנים עבור Rf ערך חישוב.3

: השיטה עקרוןסוכרים(. בכרומטוגרפית פירוט ) ראו TLC כרומטוגרפית

הינם והסמנים הנבדק והחומר מאחר פולרי לא בממס השתמשנו זו בכרומטוגרפיהההידרופוביות. רמת ע"פי בינהם הפרדה ליצור ורצינו הידרופוביים

.*Rfה- ערכי עפ"י מתבצעת ואפיונם לסמנים שנבדקו השומנים בין ההשוואה

: תוצאות

: סמנים כרומטוגרפית – תוצאות 1 טבלה

Rfשם סמן

0.16כולסטרול0.04לציטין0.24-0.5דיםטריגליצרי

: השומנים דגימת - תוצאות 2 טבלה

מרחק נדידה ]ס"מ[מספר נקודה10.0

20.831.5-2

: R f חישוב *

0- 1 נקודה0.16 –2 נקודה0.4- 0.3 –3 נקודה

3ונק' כולסטרול 2 לציטין, נק' 1נק' תזוהה הסמנים שלRf לערכי השוואה עפ"יטריגליצרידים.

   

: 5 ניסוי

Bradford שיטת לפי הגבינה מי חלבון של כמותית קביעה: הניסוי מטרת

: העבודה שיטתמרוכזים. גבינה מי של10 פי מיהול.1במעבדה. שנתנו הנחיות עפ"י חומרים והוספת מבחנות7 הכנת.2גל באורך בספקטרופוטומטר וקריאהVortex בעזרת התמיסות ערבוב.3

nm 595.

: השיטה עקרון Bradford ראגנט בין המתרחשת ראקציה על תתמכסהמ שיטה הינה Bradford שיטת

( וצביעתו.זה מסוג בניסויים , המקובלBSA בסמן בחרנו שלנו )במקרה החלבון ובין הספקטרופוטומטר( על במכשיר בליעתו )מדידת נצבע לבוןהחש בעובדה השתמשנו

.ניסויב החלבון כמות את ודדלמ ומתוכה כיול עקומת ליצור מנת

.6-7 במבחנות הבליעה ממוצע את חישבנו

הכיול. עקומתמ שהתקבלה הישר הקו בנוסחת הצבנו להנ" הערך את

הבאה: הנוסחה פי על חושב הגבינה במי החלבון אחוז

100 * 10 * 20 ( * ק"ג )במ 7-6 כמות החלבון במבחנות 1000000

מ"ל1ל- מ"ל0.05מ- להגיע בכדי20 פי הכפלה 10 פי הגבינה מי את מהלנו כי10 פי הכפלהלאחוזים לעבור ע"מ100 פי הכפלהלגרם ק"גממ לעבור כדי במיליון חלוקה

הניסוי: מבחנות הכנת אופן בזאת מפורט

מיםמס.

מ"ל

BSA 20 מ"קג/מ"ל

מ"ל

) מהולים גבינה מי

1:10 ) *

מ"ל

ברדפורד ראגנט

מ"ל

11.2--0.3

20.90.3-0.3

30.60.6-0.3

40.30.9-0.3

5-1.2-0.3

61.15-0.050.3

71.15-0.050.3

לא התקבלו תוצאות לניתוח ולכן רק מהלך הניסוי הוצג לעיל.