РАЗРАБОТКА ТЕСТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ... · 2011-12-02 ·...
Transcript of РАЗРАБОТКА ТЕСТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ ... · 2011-12-02 ·...
РАЗРАБОТКА ТЕСТОВ ДЛЯ
ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ КАРБАПЕНЕМАЗ
ТИПОВ VIM, IMP, NDM, KPC, OXA-48
МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР
В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Савочкина Ю.А. 1 Сухорукова М.В. 2, Эйдельштейн М.В. 2,
Гущин А.Е. 1, Шипулин Г.А.1
1 ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора 2 НИИ антимикробной химиотерапии
Проблема резистентности, обусловленной
приобретенными карбапенемазами
Продукция приобретенных карбапенемаз –
– самый эффективный механизм резистентности
к карбапенемам
Данный механизм АБ-резистентности имеет особое
клиническое и эпидемиологическое значение
• Возможности терапии инфекций, вызванных карбапенем-
резистентными возбудителями, критически ограничены
• Опасность широкого распространения:
гены приобретенных карбапенемаз ассоциированы
с мобильными генетическими элементами,
некоторые выявлены у эпидемических клонов
Продуценты приобретенных карбапенемаз −
основные проблемные Грам(-) возбудители
Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumanii
Klebsiella pneumoniae
др. энтеробактерии
Резистентность к бета-лактамам,
включая карбапенемы
- сепсис;
- пневмония;
- ИМП;
- интраабдоминальные
инфекции;
- раневые инфекции
Виды приобретенных карбапенемаз
MBL - металло-β-лактамазы (мол.класс B): группы VIM (23 типа), IMP (26 типов), NDM-1,-2, продуценты - P.aeruginosa, K.pneumoniae, др. Enterobacteriaceae, Aсinetobacter baumannii
KPC (мол.класс А, 10 типов) продуценты – K.pneumoniae, др. Enterobacteriaceae
OXA (мол.класс D): - OXA-48-подобные – продуцент - K.pneumoniae; - OXA-23-like, -58, -40-like – Acinetobacter spp.
Некоторые другие типы карбапенемаз имеют локальное распространение
Цель данной работы:
Разработка тестов для выявления генов
карбапенемаз типов VIM, IMP, NDM, KPC и OXA-48
методом мультиплексной ПЦР в реальном времени
Тесты для выявления генов карбапенемаз методом мультиплексной ПЦР в реальном времени
VIM
IMP
ВК
NDM
1 ПЦР, используются
4 канала детекции
Тест MBL:
выявление генов карбапенемаз
типов VIM, IMP, NDM
Амплификатор
с системой
оптической детекции
ВК - внутренний контроль
Мультиплексные ПЦР-тесты
для выявления генов карбапенемаз
Тест MBL:
• VIM -группа
• IMP -группа
• NDM-1,2
• ВК (внутренний контроль)
Тест KPC / OXA-48:
• KPC -группа
• OXA-48 -like
• ВК
Результаты за 1,5-3 часа
Анализ различных образцов:
чистая культура; гемокультура;
клинический материал (при скрининге,
эпидемиологич. исследованиях)
Тест MBL: результаты анализа
контрольных штаммов и изолятов
• У всех штаммов-продуцентов
карбапенемаз типов VIM-1, -2, -4, -10,
IMP-1, -2, -12, -13 идентифицированы
соответствующие группы генов
(VIM и IMP)
• У всех продуцирующих VIM-2 изолятов
P. aeruginosa выявлен ген группы VIM
• Для всех MBL-отрицательных
по данным фенотипического теста
изолятов - отрицательный результат
ПЦР-теста
Цикл
5 10 15 20 25 30 35
Норм
. Ф
луоресц.
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Порог
Cycle
5 10 15 20 25 30 35
Норм
. Ф
луоресц.
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Порог
VIM
Cycle
5 10 15 20 25 30 35
Норм
. Ф
луоресц.
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Порог
IMP
NDM K+
Тест KPC/OXA-48: результаты анализа
контрольных штаммов и изолятов
• У штамма-продуцента KPC-3
выявлен ген группы KPC
• У штаммов-продуцентов OXA-48
выявлен ген группы OXA-48-like
• Отрицательный результат ПЦР –
для всех изолятов энтеробактерий,
у которых фенотипически отсутствует
продукция карбапенемаз (MHT-тест)
Cycle
5 10 15 20 25 30 35
Норм
. Ф
луоресц.
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Порог
OXA-48
Cycle
5 10 15 20 25 30 35
Норм
. Ф
луоресц.
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Порог
KPC
ПЦР-тесты MBL и KPC/OXA-48:
оценка специфичности
Специфичность подтверждают отрицательные
результаты ПЦР по всем группам генов
для всех изолятов, у которых отсутствуют
фенотипические признаки продукции карбапенемаз:
• изоляты K.pneumoniae (N=20), не продуцирующие
карбапенемазы по результатам Ходж-теста (MHT)
• карбапенем-чувствительные изоляты K. pneumoniae,
E. coli, P. aeruginosa (N=60)
Заключение
• Разработаны тесты для выявления генов
приобретенных карбапенемаз групп VIM, IMP, NDM,
KPC и OXA-48 методом мультиплексной ПЦР
в режиме реального времени
• Данные ПЦР-тесты могут служить эффективным
инструментом для выявления штаммов,
обладающих АБ-резистентностью, обусловленной
приобретенными карбапенемазами