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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA – EEL/USP
CARINA MANTOVANI DA SILVA
DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO N-OCTANOL/ÁGUA DO
DEFENSIVO AGRÍCOLA IMAZETHAPYR UTILIZANDO O MÉTODO DO
FRASCO AGITADO, E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA
EMPREGADA.
Declaro que esta monografia foi revisada e encontra-se apta
para avaliação e apresentação perante a banca avaliadora
Data: ___/ ___/ 2014
_________________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
Lorena - SP
2014
CARINA MANTOVANI DA SILVA
Determinação do coeficiente de partição n-octanol/água do defensivo
agrícola Imazethapyr utilizando o método do frasco agitado, e validação da
metodologia analítica empregada.
Monografia apresentada à Escola de
Engenharia de Lorena da Universidade de
São Paulo como requisito parcial para
obtenção do título de Engenheira
Industrial Química.
Área de Concentração: Qualidade e Tecnologia Química Orientador: Prof. Dr. João Paulo Alves Silva
Lorena - SP 2014
DEDICATÓRIA
Dedico este Trabalho de Conclusão de Curso aos meus pais, Regina Célia
Mantovani da Silva e Claudinei Mariano da Silva que sempre me incentivaram aos
estudos e me ensinaram os verdadeiros valores da vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me dar forças para continuar, conciliando o trabalho com a
graduação. Às pessoas que nessa trajetória apareceram como anjos na minha
vida.
À empresa BASF S.A. que me concedeu a oportunidade de explorar o conteúdo
escolhido para apresentação deste trabalho de conclusão de curso e aos colegas
de empresa que me ajudaram, especialmente o gerente do Laboratório de
Estudos Físico-Químicos Luis Fernando P. Campos.
Ao Professor Dr. João Paulo Alves Silva que me auxiliou com sugestões sempre
construtivas durante o desenvolvimento deste trabalho e, mesmo com muitos
compromissos, possibilitou que todos os prazos fossem cumpridos.
Aos Professores que aceitaram fazer parte da banca avaliadora, Dra. Maria da
Rosa Capri, Dra. Tatiane da Franca Silva e Dr. Ângelo Capri Neto.
“Não há nada que seja maior evidência da insanidade do que fazer a mesma
coisa dia após dia e esperar resultados diferentes.”
Albert Einstein
RESUMO
SILVA, C. M. Determinação do Coeficiente de Partição n-octanol/água do
defensivo agrícola Imazethapyr utilizando o método do frasco agitado, e
validação da metodologia analítica empregada. 2014. f 77. Monografia –
Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.
A busca por maior produtividade no setor do agronegócio tem impulsionado
empresas a investirem em pesquisa e desenvolvimento de moléculas e
formulações de defensivos agrícolas. O Imazethapyr, um dos primeiros herbicidas
da família das Imidazolinonas a ser descoberto, é amplamente utilizado devido à
sua versatilidade em diversas pragas e tolerância a algumas culturas. A empresa
que deseja desenvolver uma nova molécula, uma nova rota de síntese ou
simplesmente contratar outra empresa para sintetizar a molécula do defensivo
agrícola já conhecida deve se responsabilizar por um estudo detalhado das
propriedades dessa molécula e apresentá-lo às autoridades competentes do país.
Isso deve ser feito para que a venda do produto seja autorizada. Uma das
análises físico-químicas necessárias é a determinação do coeficiente de partição
n-octanol/água. O conhecimento dessa propriedade nos permite avaliar o efeito
do potencial de bioacumulação da molécula orgânica em peixes. Este trabalho
apresenta o estudo experimental do coeficiente de partição n-octanol/água do
Imazethapyr utilizando-se o método do frasco agitado e validação da metodologia
analítica empregada com a finalidade de obter o registro no Brasil para uma nova
fonte da molécula. A análise do coeficiente de partição n-octanol/água foi feita
utilizando-se como fase aquosa solução tampão pH 7 e água destilada. A
validação do método analítico consistiu na avaliação dos parâmetros de
seletividade, linearidade, repetitividade, recuperação e estabilidade. Com base
nos resultados obtidos comprovou-se que os resultados do coeficiente de partição
n-octanol/água são coerentes com o que o software ADC/Labs 6.0 havia previsto
para a molécula. Na etapa da validação comprovou-se que o método analítico é
adequado para quantificar o Imazethapyr presente nas soluções saturadas de n-
octanol com fase aquosa e vice-versa.
Palavras-chave: Coeficiente de Partição n-Octanol/Água. Imazethapyr. Método do
Frasco Agitado. Validação de Método Analítico.
ABSTRACT
SILVA, C. M. n-Octanol/water Partition Coefficient determination of the
pesticide Imazethapyr by the shake flask method, and validation of the
analytical method used. 2014. f 77. Monograph Course Conclusion – Escola de
Engenharia de Lorena, University of São Paulo, Lorena, 2014.
The desire for more productivity in the agribusiness sector has been influenced
companies to invest in the search and development of molecules and formulations
of agrochemical defensives. The Imazethapyr, one of the first Imidazolinones
family herbicides discovered, is widely used due to its versatility in several pests
and tolerance to some cultures. The company that wants to develop a new
molecule, new synthesis route or simply transfer the production of the known
agrochemical defensive to another company should be responsible for a detailed
study about the properties of the molecule and show it to the competent
authorities. This should be done to get the authorization to sell the product. One of
the necessary physical chemical analyses is the determination of the n-
octanol/water partition coefficient. The knowledge of this property is useful to
evaluate the potential of bioaccumulation of the organic molecule in fishes. This
work shows an experimental study of partition coefficient of Imazethapyr using the
shake flask method and the validation of the analytical method used with the
objective of registering a new source of the molecule in Brazil. The partition
coefficient analysis was done using the aqueous phase as buffer solution pH 7
and distilled water. The validation of the analytical method consisted on the
evaluation of the selectivity, linearity, repeatability, recovery and stability. Based
on the obtained results it was proved that the partition coefficient results are
consistent to what the Software ACD/Labs 6.0 was predicted. According to the
validation, the analytical method is appropriate to quantify the Imazethapyr in the
solutions saturated with aqueous phase and vice-versa.
Keywords: n-Octanol/Water Partition Coefficient. Imazethapyr. Shake Flask
Method. Analytical Method Validation.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Ilustração 1 - Estrutura química do Imazethapyr .................................................. 17
Ilustração 2 - Etapa de saturação do n-octanol com fase aquosa ........................ 26
Ilustração 3 - Etapa de saturação da fase aquosa com n-octanol ........................ 26
Ilustração 4 – Fluxograma da fase experimental compreendendo as etapas de
validação do método analítico até a etapa de determinação do coeficiente de
partição n-octanol/água ....................................................................................... 29
Ilustração 5 - Etapas para determinação do coeficiente de partição n-octanol/água
do material de estudo .......................................................................................... 31
Ilustração 6 – Cromatograma representativo do padrão de referência ................. 32
Ilustração 7 – Cromatogramas da (a) fase móvel; (b) n-octanol; (c) água destilada;
(d) solução tampão pH 7 ...................................................................................... 33
Ilustração 8 – Curva de calibração para verificação da linearidade ...................... 35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Usos registrados de Imidazolinonas nos Estados Unidos (conclusão)18
Tabela 2 – Massas pesadas e os volumes utilizados no preparo dos padrões para
a verificação da linearidade ................................................................................. 34
Tabela 3 – Resultados das Curvas de Calibração injetadas em dias diferentes .. 36
Tabela 4 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções
para verificação da repetitividade em solução tampão pH 7 ................................ 37
Tabela 5 – Avaliação da repetitividade na análise das amostras preparadas em
solução tampão pH 7 saturado com n-octanol ..................................................... 38
Tabela 6 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em
solução de n-octanol saturado com solução tampão pH 7. .................................. 39
Tabela 7 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em
solução de n-octanol saturado com tampão pH 7, após a exclusão da amostra
RP-08A. ............................................................................................................... 40
Tabela 8 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções
para verificação da repetitividade em água destilada (continua) .......................... 41
Tabela 8 - Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções
para verificação da repetitividade em água destilada (conclusão)........................ 42
Tabela 9 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em
água destilada saturada com n-octanol................................................................ 42
Tabela 10 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas
em água destilada saturada com n-octanol após exclusão de RP-15A ................ 43
Tabela 11 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas
em n-octanol saturado com água destilada (continua) ............................. 43
Tabela 11 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas
em n-octanol saturado com água destilada (conclusão) .................................... 44
Tabela 12 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções
para verificação da recuperação em solução tampão pH 7 .................................. 45
Tabela 13 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em
solução tampão pH 7 saturada com n-octanol ..................................................... 46
Tabela 14 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em n-
octanol saturado com solução tampão pH 7 ........................................................ 46
Tabela 15– Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções
para verificação da recuperação em água destilada ............................................ 47
Tabela 16 – Resultados da avaliação da recuperação do analito com amostras
preparadas em água destilada saturada com n-octanol ....................................... 47
Tabela 17 – Resultados da avaliação da recuperação do analito com amostras
preparadas em n-octanol saturado com água destilada ....................................... 48
Tabela 18 – Avaliação das curvas de calibração com três pontos injetadas no
início e fim da fase experimental .......................................................................... 49
Tabela 19 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução
estoque do material de estudo com solução tampão pH 7 ................................... 50
Tabela 20 – Preparo das misturas das soluções usadas na determinação do
coeficiente de partição com solução tampão pH 7 ............................................... 50
Tabela 21 – Separação das partições, diluição e concentração para solução
tampão pH 7 ........................................................................................................ 51
Tabela 22 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em
Solução Tampão pH 7 ......................................................................................... 52
Tabela 23 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução
estoque do material de estudo com água destilada ............................................. 53
Tabela 24 – Preparo das misturas de soluções usadas na determinação do
coeficiente de partição com água destilada ......................................................... 53
Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água
destilada (continua).............................................................................................. 53
Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água
destilada (conclusão) ........................................................................................... 54
Tabela 26 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Água
Destilada (continua) ............................................................................................. 54
Tabela 26 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Água
Destilada (conclusão) .......................................................................................... 55
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 13
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 15
3. OBJETIVOS .................................................................................................. 15
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 16
4.1 Imidazolinonas ........................................................................................ 16
4.2 Registro de Defensivos Agrícolas ........................................................... 18
4.3 Coeficiente de Partição ........................................................................... 19
4.3.1 Método do Frasco Agitado para Determinação do Coeficiente de
Partição (n-octanol/água) .............................................................................. 21
4.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ................................................ 21
4.5 Validação de Método Analítico ................................................................ 22
5. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 24
5.1 Materiais ................................................................................................. 24
5.1.1 Material de estudo ............................................................................ 24
5.1.2 Padrão de referência ........................................................................ 24
5.1.3 Reagentes ........................................................................................ 24
5.2 Validação do método de quantificação .................................................... 25
5.3 Determinação do coeficiente de partição n-octanol/água ........................ 30
5.3.1 Cálculo Estimativo do Coeficiente de Partição n-octanol/água ......... 30
5.3.2 Método do frasco agitado ................................................................. 30
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................. 32
6.1 Seletividade ............................................................................................ 32
6.2 Linearidade ............................................................................................. 34
6.3 Repetitividade ......................................................................................... 36
6.4 Recuperação .......................................................................................... 44
6.5 Estabilidade ............................................................................................ 48
6.6 Estudo do Coeficiente de Partição .......................................................... 50
7. CONCLUSÃO................................................................................................ 56
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 58
APÊNDICES ........................................................................................................ 60
ANEXOS .............................................................................................................. 66
13
1. INTRODUÇÃO
Atualmente uma das tendências que sustentam o setor de pesquisa e
desenvolvimento de grandes empresas relacionadas ao agronegócio diz respeito
à manutenção do fornecimento de alimentos diante do crescimento da população
mundial. Com o crescimento da demanda o desafio dos próximos anos será
garantir alimentos nutritivos, com qualidade e que sejam economicamente viáveis
para a produção. O desafio se torna ainda maior diante das rápidas mudanças
climáticas vivenciadas nos últimos anos.
Neste contexto os defensivos agrícolas tem um papel essencial e, por isso,
muitas empresas têm investido fortemente em pesquisas de novas tecnologias
que possam garantir alta produtividade e proteção às pragas de uma forma
sustentável. Desenvolver produtos a base de água ao invés de solventes
orgânicos e produtos mais concentrados são algumas das alternativas que
carregam os conceitos da chamada Green Chemistry. Produtos a base de água
são de um modo geral menos agressivos ao meio ambiente que produtos que
utilizam outros solventes, e produtos mais concentrados utilizam menor volume de
água tanto na sua composição quanto na sua aplicação no campo.
A empresa de defensivo agrícola que deseja desenvolver uma nova
molécula, uma nova rota de síntese ou simplesmente contratar outra empresa
para sintetizar a molécula já conhecida, deve se responsabilizar por um estudo
detalhado das propriedades dessa molécula e apresentá-lo às autoridades
competentes do país para que a venda do produto de interesse seja autorizada.
Embora uma molécula seja conhecida, alterações no processo de síntese podem
acarretar no surgimento de substâncias nocivas ao equilíbrio do meio ambiente.
O estudo do coeficiente de partição n-octanol/água é uma das análises que
pode indicar o potencial de bioacumulação de uma molécula orgânica em
organismos aquáticos e, portanto, de grande interesse. O valor do coeficiente de
partição, POW, é uma medida da lipofilicidade de um composto. Quanto mais
lipofílico, maior a tendência de o composto migrar para o tecido adiposo.
Publicações têm divulgado diversos estudos relacionando o coeficiente de
partição com outras propriedades físicas, químicas e biológicas de compostos.
Isso se deve ao fato de o valor de POW estar relacionado com a interação dos
compostos no meio, quanto à absorção e transporte (SILVA e FERREIRA, 2003).
14
O coeficiente de partição n-octanol/água é definido como a relação entre a
concentração do material de estudo na fase orgânica e na fase aquosa. Portanto,
quanto maior o valor de POW da substância, mais lipofílica ela é e maior a
probabilidade de aumento da sua concentração na fase orgânica. A presença de
substâncias com alto valor de POW no meio aquático pode fazer com que os
peixes se contaminem de alguma forma. Se essas substâncias não forem
metabolizadas podem se acumular no tecido adiposo e serem transferidas ao
longo da cadeia alimentar.
A proposta deste trabalho é apresentar o estudo do coeficiente de partição
n-octanol/água do ingrediente ativo Imazethapyr utilizando-se o método do frasco
agitado. Os resultados da análise serão um complemento ao estudo de Cinco
Bateladas (determinação do perfil quantitativo e qualitativo de cinco lotes do
produto em teste) que a empresa deve apresentar às autoridades competentes do
país para obter o registro no Brasil de uma nova planta produtiva localizada nos
Estados Unidos.
Via de regra, a fase orgânica utilizada no estudo de coeficiente de partição
é caracterizada pelo uso do n-octanol como solvente. Neste trabalho a fase
aquosa será caracterizada pelo uso de água destilada e solução tampão pH 7. A
quantificação do material de estudo em cada uma das fases será realizada pela
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa.
As condições cromatográficas utilizadas na quantificação serão validadas
conforme previsto pelo guia internacional SANCO 3030 que inclui a avaliação da
seletividade, linearidade, repetitividade e recuperação para o material de estudo,
o qual se enquadra na classe de produto técnico. Quando as informações sobre
os parâmetros de validação especificados no guia SANCO 3030 não forem
aplicáveis, será utilizada como referência a norma Brasileira para validação de
métodos analíticos ABNT NBR 14029.
As normas de validação citadas atendem aos requisitos estabelecidos nos
países onde atuam. A SANCO 3030 é uma norma europeia, aceita em diversos
países. Essa norma será utilizada como guia preferencial uma vez que o trabalho
foi conduzido por solicitação da sede da empresa na Alemanha.
15
2. JUSTIFICATIVA
A nova planta produtiva para síntese da molécula de Imazethapyr,
localizada nos Estados Unidos, ainda não possui registro no Brasil. Por isso é
necessário que um dos cinco lotes utilizados na determinação do perfil
quantitativo e qualitativo da substância seja utilizado nas análises de
caracterização físico-química da molécula.
Uma dessas análises é a determinação do coeficiente de partição n-
octanol/água. O método analítico de quantificação será validado para verificar sua
aplicabilidade à matriz utilizada na determinação do coeficiente de partição n-
octanol/água.
Além disso, o tema do trabalho foi escolhido para alinhar interesses
acadêmicos com o trabalho desenvolvido na indústria e dessa forma compartilhar
conhecimentos que podem contribuir para estudos ambientais e utilização de
técnicas dentro da área de analítica instrumental.
3. OBJETIVOS
Geral: Determinar o coeficiente de partição n-octanol/água em água
destilada e solução tampão pH 7 utilizando um método confiável para
quantificação analítica.
Específicos: Para atingir o objetivo geral, os objetivos específicos listados
abaixo são apresentados.
Validação do método analítico utilizando cromatógrafo líquido de alta
eficiência (HPLC) avaliando-se os parâmetros de seletividade, linearidade,
estabilidade, repetitividade e recuperação.
Comparar os resultados obtidos de coeficiente de partição n-octanol água
com o resultado previsto pelo modelo matemático e valores já obtidos para a
mesma molécula em outros laboratórios.
16
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Imidazolinonas
As Imidazolinonas compreendem uma família de seis compostos orgânicos
sintéticos os quais apresentam ação herbicida, e foram descobertos e
desenvolvidos pela American Cyanamid Corporation. Estes herbicidas são
amplamente utilizados, pois são pré e pós-emergenciais, possuem alta atividade
em pequenas doses e amplo espectro de atuação (KRÄMER e SCHIRMER, 2007,
p. 82). Os herbicidas pré-emergenciais têm o objetivo de prevenir de ervas
invasoras o local onde foi aplicado enquanto que os herbicidas pós-emergenciais
têm ação seletiva e é aplicado após o aparecimento das ervas invasoras atuando
somente sobre elas, sem prejudicar o desenvolvimento da cultura (MONTEIRO,
2001).
Devido às características desejáveis dessa classe de herbicidas, as
Imidazolinonas seletivas a algumas culturas começaram a ser desenvolvidas no
início da década de 1980. Hoje em dia produtos que contenham esses compostos
em suas formulações são denominados ClearfieldTM. A ação das Imidazolinonas é
caracterizada pela rápida interrupção do crescimento seguido da morte total da
planta até no máximo três semanas após a aplicação do herbicida (KRÄMER e
SCHIRMER, 2007, p. 82).
Os efeitos herbicidas das Imidazolinonas é atribuído à inibição da enzima
acetolactato sintase (ALS) ou acetohidroxiacido sintase (AHAS) o que
consequentemente inibe a síntese dos aminoácidos ramificados leucina,
isoleucina e valina. A enzima ALS não ocorre nos animais, assim a toxicidade
desses herbicidas se torna específica para plantas (CONSTANTIN, INOUE e
OLIVEIRA JR., 2011, p. 141).
O Imazethapyr é uma Imidazolinona que pode ser encontrada em
formulações do tipo concentrado solúvel. A molécula foi reportada por T. Malefyt e
apresentado em 1989 pela American Cyanamid Corporation (atual BASF SE),
sendo o primeiro registro conquistado para soja. O seu uso é aplicado no controle
de muitas das principais gramíneas anuais e perenes e ervas daninha de folhas
largas. Quando aplicado diretamente, o Imazethapyr não apresenta fitoxicidade a
grãos de soja e outras culturas leguminosas (HAMPSHIRE, 2011).
17
A estrutura química do Imazethapyr é mostrada na ilustração 1.
Ilustração 1 - Estrutura química do Imazethapyr
Fonte: BRITISCH CROP PROTECTION COUNCIL, 2011.
A Tabela 1 apresenta o tipo de aplicação e os usos que são registrados
nos Estados Unidos para as Imizadolinonas. Como se pode observar, as
Imidazolinonas é utilizada em uma grande variedade de culturas.
Tabela 1 – Usos registrados de Imidazolinonas nos Estados Unidos (continua)
Imidazolinona Aplicação Cultura Cultura resistente a Imidazolinona
Imazamethabenz methyl
Foliar Cevada, trigo, girassol
Imazethapyr Foliar e solo Feijão, ervilha, soja, lentilha, alfalfa, amendoim, trevo, cornichão, coroa ervilhaca, tremoço, switchgrass, wheatgrass, little bluestem, orchardgrass, wheatgrass ocidental, big bluestem, canarygrass
Milho, arroz, canola
Imazamox Foliar Soja, chicória, ervilha, feijão, alfafa, trevo
Canola, trigo, girassol
Imazapyr Foliar e solo Áreas florestais, áreas úmidas, áreas noncrop, roadsides, bahiagrass, bermudagrass
Milho
18
Tabela 1 – Usos registrados de Imidazolinonas nos Estados Unidos (conclusão)
Imidazolinona Aplicação Cultura Cultura resistente a Imidazolinona
Imazaquin Foliar e solo Soja, íuca, hosta, bermudagrass, centipedegrass, mono grass, pachysandra, St. Augustinegrass, zoysiagrass, liriope, crape myrtle, gardênia, Indian hawthorn, wax-myrtle, dwarf yaupon, Holly, Fraser photinia, Pfitzer juniper
Imazapic Foliar e solo Amendoim, cana de açúcar, pastagens, rangeland, ornamental turf, ditch banks, conservation reserve program land, áreas noncrop
Fonte: KRÄMER e SCHIRMER, 2007.
4.2 Registro de Defensivos Agrícolas
Ao se tratar de produtos com ação herbicida, fungicida ou inseticida se faz
necessário seguir as diretrizes determinadas pelos órgãos federais competentes
para que o defensivo seja registrado no país e finalmente destinado ao uso
agrícola. No Brasil os órgãos competentes são: ANVISA (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária), MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento)
e IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis). O processo de registro envolve a avaliação de um dossiê do produto
contendo documentações legais.
O composto químico ativo é o principal constituinte da formulação do
produto comercial, e que irá exercer o controle das pragas. Portanto, é necessário
conhecer suas características toxicológicas, ecotoxicológicas e de eficácia
agronômica. O estudo de Cinco Bateladas é um dos requisitos exigidos para
registro da molécula orgânica. O estudo deve contemplar uma varredura analítica
que identifique e quantifique todas as impurezas provenientes do processo de
19
síntese. Conforme previsto no Manual de Procedimento para Registro de
Agrotóxico (2012), além do estudo de cinco bateladas, são exigidas
determinações de propriedades físico-químicas tais como: pressão de vapor;
ponto de fusão e ebulição; solubilidade em água; coeficiente de partição n-
octanol/água; hdrólise.
No Brasil, o estudo de cinco bateladas e as propriedades físico-químicas
descritas acima também são exigidas para novas fontes de síntese que irão
exportar o produto técnico para o país. Qualquer metodologia utilizada deve ser
validada e as análises devem ser realizadas por laboratórios que seguem os
Princípios das Boas Práticas de Laboratório, conforme estabelecido pela norma
do INMETRO NIT-DICLA-035 (2011).
Os objetivos de estudos que seguem as Boas Práticas de Laboratório é
garantir dados confiáveis, padronizar procedimentos, racionalizar o trabalho e
eliminar erros operacionais. As vantagens de se trabalhar com a norma é a
aceitação mundial dos dados gerados no estudo, rapidez no acesso às
informações, melhoria na qualidade dos resultados e aperfeiçoamento dos
procedimentos do trabalho.
4.3 Coeficiente de Partição
Desde tempos remotos a distribuição de um soluto entre duas fases nas
quais é solúvel é objeto de estudo e experimentação para isolar produtos naturais
como, por exemplo, essência de flores. Os primeiros estudos sobre o assunto,
que permitiram que se chegasse a uma teoria com capacidade preditiva, foram
realizados por Berthelot e Jungfleisch, os quais mediram com precisão as
quantidades de I2 e Br2 presentes no equilíbrio quando distribuídos entre CS2 e
água.
A razão entre duas concentrações de soluto distribuídas em dois solventes
imiscíveis entre si foi denominada de coeficiente de partição e em 1891 Nernst
reforçou o fato de que para o coeficiente de partição ser constante, somente uma
espécie molecular deveria estar presente nas duas fases. Partindo dessa
premissa, a partição poderia ser tratada como um processo de equilíbrio, ou seja,
um modelo clássico termodinâmico, no qual a tendência de uma única espécie
20
molecular de soluto migrar de um solvente para outro seria uma medida de sua
atividade naquele solvente (ELKINS, HANSCH e LEO, 1971).
Normalmente a partição para fases orgânicas é quantificada pela medição
da partição para o n-octanol, pois é um solvente que pode ser encontrado com
elevado grau de pureza e possui propriedades similares aos constituintes dos
lipídios. Além do estudo da partição para fases orgânicas, a partição de
substâncias orgânicas para outras fases como ar e água também é de bastante
interesse.
A razão de concentrações de uma substância orgânica nas diferentes
fases nos leva a diferentes propriedades físico-químicas, sendo o coeficiente de
partição n-octanol/água (POW), coeficiente de partição ar/água (PAW) e coeficiente
de partição n-octanol/ar (POA). As medições dos diferentes coeficientes de
partição são mais precisas em condições de diluição, onde as atividades dos
coeficientes nos três diferentes meios são relativamente constantes. O coeficiente
de partição n-octanol/água é frequentemente designado como Pow e os
resultados experimentais são expressos como logaritmo na base 10 (BOETHLING
e MACKAY, 2000).
O coeficiente de partição n-octanol/água é um importante parâmetro para o
estudo sobre o destino de substâncias químicas no meio ambiente. Tem-se o
conhecimento de que existe uma relação significativa entre o valor de POW de
substâncias e sua bioacumulação em peixes. Do mesmo modo, o valor de POW
tem-se se mostrado um parâmetro útil na predição de absorção de substâncias
nos solos e sedimentos e no estabelecimento quantitativo de atividade de
estruturas e sua relação com um grande número de efeitos biológicos (OECD
117, 1989).
Os valores de POW podem ser determinados experimentalmente conforme
duas metodologias internacionais previstas pela Organisation for Economic Co-
operation and Development. Porém, antes de se escolher qual técnica utilizar, é
necessário obter uma estimativa preliminar do valor de POW através de
modelagem matemática ou, quando apropriado, utilizando a razão da solubilidade
da substância nos solventes puros. No Anexo A, há uma explicação sucinta sobre
os métodos estimativos de cálculo. Além disso, outras informações como fórmula
estrutural, constante de dissociação, hidrólise e tensão superficial da substância
podem ser úteis no desenvolvimento do estudo.
21
Para valores de POW estimados entre -2 e -4, deve-se seguir o método do
frasco agitado. Para valores de POW estimados entre 0 e 6, deve-se seguir o
método por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) (OECD 107,
1995).
4.3.1 Método do Frasco Agitado para Determinação do Coeficiente de
Partição (n-octanol/água)
Segundo OECD 107 (1995), para determinar o coeficiente partição de uma
substância, todos os componentes do sistema devem entrar em equilíbrio e,
então, a concentração da substância em cada uma das fases é determinada
utilizando-se uma técnica de quantificação apropriada. Para se obter as alíquotas
a serem analisadas, inicialmente os solventes n-octanol e água são mutuamente
saturados. Uma solução estoque da substância em n-octanol saturado com água
é preparada. A concentração da substância no solvente não deve exceder 0,01
mol/L.
Diferentes partições da solução estoque da substância com a solução de
água saturada com n-octanol são misturadas até atingirem o equilíbrio. As fases
são separadas em uma centrífuga e as alíquotas são analisadas.
4.4 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
O termo cromatografia é utilizado para designar um conjunto de métodos
de separação onde os componentes de uma mistura são distribuídos entre duas
fases: uma estacionária (sólida ou líquida, aderente a um suporte poroso) e outra
fase móvel (fluido). Os componentes são arrastados pela fase móvel e são
separados devido às diferentes interações com a fase estacionária (POMBEIRO,
2003).
A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) é
caracterizada pela fase móvel líquida ser forçada através de tubos sob pressão ou
por gravidade, arrastando até a fase estacionária os componentes que se deseja
separar. A fase estacionária é constituída de sólido inerte finamente dividido e que
apresentam algum tipo de interação física com os compostos químicos que se
22
deseja separar, estes sólidos são confinados em uma coluna, na qual a fase
móvel escoa.
A partir da eluição dos componentes pela coluna recheada, os solutos que
tiverem mais afinidade com a fase estacionária serão retidos na coluna por um
tempo maior do que aqueles que têm mais afinidade com a fase móvel, ou seja, o
tempo de retenção do primeiro será maior do que o tempo de retenção do
segundo. Ao final da coluna é conectado um detector que registrará o sinal do
soluto em função do tempo de eluição. A partir dessas informações, um gráfico
constituído de uma série de picos, chamado de cromatograma, é construído e a
integração de sua área permite calcular a concentração dos componentes da
amostra (CROUCH et. al., 2006).
Podemos dividir os métodos de cromatografia líquida de alta eficiência em
dois grupos: métodos de fase reversa e métodos de fase normal. A diferença se
encontra na polaridade das fases móvel e estacionária. Nos métodos de fase
reversa a fase móvel apresenta uma polaridade maior que a da fase estacionária,
enquanto no método de fase normal a polarização das fases está ao contrário.
Existem muitas vantagens em utilizar os métodos de fase reversa como
uso de solventes menos tóxicos e de baixo custo, rápido alcance de equilíbrio da
coluna ao trocar a fase móvel, variedade de fase estacionária, são aplicáveis a
solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas
(EDIVAN et. al., 2002). Estes argumentos justificam o amplo uso da técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa para quantificação de
diferentes moléculas de defensivos agrícolas.
4.5 Validação de Método Analítico
Métodos validados são necessários para identificação e quantificação de
ingrediente ativo em produtos técnicos e produtos formulados. O desenvolvimento
e a validação de um método devem incluir uma descrição completa dos
equipamentos, materiais e condições utilizadas e deve seguir as normas de Boas
Práticas de Laboratório quando o material de estudo for um defensivo agrícola,
por exemplo.
23
A validação é exigida a menos que o método já for validado por um estudo
colaborativo. Por exemplo, a validação não é necessária para métodos CIPAC –
Collaborative International Pesticides Analytical Council (SANCO 3030, 2000).
Os parâmetros a serem seguidos em uma validação são especificados em
normas técnicas. De acordo com a SANCO 3030, a validação de um método
aplicado ao produto técnico deve incluir a avaliação da seletividade, linearidade,
precisão (repetitividade) e recuperação.
A seletividade tem como objetivo avaliar a possível interferência de outros
constituintes da matriz da amostra no analito de interesse. A linearidade mostra
se o método analítico é capaz de produzir resultados que sejam diretamente
proporcionais à concentração do analito em uma faixa determinada de
concentração. A repetitividade avalia a dispersão dos resultados de ensaios
independentes repetidos para uma mesma amostra. Por último, a recuperação é a
relação entre a quantidade do componente de interesse analisado e a quantidade
teórica na amostra (NBR 14029, 2005).
Conforme SANCO 3030, para cada parâmetro existe um critério de
aceitação para os cálculos estatísticos resultantes do estudo de validação. Na
seletividade os interferentes provenientes de impurezas não podem contribuir
mais do que 3 % da área total do pico de interesse. Na linearidade, uma curva de
calibração, com no mínimo 5 pontos, deve ser construída e a determinação deve
ser em duplicata. A equação da reta deve ser demonstrada e o coeficiente de
correlação deve ser maior que 0,99. A repetitividade deve incluir, no mínimo,
cinco determinações da amostra sendo que o limite do coeficiente de variação
dos resultados deve ser calculado a partir da equação modificada de Horwitz. A
porcentagem de recuperação deve ser calculada e estar dentro dos limites
especificados.
24
5. MATERIAIS E MÉTODOS
Os ensaios experimentais foram desenvolvidos no Laboratório de Estudos
Físico-Químicos da empresa BASF S.A. na cidade de Guaratinguetá/SP.
5.1 Materiais
Os materiais utilizados na fase experimental incluem o material de estudo,
o padrão de referência e reagentes descritos a seguir.
5.1.1 Material de estudo
O composto analisado neste trabalho foi o defensivo agrícola Imazethapyr
((RS)-5-ethyl-2-(4-isopropyl-4-methyl-5-oxo-2-imidazolin-2-yl) nicotinic acid). O
lote utilizado foi selecionado em um estudo de Five Batch do produto técnico
Imazethapyr, o qual foi sintetizado em uma planta produtiva dos Estados Unidos
com pureza certificada de 99,30 %.
5.1.2 Padrão de referência
Para a quantificação das alíquotas provenientes do método do frasco
agitado, foi utilizado como substância padrão de referência o Imazethapyr
fornecido pela empresa BASF SE, certificado com teor de 98,80 %.
5.1.3 Reagentes
Água grau 1
Água destilada, marca Tec-Lab
Ácido fosfórico 85 %, marca Macron
Ácido octanossulfônico, marca J.T. Baker
Acetonitrila grau HPLC, marca J.T. Baker
2-Propanol grau HPLC, marca J.T. Baker
Hidróxido de Sódio pastilhas P.A., marca Qhemis
n-Octanol, marca Merck
25
5.2 Validação do método de quantificação
A quantificação do ingrediente ativo Imazethapyr é prevista por um método
interno da empresa. Tal método é validado para quantificar a pureza de produto
técnico. Porém, para investigar a concentração da molécula em cada uma das
partições de n-octanol e fase aquosa, ou seja, em uma nova matriz, foi necessário
realizar algumas adequações ao método existente, consequentemente foi
necessário validar as alterações realizadas. A mudança mais expressiva no
método foi a retirada do padrão interno o que acarretou numa diminuição do
tempo de corrida da análise. No método original cada injeção tinha a duração de
30 minutos.
A validação foi feita em um cromatógrafo líquido (HPLC) com detector de
arranjo de diodos (Agilent Technologies, modelo 1200) e coluna Partisil 5 ODS-3,
com dimensões de 100 mm x 4,6 mm x 5 μm (Whatman). As condições de fluxo,
volume de injeção, comprimento de onda, temperatura e tempo de corrida foram
programadas no software do equipamento (ChemStation) como 1,5 mL/min,
10 μL, 254 nm, 40 °C e 10 minutos, respectivamente. A eluição foi feita com uma
fase móvel composta pela proporção de 2/18/5/2/73 % v/v de
2-propanol/acetonitrila/ácido fosfórico 1mol/L/ácido octanossulfônico
0,23 mol/L/água grau 1 com pH ajustado para 2,1 com solução de hidróxido de
sódio 50 % m/m utilizando um medidor de pH (Metrohm, modelo 827 pHLab).
Os solventes n-octanol (fase orgânica) e solução tampão pH 7 ou água
destilada (fase aquosa), utilizados no preparo das soluções do material de estudo
foram previamente saturados um no outro, conforme mostrado no fluxograma das
Ilustraçãos 2 e 3. As misturas foram agitadas durante 24 horas à temperatura de
20 ± 1 °C em uma câmara climática (Tecnal, modelo TE-422). Após o período de
agitação, as fases em maior quantidade foram separadas com um funil de
separação para serem utilizadas no preparo das soluções do material de estudo.
A pesagem do material de estudo foi feita em balança analítica com precisão
de 0,01 mg (Mettler Toledo, modelo XS 205 DU) e a dissolução do Imazethapyr
nos solventes saturados foi facilitada com o uso de um banho de ultrassom
(Branson, modelo B1510).
26
Ilustração 2 - Etapa de saturação do n-octanol com fase aquosa
Fonte: Do autor
Ilustração 3 - Etapa de saturação da fase aquosa com n-octanol
Fonte: Do autor
Os resultados obtidos serão comparados com os valores especificados na
SANCO 3030 (2011) para validação de métodos analíticos para quantificação de
produto técnico. A validação consistirá na avaliação dos parâmetros a seguir.
9 partes de n-octanol + 1 parte de fase aquosa
agitação durante 24 horas
separação da fase em
maior quantidade
n-octanol saturado com
fase aquosa
fase em menor
quantidade
descartada
9 partes de fase aquosa + 1 parte de n-octanol
agitação durante 24 horas
separação da fase em
maior quantidade
fase aquosa saturada com
n-octanol
fase em menor
quantidade
descartada
27
Seletividade
Para avaliar a seletividade, cada solvente e fase móvel foi injetado nas
condições cromatográficas. Os cromatogramas não devem apresentar picos
significativos que caracterizem interferências no tempo de retenção do material de
estudo.
Linearidade
Para avaliar a linearidade, uma curva de calibração do padrão de
referência na faixa de concentração de 5,5 mg/L a 131,5 mg/L foi preparada.
Aproximadamente 14 mg e 4 mg do padrão de Imazethapyr foram pesados em
balão volumétrico de 50 mL e 100 mL, respectivamente. O padrão de Imazethapyr
foi dissolvido e avolumado com a fase móvel e diluições foram realizadas a partir
dessas soluções para compor os 5 pontos da curva de calibração. Cada solução
foi injetada em triplicata no HPLC. A linearidade será comprovada pela
linearização dos dados e cálculo do coeficiente de correlação da reta obtida. Os
resultados serão satisfatórios se o coeficiente de correlação da reta for igual ou
maior que 0,99.
Repetitividade
Para avaliar a repetitividade, cinco preparos do material de estudo em cada
solvente saturado foram realizados de modo que a concentração calculada
ficasse no meio da curva de calibração. Aproximadamente 20 mg do material de
estudo foram pesados em balão volumétrico de 10 mL. Devido à baixa
solubilidade do Imazethapyr em água foi necessário pesar cerca de 5 mg para as
soluções que foram preparadas com água destilada saturada com n-octanol. O
material de estudo foi dissolvido e avolumado com os solventes saturados
preparados previamente.
Alíquotas das soluções preparadas com fase aquosa saturada com n-octanol
foram diluídas com a fase móvel. Alíquotas das soluções preparadas com n-
octanol saturado com a fase aquosa foram diluídas com n-octanol. Cada solução
foi injetada em duplicata no HPLC. Os valores de Grubbs mínimo e máximo e
coeficiente de variação serão calculados para avaliar se os resultados foram
satisfatórios. O limite para o valor de Grubbs será retirado da literatura para o
28
número de soluções utilizadas na repetitividade, conforme Anexo E. O limite do
coeficiente de variação será calculado pela fórmula de Horwitz, que leva em
consideração a concentração do analito na solução analisada, conforme equação
descrita no Anexo D. O método será considerado preciso se os resultados do
coeficiente de variação e Grubbs atenderem aos limites especificados.
Recuperação
Para avaliar a recuperação, três diferentes níveis de concentração foram
preparados próximo ao valor mínimo da concentração da curva de calibração.
Aproximadamente 3 mg, 4 mg e 6 mg do material de estudo foram pesados em
balão volumétrico de 25 mL. O material de estudo foi dissolvido e avolumado com
os solventes saturados. Alíquotas das soluções preparadas com fase aquosa
saturada com n-octanol foram diluídas com a fase móvel. Alíquotas das soluções
preparadas com n-octanol saturado com a fase aquosa foram diluídas com n-
octanol. Cada solução foi injetada em duplicata no HPLC. Os limites aceitáveis
para a recuperação na faixa de concentração do analito preparado serão retirados
da literatura. O método será considerado exato se os resultados da recuperação
estiverem dentro da faixa determinada.
Estabilidade
A avaliação da estabilidade não é requisito normativo, entretanto é
importante verificar a validade das soluções padrão utilizadas no período da fase
experimental. Sendo assim, a estabilidade será comprovada avaliando-se as
áreas das soluções do padrão de referência injetadas no cromatógrafo no
primeiro e último dia do período em que foi realizado o estudo. Assim como na
etapa da repetitividade, será avaliada a dispersão dos resultados. Os parâmetros
estatísticos de coeficiente de variação e Grubbs deverão estar dentro dos limites
especificados para comprovar que não houve alteração na composição das
soluções e que os resultados fornecidos são confiáveis.
O fluxograma da ilustração 4 apresenta um esquema geral da fase
experimental compreendendo as etapas de validação do método analítico até a
etapa de determinação do coeficiente de partição n-octanol/água.
29
Ilustração 4 – Fluxograma da fase experimental compreendendo as etapas de validação
do método analítico até a etapa de determinação do coeficiente de partição n-
octanol/água
Fonte: Do autor
Critérios normativos
atendidos
Não Sim
Etapa da determinação do
coeficiente de partição
n-octanol/água
Validação do método analítico
Seletividade Linearidade Repetitividade Recuperação Estabilidade
Injeção dos solventes: n-octanol, tampão pH 7, água
destilada e fase móvel
Curva de calibração
com 5 pontos de
concentração do padrão de referência
Cinco preparos do material de estudo nos solventes aquosos e orgânicos saturados entre si
Três preparos do material de estudo nos solventes aquosos e orgânicos saturados
entre si
Áreas do padrão de referência injetado no primeiro e último dia
comparadas entre si
30
5.3 Determinação do coeficiente de partição n-octanol/água
5.3.1 Cálculo Estimativo do Coeficiente de Partição n-octanol/água
O cálculo estimativo do log POW da molécula de Imazethapyr foi realizado
pelo software LogD da Advanced Chemistry Development Inc. (ACD/Labs). O
objetivo desse cálculo é escolher qual é o método mais apropriado para
determinar o coeficiente de partição n-octanol/água do material de estudo de
acordo com as características da molécula.
Conforme os cálculos estimativos, o método do HPLC é apropriado para
investigar o coeficiente de partição n-octanol/água do Imazethapyr na forma
neutra e o método do frasco agitado é apropriado para diferentes pH, pois nessas
situações os dados fornecidos pelo software mostram tendência para valores
negativos.
5.3.2 Método do frasco agitado
Foram preparadas soluções estoque do material de estudo em n-octanol
saturado com fase aquosa. Aproximadamente 40 mg do material de estudo foi
pesado em balão volumétrico de 50 mL. O material de estudo foi dissolvido e
avolumado com o solvente saturado. O preparo dos solventes saturados é
apresentado no fluxograma da Ilustração 2.
As partições foram preparadas em tubos centrífugas com a mistura de
alíquotas nas proporções de 1:2, 1:1 e 2:1 da solução estoque do material de
estudo com a fase aquosa saturada com n-octanol. Os tubos de centrífuga foram
agitados manualmente em um ângulo de 180 º, completando 100 inversões em 5
minutos. Para separar as fases, os tubos permaneceram em centrífuga (Nova
Técnica, modelo NT 820) durante 15 minutos a 3500 rpm. Os tubos de centrífuga
foram mantidos a 20 ± 1 ºC durante 1 hora e, então, alíquotas da fase orgânica e
aquosa foram retiradas com seringa e agulha descartáveis para serem
analisadas. Cada alíquota foi injetada em duplicata no HPLC. O fluxograma da
Ilustração 5 representa as etapas de partições do material de estudo.
31
Ilustração 5 - Etapas para determinação do coeficiente de partição n-octanol/água do
material de estudo
Fonte: Do autor
A quantificação do material de estudo presente em cada uma das fases
separadas foi realizada segundo método de quantificação validado descrito no
item 5.2.
aproximadamente 40 mg do
material de estudo em balão
volumétrico de 50 mL
n-octanol saturado com
fase aquosa
solução estoque do
material de estudo
alíquota
fase aquosa saturada
com n-octanol
mistura em tubo de centrífuga
separação por centrifugação
fase aquosa
alíquota
fase orgânica
quantificação quantificação
32
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES
6.1 Seletividade
Segundo a SANCO 3030 o grau de interferência de impurezas na
determinação do material de estudo deve ser reportado. As interferências
provenientes das impurezas não devem contribuir com mais do que 3 % da área
total do pico de interesse, ou seja, do analito. Como a determinação de
impurezas do material de estudo não foi o alvo deste estudo seguiu-se a
recomendação da ISO 14029 quanto a este parâmetro e foi avaliado o branco de
solventes utilizados.
Os cromatogramas dos solventes foram comparados com o cromatograma
do padrão de referência quanto ao tempo de retenção da substância de interesse
e a intensidade do sinal dos picos detectados. Foram considerados como
interferências da linha de base (ruído) os sinais abaixo de 1 mAU (procedimento
interno da empresa). O cromatograma representativo do padrão de referência
está apresentado na ilustração 6.
Ilustração 6 – Cromatograma representativo do padrão de referência
Fonte: Do autor
Os cromatogramas da fase móvel, n-octanol, água destilada e solução
tampão pH 7 estão apresentados na ilustração 7.
33
Ilustração 7 – Cromatogramas da (a) fase móvel; (b) n-octanol; (c) água destilada; (d)
solução tampão pH 7
Fonte: Do autor
34
A solução tampão pH 7 apresentou um sinal em 4 minutos, porém seu sinal
foi inferior a 0,2 mAU, o que não é relevante. Para os demais solventes, os
cromatogramas obtidos não apresentaram pico no mesmo tempo de retenção do
analito e a intensidade do sinal em todos os casos foi menor do que 1 mAU. Estes
resultados comprovam que não há interferência dos solventes utilizados.
6.2 Linearidade
Conforme descrito no item 5.2 Linearidade, foram preparadas duas
soluções do padrão de referência denominadas P1.0 e P1.4. A partir dessas
soluções foram feitas diluições para avaliar a linearidade da curva de calibração.
A tabela 2 apresenta as massas pesadas para os preparos e os volumes
utilizados na diluição das soluções.
Tabela 2 – Massas pesadas e os volumes utilizados no preparo dos padrões para a
verificação da linearidade
Solução Massa pesada
(mg)
Alíquota de padrão
(mL)
Solução de origem
Volume final (mL)
Solvente Concentração final* (mg L-1)
P1.0 13,73 - - 50
Fase móvel
274,1
P1.1 - 4,80 P1.0 10 131,5
P1.2 - 3,65 P1.0 10 100,0
P1.3 - 2,50 P1.0 10 68,5
P1.4 3,96 - - 100 39,5
P1.5 - 1,40 P1.4 10 5,5
*Concentração considerando a pureza do padrão de referência.
Fonte: Do autor
Conforme a SANCO 3030 a curva de calibração deve compreender o
intervalo de concentração nominal mínima e máxima do analito presente na matriz
considerando uma variação de ± 20 % sobre estes limites. Determinações em
duplicata de três ou mais concentrações ou determinações únicas de cinco ou
mais concentrações devem ser feitas.
Neste trabalho optou-se por realizar cinco concentrações e fazer
determinações em triplicata. A média das áreas fornecidas pelo equipamento foi
calculada. A partir dos resultados das médias das áreas e da concentração
35
preparada do padrão de referência obtiveram-se os dados da regressão linear. O
Apêndice A apresenta esses resultados.
Plotou-se o gráfico da média das áreas e da concentração do padrão de
referência, conforme mostrado na ilustração 8. Os valores dos coeficientes
angular e linear foram utilizados para escrever a equação da reta.
Ilustração 8 – Curva de calibração para verificação da linearidade
Fonte: Do autor
O coeficiente de correlação encontrado foi superior a 0,99, o que atende ao
critério especificado pela norma.
Cada grupo de injeções realizadas no cromatógrafo é chamado de corrida.
É necessário que a curva de calibração seja injetada novamente a cada corrida.
As soluções P1.1, P1.3 e P1.5 foram injetadas novamente durante um intervalo
de 30 dias, à medida que novas soluções do material de estudo eram analisadas.
Na validação do método analítico, apenas na etapa da avaliação da
Linearidade é exigida a injeção de cinco soluções do padrão de referência. Após
comprovada a linearidade na faixa de concentração preparada, as demais curvas
de calibração utilizadas podem ser compostas de, no mínimo, três diferentes
y = 13,45911x + 44,72384R = 0,99849
30
230
430
630
830
1030
1230
1430
1630
1830
2 32 62 92 122
Áre
a (
mA
U*s
)
Concentração (mg L-1)
36
concentrações do padrão de referência. Normalmente são escolhidas as
concentrações dos extremos e o ponto do meio da faixa avaliada na Linearidade.
Para as demais curvas de calibração obtidas no trabalho, o tratamento dos
resultados foi o mesmo feito na etapa da Linearidade. Nos Apêndices os
resultados dessas injeções podem ser consultados.
Como foram necessárias várias corridas ao longo do trabalho, a equação
da reta utilizada para obter os resultados de concentração calculada do material
de estudo será identificada e descrita, quando aplicável, na discussão dos
resultados. Na tabela 3 é apresentado o resumo das equações linearizadas
obtidas nas diferentes injeções das soluções da curva de calibração.
Tabela 3 – Resultados das Curvas de Calibração injetadas em dias diferentes
Curva de calibração
Intervalo de injeção após preparo
Dados da Regressão Linear
Coeficiente angular
Coeficiente linear
Coeficiente de correlação
Linearidade inicial 13,45911 44,72384 0,99849
1 7 dias 13,71157 10,54993 1,00000
2 13 dias 13,78904 11,08752 1,00000
3 21 dias 13,80811 11,72718 1,00000
4 23 dias 13,85977 13,00422 1,00000
5 30 dias 13,89608 -0,80419 1,00000
Fonte: Do autor
Em todos os casos o coeficiente de correlação atende ao critério de
r ≥ 0,99, especificado pela norma.
6.3 Repetitividade
Conforme descrito no item 5.2 Repetitividade, foram preparadas cinco
soluções utilizando-se as soluções saturadas de n-octanol com a fase aquosa e
vice-versa, conforme fluxogramas apresentados nas ilustrações 2 e 3.
Inicialmente a proposta era diluir todas as soluções com a fase móvel, entretanto
em alguns casos foi necessário fazer a diluição com n-octanol devido à
imiscibilidade das soluções. A tabela 4 apresenta o preparo das soluções (volume
final de 10 mL) e suas diluições (volume final de 25 mL) para obtenção das
37
concentrações utilizadas na avaliação da repetitividade das análises em solução
tampão pH 7.
Tabela 4 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções para
verificação da repetitividade em solução tampão pH 7
Preparo
Diluição
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração
(mg L-1)
Solução Concentração
Preparada* (mg L-1)
Solvente: tampão pH 7 saturado com n-octanol
Solvente: fase móvel
RP-01 20,90
2075,4 RP-01A 66,4
RP-02 21,81
2165,7 RP-02A 69,3
RP-03 21,99
2183,6 RP-03A 69,9
RP-04 20,18
2003,9 RP-04A 64,1
RP-05 20,22
2007,8 RP-05A 64,3
Solvente: n-octanol saturado com tampão pH 7
Solvente: n-octanol
RP-06 21,91
2175,7 RP-06A 69,6
RP-07 24,01
2384,2 RP-07A 76,3
RP-08 21,90
2174,7 RP-08A 69,6
RP-09 21,76
2160,8 RP-09A 69,1
RP-10 21,02
2087,3 RP-10A 66,8
*Considerando a pureza do material de estudo
Fonte: Do autor
Cada solução da tabela 6 foi injetada no cromatógrafo em duplicata. As
áreas obtidas foram utilizadas na equação da curva de calibração para o cálculo
da concentração do material de estudo. Utilizando-se a concentração calculada e
a concentração preparada, pôde-se obter a pureza do material de estudo. Os
parâmetros estatísticos foram calculados a partir da média e desvio padrão dos
resultados de pureza. As equações utilizadas se encontram no Anexo D.
A pureza do material de estudo é conhecida, pois se trata de um material
certificado. Entretanto também será denominada de pureza a razão em
porcentagem entre a concentração calculada através da curva de calibração e a
concentração teórica, preparada. Este valor será utilizado na avaliação da
repetitividade dos resultados fornecidos pelo equipamento. Não seria possível
avaliar a repetitividade utilizando-se somente os resultados da concentração
calculada de cada solução em mg/L, uma vez que se trata de três preparos
diferentes e, portanto, a massa do material de estudo pesada em cada caso é
38
diferente uma da outra. É necessário compensar a variação das massas pesadas
através desse artifício.
A repetitividade foi avaliada comparando-se os valores mínimo e máximo
do teste de Grubbs com o valor crítico para o número de amostras, retirado do
Anexo E. Também se comparou o valor calculado do coeficiente de variação com
o limite de Horwitz. Nos casos onde houve mais de um valor de porcentagem de
analito no grupo de amostras, o maior valor foi utilizado na equação modificada de
Horwitz. Dessa forma os limites foram mais restritivos.
A equação modificada de Horwitz mostra que quanto menor a
concentração do analito empregada, maiores os limites permitidos para o
coeficiente variação. Como em alguns casos houve uma pequena variação da
concentração preparada entre as soluções, optou-se em utilizar na equação
modificada de Horwitz a concentração da solução que forneceria o limite de
Horwitz mais crítico para a avaliação dos resultados. Dessa forma não haveria o
risco de avaliação tendenciosa ao considerar os resultados de algumas soluções
satisfatórios utilizando-se limites de coeficiente de variação mais abertos.
A tabela 5 apresenta os valores das áreas fornecidas pelo equipamento, a
concentração calculada com base na curva de calibração, a concentração de
preparo das amostras, a quantidade do material de estudo na solução em
porcentagem e a pureza calculada.
Tabela 5 – Avaliação da repetitividade na análise das amostras preparadas em solução
tampão pH 7 saturado com n-octanol
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Pureza (%)
RP-01A 926,12543 925,51086 925,81815 65,5 66,4 0,007 99
RP-02A 952,51190 952,26947 952,39069 67,4 69,3 0,007 97
RP-03A 955,16382 952,91705 954,04044 67,6 69,9 0,007 97
RP-04A 876,86255 876,26324 876,56290 61,8 64,1 0,006 96
RP-05A 887,43652 883,81860 885,62756 62,5 64,3 0,006 97
Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=5) CV
Limite Horwitz de CV
97 1 96 99 1,019 1,589 1,715 0,9 8,4
CV = Coeficiente de variação.
Fonte: Do autor
39
A concentração calculada foi obtida a partir da curva de calibração obtida
na etapa da avaliação da Linearidade: y = 13,45911x + 44,72384, onde y é o valor
da média das áreas de cada solução e x o resultado da concentração calculada.
Para a avaliação da repetitividade em solução tampão pH 7 saturada com
n-octanol, os valores de Grubbs estão dentro do valor crítico para n=5 e o
coeficiente de variação atende ao limite de Horwitz.
O mesmo procedimento foi realizado para avaliar a repetitividade dos
resultados das análises para as amostras preparadas utilizando como solvente a
solução de n-octanol saturado com solução tampão pH 7. A tabela 6 apresenta os
resultados dessa investigação.
Tabela 6 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em solução
de n-octanol saturado com solução tampão pH 7.
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Pureza (%)
RP-06A 998,99884 993,68115 996,34000 71,9 69,6 0,007 103
RP-07A 1036,76465 1037,87634 1037,32050 74,9 76,3 0,008 98
RP-08A 591,89490 585,07703 588,48597 42,1 69,6 0,007 61
RP-09A 932,79498 931,23285 932,01392 67,2 69,1 0,007 97
RP-10A 902,43323 900,36200 901,39762 65,0 66,8 0,007 97
Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=5) CV
Limite Horwitz de CV
91 17 61 103 1,770 0,690 1,715 19,0 8,3
CV = Coeficiente de variação.
Fonte: Do autor
A concentração calculada foi obtida a partir da equação da Curva de
Calibração 1: y = 13,71157x + 10,54993, onde y é o valor da média das áreas de
cada solução e x o resultado da concentração calculada.
Na avaliação da repetitividade das análises para as amostras preparadas
em n-octanol saturado com solução tampão pH 7, o valor mínimo de Grubbs e o
valor do coeficiente de variação não atenderam aos limites especificados o que
traduz a presença de um valor disperso no grupo de amostras. O valor
identificado como disperso foi o resultado da solução RP-08A. Observa-se que as
áreas dessa solução não estão coerentes com o valor esperado para a
40
concentração preparada e, consequentemente, o resultado de pureza está muito
distante do valor teórico. Portanto, o resultado da solução RP-08A foi excluído.
Segundo a norma SANCO 3030, é permitido excluir um resultado
identificado como disperso em um grupo de cinco preparos. A exclusão do valor
disperso deve ser justificada. Se mesmo após a exclusão for identificado outro
valor disperso, é necessário o preparo de duas novas soluções para repor o
último resultado excluído.
A presença do valor disperso pode indicar um erro ocorrido durante o
preparo da solução. Devido à alta viscosidade do solvente n-octanol a
transferência do volume no momento da diluição pode não ter sido quantitativa. A
micropipeta utilizada não possui sistema de pistão para dispensar o volume
coletado, o que dificulta o procedimento ao se tratar de líquidos viscosos.
A tabela 7 mostra a nova avaliação dos parâmetros estatísticos, para os
dados após a exclusão da amostra RP-08A.
Tabela 7 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em solução
de n-octanol saturado com tampão pH 7, após a exclusão da amostra RP-08A.
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Pureza (%)
RP-06A 998,99884 993,68115 996,34000 71,9 69,6 0,007 103
RP-07A 1036,76465 1037,87634 1037,32050 74,9 76,3 0,008 98
RP-09A 932,79498 931,23285 932,01392 67,2 69,1 0,007 97
RP-10A 902,43323 900,36200 901,39762 65,0 66,8 0,007 97
Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=4) CV
Limite Horwitz de CV
99 3 97 103 0,614 1,483 1,481 2,9 8,3
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
Após a exclusão da solução RP-08A, os valores mínimo e máximo de
Grubbs novamente calculados foram comparados com o novo valor crítico de
Grubbs, desta vez para n = 4. Observou-se uma diferença muito pequena entre o
valor máximo de Grubbs e o valor crítico, o que levaria a considerar novamente a
presença de um valor disperso no grupo de amostras. Entretanto, devido à
proximidade dos resultados de pureza, não foi possível identificar qual era o valor
41
disperso. Neste caso, aplicou-se o teste de Dixon, o qual verifica se um valor
suspeito está muito disperso em relação aos demais valores do grupo.
Para aplicar o teste de Dixon, os resultados da pureza foram dispostos em
ordem crescente (97 %, 97 %, 98 % e 103 %). O teste estatístico experimental
(Qexp) foi calculado a partir da diferença entre o valor suspeito e o valor mais
próximo dividido pela faixa de valores. Neste caso, o valor suspeito foi o resultado
da solução RP-06A. O resultado de Qexp foi comparado com o valor crítico (Qcrit),
retirado da tabela do Anexo F. Os valores críticos são tabelados e fornecidos de
acordo com o número de amostras e o nível de confiança desejado.
O teste de Dixon forneceu Qexp = 0,833 e Qcrit = 0,899 com 99 % de nível
de confiança. O valor experimental foi menor que o valor crítico, portanto, o valor
suspeito foi mantido e não foi considerado um valor disperso.
O parâmetro da repetitividade tanto nas soluções preparadas com solução
tampão pH 7 saturada com n-octanol como para n-octanol saturado com solução
tampão pH 7 atendeu aos requisitos especificados pela norma.
Da mesma forma feita para a solução tampão pH 7, a repetitividade foi
avaliada para o material de estudo em água destilada saturada com n-octanol e
em n-octanol saturado com água destilada. A tabela 8 apresenta o preparo
(volume final de 10 mL) e diluições (volume final de 25 mL) das soluções para
avaliação da repetitividade das amostras preparadas em água destilada.
Tabela 8 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções para
verificação da repetitividade em água destilada (continua)
Preparo
Diluição
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração
(mg L-1)
Solução Concentração
Preparada* (mg L-1)
Solvente: água destilada saturada com n-octanol
Solvente: fase móvel
RP-11 5,35
531,3 RP-11A 63,8
RP-12 5,05
501,5 RP-12A 60,2
RP-13 5,10
506,4 RP-13A 60,8
RP-14 5,76
572,0 RP-14A 68,6
RP-15 5,04
500,5 RP-15A 60,1
42
Tabela 8 - Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções
para verificação da repetitividade em água destilada (conclusão)
Preparo
Diluição
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração
(mg L-1)
Solução Concentração
Preparada* (mg L-1)
Solvente: n-octanol saturado com água destilada
Solvente: n-octanol
RP-16 20,68
2053,5 RP-16A 65,7
RP-17 21,42
2127,0 RP-17A 68,1
RP-18 20,62
2047,6 RP-18A 65,5
RP-19 20,41
2026,7 RP-19A 64,9
RP-20 20,03
1989,0 RP-20A 63,6
*Considerando a pureza do material de estudo
Fonte: Do autor
Na sequência, a tabela 9 apresenta os resultados da avaliação da
repetitividade das soluções preparadas com água destilada saturada com n-
octanol e a tabela 11 apresenta os resultados da avaliação da repetitividade das
soluções preparadas com n-octanol saturado com água destilada.
Tabela 9 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em água
destilada saturada com n-octanol
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mgL-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Pureza (%)
RP-11A 887,32996 890,75641 889,04319 63,5 63,8 0,006 100
RP-12A 831,35822 831,95612 831,65717 59,4 60,2 0,006 99
RP-13A 844,11743 844,27386 844,19565 60,3 60,8 0,006 99
RP-14A 945,44580 947,11597 946,28089 67,7 68,6 0,007 99
RP-15A 961,72418 961,05707 961,39063 68,8 60,1 0,006 115
Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=5) CV
Limite Horwitz de
CV
102 7 99 115 0,508 1,785 1,715 6,8 8,4
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
A concentração calculada foi obtida a partir da equação da Curva de
Calibração 3: y = 13,80811x + 11,72718, onde y é o valor da média das áreas de
cada solução e x o resultado da concentração calculada.
43
Na avaliação da repetitividade em água destilada saturada com n-octanol,
o valor máximo de Grubbs não atendeu ao limite especificado o que traduz a
presença de um valor diperso no grupo de amostras. O valor identificado como
disperso foi o resultado da solução RP-15A. A tabela 10 mostra a nova avaliação
dos parâmetros estatísticos após a exclusão da solução RP-15A.
Tabela 10 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em água
destilada saturada com n-octanol após exclusão de RP-15A
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Pureza (%)
RP-11A 887,32996 890,75641 889,04319 63,5 63,8 0,007 100
RP-12A 831,35822 831,95612 831,65717 59,4 60,2 0,007 99
RP-13A 844,11743 844,27386 844,19565 60,3 60,8 0,007 99
RP-14A 945,44580 947,11597 946,28089 67,7 68,6 0,007 99
Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=4) CV
Limite Horwitz de
CV
99 0,5 99 100 0,870 1,264 1,481 0,5 8,4
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
Após a exclusão da solução RP-15A, os valores mínimo e máximo de
Grubbs novamente calculados foram comparados com o novo valor crítico de
Grubbs, desta vez para n = 4. Os valores calculados de Grubbs ficaram abaixo do
valor crítico bem como o coeficiente de variação atendeu ao limite de Horwitz, o
que demonstra que a repetitividade das análises foi satisfatória para as soluções
preparadas em água destilada saturada com n-octanol.
Tabela 11 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em
n-octanol saturado com água destilada (continua)
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Pureza (%)
RP-16A 911,86926 907,03485 909,45206 65,0 65,7 0,007 99
RP-17A 939,75903 934,79633 937,27768 67,0 68,1 0,007 98
RP-18A 897,38062 891,18268 894,28165 63,9 65,5 0,007 98
RP-19A 889,70361 888,13971 888,92166 63,5 64,9 0,006 98
RP-20A 876,05591 879,53625 877,79608 62,7 63,6 0,006 99
44
Tabela 11 – Avaliação da repetitividade nas análises das amostras preparadas em n-octanol
saturado com água destilada (conclusão)
Tratamento estatístico dos resultados de pureza (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=5) CV
Limite Horwitz de
CV
98 1 98 99 1,369 1,184 1,715 0,6 8,4
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
Para a avaliação da repetitividade em n-octanol saturado com água
destilada, os valores de Grubbs estão dentro do valor crítico para n=5 e o CV
atende ao limite de Horwitz, demostrando uma repetitividade satisfatória para as
análises das soluções preparadas em n-Octanol saturado com Água Destilada.
De um modo geral a avaliação da repetitividade das análises mostrou que
este parâmetro tanto nas soluções preparadas com água destilada saturada com
n-octanol como para n-octanol saturado com água destilada atendeu aos
requisitos especificados pela norma SANCO 3030.
6.4 Recuperação
Conforme descrito no item 5.2 Recuperação, foram preparadas três
soluções em três níveis de concentração utilizando-se as soluções saturadas que
foram preparadas conforme fluxograma das ilustraçãos 2 e 3. Algumas soluções
foram diluídas com n-octanol pelo mesmo motivo ocorrido na etapa da
Repetitividade. A tabela 12 apresenta as informações relativas aos preparos das
soluções em tampão pH 7 e suas diluições (ambos com volume final de 25 mL),
as quais foram utilizadas para avaliação da recuperação.
45
Tabela 12 – Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções para
verificação da recuperação em solução tampão pH 7
Preparo
Diluição
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração*
(mg L-1)
Solução Concentração
preparada (mg L-1)
Solvente: tampão pH 7 saturado com n-octanol
Solvente: fase móvel
REC-01 6,66
264,5 REC-01A 11,6
REC-02 4,06
161,3 REC-02A 9,0
REC-03 3,30
131,1 REC-03A 12,1
Solvente: n-octanol saturado com tampao pH 7
Solvente: n-octanol
REC-04 3,88
154,1 REC-04A 11,7
REC-05 2,84
112,8 REC-05A 6,8
REC-06 6,91
274,5 REC-06A 12,1
*Considerando a pureza do material de estudo
Fonte: Do autor
Cada solução utilizada para a verificação da recuperação foi injetada no
cromatógrafo em duplicata. As áreas obtidas foram utilizadas na equação da
curva de calibração para se obter a concentração calculada. Utilizando-se a
concentração calculada e a concentração preparada, pôde-se obter a
porcentagem de recuperação do analito na solução, conforme equação do Anexo
D. A recuperação expressa a exatidão do método analítico. A recuperação foi
avaliada comparando-se os resultados com o limite de recuperação apropriado
para a concentração do analito na solução. Para todos os casos a concentração
do analito na solução foi igual a 0,001%. Segundo a norma SANCO 3030, a faixa
de resultado aceitável para concentrações menores que 0,01 % é de 80 a 120 %
de recuperação.
Além de avaliar os resultados quanto à faixa aceitável para a recuperação,
os parâmetros estatísticos de Grubbs e coeficiente de variação também foram
avaliados. A avaliação do teste de Grubbs e coeficiente de variação não é exigida
pela norma SANCO 3030 na etapa da recuperação.
Os valores das áreas fornecidas pelo equipamento, a concentração
calculada, a concentração preparada, a quantidade do analito na solução em
porcentagem e a recuperação são mostradas nas tabelas 13 e 14.
46
Tabela 13 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em solução
tampão pH 7 saturada com n-octanol
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Recuperação (%)
REC-01A 164,57977 164,54716 164,56347 11,1 11,6 0,001 96
REC-02A 124,44978 124,42055 124,43517 8,2 9,0 0,001 91
REC-03A 144,11372 145,17250 144,64311 9,7 12,1 0,001 80
Tratamento estatístico dos resultados de recuperação (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=3) CV
Limite Horwitz de
CV
89 8 80 96 1,104 0,845 1,155 8,8 11,3
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
Tabela 14 – Avaliação da recuperação do analito com amostras preparadas em n-octanol
saturado com solução tampão pH 7
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Recuperação (%)
REC-04A 162,10733 162,37450 162,24092 11,0 11,7 0,001 94
REC-05A 86,51419 86,54423 86,52921 5,5 6,8 0,001 81
REC-06A 160,79102 159,25890 160,02496 10,8 12,1 0,001 89
Tratamento estatístico dos resultados de recuperação (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=3) CV
Limite Horwitz de
CV
88 7 81 94 1,094 0,866 1,155 7,4 11,3
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
A concentração calculada foi obtida a partir da equação da Curva de
Calibração 2: y = 13,78904x + 11,08752, onde y é o valor da média das áreas de
cada solução e x o resultado da concentração calculada.
Na avaliação da recuperação em solução tampão pH 7 saturada com n-
octanol e n-octanol saturado com solução tampão pH 7, verificou-se que os
valores recuperados estão dentro da faixa de 80 a 120 %, os valores de Grubbs
estão dentro do valor crítico para n=3 e o coeficiente de variação atende ao limite
de Horwitz, o que demonstra uma recuperação satisfatória do analito na técnica
de análise empregada.
47
Da mesma forma feita para a solução tampão pH 7, a recuperação foi
avaliada para o material de estudo em água destilada. A tabela 15 apresenta os
preparos e diluições (ambos com volume final de 25 mL) das soluções para a
avaliação da recuperação em água destilada.
Tabela 15– Massas pesadas e concentrações utilizadas no preparo das soluções para
verificação da recuperação em água destilada
Preparo
Diluição
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração*
(mg L-1)
Solução Concentração
preparada (mg L-1)
Solvente: água destilada saturada com n-octanol
Solvente: fase móvel
REC-07 6,82
270,9 REC-07A 9,8
REC-08 4,48
177,9 REC-08A 8,5
REC-09 3,08
122,3 REC-09A 11,7
Solvente: n-octanol saturado com água destilada
Solvente: n-octanol
REC-10 7,17
284,8 REC-10A 10,3
REC-11 3,70
147,0 REC-11A 8,8
REC-12 3,30
131,1 REC-12A 12,1
*Considerando a pureza do material de estudo
Fonte: Do autor
Na sequência, a tabela 16 apresenta os resultados da avaliação da
recuperação das soluções preparadas com água destilada saturada com
n-octanol.
Tabela 16 – Resultados da avaliação da recuperação do analito com amostras
preparadas em água destilada saturada com n-octanol
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Recuperação (%)
REC-07A 143,33224 142,53903 142,93564 9,6 10,3 0,001 93
REC-08A 127,93587 128,07408 128,00498 8,5 8,9 0,001 96
REC-09A 170,86949 171,79790 171,33370 11,6 12,1 0,001 96
Tratamento estatístico dos resultados de recuperação (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=3) CV
Limite Horwitz de
CV
95 2 93 96 1,153 0,638 1,155 1,8 11,3
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
48
A tabela 17 apresenta os resultados da avaliação da recuperação das soluções
preparadas com n-octanol saturado com água destilada.
Tabela 17 – Resultados da avaliação da recuperação do analito com amostras
preparadas em n-octanol saturado com água destilada
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção Média Concentração
calculada (mg L-1)
Concentração preparada (mg L-1)
Analito na solução
(%)
Recuperação (%)
REC-10A 138,46846 137,79813 138,13330 9,2 9,8 0,001 94
REC-11A 118,96086 118,67371 118,81729 7,8 8,6 0,001 91
REC-12A 158,74643 158,01277 158,37960 10,6 11,8 0,001 90
Tratamento estatístico dos resultados de recuperação (%)
Média Desvio padrão
Valor mínimo
Valor máximo
Grubbs Valor mínimo
Grubbs Valor máximo
Grubbs Valor crítico
(n=3) CV
Limite Horwitz de
CV
92 2 90 94 0,672 1,149 1,155 2,1 11,3
CV = Coeficiente de variação
Fonte: Do autor
A concentração calculada foi obtida a partir da equação da reta da Curva
de Calibração 3: y = 13,80811x + 11,72718, onde y é o valor da média das áreas
de cada solução e x o resultado da concentração calculada.
Na avaliação da recuperação em água destilada saturada com n-octanol e
n-octanol saturado com água destilada, os valores da recuperação estão dentro
da faixa de 80 a 120 %, os valores de Grubbs estão dentro do valor crítico para
n=3 e o coeficiente de variação atende ao limite de Horwitz, o que demonstra uma
recuperação satisfatória do analito na técnica de análise empregada.
6.5 Estabilidade
A estabilidade das soluções do padrão de referência foi avaliada baseando-
se nos parâmetros estatísticos das áreas das primeiras e últimas injeções das
soluções P1.1, P1.3 e P1.5. As áreas das primeiras injeções foram retiradas da
tabela de resultados da Linearidade e as áreas das últimas injeções foram
retiradas da tabela de resultados da Curva de Calibração 5, que se encontra no
Apêndice F.
49
Uma vez que os parâmetros estatísticos atendam aos limites especificados,
as soluções são consideradas estáveis durante o período avaliado. A tabela 18
apresenta os resultados obtidos. Como critério de verificação de estabilidade foi
empregado o teste estatístico de Grubbs e coeficiente de variação, os quais
permitem avaliar a variabilidade entre as análises.
Tabela 18 – Avaliação das curvas de calibração com três pontos injetadas no início e fim
da fase experimental
Área P1.1 (mAU*s) Área P1.3 (mAU*s) Área P1.5 (mAU*s)
Linearidade Curva 5 Linearidade Curva 5 Linearidade Curva 5
1ª injeção 1824,50757 1829,73799 951,01013 950,64905 87,39197 76,96114
2ª injeção 1815,64697 1833,26440 947,59857 950,76654 87,45804 76,86958
3ª injeção 1818,08203 1834,49475 948,27826 950,44214 87,28123 77,05159
Avaliação estatística dos dados
Média (mAU*s) 1826 950 82
Desvio padrão (mAU*s)
8 2 6
Valor mínimo (mAU*s)
1816 948 77
Valor máximo (mAU*s)
1835 951 88
Grubbs Valor mínimo
1,307 1,499 0,929
Grubbs Valor máximo
1,083 0,834 0,927
Grubbs Valor crítico (n = 6)
1,887 1,887 1,887
CV (%) 0,4 0,2 6,9
Limite Horwitz de CV (%)
7,7 8,4 11,3
CV = Coeficiente de variação.
Fonte: Do autor
As soluções do padrão de referência preparadas foram consideradas
estáveis no período de 30 dias, devido aos resultados de Grubbs mínimo e
máximo e coeficiente de variação estar dentro dos limites permitidos. Todas as
soluções permaneceram em geladeira na faixa de 0 a 10 °C, condição que foi
considerada apropriada para armazenamento após a comprovação da
estabilidade.
50
6.6 Estudo do Coeficiente de Partição
Conforme descrito no item 3.3.2, foram preparadas em duplicata misturas
com diferentes proporções da solução estoque do material de estudo em
n-octanol saturado com solução tampão pH 7 e solução tampão pH 7 saturada
com n-octanol. O esquema do preparo é encontrado no fluxograma da
ilustração 4.
A tabela 19 apresenta o preparo da solução do material de estudo
empregada na avaliação do coeficiente de partição, e a tabela de 20 mostra as
condições referentes a misturas de soluções utilizadas nos ensaios de avaliação
do coeficiente de partição em solução tampão pH 7 saturada com n-octanol.
Tabela 19 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução estoque do
material de estudo com solução tampão pH 7
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração
(mg L-1)
Solvente
CP-A 40,15 803 n-octanol saturado com solução tampão pH 7
Fonte: Do autor
Tabela 20 – Preparo das misturas das soluções usadas na determinação do coeficiente
de partição com solução tampão pH 7
Proporção Solução CP-A
(mL) Solução tampão pH 7 saturado com
n-octanol (mL) Identificação
1 : 2 5 10 CP-01
1 : 1 5 5 CP-02
2 : 1 10 5 CP-03
1 : 2 5 10 CP-04
1 : 1 5 5 CP-05
2 : 1 10 5 CP-06
Fonte: Do autor
Alíquotas provenientes de ambas as fases formadas, fase aquosa e
orgânica, foram testadas por cromatografia para se obter uma estimativa da
concentração do material de estudo e determinar o seu coeficiente de partição. A
partir destes testes constatou-se que era necessário realizar um ajuste na
concentração de algumas soluções para que as áreas dos cromatogramas
51
ficassem dentro da região da curva de calibração O ajuste na concentração foi
feito através da diluição com solvente ou aumento no volume de injeção no
cromatógrafo. O fator resultante do ajuste da concentração foi utilizado nos
cálculos dos resultados da amostra.
Após o preparo das partições, as fases aquosa e orgânica foram
separadas. Conforme OECD 107, o pH da fase aquosa foi medido. Apesar da
acidez da molécula, o pH manteve-se no valor desejado. A tabela 21 apresenta
essas informações.
Tabela 21 – Separação das partições, diluição e concentração para solução tampão pH 7
Solução
de
origem
Fase Identificação
da fase
pH da
fase
aquosa
Volumes usados nas diluições
Solução
Volume de
injeção
(µL) Volume (mL)
Fase móvel (mL)
CP-01 aquosa CP-01.1 7,02 0,150 1,850 CP-01.1.1 10
orgânica CP-01.2 - - - - 20
CP-02 aquosa CP-02.1 6,98 0,060 1,940 CP-02.1.1 10
orgânica CP-02.2 - - - - 20
CP-03 aquosa CP-03.1 6,92 0,030 1,970 CP-03.1.1 10
orgânica CP-03.2 - - - - 10
CP-04 aquosa CP-04.1 7,00 0,150 1,850 CP-04.1.1 10
orgânica CP-04.2 - - - - 20
CP-05 aquosa CP-05.1 6,96 0,060 1,940 CP-05.1.1 10
orgânica CP-05.2 - - - - 20
CP-06 aquosa CP-06.1 6,90 0,030 1,970 CP-06.1.1 10
orgânica CP-06.2 - - - - 10
Fonte: Do autor
Cada solução foi injetada em duplicata no cromatógrafo. A concentração
calculada para os resultados do coeficiente de partição n-octanol/água em
solução tampão pH 7 foi obtida a partir da equação da reta da Curva de
Calibração 4: y = 13,85977x + 13,00422, onde y é o valor da média das áreas de
cada solução e x o resultado da concentração calculada.
De posse da concentração calculada em cada uma das fases (aquosa e
orgânica), foi calculado o valor de Pow e log Pow. A tabela 22 apresenta as áreas
fornecidas pelo equipamento e os cálculos necessários para a determinação do
coeficiente de partição n-octanol/água em solução tampão pH 7.
52
Tabela 22 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Solução
Tampão pH 7
Solução Fator*
Área (mAU*s) Concentração calculada (mg L-1)
Pow log Pow 1ª injeção 2ª injeção Média
Repetição 1
CP-01.1.1 13,33 432,23877 430,42117 431,32997 402,4
0,04 -1,36 CP-01.2 0,5 133,04501 134,02133 133,53317 17,4
CP-02.1.1 33,33 330,49396 332,39365 331,44381 765,9
0,02 -1,66 CP-02.2 0,5 482,47903 478,24280 480,36092 16,9
CP-03.1.1 66,67 315,20547 316,63181 315,91864 1457,0
0,02 -1,64 CP-03.2 - 475,38971 473,68909 474,53940 33,3
Repetição 2
CP-04.1.1 13,33 451,78458 451,59674 451,69066 422,0
0,05 -1,32 CP-04.2 0,5 153,37057 153,91565 153,64311 20,3
CP-05.1.1 33,33 335,32520 337,89569 336,61045 778,3
0,02 -1,67 CP-05.2 0,5 483,39194 466,89169 475,14182 16,7
CP-06.1.1 66,67 327,20889 326,03220 326,62055 1508,5 0,02 -1,63
CP-06.2 - 506,95334 492,59137 499,77236 35,1
Média: 0,03 -1,55
Desvio Padrão: 0,01 0,16
*Fator de do ajuste de concentração.
Fonte: Do autor
Ao se comparar as duas repetições observa-se que os resultados das
diferentes proporções foram similares. O desvio padrão calculado está dentro do
limite de ± 0,3 unidades especificado pela OECD 107.. Conforme o handbook The
e-Pesticide Manual o coeficiente de partição n-octanol/água em solução tampão
pH 7 do Imazethapyr é igual a 1,49. Este valor é próximo ao resultado encontrado
experimentalmente se for considerado em módulo. Observou-se que na literatura
os valores do coeficiente de partição n-octanol/água em solução tampão pH 5 e
pH 9 também estão apresentados como positivos. Este comportamento vai ao
contrário do que o modelo matemático prevê para valores de pH maiores do que
4, o que pode indicar que o cálculo de Pow foi feito utilizando-se a razão entre a
concentração do analito na fase aquosa e fase orgânica ao invés do contrário. O
resultado final do log Pow em solução tampão pH 7 é negativo e está coerente com
53
o que o modelo matemático, apresentado no item 5.3.1 e disponível no Anexo B,
havia previsto para a molécula do material de estudo.
Da mesma forma feita para a Solução Tampão pH 7, foram feitos os
preparos do material de estudo em água destilada. As tabelas 23 e 24
apresentam essas informações.
Tabela 23 – Massa pesada e concentração utilizada no preparo da solução estoque do
material de estudo com água destilada
Solução Massa de
Imazethapyr (mg)
Concentração ( mg L-1)
Solvente
CP-B 39,45 789 n-octanol saturado com água destilada
Fonte: Do autor
Tabela 24 – Preparo das misturas de soluções usadas na determinação do coeficiente de
partição com água destilada
Proporção Solução CP-B
(mL) Água destilada saturada com
n-octanol (mL) Identificação
1 : 2 5 10 CP-07
1 : 1 5 5 CP-08
2 : 1 10 5 CP-09
1 : 2 5 10 CP-10
1 : 1 5 5 CP-11
2 : 1 10 5 CP-12
Fonte: Do autor
Após o preparo das partições, as fases aquosa e orgânica foram
separadas, o pH da fase aquosa medido e os ajustes de concentração foram
realizados, sendo estas informações apresentadas na tabela 25.
Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água destilada
(continua)
Solução
de
origem
Fase Identificação da
fase
pH da
fase
aquosa
Volumes usados nas diluições
Solução
Volume
de injeção
(µL) Volume (mL)
Fase móvel (mL)
CP-07 aquosa CP-07.1 4,69 0,300 1,700 CP-07.1.1 10
orgânica CP-07.2 - 0,060 1,940 CP-07.2.1 10
CP-08 aquosa CP-08.1 4,31 0,300 1,700 CP-08.1.1 10
orgânica CP-08.2 - 0,060 1,940 CP-08.2.1 10
CP-09 aquosa CP-09.1 4,17 0,300 1,700 CP-09.1.1 10
orgânica CP-09.2 - 0,060 1,940 CP-09.2.1 10
54
Tabela 25 – Separação das partições, diluição e concentração para água destilada
(conclusão)
Solução
de
origem
Fase Identificação da
fase
pH da
fase
aquosa
Volumes usados nas diluições
Solução
Volume
de injeção
(µL) Volume (mL)
Fase móvel (mL)
CP-10 aquosa CP-10.1 4,12 0,300 1,700 CP-10.1.1 10
orgânica CP-10.2 - 0,060 1,940 CP-10.2.1 10
CP-11 aquosa CP-11.1 4,15 0,300 1,700 CP-11.1.1 10
orgânica CP-11.2 - 0,060 1,940 CP-11.2.1 10
CP-12 aquosa CP-12.1 4,05 0,300 1,700 CP-12.1.1 10
orgânica CP-12.2 - 0,060 1,940 CP-12.2.1 10
Fonte: Do autor
A concentração calculada para os resultados do coeficiente de partição n-
octanol/água em água destilada foi obtida a partir da equação da reta da Curva de
Calibração 5: y = 13,89608x + 0,80419, onde y é o valor da média das áreas de
cada solução e x o resultado da concentração calculada. A tabela 26 apresenta as
áreas fornecidas pelo equipamento e os cálculos necessários para a
determinação do coeficiente de partição n-octanol/água em água destilada.
Tabela 26 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Água
Destilada (continua)
Solução Fator*
Área (mA*s) Concentração calculada
(mg/L) Pow log Pow
1ª injeção 2ª injeção Média
Repetição 1
CP-07.1.1 6,67 285,72479 284,86905 285,29692 137,3
5,16 0,71
CP-07.2 33,33 292,45853 295,86267 294,16060 707,5
CP-08.1.1 6,67 331,30923 332,26740 331,78832 159,6
5,26 0,72
CP-08.2 33,33 348,76099 349,05759 348,90929 838,9
CP-09.1.1 6,67 331,82721 332,58133 332,20427 159,8
5,26 0,72
CP-09.2 33,33 357,97592 340,71054 349,34323 839,9
55
Tabela 26 – Resultados para o Coeficiente de Partição n-Octanol/Água em Água
Destilada (conclusão)
Solução Fator*
Área (mA*s) Concentração calculada
(mg/L) Pow log Pow
1ª injeção 2ª injeção Média
Repetição 2
CP-10.1.1 6,67 215,13501 215,24768 215,19135 103,6
5,43 0,73
CP-10.2 33,33 234,41920 233,10860 233,76390 562,7
CP-11.1.1 6,67 263,20743 263,66678 263,43711 126,8
5,21 0,72
CP-11.2 33,33 271,46664 277,87476 274,67070 660,8
CP-12.1.1 6,67 258,82782 258,65927 258,74355 124,5
5,97 0,78
CP-12.2 33,33 312,72546 305,49326 309,10936 743,4
Média: 5,38 0,73
Desvio padrão: 0,30 0,02
*Fator do ajuste de concentração.
Fonte: Do autor
Ao se comparar as duas repetições da determinação do coeficiente de
paetição n-octanol/água, observa-se que os resultados das diferentes proporções
foram similares. O desvio padrão calculado está dentro do limite de ± 0,3
unidades especificado pela OECD 107. Não há valor especificado na literatura
para o coeficiente de partição n-octanol/água em água destilada, por isso não foi
possível a comparação neste aspecto. O resultado final do log Pow em solução
água destilada é positivo e está coerente com o que o modelo matemático havia
previsto para a molécula do material de estudo, visto que a média do pH das
fases aquosas permaneceu em torno de 4.
Considerando-se a incerteza do modelo matemático utilizado na estimativa
do coeficiente de partição n-octanol/água em diferentes pH da fase aquosa, os
resultados obtidos ficaram dentro do previsto. A incerteza do modelo matemático
reforça que este procedimento somente deve ser adotado como ponto de partida
para a escolha do método experimental apropriado para a determinação do
coeficiente de partição n-octanol/água da molécula orgânica.
56
7. CONCLUSÃO
O método analítico se demonstrou seletivo com relação ao uso dos
solventes n-octanol, solução tampão pH 7, água destilada e fase móvel, pois não
houve interferências significativas desses solventes no tempo de retenção do
pico de interesse.
Constatou-se que o método é preciso, pois atendeu ao limite do teste de
Grubbs e limite Horwitz de coeficiente de variação na avaliação da repetitividade
para todas as soluções.
Na avaliação na recuperação foi comprovada a exatidão do método com a
quantidade do analito recuperada na faixa de 80 a 120 %, que é a apropriada
para as concentrações de analito utilizadas nas soluções.
A avaliação da estabilidade das soluções do padrão de referência
armazenadas em geladeira (0 a 10 °C) mostrou que é possível utilizá-las durante
1 mês,.
O coeficiente de partição foi determinado em duplicata para cada solvente,
água destilada e solução tampão pH 7. Os resultados obtidos foram satisfatórios e
o desvio entre uma repetição e outra permaneceu abaixo do determinado pela
norma OECD 107. Apesar de a molécula de Imazethapyr ter características
ácidas, o estudo em solução tampão pH 7 apresentou pH próximo ao valor
desejado. Por outro lado, observou-se a influência da acidez da molécula no
estudo em água destilada.
Os resultados do coeficiente de partição n-octanol/água em ambos os
solventes foram coerentes com o comportamento previsto pelo Software
ACD/Labs 6.0 .
Pode-se afirmar que o objetivo geral do trabalho foi cumprido, pois o
coeficiente de partição n-octanol/água utilizando como fases aquosas a água
destilada e a solução tampão pH 7 foi determinado utilizando-se metodologia
analítica adequada. A confiabilidade do método analítico foi comprovada uma vez
que todos os parâmetros avaliados atenderam aos limites especificados pela
norma SANCO 3030. Assim, os objetivos específicos também foram alcançados.
Os resultados do coeficiente de partição n-octanol/água foram coerentes
com o que foi previsto pelo modelo matemático. O resultado do coeficiente de
57
partição n-octanol/água utilizando solução tampão pH 7 como fase aquosa foi
próximo ao valor especificado no Handbook The e-Pesticide Manual. Não se
encontrou resultado do coeficiente de partição n-octanol/água utilizando-se como
fase aquosa a água destilada, por isso não possível a comparação dos resultados
neste aspecto.
58
REFERÊNCIAS
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 14029: Agrotóxico e Afins – Validação de Métodos Analíticos, 2005. BOETHLING, R. S.; MACKAY, D.; Handbook of Property Estimation Methods for Chemicals Environmental and Health Sciences, Boca Raton, CRC Press LLC p. 89-114, 2000. BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Manual de Procedimentos para Registro de Agrotóxicos, Coordenação Geral de Agrotóxicos e Afins. Brasília, DF, p. 17-20, 2012. BRITISCH CROP PROTECTION COUNCIL; The e-Pesticide Manual, Version 5.2, 15th Edition, Hampshire, UK, 2011. CONSTANTIN, J.; INOUE, M. H.; JR. OLIVEIRA, R. S.; Biologia e Manejo de Plantas Daninhas, Omnipax, Curitiba, p. 169-173, 2011. CROUCH, S. R.; HOLLER, F.J.; SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; Fundamentos de Química Analítica. Tradução: Marco Tadeu Grassi, Campinas, 8ª edição, Cenage Learning, p. 875-880, 2006. EDIVAN, T.; COLLINS KENNETH E.; JARDIM I. C. S. F; COLLINS C.H. Fases estacionárias para cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) baseadas em superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados. Química Nova, São Paulo, v. 25, n. 4, 2002. ELKINS, D.; HANSCH, C.; LEO, A.; Chemical Reviews, Partition Coefficient and their Uses, Department of Chemistry, Pomona College, Claremont, p. 525-527, 1971. EUROPEAN COMISSION, Directorate General Health and Consumer Protection. SANCO 3030: Technical Material and Preparations: Guidance for generating and reporting methods of analysis in support of pre- and post-registrations data requirements for Annex II (part A, Section 4) and Annex III (part A, Section 5) of Directive 91/414, Rev.04, 2000. INMETRO. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, QUALIDADE E TECNOLOGIA. NIT-DICLA-035: Princípios das Boas Práticas de Laboratório - BPL, Rev.02, 2011. KRÄMER, W.; SCHIRMER, U.; Modern Crop Protection Compounds, v.1, Weinheim, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, p. 82-92, 2007. MONTEIRO, R. A.; Processo de trabalho da atividade de aplicação manual de herbicidas na cultura da cana-de-açucar: riscos ergonômicos e ecotoxicológicos. 2001. f 140. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento e
59
Meio Ambiente) - Programa Regional de Pós-Graduação em Desenvolvimento de Meio Ambiente, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2001. ORGANIZATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT. OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS 107: Partition Coefficient (n-octanol/water): Shake Flask Method, 1995. ORGANIZATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS 117: Partition Coefficient (n-octanol/water), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method, 1989. POMBEIRO, A. J. L. O.; Técnicas e Operações Unitárias em Química Laboratorial, Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, p. 433-438, 2003. SILVA, L. R.; Estudo do coeficiente de partição octanol-água de bifenilas policloradas (PCBs) utilizando parâmetros topológicos. 2003. f 7. Artigo, Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 3, 2003.
60
APÊNDICES
APÊNDICE A – Tabela com as áreas dos cromatogramas dos padrões
injetados em triplicata, concentração real e análise da linearidade da curva
de calibração
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração
(mg L-1)
P1.1 1824,50757 1815,64697 1818,08203 1819,41219 131,5
P1.2 1376,93518 1373,94482 1375,02502 1375,30167 100,0
P1.3 951,01013 947,59857 948,27826 948,96232 68,5
P1.4 638,39038 637,49023 637,62415 637,83492 39,5
P1.5 87,39197 87,45804 87,28123 87,37708 5,5
Dados da Regressão Linear
Coeficiente angular Coeficiente linear Coeficiente de correlação
13,45911 44,71384 0,99849
61
APÊNDICE B – Resultados da Curva de Calibração 1
Tabela B – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração
real e análise da curva de calibração 1
Área
(mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração
(mg L-1)
P1.1 1815,93018 1813,72070 1816,09888 1815,24992 131,5
P1.3 948,41473 948,11633 947,24524 947,92543 68,5
P1.5 87,73899 87,44259 87,12582 87,43580 5,5
Fonte: Do autor
Ilustração B – Curva de Calibração 1
Fonte: Do autor
y = 13,71157x + 10,54993R = 1,00000
30,0
230,0
430,0
630,0
830,0
1030,0
1230,0
1430,0
1630,0
1830,0
2,0 32,0 62,0 92,0 122,0
Áre
a (
mA
U*s
)
Concentração (mg L-1)
62
APÊNDICE C – Resultados da Curva de Calibração 2
Tabela C – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração
real e análise da curva de calibração 2
Área (mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração
(mg L-1)
P1.1 1826,11328 1828,10828 1822,91870 1825,71342 131,5
P1.3 954,85675 953,64642 954,40442 954,30253 68,5
P1.5 88,16578 88,06171 88,18121 88,13623 5,5
Fonte: Do autor
Ilustração C – Curva de Calibração 2
Fonte: Do autor
y = 13,78904x + 11,08752R = 1,00000
30,0
230,0
430,0
630,0
830,0
1030,0
1230,0
1430,0
1630,0
1830,0
2,0 32,0 62,0 92,0 122,0
Áre
a (
mA
U*s
)
Concentração (mg L-1)
63
APÊNDICE D – Resultados da Curva de Calibração 3
Tabela D – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração
real e análise da curva de calibração 3
Área
(mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração
(mg L-1)
P1.1 1828,66187 1830,85828 1827,57507 1829,03174 131,5
P1.3 952,70325 958,40302 956,61566 955,90731 68,5
P1.5 89,43634 88,84163 88,87820 89,05206 5,5
Fonte: Do autor
Ilustração D – Curva de Calibração 3
Fonte: Do autor
y = 13,80811x + 11,72718R = 1,00000
30,0
230,0
430,0
630,0
830,0
1030,0
1230,0
1430,0
1630,0
1830,0
2,0 32,0 62,0 92,0 122,0
Áre
a (
mA
U*s
)
Concentração (mg L-1)
64
APÊNDICE E – Resultados da Curva de Calibração 4
Tabela E – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração
real e análise da curva de calibração 4
Área
(mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração
(mg L-1)
P1.1 1838,40918 1834,26709 1839,02686 1837,23438 131,5
P1.3 961,32135 958,37097 961,69806 960,46346 68,5
P1.5 93,06059 89,60075 89,57395 90,74510 5,5
Fonte: Do autor
Ilustração E – Curva de Calibração 4
Fonte: Do autor
y = 13,85977x + 13,00422R = 1,00000
30
230
430
630
830
1030
1230
1430
1630
1830
2 32 62 92 122
Áre
a (
mA
U*s
)
Concentração (mg L-1)
65
APÊNDICE F – Resultados da Curva de Calibração 5
Tabela F – Áreas dos cromatogramas dos padrões injetados em triplicata, concentração
real e análise da curva de calibração 5
Área
(mAU*s)
Solução 1ª injeção 2ª injeção 3ª injeção Média Concentração
(mg L-1)
P1.1 1829,73799 1833,26440 1834,49475 1832,49905 131,5
P1.3 950,64905 950,76654 950,44214 950,61924 68,5
P1.5 76,96114 76,86958 77,05159 76,96077 5,5
Fonte: Do autor
Ilustração F – Curva de Calibração 5
y = 13,89608x - 0,80419R = 1,00000
50,0
250,0
450,0
650,0
850,0
1050,0
1250,0
1450,0
1650,0
1850,0
2,0 32,0 62,0 92,0 122,0
Áre
a (
mA
U*s
)
Concentração (mg L-1)
74
ANEXO D – Equações utilizadas nos cálculos estatísticos
a) Teste de Grubbs
- Para testar o maior valor do conjunto (x1,..., xn), utilizar a seguinte equação:
𝐺𝑛 = (𝑥𝑛 − 𝑥 ̅)
𝜎
- Para testar o menor valor do conjunto (x1,..., xn), utilizar a seguinte equação:
𝐺1 = (�̅� − 𝑥1)
𝜎
Onde:
Gn = Valor máximo de Grubbs
G1 = Valor mínimo de Grubbs
σ = Desvio padrão absoluto entre os resultados
x = Média aritmética dos resultados
xn = Valor máximo
x1 = Valor mínimo
b) Teste de Dixon
𝑄𝑒𝑥𝑝 = 𝑋𝑛 – 𝑋𝑛 − 1
𝑋𝑛 – 𝑋1
Onde:
Qexp = Teste estatístico experimental
Xn = Valor suspeito de estar disperso
Xn-1 = Valor mais próximo do valor suspeito
Xn = Último valor do conjunto em ordem crescente
X1 = Primeiro valor do conjunto em ordem crescente
75
c) Coeficiente de variação
𝐶𝑉 = [𝜎
�̅�] × 100
Onde:
CV = Coeficiente de variação (%)
σ = Desvio padrão absoluto entre os resultados
x = Média aritmética dos resultados
d) Limite Horwitz de CV
𝐻𝑜𝑟𝑤𝑖𝑡𝑧 = 21−0,5 × 𝑙𝑜𝑔𝐶
Onde:
C = Concentração do analito na solução (%)
e) Recuperação
𝑅𝑒𝑐 =𝐶𝑎
𝐶𝑛 × 100
Onde:
Rec = Recuperação (%)
Ca = Concentração analisada do analito, usando-se a curva de calibração
Cn = Concentração nominal do analito
76
ANEXO E – Valores Críticos (Gc) para o Teste de Grubbs conforme número
de amostras (n)
Fonte: Procedimento interno da empresa, 2013.