Post on 23-Oct-2019
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
TANJA MURN
VPLIV RAZLIČNIH ZDRUŽB TALNIH
MIKROORGANIZMOV NA PRIVZEM ŽIVEGA SREBRA
PRI SONČNICI (Helianthus annuus L.)
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2016
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
DVOPREDMETNI UČITELJ
TANJA MURN
Mentor: PROF. DR. KATARINA VOGEL MIKUŠ
VPLIV RAZLIČNIH ZDRUŽB TALNIH MIKROORGANIZMOV NA
PRIVZEM ŽIVEGA SREBRA PRI SONČNICI (Helianthus annuus L.)
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2016
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija kemije in biologije. Večina poskusov
je bilo izvedenih na Katedri za fiziologijo rastlin Oddelka za biologijo Biotehniške
fakultete Univerze v Ljubljani. Meritve koncentracij živega srebra v koreninah in
poganjkih sončnic so bile izmerjene z metodo masne spektroskopije z induktivno
sklopljeno plazmo (ICP-MS) na Kemijskem inštitutu Ljubljana, v Laboratoriju za analizno
kemijo.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mateja GERM
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Mentorica: prof. dr. Katarina VOGEL-MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Član: prof. dr. David STOPAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora: 29.8.2016
Podpisana izjavljam, da je diplomska naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Izjavljam, da je elektronska oblika identična tiskani. Na univerzo prenašam pravico objave
svoje diplomske naloge v polnem tekstu na svetovnem spletu preko Digitalne knjižnice
Pedagoške fakultete.
Tanja Murn
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dn
DK UDK 581.1.543.272.81(043.2)=163.6
KG živo srebro/Idrija/mikrobni inokulum/akumulacija v sončnicah
AV MURN, Tanja
SA VOGEL MIKUŠ, Katarina (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta
LI 2016
IN VPLIV RAZLIČNIH ZDRUŽB TALNIH MIKROORGANIZMOV NA PRIVZEM ŽIVEGA SREBRA PRI SONČNICI (Helianthus annuus L.)
TD Diplomsko delo
OP VIII, 37 str., 11 pregl., 15 sl., 37 vir.
IJ Sl
JI sl/en
AI Mesto Idrija je znano po 500-letnem rudarjenju živega srebra (Hg), ki spada med najbolj strupena (an)organska onesnažila. Tekom procesa pridobivanja Hg se je kar četrtina celotne proizvodnje sprostila v okolje. Posledično je to vplivalo na tamkajšnje rastline in mikrobe v tleh, ki so se bili primorani prilagoditi na onesnaževanje z razvojem različnih tolerančnih mehanizmov. Namen raziskave je bil ugotoviti, kako inokulacija sončnic z različnimi talnimi mikrobi vpliva na privzem Hg in na njeno rast. Mikrobe smo izolirali iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto (MIBF) in na vrtu v Idriji (MII), uporabili pa smo tudi
komercialni mikrobni inokulum EM (Micronatura) (MIEM). Določili smo suho maso korenin in poganjkov ter vsebnost fotosinteznih pigmentov. Koncentracije Hg smo določili z metodo masne spektroskopije z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS). Pri tem smo potrdili hipotezo, da so koncentracije Hg v koreninah večje kot v poganjkih in da MII negativno vpliva na privzem Hg. Hkrati smo zavrnili hipotezo, da MII v prisotnosti Hg vpliva na boljšo rast sončnic. Biomasa korenin in koncentracija Hg je bila največja pri sončnicah, ki so bile izpostavljene MIEM.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION
ŠD Dn
DK UDK 581.1.543.272.81(043.2)=163.6
CX mercury/Idrija/microbial inoculum/sunflower accumulation
AU MURN, Tanja
AA VOGEL MIKUŠ, Katarina (supervizor)
PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotechnical Faculty
PY 2016
TI EFFECTS OF DIFFERENT SOIL MICROBIAL COMMUNITIES ON THE UPTAKE OF MERCURY IN SUNFLOWER (Helianthus annuus L.)
DT Graduation Thesis
NO VIII, 37 p., 11 tab., 15 fig., 37 ref.
LA Sl
AL sl/en
AB Idrija is a small city known for its 500 year history of mercury (Hg) mining, one of the most toxic (an)organic pollutants. A quarter of the processed mercury was lost in the surrounding countryside. Therefore the plants and microbes growing in such environment were forced to adapt by developing of different tolerance mechanisms. The goal of this study was to investigate the effects of different soil microbial communities on the uptake of mercury and growth and development of sunflower. The microbes were isolated from soil collected in the field near Biotechnical Faculty (MIBF) and in the garden in Idrija (MII). Commercial microbial inoculum
EM (Micronatura) (MIEM) was also utilized. Dry weight of roots and shoots and the concentrations of photosynthetic pigments were determined. The mercury levels were determined by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS). Our results show that Hg is mainly concentrated in sunflower roots. We have confirmed the hypothesis that MII negatively affects Hg uptake and rejected the hypothesis that MII increases the sunflower growth in the presence of mercury when compared to the other treatments. The biomass of roots and shoots was the biggest in the sunflowers inoculated with MIEM in the substrate with Hg.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
V
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ........................................................................................................................................... 1
2 PREGLED OBJAV ...................................................................................................................... 3
2.1 ŽIVO SREBRO ........................................................................................................................ 3
2.1.1 Fizikalne in kemijske oblike živega srebra .............................................................................. 3
2.1.2 Živo srebro v okolju ................................................................................................................. 4
2.2 MIKROBNE TRANSFORMACIJE ŽIVEGA SREBRA ....................................................... 4
2.2.1 Metilacija živega srebra ........................................................................................................... 4
2.2.2 Demetilacija živega srebra ....................................................................................................... 5
2.2.2.1 Redukcija živega srebra ...................................................................................................... 6
2.2.2.2 Oksidacija živega srebra ...................................................................................................... 6
2.3 ODPORNOST BAKTERIJ PROTI ŽIVEMU SREBRU S POMOČJO MER OPERONA ... 6
2.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE ........................................................................... 6
2.4.1 Fitoremediacija ........................................................................................................................ 8
3 METODE DELA ........................................................................................................................ 10
3.1 PRIPRAVA SUBSTRATA .................................................................................................... 10
3.2 PRIPRAVA INOKULUMA ................................................................................................... 10
3.3 ŠTETJE KOLONIJ ............................................................................................................... 11
3.4 GOJENJE SONČNIC ............................................................................................................ 12
3.5 DOLOČANJE BIOMASE RASTLIN ................................................................................... 12
3.6 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV............................................................... 12
3.7 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC ........................................................................................................................................... 13
3.7.1 Priprava vzorcev .................................................................................................................... 14
3.7.1.1 Kislinski razklop vzorcev ................................................................................................... 14
3.7.2 Priprava Standardov ............................................................................................................. 14
3.7.2.1 Induktivno Sklopljena Plazemska Masna Spektroskopija (ICP-MS) ............................... 15
3.8 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ............................................................................. 16
4 REZULTATI .............................................................................................................................. 17
4.1 ŠTETJE KOLONIJ ............................................................................................................... 17
4.2 BIOMASA SONČNIC ........................................................................................................... 18
4.2.1 Korenine ................................................................................................................................. 18
4.2.2 Poganjki ................................................................................................................................. 19
4.3 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV............................................................... 20
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
VI
4.3.1 Klorofil a ................................................................................................................................ 20
4.3.2 Klorofil b ................................................................................................................................ 21
4.3.3 Karotenoidi ............................................................................................................................ 22
4.4 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC ........................................................................................................................................... 23
4.4.1 Koncentracije živega srebra .................................................................................................. 23
4.4.1.1 Korenine ............................................................................................................................ 23
4.4.1.2 Poganjki ............................................................................................................................. 24
4.4.2 Translokacijski faktor za Hg ................................................................................................. 25
4.4.3 Vsebnost živega srebra ........................................................................................................... 26
4.4.3.1 Korenine ............................................................................................................................ 26
4.4.3.2 Poganjki ............................................................................................................................. 27
4.4.3.3 Skupna vsebnost Hg v sončnicah ....................................................................................... 28
5 DISKUSIJA ................................................................................................................................ 30
5.1 KOLONIJE ............................................................................................................................ 30
5.2 BIOMASA SONČNIC ........................................................................................................... 30
5.3 FOTOSINTEZNI PIGMENTI .............................................................................................. 30
5.4 KONCENTRACIJE Hg V SONČNICAH ............................................................................. 31
6 SKLEPI ...................................................................................................................................... 33
7 VIRI ............................................................................................................................................ 34
ZAHVALA
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
VII
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Priprava standardnih raztopin za Hg (IS – inertni standard). .............................. 15
Preglednica 2: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso korenin ............................................ 18
Preglednica 3: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso poganjkov ....................................... 19
Preglednica 4: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila a .................................. 20
Preglednica 5: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila b .................................. 21
Preglednica 6: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo karotenoidov .............................. 22
Preglednica 7: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v koreninah .......................... 23
Preglednica 8: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v poganjkih .......................... 24
Preglednica 9: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah .................................. 26
Preglednica 10: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v poganjkih ................................ 27
Preglednica 11: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah. ............................... 28
KAZALO SLIK
Slika 1: Kroženje živega srebra v okolju ...................................................................................... 4
Slika 2: Oznake izpostavitev....................................................................................................... 11
Slika 3: Primer kalibracijske krivulje ......................................................................................... 15
Slika 4: Agarne plošče z razvitimi kolonijami ............................................................................ 17
Slika 5: Suha masa korenin sončnic pri različnih izpostavitvah ................................................. 18
Slika 6: Suha masa poganjkov sončnic pri različnih izpostavitvah ............................................ 19
Slika 7: Koncentracija klorofila a v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah ................... 20
Slika 8: Koncentracija klorofila b v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah .................. 21
Slika 9: Koncentracija karotenoidov v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah ............... 22
Slika 10: Koncentracija Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah ............................. 24
Slika 11: Koncentracija Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah ............................. 25
Slika 12: Translokacijski faktor za Hg v sončnici pri različnih izpostavitvah ........................... 25
Slika 13: Vsebnost Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah .................................... 27
Slika 14: Vsebnost Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah .................................... 28
Slika 15: Skupna vsebnost Hg korenin in poganjkov pri različnih izpostavitvah ...................... 29
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ADP adenozin difosfat
ATP adenozin trifosfat
CO2 ogljikov dioksid
CH4 metan
Cd kadmij
Ca(CO)3 kalcijev karbonat
DMHg ((CH3)2Hg) dimetil živo srebro
H2O voda
Hg živo srebro
Hg0 elementarno živo srebro
Hg+ enovalentno živo srebro
Hg2+ dvovalentno živo srebro
HgCl2 živosrebrov(II) klorid
Hg(OH)2 živosrebrov hidroksid
HgS živosrebrov sulfid (cinabarit)
H2S vodikov sulfid
CH3- metilni anion
HNO3 dušikova(V) kislina
HCl klorovodikova kislina
IS inertni standard
ICP-MS sklopljena plazemska masna spektrometrija
MeHg (CH3Hg+) metil živo srebro
NaCl natrijev klorid
O3 ozon
PO4- fosfatni(V) ion
-SH tiolna oz. sulfhidrilna skupina
SRB sulfat reducirajoče bakterije
SO42- sulfatni(VI) ion
S2- sulfidni ion
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
1
1 UVOD
Po legendi pripovedujoč, je v 15. stoletju pod curkom idrijske studenčnice »škafar« odkril
neznano tekočo, svetlečo in težko snov, kasneje prepoznano kot živo srebro (Hg). Pričelo
se je petstoletno neprekinjeno rudarjenje v idrijski kotlini, kar se odraža v povečanih
vsebnostih Hg v okolju. Idrijski rudnik je veljal za drugi največji rudnik na svetu, z več kot
13 % svetovne proizvodnje Hg. Prekašal ga je le španski Almaden, katerega začetki so
segali v antični čas. V celotni zgodovini rudnika je bilo izkopane več kot 12 milijonov ton
živosrebrove rude. Med procesom pridobivanja se je okoli 38.000 ton Hg izgubilo v
okolju, predvsem v obliki hlapov Hg ali deponiranega v reki Idrijci (Urbanc, 2010).
Živo srebro uvrščamo med najbolj znane in najbolj problematične kovine v okolju. Živo
srebro in njegove spojine v okolju so naravnega (preperevanje kamnin, erozija, vulkani) in
antropogenega izvora (rudarjenje, industrija) v vseh medijih in v več oblikah. Vse oblike
Hg so za ljudi in živali strupene, najbolj pa organske oblike, kot sta metil-Hg (MeHg) in
dimetil-Hg (DMHg) (Gochfeld, 2003).
Pri biogeokemijskem kroženju Hg pomembno vlogo igrajo rizosferni mikroorganizmi, ki
delujejo kot vmesnik med tlemi in rastlino. Uporaba talnih mikroorganizmov je velikega
pomena pri fitoremediaciji, saj mikroorganizmi lahko vplivajo na mobilnost težkih kovin
in s tem dostopnost rastlinam (Yan-de in sod., 2007).
Živo srebro v organizmih nima znane biološke vloge, lahko pa že v zelo majhnih
koncentracijah negativno vpliva na rast in razvoj rastlin (Patra in Sharma, 2000). Mikrobi,
ki so dalj časa izpostavljeni povečanim koncentracijam Hg, lahko razvijejo biokemijske
zaščitne sisteme, s pomočjo katerih preprečujejo učinke strupenosti živosrebrovih ionov
(Hg2+) (Wood, 1984).
Cilj diplomske naloge je bil ugotoviti vpliv različnih talnih mikrobnih združb na privzem
Hg ter na rast sončnic (Helianthus annuus L.). Rast sončnic smo preverjali z merjenjem
rastnih parametrov (suha masa korenin in poganjkov, koncentracija fotosinteznih
pigmentov) in analizo koncentracij živega srebra v koreninah in poganjkih ob dodatku
različnih mikrobnih izvlečkov (mikrobni inokulum). Dobljene vrednosti merjenih rastnih
parametrov, smo nato primerjali z vrednostmi merjenih parametrov na kontrolnih
sončnicah. Zanimal nas je tudi vpliv komercialnega inokuluma EM (Micronatura) na rast
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
2
sončnic. Ta inokulum naj bi vseboval mlečnokislinske bakterije in kvasovke, za katere
proizvajalci trdijo, da izboljšajo rast rastlin preko izboljšane absorpcije mineralnih hranil.
Ni pa znano, ali vplivajo tudi na privzem težkih kovin.
HIPOTEZE
• Predvidevamo, da bodo sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom,
izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji, v prisotnosti Hg, rasle bolje od
sončnic, inokuliranih z mikrobnimi inokulumi, izoliranimi iz neonesnaženih
okoljih.
• Največje koncentracije Hg bomo zasledili v koreninah sončnic.
• Predvidevamo, da bodo mikroorganizmi, izolirani iz vzorca tal, nabranega na vrtu v
Idriji, vplivali na privzem Hg pri sončnicah.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
3
2 PREGLED OBJAV
2.1 ŽIVO SREBRO
2.1.1 Fizikalne in kemijske oblike živega srebra
Ime živo srebro (Hg) izhaja iz grške besede hydrargyrium (hidros – voda in agyrum –
srebro). Je kemijski element s simbolom Hg, atomskim številom 80 in relativno atomsko
maso 200,59. Nahaja se v II. stranski skupini periodnega sistema, znani kot skupini
prehodnih elementov. Od drugih prehodnih elementov se razlikuje v tem, da je pri sobni
temperaturi v tekočem agregatnem stanju. Je srebrno-bele barve, ima veliko gostoto
(13,456 g cm-3 pri 20 °C), tališče pri –38,87 °C in vrelišče pri 357 °C (Brenčič in Lazarini,
1995).
Živo srebro lahko nastopa v treh oksidacijskih stanjih: elementarno živo srebro (Hg0),
enovalentno živo srebro (Hg+) in dvovalentno živo srebro (Hg2+). Kemijske lastnosti Hg so
močno odvisne od oksidacijskega stanja. Elementarno Hg0 je večinoma prisotno v
atmosferi, včasih tudi v vodnih medijih. Enovalentno in dvovalentno živo srebro običajno
ne obstajata v ionski obliki, ampak tvorita številne anorganske in organske spojine v vodi,
tleh in sedimentih (EPA, 1997).
Najpogostejše anorganske spojine v okolju so živosrebrov klorid (HgCl2), živosrebrov
hidroksid (Hg(OH)2) in živosrebrov sulfid (HgS). Spojine so v obliki belega prahu ali
kristalov, razen HgS, ki je rdeč in potemni, če je izpostavljen svetlobi. V različnih
toksikoloških študijah se navadno uporablja HgCl2, ker se kljub veliki hlapljivosti dobro
topi in je kemično bolj aktivna spojina kot elementarno Hg0. Organske spojine so tiste, pri
katerih je Hg2+ s kovalentno vezjo neposredno vezan na vsaj en C atom, najpogosteje na C
atom iz metilne skupine (CH3-). Najpomembnejši organski obliki sta metil-Hg - MeHg
(CH3Hg+) in dimetil-Hg - DMHg ((CH3)2Hg) (EPA, 1997). Obe metilni obliki - MeHg in
DMHg sta hlapni in dobro topni v lipidih. Od vseh oblik Hg, največjo stopnjo strupenosti
predstavlja nevrotoksin MeHg, ki se akumulira v prehranjevalni verigi in na ta način
ogroža zdravje ljudi in živali (Robinson in Tuovinen, 1984).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
4
2.1.2 Živo srebro v okolju
Glavna oblika živega srebra v atmosferi je elementarno Hg0, ki je zelo hlapljivo in se lahko
v interakciji z ozonom (O3) in ob prisotnosti vode (H2O) oksidira v Hg2+. Veliko Hg2+ z
dežjem prehaja iz atmosfere v oceane, kjer poteka fotoredukcija ali bakterijska redukcija v
Hg0. Elementarno Hg0 na ta način ponovno hlapi nazaj v atmosfero. V vodi in sedimentih
je Hg2+ glavni substrat za bakterijsko pretvorbo v MeHg, ki se nato bioakumulira v
prehranjevalni verigi (Nascimento in Chartone-Souza, 2003) (Slika 1).
Slika 1: Kroženje živega srebra v okolju
Glavne oblike živega srebra, katerim smo ljudje izpostavljeni, so Hg0 in MeHg, ki so zelo
strupene za vse živeče organizme. Strupenost organskih in anorganskih oblik Hg
pripisujejo njihovi močni afiniteti do tiolnih (-SH) skupin organskih molekul. Zaradi tega
so bakterije, glive in rastline, ki živijo na s Hg onesnaženih območjih, razvile različne
mehanizme za zaščito oz. odpornost na različne oblike Hg (Osborn in sod., 1997).
2.2 MIKROBNE TRANSFORMACIJE ŽIVEGA SREBRA
Različni mikroorganizmi lahko s transformacijami Hg zmanjšajo ali povečajo strupenost za
večcelične organizme, saj se Hg spojine med seboj razlikujejo po strupenosti.
2.2.1 Metilacija živega srebra
Raziskave o Hg metilaciji so se pričele leta 1960, ko se je v zalivu Minamata (Japonska)
zgodila tragedija, ki je povzročila zastrupitev na tisoče ljudi z MeHg, prisotnim v
kontaminiranih ribah (Bakir in sod., 1973).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
5
Benoit in sod. (2003) poročajo, da je metilacija Hg znotrajcelični proces v bakterijah, ki
Hg2+ metilirajo tako, da nastane MeHg. Donor metilne skupine so metilkorinoidi (analogi
vitamina B12), ki so sposobni prenesti negativno nabiti CH3- na pozitivno nabiti Hg2+
(Wood, 1974). Transformacije Hg2+ v MeHg s pomočjo mikroorganizmov, sta prvič
dokazala Jensen in Jernelov (1969) z usedlinami sladkih vod in jezer, ki so metilirale
HgCl2, medtem ko sterilizirani sedimenti niso.
Na hitrost nastajanja in kopičenje MeHg vplivajo različni dejavniki. Med te dejavnike
sodijo koncentracija razpoložljivega Hg2+, koncentracija celokupnega Hg2+, kemijska
oblika Hg, struktura mikrobne združbe in okoljski dejavniki, med katere prištevamo
temperaturo, pH, redoks potencial, koncentracijo in dostopnost organskih spojin za
sulfatne reducente (Kelly in sod., 1995).
Mikrobna metilacija najbolj intenzivno poteka v anaerobnih sedimentih, kjer jo v večji
meri opravljajo sulfat-reducirajoče bakterije (SRB). Povezavo med sulfatno respiracijo in
metilacijo Hg sta dokazala Compeau in Bartha (1985), ko sta ob dodatku molibdena
(specifičen inhibitor sulfatne redukcije) zaznala inhibicijo sulfatne redukcije in s tem upad
tvorbe MeHg v gojiščih s SRB.
Hitrost metilacije pozitivno korelira s hitrostjo redukcije sulfata, vendar z naraščanjem
koncentracije reduciranega žvepla pada. SRB v anaerobnih pogojih in bogatih organskih
sedimentih reducirajo sulfat (SO42-) v vodikov sulfid (H2S). Nastali sulfid (S2-) reagira s
Hg2+ v netopen HgS, ki močno inhibira metilacijo in s tem tvorbo MeHg v tleh in
sedimentih (Barkay, 2005). Metilacijo inhibirajo tudi huminske in fulvo kisline. Te s Hg2+
tvorijo kemično zelo stabilne komplekse in s tem zmanjšajo biodostopnost Hg2+ za
metilacijo (Stamenkovič in sod., 2004).
2.2.2 Demetilacija živega srebra
Demetilacija je bila prvič odkrita v letu 1970. Vzorce sedimentov so inkubirali z 14C-
MeHg, produkt razgradnje sta bila 14CH4 in Hg0. Billen je s sodelavci leta 1974 ugotovil,
da se hitrost demetilacije poveča ob prisotnosti povečanih koncentracij MeHg, povezana z
bogatitvijo populacije bakterij, ki so odporne na MeHg (Barkay, 2005).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
6
Metil-Hg se lahko demetilira po oksidativni ali reduktivni poti. Na abiotsko razgradnjo
MeHg lahko vpliva tudi ultravijolično sevanje (UV-A in UV-B). Tako lahko ob prisotnosti
sončne svetlobe poteka fotorazgradnja MeHg v Hg2+ (Barkay, 2003).
2.2.2.1 Redukcija živega srebra
Reduktivna demetilacija MeHg večinoma poteka v aerobnih okoljih. Vršijo jo lahko
bakterije, ki vsebujejo mer operon. Na njem je zapis za encim liazo, ki cepi vez med Hg in
ogljikom iz metilne skupine. Pri tem nastane metan (CH4) in Hg2+. Po drugi strani encim
Hg-reduktaza reducira Hg2+ v hlapen Hg0 (Robinson in Tuovinen, 1984).
2.2.2.2 Oksidacija živega srebra
Mehanizmi oksidativne demetilacije organizmov, vpletenih v ta proces, naj bi bili za enkrat
še neznani. Gre za biokemične poti metabolizmov z enim ogljikovim atomom (metilirani
amini, metanol), katerih končni produkt je CO2, manjša količina CH4 in Hg2+, ki se pozneje
lahko metilira (Oremland, 1991).
2.3 ODPORNOST BAKTERIJ PROTI ŽIVEMU SREBRU S POMOČJO MER OPERONA
Mehanizem obrambe bakterij pred Hg omogoča mer operon, ki bakterijam preko encimske
redukcije omogoči razstrupljanje Hg2+ v hlapljivo elementarno Hg0. Prenos in redukcija
potekata s pomočjo -SH skupin cisteinov, ki so tarče za vezavo Hg. Ne strupen Hg0 nato
difundira v citoplazmo, kjer zaradi svojega visokega parnega tlaka izhlapi v zunajcelično
okolje oz. atmosfero. Encim, ki sodeluje pri redukciji Hg2+, je Hg-reduktaza, znotrajcelični
flavoprotein, ki so ga zasledili v sevih Pseudomonas sp., Escherichia coli in
Staphylococcus aureus. Mer operon je prisoten tako v Gram negativnih bakterijah, kot tudi
v Gram pozitivnih bakterijah. Ponavadi so mer operoni locirani na plazmidih, kromosomih,
pogosto so tudi komponente transpozonov in integronov (Barkay, 2003).
2.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE
Zastrupitev s Hg je posledica onesnaževanja okolja v svetovnem merilu. K onesnaževanju
s Hg dve tretjini prispevajo naravne emisije, eno tretjino pa človek sam, ko na kmetijska
zemljišča dodaja različne pripravke (gnojila, apno, itd.). Najpomembnejši vir
kontaminacije kmetijske zemlje s Hg predstavlja uporaba živosrebrovih organskih spojin,
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
7
ki se tlem dodajajo za preprečevanje razvoja glivnih bolezni semen. Če se ga uporablja v
priporočenih odmerkih, ima le ta ugoden vpliv na kalitev semen (Patra in Sharma, 2000).
Koncentracija Hg v rastlini, ki ga privzame iz zemlje, je odvisna od koncentracije Hg v
tleh, pH tal, vsebnosti glinenih, mineralnih in organskih snovi, kationske izmenjevalne
kapacitete, redoks razmer, prisotnost kalcijevega karbonata (CaCO3) v tleh, kot tudi
lastnosti posameznih rastlinskih vrst. Znano je, da več kot je organskih in mineralnih snovi
v tleh, več Hg se veže nanje in posledično se zmanjša biodostopnost in mobilnost Hg za
rastline (Patra in Sharma, 2000).
Živo srebro v organizmih nima znane biološke vloge, lahko pa že pri zelo nizkih
koncentracijah povzroča različne fitotoksične učinke, podobno kot druge težke kovine, npr.
Cd in Pb. Večina Hg se akumulira v korenine rastlin, ki služijo kot ovira za prenos Hg v
nadzemne dele, zato so koncentracije Hg v nadzemnih delih odvisne predvsem od
foliarnega privzema Hg0, ki prvotno izvira iz tal (Gracey in Stewart, 1974). Koncentracija
Hg v rastlinah je višja, če je Hg na voljo v organski obliki. Na privzem Hg vpliva sama
vrsta rastline, sezonske spremembe v prirastku in kemijska oblika Hg, ki ga absorbira.
(Patra in Sharma, 2000)
Glavni znaki vpliva Hg na rastline se kažejo predvsem na rastlinskem zarodku in
semenskem endospermu. Živo srebro ima veliko afiniteto do tiolnih skupin –(SH), zato so
tarče zlasti proteini, bogati z cisteinom, ker vsebujejo –SH skupine. Posledica tega je
nastanek –S-Hg-S- mostu. Tak način vezave Hg vpliva na kalitev in posledično rast
mladega zarodka, saj so ravno ta tkiva še posebej bogata z –SH skupinami. Živo srebro
rado reagira tudi z fosfatnimi skupinami (PO42-) ADP in ATP-ja in DNK, kar vodi v
zaviranje funkcij. Velikokrat nadomesti atome magnezija v klorofilu, s čimer zavira
fotosintezo. Poleg tega rastlinske celice vsebujejo tudi veliko akvaporinov, ki so prav tako
pogoste tarče Hg in na ta način je omejen transport vode v tonoplast, kar posledično vpliva
na transpiracijo (Patra in Sharma, 2000).
Celična stena koreninskih celic rastline je v neposrednem stiku s kovinami v tleh. Proteini,
ki so v celični membrani in na površini membrane so torej prva tarča strupenosti težkih
kovin. Znano je, da se kar 90 % Hg nahaja v celični steni koreninskih celic (Patra in
Sharma, 2000).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
8
2.4.1 Fitoremediacija
Fitoremediacija je tehnologija, ki uporablja za to primerne rastline za čiščenje oziroma
stabilizacijo onesnaženega okolja. Gre za učinkovito, poceni in okolju prijazno tehnologijo
odstranjevanja onesnaževal (Glick, 2010).
Poznamo več tehnik fitoremediacije (Yan-de, 2007):
1. Fitoekstrakcija je postopek koncentriranja težkih kovin iz tal v korenine in
poganjke rastlin.
2. Rizofiltracija je uporaba rastlinskih korenin za absorpcijo, koncentriranje ali
obarjanje težkih kovin iz odpadnih voda.
3. Fitostabilizacija je zmanjšanje mobilnosti težkih kovin na podlagi absorpcije na/v
rastline, kar zmanjša njihovo biodostopnost.
4. Fitovolatilizacija je vnos težkih kovin v rastline, kjer se nato sprostijo v obliki
hlapov v ozračje. Primarna težka kovina za odstranitev preko fitovolatilizacije je
živo srebro, kjer poteka razstrupljanje Hg2+ v hlapljivo elementarno Hg0.
Posledica je volatilizacija Hg0 v atmosfero, kjer se razredči. Globalno gledano je
omenjena metoda deloma problematična, ker se pare Hg0 v atmosferi oksidirajo v
Hg2+ in v obliki padavin vračajo nazaj v kopenske in vodne ekosisteme.
Volatilizacija Hg tako prispeva k globalnemu onesnaževanju s Hg. (Henry, 2000).
Za fitoremediacijo se torej uporabljajo rastline, ki so se bile za svoje preživetje primorane
prilagoditi na onesnaževanje z razvojem različnih obrambnih mehanizmov pred strupenimi
kovinami. Ti mehanizmi delujejo na osnovi preprečevanja akumulacije težkih kovin v
rastline ali pa kopičenja velikih količin težkih kovin v tkivih rastline (Khan in sod., 2000).
V primeru Hg je najbolj priporočljiva uporaba rastlin, ki Hg zadržijo v svojem
koreninskem sistemu, pri čemer se zmanjša volatilizacija in izpiranje v okoliške vodotoke.
Pomembno vlogo v učinkovitosti fitoremediacije Hg predstavljajo tudi rizosferni
mikroorganizmi in njihove interakcije z koreninami rastlin, saj lahko le-ti vplivajo na
mobilnost Hg v tleh in s tem dostopnost rastlinam (Yan-de, 2007).
Dolgoročna izpostavljenost mikroorganizmov substratu s Hg lahko vodi v razvoj različnih
tolerančnih mehanizmov. V splošnem ti sistemi zajemajo protonske črpalke, ki aktivno
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
9
odstranjujejo Hg2+ iz celice, encime, ki reducirajo Hg2+ v manj strupeno elementarno
obliko (Hg0), proteinske receptorje na celični površini, ki vežejo Hg2+ in tako preprečujejo
njegov vstop v celico, sisteme, ki omogočajo tvorbo in obarjanje netopnih Hg sulfidov, kot
tudi metilacijo z difuznim izločanjem MeHg v okolje (Wood, 1984).
Obstajajo pa tudi mikroorganizmi, ki s svojim delovanjem in mehanizmi povečajo
akumulacijo Hg v rastlinah (de Souza in sod., 1999)
i) mikroorganizmi v rizosferi lahko povečajo površino korenin, s čimer se poveča
privzem težkih kovin (Kapulnik in Okon, 1996)
ii) mikroorganizmi lahko anorganski Hg transformirajo v organske oblike, npr.
MeHg, ki se korenine privzame hitreje (Zayed in sod., 1998)
iii) mehanizem privzema Hg2+ v višje rastline še ni dobro raziskan. Znano je, da
mikroorganizmi znižajo pH tal in na ta način se poveča akumulacija Hg
(Moorby in sod., 1988)
Diplomsko delo je nastalo zaradi pomanjkanja raziskav na področju mikrobov, izoliranih iz
okolij, onesnaženih s Hg, in slabo raziskanega prispevka k akumulaciji Hg v rastline.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
10
3 METODE DELA
3.1 PRIPRAVA SUBSTRATA
Za poskus smo substrat pripravili tako, da smo zmešali substrat za rože in substrat iz tal,
nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, v razmerju 1:1. Pripravljen substrat smo
sterilizirali z avtoklaviranjem v razmiku dveh dni (121°C, 101 Pa), da smo odstranili
morebitne že prisotne mikroorganizme. Avtoklaviran substrat smo razporejenega na vrečki
za smeti, štiri dni sušili na zraku pri sobni temperaturi. Nato smo polovico suhega substrata
kontaminirali s 50 mg kg-1 Hg v obliki HgCl2 raztopljenega v destilirani vodi.
Kontaminacijo substrata s Hg smo izvedli v digestoriju. Polovico substrata smo
kontaminirali s HgCl2 (Merck, Nemčija). Zatehtali smo 0,29 g HgCl2/4,3 kg substrata. Bel
prah HgCl2 (Merck, Nemčija) smo raztopili v 2 dcl destilirane vode. To smo nato razlili po
substratu in ga dobro premešali. Substrat smo pospravili v vrečko za smeti, jo dobro
zavezali in jo pustili stati 10 dni, da se je Hg dobro razporedil po substratu. Preostali
polovici substrata nismo dodajali HgCl2.
3.2 PRIPRAVA INOKULUMA
V poskusu smo pripravili dva različna inokuluma mikroorganizmov. V dva merilna valja
(1000 ml) smo do volumna 200 ml natresli posamezen vzorec tal (vzorec tal, nabran na
vrtu v Idriji (MII) in na njivi za Biotehniško fakulteto (MIBF)), nato pa do 800 ml
dopolnili z destilirano vodo in to pustili stati en dan. Mikrobni izvleček smo nato pripravili
tako, da smo po treh dneh vsebino prefiltrirali skozi sito s porami velikosti 45 µm. Tretji
inokulum je bil komercialni mikrobni inokulum EM (Micronatura) (MIEM), redčen z
vodo v razmerju 1:10. Proizvajalci trdijo, da gre za mikrobno združbo fototrofnih in
mlečnokislinskih bakterij ter kvasovk (http://www.micronatura.si). Četrta izpostavitev je
bila kontrola – destilirana voda (Slika 2).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
11
Slika 2: Oznake izpostavitev (N=5 za vsako posamezno izpostavitev). Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji.
3.3 ŠTETJE KOLONIJ
V naših pripravljenih inokulumih smo opravili štetje kolonij. Uporabili smo metodo z
razmazovanjem (Čadež in Mahne 2005). Običajno je število mikroorganizmov v
osnovnem vzorcu preveliko, da bi ga lahko po metodi z razmazovanjem neposredno
določili, zato iz osnovnega vzorca pripravimo serijo redčitev.
Iz tekočih mikrobnih inokulumov MII in MIBF smo s sterilno pipeto odpipetirali 1 ml
posameznega inokuluma, ki smo ga v nadaljevanju uporabili za redčitev. Iz tega smo
ponovno s sterilno pipeto odpipetirali 100 µl posameznega vzorca in ga prenesli v sterilno
centrifugirko z 0,9 ml fiziološke raztopine (0,9 % NaCl). Dobljeno razredčitev 10-1 smo
nato mešali na mehanskem mešalniku približno 10 sekund ter nato iz nje z novo sterilno
pipeto odpipetirali 100 µl in prenesli v novo sterilno centrifugirko z 0,9 ml 0,9 % NaCl.
Dobili smo razredčitev 10-2. Postopek smo ponavljali do želene razredčitve 10-5.
100 µl posamezne razredčitve smo nanesli na površino trdnega gojišča in jo razmazali po
celotni površini s pomočjo sterilne steklene trikotne lopatice. Pri MIEM smo na površino
trdnega gojišča direktno nanesli 100 µl osnovnega vzorca. Po inkubaciji (2 dni) na 37 ⁰C
smo nastale kolonije prešteli na tistih ploščah, kjer je bilo od 30 do 300 kolonij. S pomočjo
preštetih kolonij in razredčitvenega faktorja smo izračunali koncentracijo kultivabilnih
celic v osnovnem vzorcu (Formula 1).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
12
N=��� (1)
N – število mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml)
np – povprečno število kolonij
R – razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije
3.4 GOJENJE SONČNIC
Za poskus smo izbrali sončnico vrste Helianthus annuus L. Sončnice smo kalili v
vermikulitu, po dveh tednih pa smo sončnice enakih velikosti prenesli v substrat z ali brez
dodanega HgCl2. Kontrolni in kontaminirani substrat smo razporedili v lončke. Za vsako
izpostavitev (kontrola, Hg) smo uporabili po 20 lončkov, skupaj 40 lončkov. Četrtino
lončkov (pet lončkov s kontrolnim substratom in pet lončkov s kontaminiranim
substratom) s sončnicami smo zalili z destilirano vodo, četrtino z MIBF, četrtino z MII in
četrtino z MIEM, redčen v razmerju 1:10. Lončke smo prekrili s plastičnimi vrečkami, da
bi omejili izhlapevanje Hg iz substrata.
Sončnice smo gojili 5 tednov v kontroliranem okolju, v rastnih komorah pri 50 % relativni
zračni vlagi, 16/8 h dnevno/nočni periodi in temperaturi 24 0C. Zalivanje sončnic je
potekalo dvakrat tedensko, po petih tednih pa smo sončnice pripravili za nadaljnje analize.
3.5 DOLOČANJE BIOMASE RASTLIN
Po petih tednih smo poskus končali. Korenine sončnic smo namočili v vodovodno vodo za
lažjo odstranitev substrata, jih sprali z vodo in jih osušili s pomočjo papirnatih brisač.
Poganjke smo ločili od korenin, jih zavili v aluminijasto folijo, vsak paket ustrezno
označili in jih zmrznili v tekočem dušiku. Zmrznjene pakete sončnic smo nato posušili v
liofilizatorju (liofilizer Alpha 2-4 Christ). Rastlinski material se je sušil 5 dni. Po
končanem sušenju smo določili suho maso poganjkov in korenin ter strli ves material v
terilnici s pomočjo tekočega dušika.
3.6 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV
Liofilizirane poganjke smo strli v terilnici s pomočjo tekočega dušika. V čiste centrifugirke
smo zatehtali 30 mg uprašenih liofiliziranih poganjkov, vzorcu dolili 5 mL 80 % acetona
(Empatra ASC, Nemčija) ter premešali z vorteksom. Centrifugirke smo pokrili z
gumijastimi pokrovčki, označili nivo acetona in jih shranili čez noč v hladilniku. Naslednji
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
13
dan smo do označene črte vzorca dopolnili z 80 % acetonom. Vzorce smo ponovno
premešali na vorteksu in centrifugirali 2 minuti pri 2500 obratih/minuto pri sobni
temperaturi.
Absorbanco smo izmerili na spektrofotometru 8452A (HP-Hewlett Packard) pri valovnih
dolžinah 647 nm, 664 nm in 470 nm. Za kalibracijo smo pomerili absorbanco slepega
vzorca, in sicer 80 % acetona (Monni in sod., 2001). Program smo nastavili tako, da je od
vsakega izmerjenega vzorca odštel izmerjeno vrednost slepega vzorca. Iz dobljenih
absorpcij smo preračunali koncentracije pigmentov v µmol/l za klorofil a, klorofil b in
karotenoide (Graan in Ort, 1984) (Formule 2-4). Na koncu smo upoštevali še maso
rastlinskega materiala in volumen ekstrakta, da smo dobili končne koncentracije
fotosinteznih pigmentov v mg/g suhe mase (Formula 5).
�ℎ��(�� ) = 13,19 × ���� − 2,57 × ���� (2)
�ℎ�� ��� = 22,10 × ���� − 5,26 × ���� (3)
∑$%&'()*'+,'-(�� ) = .///×01234.,56×78 945:,/6×78 ;
.<5 (4)
× �== = >��7�?@ABCD9×EBFGDH9FD9
��I@9CJFIK×./// (5)
3.7 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC
Analize koncentracije živega srebra v vzorcih so bile opravljene z masno spektroskopijo z
induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS) na Kemijskem inštitutu Ljubljana, v Laboratoriju
za analizno kemijo ob pomoči dr. Bojana Budiča.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
14
3.7.1 Priprava vzorcev
3.7.1.1 Kislinski razklop vzorcev
Za razklop vzorcev smo potrebovali posebne teflonske posodice. Vanje smo zatehtali po
100 mg uprašenega liofiliziranega rastlinskega materiala. V vsako teflonko smo dodali po
3 ml 65 % dušikove kisline (HNO3, Sigma aldrich). Pripravljene vzorce smo dali v
mikrovalovno pečico MarsXpress (CEM) za razklop. Mineralizacija je potekala tako, da
smo vzorce najprej dvajset minut segrevali do 180 oC pri 1600 W, nato pa trideset minut
vzdrževali konstantno temperaturo pri 180 oC. Zaradi čim manjših izgub Hg v segretih
parah HNO3, smo vzorce ohlajali čez noč v zaprtih teflonskih posodicah na sobni
temperaturi. Ohlajene vzorce smo naslednji dan prelili v epruvete t.i. falkonke in jih redčili
z bidestilirano vodo do 5 ml. Pri vsakem razklopu smo sočasno naredili še slepi vzorec.
Raztopine vzorcev za merjenje koncentracij Hg smo pripravili tako, da smo v nove
epruvete odpipetirali 1 ml našega razklopljenega vzorca, mu dodali 50 µL inertnega
standarda (IS) (Se, Ge, Y, Ga, 10 mg kg-1) in 750 µL HCl za stabilizacijo Hg v raztopini,
ter redčili do končnega volumna 10 ml z bidestilirano vodo Mili Q.
3.7.2 Priprava standardov
Najprej smo pripravili tri založne raztopine za Hg s koncentracijo 0,2, 1 in 5 mg kg-1. Za
0,2 mg kg-1 založno raztopino smo odpipetirali 2 µl 1000 mg kg-1 standardne raztopine Hg
(Merck, Nemčija). Za 1 mg kg-1 založno raztopino smo odpipetirali 10 µl 1000 mg kg-1
standardne raztopine Hg, za 5 mg kg-1 založne raztopine pa smo odpipetirali 50 µl 1000 mg
kg-1 standardne raztopine Hg. Vsem trem raztopinam smo še dodali 200 µl 2 % HNO3 in
redčili z bidestilirano vodo do končnega volumna 10 ml.
V nadaljevanju smo pripravljene založne raztopine pomerili z ICP-MS, vrednosti (sunki/s)
pa uporabili za izdelavo umeritvene krivulje, iz katere smo odčitali koncentracije Hg v
naših vzorcih (Preglednica 1) (Slika 3).
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
15
Slika 3: Primer kalibracijske krivulje
Preglednica 1: Priprava standardnih raztopin za Hg (IS – inertni standard).
Koncentracija Hg (ppb)
V Hg (0,2 ppm) (µL)
IS (Ge, Y, Ga, Sc) (µL)
V HNO3 (µL) V (HCl) (µL) Končni volumen
0 0 50 250 750 10 0,01 0,5 50 250 750 10 0,05 2,5 50 250 750 10
Koncentracija Hg
(ppb) V Hg (1
ppm) (µL) IS (Ge, Y,
Ga, Sc) (µL) V HNO3 (µL) V (HCl) (µL) Končni
volumen 0,1 1 50 250 750 10
0,25 2,5 50 250 750 10 0,5 5 50 250 750 10
Koncentracija Hg
(ppb) V Hg (5
ppm) (µL) IS (Ge, Y,
Ga, Sc) (µL) V HNO3 (µL) V (HCl) (µL) Končni
volumen 1 2 50 250 750 10 5 10 50 250 750 10
10 20 50 250 750 10 20 40 50 250 750 10 50 100 50 250 750 10 100 200 50 250 750 10
3.7.2.1 Induktivno sklopljena plazemska masna spektroskopija (ICP-MS)
Metoda ICP-MS se zaradi svoje velike občutljivosti (0,01 – 1 µg g-1) uporablja za
elementno analizo, ki temelji na ionizaciji vzorca v plazmi, ki je raztopljen v kislini.
y = 7324x + 594,51R² = 1
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
0 20 40 60 80 100 120
sun
ki/s
Koncentracija
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
16
ICP-MS deluje na način, da združuje visoko temperaturo ICP (induktivno sklopljeno
plazmo) z masnim spektrometrom. ICP najprej sprejme aerosole, ki jih aparatura po cevki
posrka iz vzorca. Aerosoli se pod vplivom visoke temperature ionizirajo, nato pa se v
masnem spektrometru ločijo na podlagi njihove mase.
Koncentracije živega srebra smo odčitali iz kalibracijske krivulje, ki smo jo dobili iz
pripravljenih standardnih raztopin (Slika 3).
Sposobnost transporta težke kovine (TK) iz korenin v poganjke rastline se meri s
translokacijskim faktorjem (TF).
(&%*L�'$%�+ML$+N%$('& = $'*�)*(&%�+M%OP-Q'R%*M$+ℎ$'*�)*(&%�+M%OP-$'&)*+*%ℎ
Ker na koncentracijo kovin vpliva hitrost rasti rastline in prihaja do t.i. redčitvenega oz.
koncentracijskega efekta, smo uvedli še parameter, ki smo ga poimenovali »vsebnost Hg«.
»Vsebnost Hg« (µg) v koreninah in poganjkih smo določili tako, da smo koncentracijo Hg
(µg/g) v posameznem organu pomnožili z njegovo biomaso (g).
3.8 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV
Za analizo podatkov smo uporabili standardne statistične metode. Podatke smo obdelali v
programu MS Excel 2007 in programu Statistica (Statsoft 7.0.61.0.). Statistično značilne
razlike smo določili v programu enosmerna ANOVA, Duncanov test (p < 0,05), pri čemer
smo predpostavili, da so vzorci normalno porazdeljeni.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
17
4 REZULTATI
4.1 ŠTETJE KOLONIJ
Nastale kolonije, ki so zrasle po inokulaciji agarnih plošč z MII, MIBF in MIEM, smo šteli
s prostim očesom. Določili smo makromorfološke lastnosti kolonij. Makromorfološke
lastnosti opredeljuje oblika, površina, prerez in čvrstost. Kolonije vseh inokulumov so bile
bele barve. Na trdnem gojišču je bilo prisotnih več različnih oblik kolonij. Kolonije so bile
točkaste oblike, pravilno okrogle in nitaste. Robovi kolonij so bili pretežno gladki, razen
pri nitastih, kjer so bili robovi nakodrani. Površina kolonij pri vseh inokulumih je bila
gladka, prerez kolonij pa ploščat.
V petrijevkah, kjer je zraslo števno število kolonij (splošno velja, da je števna plošča za
bakterije 30-300 kolonij), smo izračunali število mikroorganizmov v 1 ml vzorca (cfu/ml)
(Formula 1) (Slika 4).
MIEM
2,91*105 cfu/ml
MIBF
8,4*107 cfu/ml
MII
8,2*107 cfu/ml
Slika 4: Agarne plošče z razvitimi kolonijami. Legenda: MIEM – komercialni mikrobni inokulum EM, MIBF – mikrobni inokulum, izoliran iz vzorca tal, nabranega na vrtu za Biotehniško fakulteto (redčitev 10-3),
MII – mikrobni inokulum, izoliran iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji (redčitev 10-3), cfu – enota za oceno števila viabilnih bakterijskih celic v vzorcu.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
18
4.2 BIOMASA SONČNIC
4.2.1 Korenine
Znotraj kontrolnega substrata med izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik.
Največjo biomaso korenin so imele sončnice, izpostavljene MIEM v substratu s Hg, ki se
statistično značilno razlikujejo od ostalih izpostavitev. Biomasa kontrolnih sončnic in
sončnic, inokuliranih z MII, ki so rasle v substratu s Hg, je bila primerljiva (Slika 5).
Faktorska analiza variance je pokazala, da je na suho maso korenin vplivala izpostavitev
Hg, inokulum in tudi njuna interakcija (Preglednica 2).
Preglednica 2: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso korenin. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS df MS F P
Izpostavitev Hg 2,15076 1 2,15076 33,8079 0,000006
Inokulum 1,63177 2 0,81589 12,8250 0,000181
Izpostavitev Hg*Inokulum 1,15537 2 0,57768 9,0806 0,001240
Napaka 1,46319 23 0,06362
Slika 5: Suha masa korenin sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
abab
aba
c
d
bc
ab
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
K MIEM MIBF MII
SM
kor
enin
(g)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
19
4.2.2 Poganjki
Tako znotraj kontrolnega substrata, kot tudi znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med
izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik (Slika 6). Suha masa poganjkov sončnic,
izpostavljenih Hg, je bila statistično večja od suhe mase poganjkov kontrolnih sončnic.
Faktorska analiza variance je pokazala, da je na suho maso poganjkov vplivala samo
izpostavitev Hg, ne pa tudi vrsta inokuluma ali njuna interakcija (Preglednica 3).
Preglednica 3: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso poganjkov. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS df MS F P
Izpostavitev Hg 34,2455 1 34,2455 91,1672 0,000000
Inokulum 0,1795 2 0,0897 0,2389 0,789425
Izpostavitev Hg*Inokulum 0,3751 2 0,1875 0,4993 0,613402
Napaka 8,6396 23 0,3756
Slika 6: Suha masa poganjkov sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
aa
aa
bb b
b
0
1
2
3
4
5
6
K MIEM MIBF MII
SM
pog
anjk
ov (
g)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
20
4.3 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV
4.3.1 Klorofil a
Tako znotraj kontrolnega substrata, kot znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med
izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik. V povprečju imajo sončnice, ki so rasle v
substratu s Hg, v poganjkih manjšo koncentracijo klorofila a (kontrolni substrat – 5,9 mg/g
SM, s Hg kontaminirani substrat – 3,4 mg/g SM) (Slika 7). S faktorsko analizo variance
smo dokazali, da je imela na koncentracijo klorofila a v poganjkih statistično značilen
vpliv samo prisotnost Hg (p < 0,05) (Preglednica 4).
Preglednica 4: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila a. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS Df MS F P
Izpostavitev Hg 54,7818 1 54,7818 176,646 0,000000
Inokulum 0,7881 2 0,3941 1,271 0,299611
Izpostavitev Hg*Inokulum 0,4149 2 0,2075 0,3101 0,521939
Napaka 7,1328 23 0,3101
Slika 7: Koncentracija klorofila a v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
a a a a
bc
cbc
bc
0
1
2
3
4
5
6
7
K MIEM MIBF MII
Kon
cen
trac
ija
klo
rofi
la a
(mg/
g S
M)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
21
4.3.2 Klorofil b
Tako znotraj kontrolnega substrata, kot znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med
izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik. V povprečju imajo sončnice, ki so rasle v
substratu s Hg, v poganjkih manjšo koncentracijo klorofila b (kontrolni substrat – 5,9 mg/g
SM, s Hg kontaminirani substrat – 1,3 mg/g SM) (Slika 8). S faktorsko analizo variance
smo dokazali, da je imela na koncentracijo klorofila b v poganjkih statistično značilen
vpliv samo prisotnost Hg (p < 0,05) (Preglednica 5).
Preglednica 5: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila b. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS Df MS F P
Izpostavitev Hg 164,5419 1 164,5419 161,8667 0,000000
Inokulum 1,5857 2 0,7928 0,7799 0,470185
Izpostavitev Hg*Inokulum 2,7322 2 1,3661 1,3439 0,280548
Napaka 23,2801 23 1,0165
Slika 8: Koncentracija klorofila b v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
a
a
aa
b
b b b
0
1
2
3
4
5
6
7
8
K MIEM MIBF MII
Kon
cent
raci
ja k
loro
fila
b(m
g/g
SM
)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
22
4.3.3 Karotenoidi
Pri sončnicah, inokuliranih z MIEM, je prišlo do statistično značilnih razlik v koncentraciji
karotenoidov v poganjkih pri izpostavitvi sončnic različnim substratom (kontrola, Hg). Pri
ostalih izpostavitvah so bile koncentracije karotenoidov v poganjkih primerljive. V
povprečju imajo sončnice, ki so rasle v substratu s Hg, v poganjkih večjo koncentracijo
karotenoidov (kontrolni substrat – 10,5 mg/g SM, s Hg kontaminirani substrat – 17,4 mg/g
SM) (Slika 9). S faktorsko analizo variance smo dokazali, da je imela na koncentracijo
karotenoidov v poganjkih statistično značilen vpliv samo prisotnost Hg (p < 0,05)
(Preglednica 6).
Preglednica 6: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo karotenoidov. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS Df MS F P
Izpostavitev Hg 24,4264 1 24,4264 8,7580 0,007028 Inokulum 6,3858 2 3,1929 1,1448 0,335763 Izpostavitev Hg*Inokulum 2,6144 2 1,3072 0,4687 0,631662
Napaka 64,1479 23 2,7890
Slika 9: Koncentracija karotenoidov v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
ab
b
abab
aa
aa
0
1
2
3
4
5
6
K MIEM MIBF MIIKon
cent
raci
ja k
arot
enoi
dov
(m
g/g
SM
)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
23
4.4 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC
4.4.1 Koncentracije živega srebra
4.4.1.1 Korenine
Korenine, ki so bile izpostavljene substratu s Hg, so imele statistično značilno višje
koncentracije Hg v koreninah v primerjavi s kontrolami. Pri sončnicah, ki so rasle v
substratu s Hg, so imele najmanjšo koncentracijo Hg v koreninah sončnice, inokulirane z
MII, medtem ko je bila koncentracija Hg v koreninah ostalih izpostavitev primerljiva in
večja. Znotraj kontrolnega substrata ni bilo statistično značilnih razlik (Slika 10). S
faktorsko analizo variance smo dokazali, da je na koncentracijo Hg v koreninah vplivala
samo izpostavitev Hg (Preglednica 7).
Preglednica 7: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v koreninah. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS df MS F P
Izpostavitev Hg 0,000446 1 0,000446 259,1056 0,000000
Inokulum 0,000011 2 0,000005 3,1825 0,060233
Izpostavitev Hg*Inokulum 0,000011 2 0,000006 3,3234 0,053968
Napaka 0,000040 23 0,000002
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
24
Slika 10: Koncentracija Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
4.4.1.2 Poganjki
Živo srebro je bilo prisotno v poganjkih vseh izpostavitev. Tako znotraj kontrolnega
substrata, kot znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med izpostavitvami ni bilo
statistično značilnih razlik. V povprečju pa imajo sončnice, ki so rasle v substratu s Hg,
statistično značilno večjo koncentracijo Hg v poganjkih (Slika 11). S faktorsko analizo
variance smo dokazali, da je na koncentracijo Hg v poganjkih vplivala samo izpostavitev
Hg (Preglednica 8).
Preglednica 8: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v poganjkih. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
a a a a
c c
c
b
0
2
4
6
8
10
12
K MIEM MIBF MII
Kon
cen
trac
ija
Hg
v k
oren
inah
(µ
g/g
SM
)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
SS df MS F P
Izpostavitev Hg 0,000000 1 0,000000 9,1548 0,006213
Inokulum 0,000000 2 0,000000 0,4596 0,637447
Izpostavitev Hg*Inokulum 0,000000 2 0,000000 0,4803 0,624930
Napaka 0,000001 22 0,000000
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
25
Slika 11: Koncentracija Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
4.4.2 Translokacijski faktor za Hg
S translokacijskim faktorjem za Hg smo pokazali statistično značilen vpliv MII na
translokacijo Hg iz korenin v poganjke sončnic (Slika 12).
Slika 12: Translokacijski faktor za Hg v sončnici pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji.
aab
ab
abcac
c
acac
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
K MIEM MIBF MII
Kon
cen
trac
ija
Hg
v po
gan
jkih
(µ
g/g
SM)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
a
a a
b
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
K MIEM MIBF MII
Tra
nsl
okac
ijsk
i fak
tor
za H
g
Izpostavitev
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
26
Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
4.4.3 Vsebnost živega srebra
4.4.3.1 Korenine
Znotraj kontrolnega substrata je bila vsebnost Hg v koreninah primerljiva oziroma pod
mejo detekcije. V povprečju imajo sončnice, ki so rasle v substratu s Hg, statistično
značilno višje vsebnosti Hg v koreninah v primerjavi s sončnicami iz kontrolnega
substrata. Pri izpostavitvi sončnic v substratu s Hg so bile prisotne statistično značilne
razlike v vsebnosti Hg v koreninah med inokulumi. Največjo vsebnost Hg v koreninah smo
zabeležili pri sončnicah, inokuliranih z MIEM, najmanjšo pa pri sončnicah, inokuliranih z
MII (Slika 13). Faktorska analiza variance je pokazala, da je na vsebnost Hg v koreninah
vplivala izpostavitev Hg, inokulum in tudi njuna interakcija (Preglednica 9).
Preglednica 9: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS df MS F P
Izpostavitev Hg 621,5575 1 621,5575 57,70407 0,000000
Inokulum 158,0920 2 79,0460 7,33846 0,003428
Izpostavitev Hg*Inokulum 158,6824 2 79,3412 7,36587 0,003371
Napaka 247,7437 23 10,7715
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
27
Slika 13: Vsebnost Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
4.4.3.2 Poganjki
Tako znotraj kontrolnega substrata, kot znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med
izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik. Vsebnost Hg v poganjkih, izpostavljenih
s Hg, je bila statistično značilno večja od vsebnosti Hg v poganjkih kontrolnih sončnic
(Slika 14). Faktorska analiza variance je pokazala, da je na vsebnost Hg v poganjkih
vplivala samo prisotnost Hg, ne pa tudi vrsta inokuluma ali njuna interakcija (Preglednica
10).
Preglednica 10: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v poganjkih. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS Df MS F P
Izpostavitev Hg 22,9473 1 22,9473 25,4395 0,000042
Inokulum 0,5498 2 0,2749 0,3047 0,740241
Izpostavitev Hg*Inokulum 1,5355 2 0,7678 0,8511 0,439938
Napaka 20,7467 23 0,9020
a a a a
c
d
bc
b
0
5
10
15
20
25
K MIEM MIBF MIIVse
bno
st H
g v
kore
nin
ah (
µg)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
28
Slika 14: Vsebnost Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
4.4.3.3 Skupna vsebnost Hg v sončnicah
Kot že omenjeno na koncentracijo kovin vpliva hitrost rasti rastline in tako prihaja do
redčitvenega oziroma koncentracijskega efekta. Znotraj kontrolnega substrata v skupni
vsebnosti Hg v rastlini ni bilo statistično značilnih razlik. Pri izpostavitvi sončnic s Hg so
bile prisotne statistično značilne razlike v vsebnosti Hg v rastlini med inokulumi, kjer smo
pri MIEM zabeležili najvišjo skupno vsebnost Hg v rastlini, pri sončnicah inokuliranih z
MII, pa najmanjše (Slika 15). Faktorska analiza variance je pokazala, da je na skupno
vsebnost Hg na rastlino vplivala izpostavitev Hg, inokulum in tudi njuna interakcija
(Preglednica 11).
Preglednica 11: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.
SS df MS F P
Izpostavitev Hg 883,361 1 883,361 67,71621 0,000000
Inokulum 175,735 2 87,868 6,73570 0,004982
Izpostavitev Hg*Inokulum 189,952 2 94,976 7,28060 0,003551
Napaka 300,036 23 13,045
a a aa
b
b
b
b
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
K MIEM MIBF MII
Vse
bnos
t H
g v
poga
njk
ih (µ
g)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
29
Slika 15: Skupna vsebnost Hg korenin in poganjkov pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).
a a a a
c
d
c
b
0
5
10
15
20
25
K MIEM MIBF MII
Vse
bn
ost
Hg
v ra
stli
ni (
µg)
Izpostavitev
kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
30
5 DISKUSIJA
5.1 KOLONIJE
Kontrolo kakovosti pripravljenih mikrobnih inokulumov smo preverjali z metodo štetja
kolonij z razmazovanjem. V MII in MIBF je bilo prisotno podobno število
mikroorganizmov, medtem ko smo v MIEM našteli bistveno manj kolonij. Čeprav je bilo
prisotnih manj mikroorganizmov, je MIEM v primerjavi z drugimi, še vedno imel močnejši
vpliv na biomaso korenin sončnic in vsebnost Hg v koreninah.
Kolonije so bile med različnimi mikrobnimi inokulumi po makromorfoloških lastnosti
podobne. Na podlagi pridobljenih rezultatov predvidevamo, da kljub tem podobnostim,
združbe mikroorganizmov niso bile enake, saj so bile prisotne statistično značilne razlike v
biomasi korenin in koncentracijah Hg v koreninah med inokulumi.
5.2 BIOMASA SONČNIC
V našem poskusu se je pri biomasi korenin pokazal statistično značilen vpliv MIEM na
korenine sončnic, ki so rasle v substratu s Hg, medtem ko so bile vrednosti med ostalimi
izpostavitvami primerljive. Sončnice, ki so bile izpostavljene MIEM v substratu s Hg, so
imele v povprečju enkrat večjo biomaso korenin. Predvidevamo, da so ti rezultati posledica
delovanja fototrofnih in mlečnokislinskih bakterij ter kvasovk, za katere proizvajalci trdijo,
da pripomorejo k močnejšemu koreninskemu sistemu. Ta vpliv ni bil opazen pri kontrolnih
sončnicah in ga ne znamo pojasniti.
Do podobnih zaključkov so leta 2013 prišli tudi Quinones in sod. Semena od Lupinus
albus so kalili v substratu z različnimi koncentracijami Hg (0, 50, 100, 150 in 200 mg/kg)
in jih ob tem inokulirali s Hg-tolerantnimi in s Hg-občutljivi sevi. Opazili so, da rastline, ki
so rasle do koncentracije 50 µM substratu s Hg, niso imele značilnih fenotipičnih razlik v
odvisnosti od vrste bakterij. To so pripisali dejstvu, da so rastline, kljub izpostavitvi Hg
sposobne obdržati homeostazo, ne da bi pri tem prišlo do učinkov strupenosti.
5.3 FOTOSINTEZNI PIGMENTI
Prisotnost prekomerne koncentracije kovin v rastlinah lahko negativno vpliva na njihovo
delovanje, zlasti na fotosintezo. Težke kovine so sposobne zavirati delovanje nekaterih
fotosinteznih encimov in biosintezo klorofila. Kovine lahko poškodujejo tudi tilakoidno
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
31
membrano in na ta način motijo elektronsko prenašalno verigo elektronov (Aggarwal in
sod., 2011).
S poskusom smo dokazali, da tako znotraj kontrolnega substrata, kot znotraj s Hg
kontaminiranega substrata, med različnimi izpostavitvami ni bilo statistično značilnih
razlik, kar kaže na to, da mikrobne združbe niso imele vpliva na koncentracijo klorofilov v
poganjkih. Koncentracija klorofila a in b je bila pri sončnicah, ki so rasle v substratu s Hg,
manjša. Znano je, da Hg velikokrat nadomesti atome magnezija v klorofilu, s čimer zavira
fotosintezo (Patra in Sharma, 2000). Kot posledico Hg, so zmanjšano vsebnost klorofilov
na sadikah kumar ugotovili tudi Cargnelitti in sod. (2006). To so pripisali sintezi prostih
kisikovih radikalov, ki povzročajo peroksidacijo membran in zavirajo sintezo klorofila. V
našem poskusu so bile koncetracije Hg v poganjkih relativno majhne (pod 1 µg g-1), zato
zmanjšanje koncentracije klorofilov ne moremo neposredno pripisati Hg, nakopičenem v
poganjkih. Najverjetneje gre za posredne vplive preko koreninskega sistema, kjer Hg
zaradi negativnih interakcij s celično steno in membrano moti privzem mineralnih hranil,
kot so magnezij (Mg) in železo (Fe), ki sta potrebna za sintezo klorofila (Boening, 2000).
5.4 KONCENTRACIJE HG V SONČNICAH
S pridobljenimi rezultati smo potrdili našo hipotezo, da se bo večina Hg akumuliralo v
koreninah, saj služijo kot ovira za prenos Hg v nadzemne dele. Pri kontrolnih sončnicah
smo v poganjkih zasledili Hg kot posledica volatilizacije Hg0 iz lončkov, medtem ko je bil
v koreninah kontrolnih sončnic Hg pod mejo detekcije.
Naši rezultati so pokazali statistično značilen vpliv MII na koncentracijo Hg v koreninah.
Koncentracija Hg je bila statistično značilno manjša v primerjavi z ostalimi izpostavitvami.
Pri rastlinah učinkovitost privzema in translokacijo kovine v poganjke ocenimo s
translokacijskim faktorjem (TF). Gre za razmerje med koncentracijami težkih kovin v
poganjkih in koreninah. Če je razmerje med poganjki in koreninami >1, se težke kovine v
manjši meri zadržujejo v koreninah, ker se po ksilemu transportirajo v poganjke (Baker,
1981). V našem poskusu je bil TF značilno <1, vendar so bile med izpostavitvami opazne
razlike. TF se je pri MII statistično značilno razlikoval od ostalih izpostavitev.
V koreninah, ki so rasle v substratu s Hg, je bila koncentracija Hg ob dodatku MII
statistično značilno nižja, medtem ko v poganjkih statistično značilnih razlik ni bilo. Zato
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
32
predvidevamo, da so bile pri MII prisotne takšne bakterije, ki znižujejo koncentracijo Hg v
koreninah s tem, da povečujejo translokacijo Hg v poganjke. Predvidevamo, da je šlo več
Hg iz korenin po ksilemu v poganjke, ki je nato volatiliziral v atmosfero in se usedal nazaj
na liste. Ker koncentracije volatiliziranega Hg nismo izmerili, tega ne moremo z gotovostjo
trditi.
Do podobnih rezultatov so prišli tudi Heaton in sod. (1998), ki so rastline, izpostavljene
Hg, inokulirali z bakterijami, ki vsebujejo gene merA in merB. Predpostavljali so, da lahko
merA rastline transformirajo koreninam dostopen Hg2+ v manj toksično Hg0, ki nato
volatilizira in posledično zniža koncentracijo Hg v koreninah. Tega pri našem poskusu ne
moremo potrditi, saj imamo le podatek, da so bili mikrobi izolirani iz vrta v Idriji. Da bi
ugotovili, ali smo imeli znotraj MII bakterije, ki so vsebovale gene merA, bi bilo potrebno
opraviti verižno reakcijo s polimerazo.
V nasprotju z našim poskusom so de Souza in sod. (1999) na močvirnatih rastlinah
preučevali vpliv rizosfernih bakterij na akumulacijo selena (Se) in Hg. V rastlini se je v
prisotnosti rizosfernih bakterij akumuliralo za 70-80 % več Se v koreninah in za 40-60 %
več Se v poganjkih, v primerjavi z neinokuliranimi rastlinami. V prisotnosti bakterijskega
inokuluma se je povečala tudi koncentracija Hg v koreninah, in sicer za 35-65 %.
S pomočjo koncentracij Hg (µg/g SM) in celotne mase korenin in poganjkov (g) smo
preračunali tudi vsebnost Hg v rastlini. Rezultati so pokazali statistično značilen vpliv
MIEM na biomaso in koncentracijo Hg v sončnicah. Vsebnost Hg v koreninah sončnic,
izpostavljenih MIEM, je bila v povprečju enkrat večja kot pri ostalih izpostavitvah, zaradi
enkrat večje biomase korenin.
V poganjkih med različnimi izpostavitvami v substratu s Hg, so bile koncentracije Hg
primerljive in večje od kontrolnih. Kontrolne sončnice so rasle v drugi komori pri istih
razmerah, vendar so kljub temu vsebovale nekaj Hg. Verjetno gre za kopičenje Hg0 v
zračnem prostoru komor, ki je lahko posledica kontaminacije z predhodnjimi poskusi na
Hg.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
33
6 SKLEPI
• Sončnice, inokulirane z MII, v prisotnosti Hg, niso rasle bolje od rastlin,
inokuliranih z MIBF in MIEM.
• Največje koncentracije Hg so bile prisotne v koreninah sončnic.
• MII je zmanjšal akumulacijo Hg v korenine s tem, da je povečal translokacijo iz
korenin v poganjke.
• Različne združbe mikrobnih inokulumov niso vplivale na rast sončnic v substratu s
Hg, razen MIEM, ki je povečal maso koreninskega sistema, s tem pa tudi privzem
Hg v korenine. Na to temo predlagam nadaljnje raziskave ali je MIEM dejansko
dobro uporabljati, kadar so v tleh prisotne težke kovine.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
34
7 VIRI
Aggarwal ., Sharma I., Tripathi B.N., Munjal A.K., Baunthiyal M., Sharma V. 2011. Metal
toxicity and photosynthesis. Department of bioscience and biotechnology, 16:
229-236.
Baker A.J.M. 1981. Accumulators and excluders: strategies in the response of plants to
heavy metals. J. Plant Nutrition, 3: 643-654.
Bakir F., Damluji S.F., Amin-Zaki L., Murtadha M., Khalidi A., Al-Rawi N.Y., Tikriti S.,
Dhahir H.I., Clarkson T.W., Smith J.C., Doherty R.A. 1973. Methylmercury
poisoning in Iraq. Science, 181, 4096: 230-241.
Barkay T., Miller S.M., Summers A.O. 2003. Bacterial mercury resistance from atoms to
ecosystems. FEMS Microbiology reviews, 27: 355-384.
Barkay T., Wagner-Dobler I. 2005. Microbial transformation of mercury: potentials,
challenges and achievements in controlling mercury toxicity in the environment.
Advances in applied microbiology, 57: 1-52.
Benoit J.M., Gilmour Cynthia C., Heyes A., Mason R.P., Miller C. 2003. Geochemical and
biological controls over methylmercury production and degradation in aquatic
ecosystems. Biogeochemistry of environmentally important trace elements, 262-
297.
Boening D.W. 2000. Ecological effects, transport and fate of mercury: a general review.
Chemosphere, 40, 12: 1335-51.
Brenčič J., Lazarini F. 1995. Splošna in anorganska kemija. Ljubljana: DZS.
Cargnelutti D., Tabaldi L.A., Spanevello R.M., Jucoski G.O., Battisti V., Redin M.,
Linares C.E.B., Dressler V.L., Flores M.M., Nicoloso F.T., Morsch V.M.,
Schetinger M.R.C. 2006. Mercury toxicity induces oxidative stress in growing
cucumber seedlings. Chemosphere, 65, 6: 999–1006.
Compeau G.C., Bartha R. 1985. Sulfate-Reducing Bacteria: principal methylators of
mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and environmental microbiology,
50, 2: 498-502.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
35
Čadež P., Mahne I. 2005. Praktikum iz fiziologije mikroorganizmov, http://web.bf.uni-
lj.si/zt/mikro/homepage/Praktikumfiziologija.pdf
EPA: Rice G.E., Bullock O.R., Ambrose R.B., Swartout J. 1997. Fate and transport of
mercury in the environment. Mercury study report to congress, 3.
Glick B.R. 2010. Using soil bacteria to facilitate phytoremediation. Biotechnology
advances, 28, 367-374.
Gochfeld M. 2003. Cases of mercury exposure, bioavailability, and absorption.
Ecotoxicology and environmental safety, 56, 1: 174-179.
Graan T., Ort D.R. 1984. Quantitation of the rapid electron donors to P700, the functional
plastoquinone pool and the ratio of the photosystems in spinach chloroplasts. J.
Biol. Chem. 259: 14,003-14,010.
Gracey, H. I. & J. B. W. Stewart. 1974. Canad. J. Soil Sci. 54: 105.
Heaton A.C.P., Rugh C.L., Wang N., Meagher R.B. 1998. Phytoremediation of mercury-
and methylmercury- polluted soils using genetically engineered plants. Journal of
Soil Contamination, 7, 4:497-509.
Henry J.R. 2000. An overview of the phytoremediation od lead and mercury. NNEMS
Report. Washinton, D.C.
Jensen S., Jernelov A. 1969. Biological methylation of mercury in aquatic organisms.
Nature, 223, 753-754.
Kapulnik Y., Okon Y. 1996. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. University of
Michigan Library, 48, 869-885.
Khan A.G., Kuek C., Chaudhry T.M., Khoo C.S., Hayes W.J. 2000. Role of plants,
Mycorrhizae and phytochelators in heavy metal contaminated land remediation.
Chemosphere, 41: 197-207.
Kelly C.A., Rudd J.W.M., Louis V.L. Heyes A. 1995. Is total mercury concentration a
good predictor of methyl mercury concentration in aquatic systems. Water, air and
soil pollution, 80, 1: 715-724.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
36
Monni S., Uhlig C., Junttila O., Hansen E., Hynynen J. 2001. Chemical composition and
ecophysiological responses of Empetrum nigrum to above ground element
application. Environmental Pollution 112: 417-426.
Moorby H., White R.E., Nye P.H. 1988. The influence of phosphate nutrition on H+ ion
efflux from the roots of young rape plants. Plant and Soil, 105: 247-256.
Nascimento A.M.A., Chartone-Souza E. 2003. Operon mer: Bacterial resistance to
mercury and potential for bioremediation of contaminated environments. Genetics
and molecular research, 2, 1: 92-101.
Oremland R.S., Culbertson C.W., Winfrey M.R. 1991. Methylmercury decomposition in
sediments and bacterial cultures: involment of methanogens and sulfate reducers
in oxidative demethylation. Applied and environmental microbiology, 57, 1: 130-
137.
Osborn A.M., Bruce K.D., Strike P., Ritchie D.A. 1997. Distribution, diversity and
evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon. FEMS
Microbiological reviews, 19, 4: 239-262.
Patra A., Sharma A. 2000. Mercury toxicity in plants. The Botanical review, 66, 3: 379-
422.
Quiñones M.A., Ruiz-Díez B., Fajardo S., López-Berdonces M.A., Higueras P.L.,
Fernández-Pascual M. (2013). Lupinus albus plants acquire mercury tolerance
when inoculated with an Hg-resistant Bradyrhizobium strain. Plant physiology
and biochemistry, 73: 168-175.
Robinson J.B., Tuovinen O.H. 1984. Mechanisms of microbial resistance and
detoxification of mercury and organomercury compounds: physiological,
biochemical and genetic analyses. Microbiological Reviews, 48, 2: 95-124.
Stamenkovic J., Gustin M.S., Marvin-DiPasquale M.C., Thomas B.A., Agee J.L. 2004.
Distribution of total and methyl mercury in sediments along Steamboat Creek
(Nevada, USA). Science of the total environment, 300: 167-177.
Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.
37
de Souza M.P., Huang C.P., Chee N., Terry N. 1999. Rhizosphere bacteria enhance the
accumulation of selenium and mercury in wetland plants. Planta, 209, 2: 259-263.
Urbanc M. 2010. Idrijski rudnik živega srebra. DEDI - digitalna enciklopedija naravne in
kulturne dediščine na Slovenskem, http://www.dedi.si/dediscina/220-idrijski-
rudnik-zivega-srebra.
Wood J.M. 1974. Biological cycles for toxic elements in the environment. Science, 183,
4129: 1049-1052.
Wood J.M. 1984. Alkylation of metals and the activity of metal alkyls. Toxicological and
environmental chemistry, 7, 3: 229-240.
Yan-de J., Zhen-li H., Xiao-e Y. 2007. Role of soil rhizobacteria in phytoremediation of
heavy metal contaminated soils. Journal of Zhejiang university-Science B, 8, 3:
192-207.
Zayed A.M., Lytle C.M., Terry N. 1998. Accumulation and volatilization of different
chemical species of selenium by plants. Planta, 206: 284-292.
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš, ki mi je prijazno
pomagala in svetovala pri izdelavi diplomske naloge. Iz srca se ji zahvaljujem za ves
trud in čas, ki mi ga je namenila; le z njeno pomočjo in strokovnim znanjem je lahko
nastalo to diplomsko delo.
Zahvaljujem se tudi ostalima članoma komisije za hiter pregled diplomskega dela in
predlagane popravke.
Najlepše se zahvaljujem dr. Evi Kovačec, ki mi je pri izdelavi diplomske naloge ves čas
pomagala in me usmerjala pri praktičnem in teoretičnem delu naloge.
Zahvaljujem se tudi mladim raziskovalkam (doktorantkam) Anji Kavčič, Mateji Potisek
in Marti Debeljak za njihovo pomoč, nasvete in usmeritve.
Hvala Mileni Kubelj za praktično usmeritev poskusa in Nini Brudar za pomoč pri
izvajanju praktičnega dela.
Navsezadnje se najbolj zahvaljujem svoji družini, ki so mi omogočili študij in mi s tem
odprli svet. Hvala za vso njihovo podporo, razumevanje in potrpežljivost v času študija.