Post on 11-Nov-2018
UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO
Mestrado Profissional em Farmácia
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
Maéli Mosena Ferri Civa
Síntese, caracterização e avaliação do potencial
antioxidante de complexos metálicos de diosmina
São Paulo
2012
UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO
Mestrado Profissional em Farmácia
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
Maéli Mosena Ferri Civa
Síntese, caracterização e avaliação do potencial
antioxidante de complexos metálicos de diosmina
Dissertação apresentada à Universidade
Bandeirante de São Paulo, como requisito
de conclusão do Mestrado Profissional em
Farmácia Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos.
Orientadora: Profª. Drª. Regina Mara Silva
Pereira
São Paulo
2012
UNIVERSIDADE BANDEIRANTE DE SÃO PAULO
Mestrado Profissional em Farmácia
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
Maéli Mosena Ferri Civa
Síntese, caracterização e avaliação do potencial
antioxidante de complexos metálicos de diosmina
Dissertação apresentada à Universidade
Bandeirante de São Paulo, como requisito
de conclusão do Mestrado Profissional em
Farmácia Produtos Naturais e Sintéticos
Bioativos.
Aprovada em: ___________________________________________________
Banca Examinadora:
_______________________________________________________________
1º Membro Titular Externo: Prof. Dr. Erick Leite Bastos (USP)
_______________________________________________________________
2º Membro Titular Interno: Profª. Drª. Claudete Justina Valduga (UNIBAN)
_______________________________________________________________
Presidente - Orientadora: Profª. Drª. Regina Mara Silva Pereira (UNIBAN)
Dedico este trabalho às pessoas que
lutam diariamente ao meu lado, com
determinação, coragem e paciência, tornando os
meus dias mais fáceis e felizes, ao meu esposo
Mário, aos meus pais e irmãos pelo apoio
recebido.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força espiritual para a realização desse trabalho.
Aos meus pais Alfeu e Maria e irmãos Marlos e Maiara, pelo orgulho, pelo
apoio, pela compreensão, e em especial, por todo carinho ao longo deste percurso.
Ao meu marido Mário, pelo carinho, apoio, compreensão e pela grande ajuda.
Aos meus amigos e a todos os colegas de curso, em especial Dayany e
Daniel, pela cumplicidade, grande ajuda e amizade.
A todos os componentes do Mestrado Profissional em Farmácia, aos técnicos
dos laboratórios, aos professores, em especial às professoras, Drª. Susana Diniz,
Drª. Claudete Valduga, Drª. Isis Arvati e Drª. Cristina Okuyama, pelo conhecimento
adquirido, e colaboração extremada.
E por fim, à professora Drª. Regina Mara Sila Pereira, pela orientação deste
trabalho, conhecimento e carinho durante todos esses meses.
“Não se pode ensinar tudo a alguém,
pode-se apenas ajudá-lo a encontrar por si
mesmo”.
Galileu Galilei
RESUMO
CIVA, M. F. Maéli. Síntese, caracterização e avaliação do potencial antioxidante
de complexos metálicos de diosmina. Dissertação. Curso de Mestrado
Profissional em Farmácia da Universidade Bandeirante (UNIBAN). São Paulo. p. 80,
2012.
A busca por novos compostos com potencial bioativo é objeto de estudo de
muitos pesquisadores, o que motiva a utilização de flavonóides, devido ao
conhecimento de suas atividades biológicas. Uma das formas de investigação é a
complexão destes com metais de transição, com a finalidade de se obter novas
moléculas com maior atividade biológica e baixa toxicidade.
O flavonóide diosmina é considerado um agente protetor vascular da
circulação periférica de retorno, utilizada para tratar a insuficiência venosa crônica,
hemorroidas, linfedema e varizes. Também possui atividade anti-inflamatória e
antioxidante. Outras atribuições recentes da diosmina vêm sendo investigadas como
agente no combate ao câncer, síndrome pré-menstrual, colite e diabetes.
A diosmina foi complexada com metais de transição Cu (II), Ni (II), Fe (II) e Co
(II). Os complexos obtidos, diosmina-Cu (II), diosmina-Ni (II), diosmina-Fe (III) e
diosmina-Co (II), foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho (IV) e
ultravioleta (UV) e também por espectrometria de massas (EM).
Neste trabalho, também foram avaliadas as propriedades antioxidante dos
complexos obtidos de acordo com a metodologia do radical orgânico ABTS˙ˉ. Os
complexos diosmina-Fe e diosmina-Cu apresentaram atividade antioxidante melhor
em comparação à diosmina e aos demais complexos.
Palavras-chave: flavonóide - diosmina - complexos - metais de transição
ABSTRACT
CIVA, M. F. Maéli. Synthesis, characterization and evaluation of the antioxidant
potential of metal complexes from diosmin. Dissertation. Professional Master
Course in Pharmacy at the University Bandeirante (UNIBAN). Sao Paulo. p. 80,
2012.
Searching for new compounds with bioactive potential, is object of study by
many researchers, which motivates the use of flavonoids because the knowledge
about their biological activities. One way of investigation is the complexation of
flavonoids with transition metals in search for new molecules with increased
biological activity and low toxicity.
Flavonoid diosmin is considered a vascular protective agent from the
peripheral circulation of return used to treat chronic venous insufficiency,
hemorrhoids, lymphedema, and varicose veins. It also has anti-inflammatory and
antioxidant activity. Other recent assignments of diosmin have been investigated as
an agent against cancer, premenstrual syndrome, colitis and diabetes.
The diosmin was complexed with transition metals Cu (II), Ni (II), Fe (II) and
Co (II). The diosmin-Cu (II), diosmin-Ni (II), diosmin-Fe (III) and diosmin-Co (II)
complexes obtained, were characterized by infrared spectroscopy (IR), ultraviolet
(UV) and by mass spectrometry (MS).
This work also evaluated the antioxidant properties of the complexes obtained,
in accordance with the methodology of organic radical ABTS˙ˉ. The complex diosmin-
Fe and diosmin-Cu showed the best antioxidant activity in comparison with diosmin
and the other complexes.
Keywords: flavonoid - diosmin - complexes - transition metals
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo biossintético dos flavonóides (metabólitos secundários) ............. 18
Figura 2 - Estrutura geral dos flavonóides............................................................. 19
Figura 3 - Esqueletos básicos de flavonóides........................................................ 19
Figura 4 - Estrutura da diosmina............................................................................ 20
Figura 5 - Scrophularia nodosa.............................................................................. 21
Figura 6 - Diferença estrutural da diosmina (A) e hesperidina (B) ........................ 22
Figura 7 - Estrutura da hesperitina ........................................................................ 24
Figura 8 - Estrutura da diosmetina ..................................................................... 25
Figura 9 - Aspecto macroscópico dos complexos formados diosmina-Cu (A),
diosmina-Co (B), diosmina-Ni (C) e diosmina-Fe (D)............................
37
Figura 10 - Estrutura do radical ABTS2-..................................................................... 40
Figura 11 - Estrutura do radical ABTS˙ˉ................................................................... 41
Figura 12 - Estrutura do trolox ................................................................................. 42
Figura 13 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Cu
em azul .................................................................................................
46
Figura 14 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Ni em
azul .......................................................................................................
46
Figura 15 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Fe
em azul ................................................................................................
47
Figura 16 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Co
em azul ................................................................................................
47
Figura 17 - Espectro UV da diosmina-Cu em comparação a diosmina................... 49
Figura 18 - Espectro UV da diosmina-Ni em comparação a diosmina..................... 49
Figura 19 - Espectro UV da diosmina-Fe em comparação a diosmina ................... 50
Figura 20 - Espectro UV da diosmina-Co em comparação a diosmina .................. 50
Figura 21 - Espectros UV da diosmina em comparação aos complexos D-Cu (II),
D-Co (II), D-Fe (II) e D-Ni (II).................................................................
51
Figura 22 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Cu e seus
principais fragmentos ............................................................................
53
Figura 23 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Co e seus
principais fragmentos ............................................................................
54
Figura 24 - Estrutura proposta para os complexos da diosmina-metal (Cu, Ni e
Co).........................................................................................................
55
Figura 25 - Estrutura proposta para o complexo diosmina-Fe ................................ 56
Figura 26 - Curva de decaimento do radical ABTS˙ˉ pelo composto diosmina-Fe.. 57
Figura 27 - % Inibitória do radical ABTS˙ˉ pelas concentrações dos complexos e
da diosmina............................................................................................
57
Figura 28 - Consumo do radical ABTS˙ˉ (µM) versus as concentrações da
diosmina-Fe (µM), demonstrando o n = 3,3683 (3,4) calculado da
diosmina-Fe...........................................................................................
58
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 - Quantidades dos reagentes utilizados para formação dos complexos.. 37
Quadro 2 - Diluições e concentrações da diosmina e dos complexos diosmina-
metal.......................................................................................................
41
Tabela 1 - Solubilidade dos compostos ................................................................. 45
Tabela 2 - Principais bandas na espectroscopia no infravermelho da diosmina e
dos complexos ....................................................................................
48
Tabela 3 - Principais bandas na espectroscopia no infravermelho da diosmina e
dos complexos ......................................................................................
52
Tabela 4 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) da diosmina-
e dos complexos ...................................................................................
59
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA............................................................... 13
2.1 Radicais livres..................................................................................... 13
2.2 Flavonóides.......................................................................................... 17
2.3 Flavonóides diosmina e hesperidina................................................... 20
2.4 A utilização terapêutica de metais....................................................... 26
2.5 Compostos de coordenação................................................................ 28
2.6 Complexação de flavonóides com metais de transição...................... 28
3 OBJETIVO............................................................................................ 33
3.1 Objetivo geral........................................................................................ 33
3.2 Objetivos específicos............................................................................ 33
4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................... 34
4.1 Material e equipamentos utilizados.................................................... 34
4.2 Reagentes e solventes utilizados......................................................... 35
4.3 Síntese da diosmina com os metais de transição ............................... 36
4.4 Teste de solubilidade dos compostos................................................... 37
4.5 Caracterização dos complexos ............................................................ 38
4.6 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos.......................... 39
4.6.1 Determinação da atividade antioxidante dos complexos de diosmina-
metal pela captura do radical livre ABTS˙ˉ...........................................
39
4.6.2 Preparo da solução tampão fosfato 20 mM pH 7,4 ............................. 39
4.6.3 Preparo da solução ABTS2- 2 mM ...................................................... 39
4.6.4 Preparo da solução de ABTS˙ˉ 100 µM ............................................... 40
4.6.5 Preparação das soluções de diosmina e diosmina-metal para os
testes de atividade antioxidante...........................................................
41
4.6.6 Avaliação da atividade antioxidante da diosmina e complexos
diosmina-metal.....................................................................................
42
4.6.7 Determinação da atividade antioxidante total (AAT)............................ 42
4.6.8 Determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox
(TEAC)..................................................................................................
43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................... 44
5.1 Síntese dos complexos de coordenação de diosmina-metal............... 44
5.2 Solubilidade dos complexos diosmina-metal........................................ 44
5.3 Espectroscopia no Infravermelho (IV).................................................. 45
5.4 Espectroscopia no Ultravioleta (UV)..................................................... 48
5.5 Análise elementar................................................................................. 52
5.6 Espectrometria de massas (EM).......................................................... 52
5.7 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos diosmina-metal 56
5.7.1 Método ABTS˙ˉ............................................................................. 56
6 CONCLUSÃO....................................................................................... 60
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................... 61
ANEXOS.............................................................................................. 69
12
1 INTRODUÇÃO
A oxidação é um processo metabólico presente nas células para a produção
de energia, no entanto, o metabolismo do oxigênio gera de radicais livres, que
quando em excesso, provocam danos extensivos. O estresse oxidativo vem sendo
associado ao desenvolvimento de doenças degenerativas crônicas,
cardiovasculares, inflamatórias bem como ao desenvolvimento de câncer.
Os flavonóides são substâncias naturais derivadas de metabólitos
secundários de plantas presentes principalmente nas folhas, flores e frutos, ou ainda
podem ser semissintéticos. Possuem atividade antioxidante conhecida e explorada
devido aos seus principais mecanismos de ação serem as interações diretas com
enzimas biológicas, radicais livres e metais de transição, prevenindo o organismo
dos efeitos adversos destas espécies quando geradas em excesso.
Possuem estruturas derivadas de benzeno e piranos e também anéis
fenólicos, com uma infinidade de formas diferentes. Estudos sugerem e demonstram
que flavonóides quando complexados com metais de transição, apresentam
propriedades melhoradas, em comparação aos flavonóides em sua forma livre.
A diosmina é um flavonóide da classe das flavonas usada como medicamento
(Daflon 500®, Flavenos®, Diosmin®) em associação ao flavonóide hesperidina uma
flavanona. A diosmina semissintética é conhecida por apresentar propriedades
venotônica e venoprotetora dentre outras.
Poucos estudos são encontrados na literatura quanto a sua complexação com
metais de transição. Em estudos realizados neste trabalho com complexos de Cu
(II), Ni (II), Fe (III) e Co (II) observou-se um aumento da capacidade antioxidante da
diosmina complexada. Outra área de interesse é o estudo das propriedades
antitumorais dos complexos que se encontram em andamento.
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Radicais livres
Na atualidade é crescente a variedade de pesquisas realizadas para melhor
compreensão sobre os radicais livres e os danos que possam causar ao organismo.
Há um enorme interesse no estudo e na busca de novos compostos com atividade
antioxidante devido ao conhecimento sobre os efeitos dos radicais livres e espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio no organismo (BARREIROS e DAVID, 2006; HECK,
et al., 2011).
Radicais livres são átomos ou moléculas altamente reativos e que possuem
elétrons ímpares na sua última camada eletrônica. “É este não emparelhamento de
elétrons da última camada que confere alta reatividade a esses átomos ou
moléculas” (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
A oxidação é parte fundamental do nosso metabolismo para cumprir funções
fisiológicas relevantes como a geração de energia para a célula. E assim, os radicais
livres naturalmente e continuamente são formados em pequenas quantidades pelos
processos normais do metabolismo. Atuando como mediadores para a transferência
de elétrons para as várias funções bioquímicas.
Os mecanismos de geração de radicais livres ocorrem normalmente nas
mitocôndrias, membranas celulares e citoplasma das células. Sendo que nas células
de organismos aeróbios (que necessitam de oxigênio para sobreviver) as
mitocôndrias consomem 85 – 90% do oxigênio (O2), o restante deste, 10 – 15% são
utilizados por enzimas como oxidases, oxigenases e por reações químicas de
oxidação diretas (BARBOSA, et al., 2010).
Devido à produção contínua de radicais livres, pelos processos metabólicos
celulares, o organismo desenvolveu mecanismos de defesa antioxidante, com o
objetivo de limitar a geração destes intracelularmente e controlar a ocorrência de
danos. Por alguma disfunção biológica, genética ou proveniente dos alimentos estas
espécies reativas, em determinadas situações podem aumentar e causar danos para
as biomoléculas quando gerados em excesso (MIRA, et al., 2002; BARREIROS e
DAVID, 2006).
14
É importante ressaltar que esses radicais livres cujo elétron desemparelhado
encontra-se centrado nos átomos de oxigênio ou nitrogênio são denominados ERO
(espécies reativas de oxigênio) e ERN (espécies reativas de nitrogênio),
respectivamente. Sendo estes os responsáveis por inúmeras patogenias, pois nem
todas as substâncias denominadas radicais livres apresentam elétrons
desemparelhados em sua última camada. Como é o caso do peróxido de hidrogênio
(H2O2) (BARBOSA, et al., 2010).
No organismo, os radicais livres estão fisiologicamente envolvidos na
produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, fertilização do
óvulo, ativação de genes, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas
importantes, dentre outras.
Os termos ERO compreendem radicais como superóxido (O2•), derivado do
oxigênio molecular (O2); hidroxila (OH•); peroxila (ROO•/LO2•); hidroperoxila (HO2•) e
alcoxila (RO•/LO•); bem como espécies não radicalares derivadas de oxigênio como
peróxido de hidrogênio (H2O2), extremamente reativo e tóxico para as células.
Dentre as ERN incluem-se o óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O2), ácido
nitroso (HNO2), nitritos (NO2), nitratos (NO3) e peroxinitritos (ONOO-) dentre outras
(FERREIRA e MATSUBARA, 1997; BARREIROS e DAVID, 2006; DORNAS, et al.,
2007; BARBOSA, et al., 2010).
A situação de desequilíbrio entre espécies oxidantes e sua destruição
denomina-se estresse oxidativo. Este pode conduzir o organismo à um metabolismo
anormal com perda de funções fisiológicas e a doenças. Como por exemplo, a
agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, às enzimas, aos carboidratos
e ao DNA (MIRA, et al., 2002; FERNANDEZ, et al., 2007; BARBOSA, et al., 2010)..
Essa agressão causada gera doenças como aterosclerose, trauma, infarto do
miocárdio, isquemia tecidual, inflamação, artrite, Parkinson, Alzheimer, acidente
vascular cerebral (AVC), o envelhecimento celular precoce e principalmente câncer
(FERREIRA e MATSUBARA, 1997; BARREIROS e DAVID, 2006; DORNAS, et al.,
2007).
Outra preocupação é com a presença de metais e o estresse oxidativo.
Metais de transição, como o ferro e o cobre participam de reações de óxido-redução.
Eles podem doar ou aceitar elétrons livres durante reações intracelulares, formando
15
radicais livres. Essas reações onde os metais participam na formação de espécies
reativas de OH• são conhecidas como reações de Fenton e Haber-Weiss
(FERNANDEZ, et al., 2007; BARBOSA, et al., 2010). O esquema da reação de
Fenton está descrito abaixo:
H2O2 + Mn+ HO- + HO. + M (n+1)+
Onde M = metal
Na reação de Haber-Weiss, representada abaixo, ocorre a formação de O2•
com a finalidade de gerar radicais OH• da mesma maneira.
O2- + Mn+ O2
. + M (n-1)+
Como exemplo dessas reações, na mitocôndria, o O2 sofre uma redução
tetravalente, por meio da qual recebe quatro elétrons (e-) e quatro íons de
hidrogênio (H+), formando duas moléculas de água (H2O) e liberando energia na
forma de ATP (adenosina trifosfato). Quando o O2, em seu estado fundamental,
recebe um e- ocorre a geração de superóxido (O2•).
Por meio de um processo denominado dismutação, o O2•, ao receber íons
hidrogênio, gera H2O2. Tal reação é catalisada pela superóxido dismutase (SOD),
enzima esta que acelera a reação. Na reação de Fenton, quando o H2O2 reage com
íons ferro (Fe2+) ou cobre (Cu+) forma-se o radical hidroxila (OH•).
Logo, na reação de Haber-Weiss os referidos íons também podem catalisar a
reação entre H2O2 e O2• gerando, da mesma forma o OH•. O O2• pode também
reagir com o óxido nítrico radicalar (NO•) gerando peroxinitrito (ONOO-) (BARBOSA,
et al., 2010).
A enzima responsável pelo controle dessas reações é a citocromo oxidase,
ela oxida as quatro moléculas de citocromo c (uma pequena proteína heme presente
na membrana interna da mitocôndria), removendo um elétron de cada uma delas.
Esses quatro elétrons são acondicionados no O2 (sofre uma redução tetravalente)
até a formação da água. A enzima referida controla a geração excessiva de radicais
livres na mitocôndria (BARBOSA, et al., 2010).
A reação de Fenton, também ocorre em neurônios dopaminérgicos. A
monoamina oxidade (MAO) enzima responsável por degradar as catecolaminas
16
(noradrenalina, adrenalina, dopamina e dopa) ao degradar a dopamina pela sua
desaminação oxidativa gera o H2O2, e o acumulo deste, como já visto anteriormente,
gera radicais livres, podendo causar doenças como o Mal de Parkinson
(LEOPOLDINI, et al., 2006).
Estas espécies reativas livres afetam a saúde humana, e os danos mais
graves são aqueles causados ao DNA e RNA e ao sistema nervoso central (SNC).
Se a cadeia de DNA é quebrada pode ser reconectada em outra posição, alterando
a ordem de suas bases. Esse é um processo básico de mutação, que pode
desencadear a oncogênese (MIRA, et al., 2002).
Já o SNC, de todos os órgãos, é um dos mais sensíveis, devido ao alto
consumo de oxigênio (O2) e a tendência de acumular metais, e também devido a
neurotransmissores que se oxidam (exemplo a dopamina) produzindo ERO,
podendo implicar em doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson
como já mencionado (FERNANDEZ, et al., 2007).
Agentes antioxidantes que protegem as células podem ser classificados em
enzimáticos e não enzimáticos. Enzimáticos, como por exemplo, a superóxido
dismutase, catalase, glutationa peroxidase, presentes no organismo. E não
enzimáticos como α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno, ácido ascórbico (vitamina C),
selênio, curcumina, flavonóides (polifenólicos) dentre outros obtidos da dieta
alimentar (BIANCHI e ANTUNES, 1999; DE MORAIS, et al, 2009)
Em situações de aumento dos radicais livres endógenos, como em
oncologias, devem-se reforçar as defesas antioxidantes com suplementação de
antioxidantes na dieta (MIRA, et al., 2002).
Estudos como dos Santos e Cruz (2001) descrevem que em alguns casos
como em terapias antitumorais, as interações entre medicamentos antineoplásicos e
antioxidantes promovem a potencialização do mecanismo de ação destes fármacos,
resultando em diminuição do tamanho do tumor com redução dos efeitos colaterais.
E também a melhoria da qualidade de vida dos pacientes oncológicos com maior
tempo de sobrevida.
Outros estudos como o de Dornas e colaboradores (2007) citam apud Heo e
Lee (2004), que o flavonóide quercetina, pode proteger as células nervosas, contra
os danos do estresse oxidativo, associado ao Alzheimer. Comprovaram que o efeito
17
protetor da quercetina, foi superior ao da vitamina C. A quercetina pode entrar em
regiões cerebrais beneficiando-se de funções antioxidantes e biológicas, protegendo
da citotoxicidade induzida por peróxido de hidrogênio (H2O2).
O organismo é protegido em parte por macro e micro moléculas, de origem
endógena ou obtidas diretamente da dieta, como a exemplo de micromoléculas
provenientes da dieta estão os flavonóides (BARREIROS e DAVID, 2006).
2.2 Flavonóides
A palavra “flavonóide” deriva do latim flavus, que significa amarelo, apesar de
alguns flavonóides serem incolores e outros variarem seu espectro de cores do
verde ao azul.
Os flavonóides foram descobertos em 1936, por Albert von Szent-György
Nagyrápolt (1893 – 1986), um fisiologista Húngaro, naturalizado Norte-Americano,
prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1937, por descobrir e documentar a
vitamina C como catalisador.
A descoberta dos flavonóides deu-se pela extração da citrina da casca do
limão. A citrina possui a capacidade de regulação da permeabilidade dos capilares,
e por isso recebeu na época a denominação de vitamina P e também vitamina C2,
devido a algumas substâncias da classe, apresentarem atividades semelhantes às
da vitamina C.
Em 1950 pela não confirmação dessas substâncias como vitaminas essa
denominação foi abandonada (MALESEV e KUNTIC, 2007). O termo flavonóide foi
introduzido em 1952 por Geissman e Hinreiner (PIRES, 2009).
Os flavonóides são definidos como metabólitos secundários de plantas, sendo
pigmentos naturais presentes em vegetais. Eles participam de funções como
crescimento, desenvolvimento e defesa dos vegetais. São encontrados em
sementes, frutos, cascas, raízes, flores e folhas das plantas. Mais de 8000
flavonóides diferentes já foram identificados. São biossintetizados através da via do
ácido chiquímico e da acetil-CoA (acetato) (Fig. 1), e também pela via dos
fenilpropanóides, precursores de vários grupos de substâncias como aminoácidos
18
alifáticos, terpenóides, ácidos graxos e outros (DORNAS, et al., 2007; GATTUSO, et
al., 2007).
Figura 1 - Ciclo biossintético dos flavonóides (metabólitos secundários). Fonte: Maciel, 2011 apud SIMÕES, et al., pag. 411, 2004.
A quantidade de flavonóides nas plantas é grande e variada devido à
existência da forma O-glicosídica com diversos açúcares, tais como glucose,
galactose, ramnose, arabinose, xilose e rutinose. A glicosilação aumenta a
polaridade dos flavonóides e também sua solubilidade (PIRES, 2009).
A estrutura básica dos flavonóides (Fig. 2) consiste em um núcleo
fundamental flavano constituído de quinze átomos de carbono, arranjados em três
anéis (C6-C3-C6). Sendo preferencialmente dois anéis fenólicos substituídos (A e B)
e um pirano (C) cadeia heterocíclica acoplado ao anel A. Os anéis A e B são
hidroxilados e podem conter substituintes metoxílicos (MOURÃO, 1990; DORNAS, et
al., 2007; PIRES, 2009).
19
O
C A
B
Figura 2 - Estrutura geral dos flavonóides.
De acordo com modificações no anel C (pirano) central, os flavonóides podem
formar várias classes estruturais diferentes incluindo flavonas, flavonóis, flavanonas,
chalconas, isoflavonas, antocianidinas, flavan-3-ol, flavononol dentre outros como
mostra a Figura 3 (FRAGA, 2010).
Flavonol
O
Chalcona
A
B
HO
O
3
Flavan-3-ol
O+
Antocianidina
O
O
Isoflavona
AC
B
AC
B
AC
B
AC
B
A
B
CAC
B
AC
B
HO
O
O
Flavona
O
O
Flavanona
O
HO
O
Flavanonol
O
O
HO
Figura 3 - Esqueletos básicos de flavonóides.
Estes compostos atuam principalmente capturando radicais livres com
formação de radicais flavínicos, muito menos reativos que radicais livres de ERO e
ERN, também podem quelar íons metálicos de transição como, por exemplo, Fe (III)
e Cu (II) o que evitaria a formação de ERO (DE LUIS, et al., 2008).
20
2.3 Flavonóides diosmina e hesperidina
Diosmina e hesperidina são flavonóides glicosilados que ocorrem
naturalmente nas Rutáceas (família Rutaceae), plantas compostas por frutos cítricos.
Ou também em outros gêneros, como Fabaceae, Betulaceae, Lamiaceae e
Papilionaceae em menor quantidade (MAJUMDAR e SRIRANGAM, 2009).
Estes compostos apresentam grande variedade de propriedades
farmacológicas tais como anti-inflamatório, antioxidante, antiulceroso, sequestro de
radicais livres, além de inibir determinadas enzimas do citocromo P-450, podendo
causar interações com outros medicamentos (NIOPAS, 2009; PIRES, 2009).
A diosmina (C28H32O15) (Fig. 4) foi isolada pela primeira vez em 1925 da
planta Scrophularia nodosa (Fig. 5), e seu emprego como agente terapêutico foi
introduzido pela primeira vez em 1969. É um flavonóide da classe das flavonas.
O OH
CH3
H3C
OH
O
O
O
OH
OH
HO
OH
OH
HO
O O
O
Figura 4 - Estrutura da diosmina
A diosmetina (3′,5,7-trihidroxi-4′-metoxiflavona) é a aglicona da diosmina
(3′,5,7-trihidroxi-4′-metoxiflavona-7-ramnoglicosídeo), ou seja, não possui o açúcar
em sua estrutura (DORNAS, et al., 2007).
A diosmina comercial é sintetizada a partir da hesperidina, flavonóide extraído
de casca de frutos cítricos imaturos. A síntese consiste da sua conversão em
diosmina pela oxidação da ligação dupla via reação de desidrogenação no anel
21
central C. O produto se apresenta na forma sólida, amarelo pálido, com ponto de
fusão 274°C e massa molecular de 608,54 g/mol (THE MERCK INDEX, 1996;
PIRES, 2009).
Figura 5 - Scrophularia nodosa. Fonte: NHSN, 2012.
A diosmina difere da hesperidina apenas pela presença da ligação dupla entre
dois átomos de carbono presentes no anel central C (pirano) das moléculas, como
mostra a Figura 6.
22
CA
BC
CH3
CH3
H3C
H3C
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
HO
HO
OH
OH
OH
OH
HO
HO
O
O
O
O
O
O
Figura 6 - Diferença estrutural da diosmina (A) e hesperidina (B).
A diosmina é considerada um agente protetor vascular da circulação periférica
de retorno, utilizada para tratar a insuficiência venosa crônica dos membros
inferiores, hemorroidas, linfedema e varizes. Sua farmacologia é reportada por
exercer a diminuição da distensibilidade e redução da estase venosa. Na
microcirculação, normaliza a permeabilidade e resistência capilar; e promove
aumento da drenagem linfática por diminuir a pressão intra-linfática e aumentar o
número de linfáticos funcionais, promovendo uma maior eliminação do líquido
intersticial (Bula Daflon®).
Como um flavonóide, apresenta propriedade antioxidante e antimutagênica.
Outras atividades biológicas atribuídas à diosmina vêm sendo investigadas mais
recentes, como agente no combate ao câncer, síndrome pré-menstrual, colite e
diabetes (DE LUIS, et al., 2008; NIOPAS, 2009; VADE-MÉCUM, 2010).
A hesperidina é um flavonóide glicosídeo que pertence à classe das
flavanonas, que são intermediárias biossintéticas da maioria das classes de
flavonóides (DORNAS, et al., 2007).
A hesperidina (3′,5-dihidroxi-4′-metoxiflavanona-7-O-rutinosa), C28H34O15,
apresenta-se sob a forma de um pó cristalino claro, com ponto de fusão entre 250 e
23
255 °C. Sua massa molecular é de 610,56 g/mol (PIRES, 2009). Possui ação
analgésica, anti-inflamatória, modulando a síntese de prostaglandinas (tipo E2) via
ciclooxigenase 2 (COX-2); antioxidante, pela capacidade de modular reações
oxidativas; antialérgica, vasoprotetora, hipolipemiante, anti-hipertensiva, diurética e
anticarcinogênica, mediada pela supressão da proliferação celular (KANAZE, et al.,
2005; PIRES, 2009). Outra propriedade importante estudada é sua atividade em
prevenir a iniciação ou progressão de retinopatia diabética ou degeneração macular
(MALESEV, et al., 1997; MAJUMDAR e SRIRANGAM, 2009).
A estudos reportam que uma dieta rica em hesperidina combinada ou não
com a diosmina, exerce ação contra o câncer de língua, de colón, entre outros; no
entanto, é fato que a associação destes dois ativos possui ação sinérgica no
tratamento das patologias para quais são indicados (PIRES, 2009).
Como medicamento a associação da diosmina (90%) com a hesperidina
(10%) em uma dose de 500 mg duas vezes ao dia, é indicada em flebologia nos
casos de insuficiência venosa crônica, varizes e varicosidades, úlceras varicosas
entre outros processos flebíticos. Também é usado em proctologia, nos tratamentos
de hemorroidas (Bula Daflon®).
Em ginecologia e obstetrícia, nos casos de insuficiência venosa da mulher
grávida, na prevenção de congestão pélvica e na prevenção do risco venoso no
tratamento com anticoncepcionais, menorragias funcionais e prevenção das
menorragias devido ao DIU (dispositivo intrauterino). Nestes últimos casos, em
doses mais elevadas 1000 mg duas vezes ao dia. Apresenta um excelente perfil de
segurança, sendo os efeitos adversos infrequentes ou leves (Bula Daflon®,
Diosmin®, Flavenos®).
As informações farmacocinéticas relacionadas ao medicamento Daflon® 500
mg são escassas e se referem apenas a diosmina.
Após a administração oral, a diosmina é rapidamente hidrolisada por enzimas
produzidas por bactérias da microflora intestinal formando sua aglicona flavona
diosmetina, que é então absorvida para a circulação sistêmica (KANAZE, et al.,
2005; CAMPANERO, et al., 2010).
Estudos farmacocinéticos como o de Niopas e colaboradores (2009) sugerem
ainda que na microflora intestinal, a diosmetina seja reduzida por enzimas
24
bacterianas a forma aglicona hesperitina (Fig. 7), pela redução da ligação dupla no
anel C da diosmetina. No estudo, foi administrada uma dose diária de 1000 mg de
diosmina, em homens saudáveis. No plasma foi encontrada a forma aglicona
hesperitina. O estudo não reportou a porcentagem de pureza da diosmina utilizada.
C
B
A
O OH
H3C
OH
O
OHO
Figura 7 - Estrutura da hesperitina.
A diosmetina apresenta uma fase rápida de distribuição e uma fase lenta de
eliminação, com concentração plasmática máxima de 417 ng/mL encontrada 1 hora
após a administração e meia-vida de eliminação plasmática de 26 a 43 horas, sendo
em média 31,5 horas (COVA, et al., 1992; LYSENG e PERRY, 2003). Estes dados
de meia-vida e tmax (tempo para atingir o pico máximo de concentração plasmática)
foram obtidos a partir da administração de formulação não micronizada de diosmina
(COVA, et al., 1992).
A diosmina é excretada essencialmente pela via fecal (80%) e também é
degradada em ácidos fenólicos e eliminada pela via urinária (14%), evidenciado pela
presença de vários fenóis ácidos na urina (Bula Daflon 500®). A estrutura da
diosmetina é mostrada na Figura 8 abaixo.
.
25
C
B
A
O OH
H3C
OH
O
OHO
Figura 8 - Estrutura da diosmetina.
A absorção da diosmetina é diferenciada entre as formulações micronizada e
não micronizada de diosmina, mas os processos metabólicos são semelhantes a
partir das duas formulações. Estudos como o de Garner e colaboradores (2002)
demonstraram que a forma micronizada da diosmina (partículas menores que 2
micrômetros/µm), possuem um aumento na absorção de 80% em comparação à
formulação não micronizada (partículas com tamanho aproximado de 36 µm),
melhorando a farmacocinética e a eficácia clínica da formulação.
A diosmetina é rapidamente degradada em ácidos fenólicos ou conjugados
glicínicos que são eliminados na urina. Não é possível encontrar diosmina ou
diosmetina na urina. Aproximadamente metade de uma dose marcada com
radioatividade é encontrada nas fezes como diosmina e diosmetina, correspondendo
à fração não absorvida da dose e também a uma pequena excreção biliar (LYSENG
e PERRY, 2003).
Os mecanismos de ação sugeridos para a diosmina e outros flavonóides são
a inibição da prostaglandina E2 (PGE2) e tromboxano A2 (TXA2) e também inibem a
ativação, migração e adesão de leucócitos. A diosmina provoca uma significativa
diminuição dos níveis plasmáticos de moléculas de adesão endotelial vascular e
reduz a ativação de neutrófilos, protegendo contra danos na microcirculação (DE
LUIS, et al., 2008; MAJUMDAR e SRIRANGAM, 2009).
26
2.4 A utilização terapêutica de metais
A utilização de metais na medicina existe há aproximadamente 5000 anos.
Fármacos à base de ferro foram utilizados no Egito em torno de 1500 a.C., ao
mesmo tempo em que se descobriu que o zinco promovia a cura de feridas. No
entanto, foram nos últimos cem anos, que as propriedades medicinais dos metais
começaram a ser investigadas, sendo recente a elucidação dos prováveis
mecanismos de ação no organismo (BERALDO, 2005).
O primeiro composto de coordenação, contendo a platina, usado no
tratamento do câncer foi a cisplatina, sintetizada pela primeira vez em 1844 e
denominado na época de cloreto de Peyrone. Mas somente em 1970 sua eficácia no
tratamento do câncer foi estabelecida. Complexos metálicos contendo ferro, ou
outros metais, também apresentam atividade antitumoral (BERALDO, 2005).
Metais possuem um importante papel nos sistemas biológicos, por interagirem
com biomoléculas tais como proteínas, e por apresentarem afinidade por outras
moléculas como a de oxigênio (O2) ou de óxido nítrico (NO), dentre outras (GUO e
SADLER, 1999; BERALDO, 2005; VILELA-RIBEIRO, et al., 2011; BERALDO, 2011).
O estudo destes metais e outros compostos inorgânicos presentes
naturalmente nos meios biológicos hoje esta incluído em um ramo da química
chamado de Bioinorgânica.
Estas biomoléculas são conhecidas como metaloenzimas ou
metalobiomoléculas, que contêm em seu sítio ativo, no mínimo um íon metálico. Este
sítio ativo consiste em um ou mais íons metálicos, tendo na cadeia da proteína,
pontes ligantes que definem a coordenação de cada íon metálico. O papel do íon
metálico nos sistemas biológicos é tanto estrutural quanto funcional (HENRIQUES,
et al., 2003).
O ferro e o cobre são centros ativos de várias metaloenzimas e também
proteínas transportadoras de oxigênio (O2) como a hemoglobina (Hb) e mioglobina.
Manganês, cobalto e zinco são constituintes de enzimas catalisadoras de reações
de hidrólise e descarboxilação. Proteínas de expressão gênicas contêm zinco, a
exemplo as de RNA-polimerase (DE FARIAS, 2009).
27
A Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) ou dipeptidil-carboxipeptidase,
dentre outras nomenclaturas conhecidas, é também uma
metaloenzima/metaloprotease, a qual possui o metal zinco em sua estrutura. É
importante para o mecanismo renal hormonal (sistema
renina/angiotensina/aldosterona), no controle da pressão arterial e da homeostase
hidroeletrolítica corpórea (HENRIQUES, et al., 2003).
A citocromo c oxidase, que participa da cadeia respiratória celular apresenta o
cobre em sua estrutura. A urease, que hidrolisa a uréia a dióxido de carbono (CO2) e
o amoníaco, possui o níquel. A xantina desidrogenase, que converte xantina a ácido
úrico no metabolismo de degradação de purinas apresenta molibdênio. As
superóxido dismutases (SOD), que protegem as células dos radicais superóxido,
contêm cobre, manganês e zinco em suas estruturas. Estes são alguns exemplos de
metaloenzimas, dentre várias outras conhecidas. Assim, com a evolução, os metais
foram sendo incorporados às funções essenciais á vida (GUYTON e HALL, 1998;
HENRIQUES, et al., 2003; DE FARIAS, 2009).
As contribuições da química inorgânica para a química medicinal tiveram suas
origens nos trabalhos de Paul Ehrlich (1854-1915), prêmio Nobel em Medicina e
Fisiologia em 1908, fundador da quimioterapia e introdutor das primeiras ideias
sobre relações estrutura-atividade e do conceito de índice terapêutico.
Alfred Werner (1866-1919), pai da química de coordenação, também
contribuiu com sua teoria para explicar as estruturas das ligações químicas nos
complexos metálicos; ganhou o prêmio Nobel de Química em 1913, o primeiro a ser
conferido a um químico inorgânico. Apesar da grande importância de Ehrlich e
Werner, a química medicinal dedicava-se mais aos compostos orgânicos, até a
descoberta da Cisplatina e suas propriedades antitumorais em 1965, pelo físico
Barnett Rosenberg (1926-2009). Desde então, ocorre um grande interesse por
complexos metálicos como possíveis agentes terapêuticos (GUO e SADLER, 1999;
BERALDO, 2005; DE FARIAS, 2009; BERALDO; 2011).
28
2.5 Compostos de coordenação
A grande maioria dos compostos de coordenação (complexos) tem como
átomos centrais, elementos metálicos na forma catiônica (+), que funcionam como
ácidos de Lewis. Um ácido de Lewis é um íon ou átomo metálico, receptor de pares
de elétrons.
Com relação aos ligantes, verifica-se que podem ser aniônicos, moleculares,
radicalares ou catiônicos, e comportam-se como bases de Lewis. Uma base de
Lewis é um doador de pares eletrônicos. O requisito para que uma espécie possa
funcionar como ligante é que pelo menos um de seus átomos disponha de elétrons
para se ligar ao átomo central (ácido), formando ligações coordenativas (DE
FARIAS, 2009).
A reação dos ácidos com as bases de Lewis é a formação de um complexo,
unido pelo compartilhamento do par (ou dos pares) de elétron fornecido pela base
(SHRIVER e ATKINS, 2008).
Duas das teorias mais utilizadas para explicar a coordenação dos complexos
dos metais do bloco d (como ferro, cobre, níquel e cobalto), são a Teoria do Campo
Cristalino (TCC) e a Teoria do Campo Ligante (TCL). A TCC é utilizada para os
elementos da primeira série (incluindo ferro, cobre, níquel e cobalto, também
chamados de 3d); e segunda série de transição da tabela periódica (4d). Na TCC,
para o estudo de compostos de coordenação, se reconhece somente as interações
eletrostáticas entre o íon metálico e os ligantes (SHRIVER e ATKINS, 2008).
A TCL é utilizada para interpretar dados magnéticos, espectroscópicos e
termoquímicos dos compostos de coordenação. Ela é a teoria dos orbitais
moleculares e se concentra mais nos orbitais d do átomo metálico central (SHRIVER
e ATKINS, 2008; DE FARIAS, 2009; MCMURRY, 2011).
2.6 Complexação de flavonóides com metais de transição
A complexação de flavonóides com metais é conhecida graças a um dos
mecanismos de ação antioxidante dos flavonóides ser a capacidade destes em
quelar íons metálicos endógenos, como ferro e cobre, evitando a participação destes
29
na formação de ERO. Compostos com capacidade de quelar metais, removem o
metal e alteram o potencial de redução tornando-o inativo. Os flavonóides com seus
inúmeros grupamentos hidroxila (OH) e carbonila (C=O) no anel C, possuem sítios
para complexação com metais (LEOPOLDINI, et al., 2006).
Devido à sua estrutura química, os flavonóides têm facilidade de fazer
ligações com metais de transição e outros átomos, a exemplo alumínio. O alumínio
quando elevado endogenamente, implica em desordens neurológicas e ósseas, pela
sua alta toxicidade. Complexando a quercetina com alumínio (Al3+) ocorre a redução
da sobrecarga deste na dieta, podendo sugerir que flavonóides também sejam
antídotos para metais pesados (MALESEV, et al., 1997).
Ao se complexarem com íons de metais de transição, especialmente Fe (II) e
(III), e Cu (II), os flavonóides previnem a geração de radicais livres mediados por
estes metais, protegendo o organismo do estresse oxidativo (MALESEV e KUNTIC,
2007).
Estudos de Moridani e colaboradores (2003) demonstram a atividade
antioxidante de flavonóides como quercetina, rutina, luteonina (flavonas) e taxifolina
(flavanona), dentre outros, quando complexados com ferro (Fe2+ e Fe3+) e cobre
(Cu2+). Estes apresentam maior atividade em sequestrar radicais superóxido, do que
quando livres, ou seja, a forma não complexada. Além disso, estudos mostram que
flavonóides complexados com metais são mais efetivos em prevenir hipóxia,
prevenindo lesão nos hepatócitos (de ratos) causadas por ERO, no teste de
citotoxicidade. Kuntic e colaboradores (2011) apud Guglielmone e colaboradores
(2002) também citam a atividade anticoagulante da quercetina.
Pereira e colaboradores (2007) demostraram a melhora da atividade do
flavonóide naringina, uma flavanona, após sua complexação com cobre (Cu2+).
Avaliaram a sua atividade anti-inflamatória (in vivo e in vitro), antioxidante,
antimicrobiana e antitumoral. A atividade anti-inflamatória em células 264.7 RAW
NO- (monócitos/macrófagos), avaliaram pela redução do óxido nítrico (NO); e in vivo
observaram a redução da inflamação induzida pela carragenina na cavidade
peritoneal de ratos Swiss. A atividade antioxidante foi realizada pelo método de
sequestro do radical orgânico DPPH (radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil). Na
verificação sobre os efeitos antibacterianos e antifúngicos, pelo método de difusão
30
em disco (em S. aureus, E. coli, B. cereus e C. albicans). E também na atividade
antitumoral em células dos tipos K562 (eritroleucemia), B16F10 (melanoma) e 3T3
(fibroblastos embrionários). Demonstrando que em todos os experimentos realizados
a atividade do complexo naringina-Cu é superior comparando com a molécula não
complexada.
Li e colaboradores (2008) sintetizaram e caracterizaram novos derivados
metálicos com cobre (II), níquel (II) e zinco (II), do flavonóide naringenina (flavanona)
um flavonóide com atividade antibacteriana e antitumoral. Testando a interação
destes compostos com DNA de timo de vitelo [CT DNA (Calf-Thymus DNA)], e
analisarem por espectroscopia eletrônica de absorção, verificando que a interação
dos complexos metálicos com o DNA, ocorre mais fortemente, em comparação com
naringenina. Sendo ainda o complexo naringenina cobre, o que interage mais
fortemente. Na avaliação da supressão dos radicais superóxido (O2•) e hidroxila
(OH•), os complexos metálicos também apresentaram atividade superior.
Tan e colaboradores (2009) complexaram hesperitina, naringenina e
apigenina (uma flavona), com cobre (II), caracterizaram e estudaram a ação
antitumoral destes complexos, em células. Contra células de linhagem humana
como HepG-2 (carcinoma hepatocelular), SGC-7901 (carcinoma gástrico) e HeLa
(carcinoma cervical). Verificaram que a ação citotóxica dos complexos metálicos é
elevada nas três linhagens em comparação aos respectivos flavonóides. Os
complexos hesperitina-Cu e apigenina-Cu foram mais efetivos contra as linhagens
SGC-7901 e HepG-2; e a naringenina-Cu apresentou elevada atividade contra
células do tipo HepG-2. Sugerindo com o estudo, que esses novos compostos
apresentaram potencial como possíveis fármacos contra o câncer.
Em 2010, Panhwar e colaboradores estudaram outro flavonol, a morina,
complexado com cobre (II). Neste trabalho avaliaram a atividade antioxidante pelo
método de sequestro da radical DPPH, onde observaram que a atividade
antioxidante da morina-Cu é superior à da morina.
Em 2011, Kuntic e colaboradores, utilizaram os flavonóides rutina e
hesperidina, e seus complexos com os metais alumínio (Al3+) e cobre (Cu2+), em um
estudo para avaliar a atividade na coagulação sanguínea (in vitro). Utilizaram três
testes para esta avaliação, aPTT (tempo de tromboplastina parcial ativada), PT
31
(tempo de protrombina) e TT (tempo de trombina). Os resultados da avaliação da
rutina e hesperidina mostraram que estes compostos não possuem nenhuma
atividade satisfatória na cascata da coagulação plasmática. Apenas a rutina, em
elevada concentração apresenta atividade anticoagulante, porém, estatisticamente
insignificante. Já os quatro complexos Hesp-Cu, Hesp-Al, Rut-Cu e Rut-Al
apresentam atividade anticoagulante ao aumentar o tempo do teste aPTT, sem
interferir nos outros testes PT e TT. Entretanto, o mecanismo anticoagulante dos
complexos, necessita de mais estudos para ser elucidado.
Gharagozloo e colaboradores (2008) investigaram a atividade antiproliferativa
em células Jurkat (linfoma de células T), do flavonóide silimarina, conhecido por
suas atividades hepatoprotetora, anticarcinogênica, antiinflamatória e
imunomoduladora. Comparando este, com a desferroxamina, um agente quelante,
que promove a excreção do ferro e do alumínio, no organismo. A desferroxamina
inibe a proliferação das células Jurkat ao quelar com o ferro do meio, o que não foi
observado com a silimarina, que ao contrário, promoveu o crescimento celular em
baixa concentração e somente em concentrações elevadas inibiu parcialmente a
proliferação celular. Quando complexados com ferro (III), a desferroxamina-Fe
continuou inibindo a divisão celular; entretanto, a silimarina-Fe, não apresentou
atividade antiproliferativa, sugerindo ainda ser este, um complexo pró-oxidante para
as células Jurkat.
Flavonóides complexados com metais são objeto de pesquisa ha muitos
anos, durante os quais, suas propriedades, composição, características de formação
do complexo, estabilidade e sua avaliação biológica estão sendo estudadas. As
investigações de compostos flavonóides-metais datam desde 1980 até hoje, e mais
de 40 complexos de flavonóides de diferentes classes, com inúmeros íons metálicos
estão sendo investigados (MALESEV e KUNTIC, 2007; GRAZUL e BUDZISZ, 2008;
KUNTIC, et al., 2011).
A literatura, neste contexto, necessita de maiores informações sobre os
mecanismos de ação de complexos metálicos com flavonóides, e os resultados
dependem de condições experimentais para entender o tipo de coordenação e
interação entre o flavonóide e o íon metálico em questão. A utilização de agentes
antioxidantes melhores pode representar uma nova abordagem para redução dos
32
danos causados pelo excesso de radicais livres ao nosso organismo, e também a
obtenção de novos compostos com atividade anticancerígena. Estas interações,
metal-flavonóide mudam as propriedades antioxidantes e os efeitos biológicos dos
flavonóides, sugerindo que quando coordenados com metais essas atividades são
melhoradas (PEREIRA, et. al., 2007; GRAZUL e BUDZISZ, 2008; KUNTIC, et al.,
2011).
33
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Síntese, caracterização e avaliação da atividade antioxidante de complexos
de coordenação do flavonóide diosmina com metais de transição.
3.2 Objetivos específicos
- Síntese de novos compostos através da complexação do flavonóide
diosmina com os íons dos metais de transição (3d) cobre (II), ferro (II), cobalto (II) e
níquel (II);
- Purificação dos complexos formados.
- Caracterização dos complexos por Espectroscopia no Ultravioleta (UV),
Infravermelho (IV), Espectrometria de Massas (EM);
- Avaliação da atividade antioxidante dos complexos.
34
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material e equipamentos utilizados
Agitador magnético
Balanças analíticas (com precisão de 0,0001g e 0,00001g)
Balões volumétricos
Barra magnética
Bastão de vidro
Béqueres
Capela de exaustão
Centrífuga refrigerada (ALC PK 120R)
Chapa de aquecimento
Cubetas de quartzo e vidro
Eppendorfs
Erlenmeyers
Espátulas
Espectrofotômetro (UV-VIS) (Femto 800 XI)
Espectrofotômetro (UV-VIS) (Beckman DU® 640B. U.S. A) (UNICAMP)
Espectrofotômetro (IV) (Nicolet, Nexus)
Espectrômetro de massas (TQD Acquity. Micromass Water) (UNICAMP)
Estufa (Quimis 317B342)
Etiquetas
Funil simples
Garras (anel para funil)
Papel de filtro qualitativo
Papel de pesagem
Phmetro (Digimed - DM 20)
Pipetas volumétricas
Placas de Petri
Ponteiras
35
Ponto de fusão (Quimis - PMF II)
Provetas
Rota evaporador (Rotovac - Heidolph digital)
Shaker (Tecnal - TE 420)
Suporte universal
Destilador (Millipore)
4.2 Reagentes e solventes utilizados
ABTS [2,2’ azinobis (3-etil-benzotiazolino-6-ácido sulfônico) sal diamônio]
(Fluka®)(MM=548,68g/mol)
Acetato de cobalto (II) [Co(CH3COO)2] (Audaz®)(MM=249,08g/mol)
Acetato de cobre (II) [Cu(CH3COO)2] (Sigma-Aldrich®)(MM=199,65g/mol)
Acetato de níquel (II) [Ni (CH3COO)2] (Sigma-Aldrich®)(MM=248,86g/mol)
Acetato de zinco (II) [Zn(CH3COO)2] (Sigma-Aldrich®) (MM=219,51g/mol)
Acetonitrila (CH3-CN)
Água destilada
Álcool etílico (etanol) (CH3-CH2-OH) (J.T. Baker®)
Álcool metílico P.A. (metanol) (CH3-OH) (Dinâmica®)
Clorofórmio (CHCl3) (Dinâmica®)
Dimetilformamida (DMF) (H-C(O)N(CH3)2) (Dinâmica®)
Dimetilsulfoxido (DMSO) (CH3-S(O)-CH3) (Synth®)
Diosmina (C28H32O15) (Sigma-Aldrich®) (MM=608,56g/mol)
Fosfato de sódio dibásico (Sigma®) (MM=141,98 g/mol)
Fosfato de sódio monobásico (Sigma®) (MM=138,01g/mol)
Hexano (C6H14) (Audaz®)
Oxido de manganês (MnO2) (Sigma-Aldrich®)
Sulfato de ferro (II) (sulfato ferroso) (FeSO4)7H2O (Sigma-
Aldrich®)(MM=278,02g/mol)
Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácido carboxílico) (Calbiochem®)
(250,3g/mol)
36
Todos os reagentes e solventes obtidos comercialmente utilizados nesse
trabalho possuem grau de pureza PA ou HPLC.
4.3 Síntese da diosmina com os metais de transição
A diosmina foi pesada e solubilizada em 20 mL de dimetilformamida (DMF) a
uma temperatura de aproximadamente 50 graus célsius (ºC) e agitação até completa
solubilização. Os sais de acetato de Zn (II), Cu (II), Co (II), Ni (II) e sulfato de Fe (II)
também foram solubilizados nas mesmas condições da diosmina, em 20 mL DMF, à
temperatura de aproximadamente 50 ºC e agitação constante. Os respectivos sais
foram adicionados à diosmina gota a gota até completa solubilização, sem que
ocorressem precipitações.
As soluções foram agitadas em Shaker por cinco dias a 160 rotações por
minuto (rpm) e a temperatura mantida em 37 ºC. Os complexos diosmina-metal
foram filtrados em papel de filtro (nº 42) e colocados em placas de petri a
temperatura ambiente em capela de exaustão para completa secagem do solvente.
Em uma segunda etapa, os compostos obtidos [diosmina-cobalto (diosmina-
Co), diosmina-níquel (diosmina-Ni) e diosmina-ferro (diosmina-Fe)] foram
solubilizados em metanol. A diosmina-cobre (diosmina-Cu) em água purificada.
Foram novamente filtrados em papel filtro para serem recristalizados. Esta etapa foi
repetida por no mínimo duas vezes para garantir a purificação dos compostos.
Devido à diosmina não ser solúvel em metanol e água e não ocorrerem
dissociações dos complexos, o metanol foi o solvente escolhido para recristalização
(purificação). Com exceção da diosmina-cobre que é praticamente insolúvel em
metanol. Após a secagem dos solventes, em rotaevaporador e capela de exaustão,
os compostos purificados foram acondicionados em vidro âmbar etiquetados e
mantidos à temperatura ambiente (25 ± 5ºC).
O aspecto macroscópico dos complexos obtidos é mostrado na Figura 9.
As proporções dos reagentes utilizadas para formação dos complexos (como
mostra o quadro 1) foi de 1:4 de diosmina/sal metálico.
37
Quadro 1 – Quantidade dos reagentes utilizados para formação dos complexos
de diosmina metal.
Reagentes
Complexos
diosmina-Cu diosmina-Ni diosmina-Fe diosmina-Co
Diosmina
126 mg (0,21 mmol)
135 mg (0,22 mmol)
125 mg (0,20 mmol)
116 mg (0,19 mmol)
Sal metálico
165 mg (0,83 mmol)
220 mg (0,88 mmol)
228 mg (0,82 mmol)
190 mg (0,76 mmol)
Outros sais como nitrato de cobre (II) [(Cu(NO3)2], nitrato de níquel (II)
[Ni(NO3)2], nitrato de cobalto (II) [Co(NO3)2] e nitrato de zinco (II) [Zn(NO3)2] também
foram testados.
Os solventes e reagentes utilizados estão descritos na seção 4.2.
Figura 9 – Aspecto macroscópico dos complexos formados diosmina-Cu (A), diosmina-Co (B),
diosmina-Ni (C) e diosmina-Fe (D).
4.4 Teste de solubilidade dos compostos
O teste de solubilidade dos compostos foi realizado em duplicata, em capela
com exaustão, sem aquecimento e sob agitação constante em agitador magnético,
38
pesando-se 1 mg de diosmina e 1 mg de cada composto sintetizado (diosmina-Cu,
diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co) para cada solvente testado.
Os compostos foram pesados em papel de pesagem, em seguida transferidos
para tubos de ensaio, aos quais se adicionaram 100 µL do solvente e mantidos sob
agitação. A cada intervalo de tempo (3 minutos) adicionando-se a cada tudo de
ensaio mais 100 μL de solvente, até completa dissolução do composto.
4.5 Caracterização dos complexos
Os compostos foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho
(Espectrofotômetro Nicolet, Nexus) e no Ultravioleta-Visível (Espectrofotômetro
Femto – 800-XII) no laboratório de química de coordenação da UNIBAN.
A leitura das absorbâncias no UV dos complexos foi realizada partindo-se de
1mg de cada complexo e da diosmina e diluindo-os em 1 mL de dimetilsulfóxido
(DMSO), transferindo-se para balão de 10 mL, completando o volume com água
deionizada. Desta solução, pipetaram-se 700 µL e transferiu-se para um novo balão
volumétrico de 10 mL completou-se com água deionizada. As concentrações das
soluções foram de 2,9 µM da diosmina-Cu; 8,8 µM da diosmina-Ni; 8,4 µM da
diosmina-Fe; 8,7 µM da diosmina-Co; e de 11,5 µM da diosmina. Os comprimentos
de onda utilizados para leitura foram de 190 – 500 nm em intervalos de 2s.
Os complexos também foram enviados para análise elementar no instituto de
química da USP.
A espectrometria de massas dos complexos (Espectrômetro de massas - TQD
Acquity. Micromass Water), foi realizada no instituto de biologia no laboratório do
Prof. Dr. Paulo Mazzafera (UNICAMP). As condições do equipamento foram de
capilar 3,0 kV (3000 v), cone 35 V, energia de colisão 20 e 25 eV (diosmina-Cu) e
30, 40 e 50 eV (diosmina-Co), infusão direta em modo positivo e negativo.
Temperatura da fonte 150 ºC e temperatura de solvatação 300 ºC.
39
4.6 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos
4.6.1 Determinação da atividade antioxidante dos complexos de
diosmina-metal pela captura do radical livre ABTS˙ˉ
O fundamento do ensaio de determinação de capacidade antioxidante
consiste basicamente na redução de radicais livres ABTS˙ˉ [2,2’ azinobis(3-etil-
benzotiazolino-6-ácido sulfônico) sal diamônio] por compostos com atividade
antioxidante. A metodologia foi adaptada de Souza e colaboradores (2003),
Leopoldini e colaboradores (2006), Rufino e colaboradores (2007) e Velosa e
colaboradores (2012).
4.6.2 Preparo da solução tampão fosfato 20 mM pH 7,4
Em balança analítica foram pesados 5,52 g de fosfato de sódio monobásico e
diluídos em 200 mL de água desionizada, formando uma solução final de 200 mM
(solvente monobásico).
Pesaram-se 5,68 g de fosfato de sódio dibásico e dissolveram-se em 200 mL
de água desionizada formando uma segunda solução também a 200 mM (solvente
dibásico).
Mediu-se o pH das duas soluções, e estas apresentaram um pH de 7,4.
Pipetaram-se 8 mL da solução diluída de solvente dibásico e transferiu-se
para um balão volumétrico de 100 mL. Pipetaram-se 2 mL da solução diluída de
solvente monobásico e transferiram-se para o mesmo balão volumétrico de 100 mL,
completando-se o volume do balão com água deionizada (18 M cm), obtendo-se
uma solução final de tampão fosfato (100 mL) a 20 mM. Verificou-se o pH da
solução e este manteve-se a 7,4.
4.6.3 Preparo da solução ABTS2- 2 mM
Pesou-se 0,0274 g de ABTS e em balão de 25 mL e solubilizou-se com água
desionizada, obtendo-se uma concentração final de 2 mM de ABTS2-.
40
Observação. Quando em água o ABTS torna-se um ânion (duas cargas
negativas) ABTS2- (Fig. 10).
S
O
OO
-
S
N
NN
N
S S
O-
O
O
Figura 10 - Estrutura do radical ABTS2-
.
4.6.4 Preparo da solução de ABTS˙ˉ 100 µM
Pipetaram-se 5 mL da solução de 2 mM de ABTS2-, transferiu-se para balão
volumétrico de 100 mL e completou-se com tampão fosfato 20 mM (pH 7,4),
atingindo uma concentração de 100 μM.
Em tubos de ensaio para centrífuga, foram adicionados, aproximadamente
0,0200 g de óxido de manganês (MnO2) (agente oxidante), e 5 mL de ABTS2- (100
µM); os tubos foram agitados em vórtex por aproximadamente 60 segundos e
centrifugados a 3800 rpm durante 30 minutos. O líquido sobrenadante dos tubos foi
recolhido em um béquer com delicadeza, onde o MnO2 não se desprendeu do fundo.
A solução recolhida foi filtrada com filtro de seringa de 0,22 µm para obter
uma solução de ABTS˙ˉ de concentração aproximadamente 60 µM (absorbância
0,95), considerando-se que a absortividade molar do ABTS.- em água ou tampão é
igual a 15000. A solução apresentou uma coloração verde escuro (Fig.11).
A solução final foi acondicionada em um frasco âmbar, sob-refrigeração e
protegida da luz e deixada por 48 horas sob refrigeração a 5 ºC, até sua
absorbância ser aproximadamente 0,70 e sua concentração nesta absorbância ser
48 µM.
41
S
O
OO
-
S
N
NN
N
S S
O-
O
O.+.
Figura 11 - Estrutura do radical ABTS˙ˉ.
4.6.5 Preparação das soluções de diosmina e diosmina-metal para os
testes de atividade antioxidante
Pesou-se 1mg de cada um dos composto (diosmina, diosmina-Ni, diosmina-
Fe, diosmina-Co), com exceção da diosmina-Cu (0,33 mg). Os compostos foram
dissolvidos em 1 mL de DMSO e transferidos para balões volumétricos de 10 mL
completando-se o volume com água deionizada (solução padrão).
Partindo-se da solução mãe, pipetaram-se cinco volumes diferentes de cada
composto (como mostra o quadro 2) e transferiu-se os volumes para balões de 5 mL.
Os balões foram completados com água desionizada, para formar cinco soluções em
diferentes concentrações variando de 1,4 a 7,1 µM.
O cálculo das concentrações das soluções dos complexos foi baseado no
trabalho de Velosa e colaboradores (2012), que utilizaram o método do ABTS para
avaliar a atividade do flavonóide rutina e seus complexos metálicos.
Quadro 2 - Diluições e concentrações da diosmina e dos complexos diosmina-metal.
Compostos Diluição 1 (µL)
Diluição 2 (µL)
Diluição 3 (µL)
Diluição 4 (µL)
Diluição 5 (µL)
Diosmina 218 174 131 87 43
Diosmina-Cu(II) 862 689 517 345 172
Diosmina-Ni(II) 283 226 169 113 56
Diosmina-Fe(III) 320 256 192 128 64
Diosmina-Co(II) 350 280 210 140 70
Concentração dos compostos
7,1 µM 5,7 µM 4,3 µM 2,8 µM 1,4 µM
42
O trolox (Fig. 12) é um antioxidante análogo da vitamina E utilizado para
comparar e avaliar a capacidade antioxidante dos compostos (TEAC) pela
metodologia do radical ABTS˙ˉ. O valor do fator estequiométrico ou “n” do rolox foi
obtido através da literatura (n trolox = 2,0), segundo Velosa e colaboradores (2012).
O
OH
HO
O
Figura 12 - Estrutura do trolox.
4.6.6 Avaliação da atividade antioxidante da diosmina e complexos
diosmina-metal
Em uma cubeta de vidro adicionou-se água deionizada e foi realizada a leitura
do branco. Após está etapa foi realizada a leitura da absorbância (em 734 nm) do
padrão (em triplicata), 2 mL da solução de ABTS˙ˉ.
Adicionaram-se 10 µL de cada uma das soluções preparadas no item 4.6.5
em uma cubeta de vidro e rapidamente adicionaram-se 2 mL da solução de ABTS˙ˉ.
As absorbâncias foram monitoradas em função do tempo, por 180 segundos com
intervalos de 1 segundo. Foram realizadas leituras em triplicatas.
4.6.7 Determinação da atividade antioxidante total (AAT)
Inicialmente foram construídas as curvas de decaimento espectrofotométrico
do radical ABTS˙ˉ, plotando-se as absorbâncias das diferentes concentrações no
eixo Y e o tempo em segundos no eixo X em um gráfico de dispersão.
Para o cálculo da AAT, utilizaram-se os valores referentes ao último ponto da
curva de decaimento espectrofotométrico (absorbância em 180 s de cada
concentração) na seguinte equação matemática:
43
4.6.8 Determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox
(TEAC)
Para o cálculo do consumo de ABTS.- em µM, utilizaram-se os valores de
absorbância referentes ao último ponto da curva de decaimento espectrofotométrico
(em 180 s para cada concentração) na seguinte equação matemática:
Com os valores de concentração de radicais ABTS.- sequestrados versus a
concentração dos compostos (µM) foi construído um novo gráfico, cuja inclinação da
reta corresponde ao numero de moléculas de radicais abstraídos (n) por molécula de
antioxidante (composto).
O gráfico foi construído plotando-se as concentrações dos compostos no eixo
X, e os valores de ABTS consumido no eixo Y. Calculou-se a equação da reta
obtendo-se:
y = ax – b (onde o valor numérico de “a” = “n”, número de radicais ABTS.-
sequestrados por molécula antioxidante)
A determinação da TEAC foi obtida usando-se diretamente o valor referente à
inclinação da reta das regressões lineares obtidas (n), dividindo-se esse valor pelo
valor do fator estequiométrico (n) do trolox.
44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese dos complexos de coordenação de diosmina-metal
Os rendimentos dos complexos foram calculados pela massa molar (MM),
utilizando a proporção de 1:1 diosmina/metal. Os resultados obtidos foram
aproximadamente (≈) 44,7% para diosmina-Ni; ≈ 45,9% para diosmina-Fe; e ≈ 60,3%
para diosmina-Co. O rendimento do complexo diosmina-Cu não foi calculado devido
à dificuldade de solubilização e recristalização deste, nos solventes utilizados. O
complexo obtido com melhor rendimento foi diosmina-Co.
A complexação da diosmina com os nitratos não ocorreu. Com os sais (nitrato
e acetato) de zinco (II) também não ocorreu complexação.
5.2 Solubilidade dos complexos diosmina-metal
Os resultados de solubilidade em diferentes solventes testados estão
representados na Tabela 1. Os complexos obtidos tiveram diferenças significativas
referentes à solubilidade comparados com a diosmina. A diosmina é insolúvel em
solventes como metanol, etanol e água. No entanto, os complexos apresentaram
solubilidade relativa nestes solventes.
Solventes polares como água, etanol, DMSO e DMF, são solventes com
caráter de bases “duras” de Lewis, e podem formar complexos com o soluto e
participar da reação. Em DMSO os complexos apresentaram as melhores
solubilidades, devido ao DMSO [(CH3)2SO] ser um solvente bidentado, e comportar-
se como uma base “dura” de Lewis, devido ao oxigênio (O) ser um doador de é, e
também como base “mole” de Lewis, por causa do enxofre (S) como doador
(SHRIVER e ATKINS, 2008).
O complexo diosmina-Fe (III) é o complexo que apresentou melhor
solubilidade, o que se pode justificar devido a sua instabilidade de Fe3+ (d5).
45
Tabela 1 - Solubilidade dos compostos. Onde I = Insolúvel.
Solventes
Solventes Polares Apróticos
Solventes Polares Próticos
Compostos Massa
pesada
Acetona Acetonitrila DMSO DMF Água Etanol
Metanol
Diosmina
1 mg I I 0,2 mL 0,3 mL I I I
Diosmina-Cu
1 mg I I 3 mL 3 mL 6 mL I I
Diosmina-Fe
1 mg I I 0,2 mL 0,2 mL 0,07 mL 0,2 mL 0,2 mL
Diosmina-Ni
1 mg I I 2 mL 2 mL 0,2 mL 2 mL 0,2 mL
Diosmina-Co 1 mg I I 0,6 mL 1 mL 0,2 mL I 0,6 mL
Solventes apolares como o clorofórmio e o hexano também foram testados e
tanto a diosmina quanto os complexos formados são insolúveis. Os solventes
apolares comportam-se como bases “moles” de Lewis (SHRIVER e ATKINS, 2008).
5.3 Espectroscopia no Infravermelho (IV)
Os resultados das principais bandas obtidas nos espectros IV da diosmina em
comparação as principais bandas dos complexos estão demonstrados nas figuras
13, 14, 15 e 16.
As bandas alargadas obtidas para os espectros IV são processos envolvendo
orbitais moleculares, influenciadas pelas vibrações moleculares (PAVIA, et al.,
2010).
46
Figura 13 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Cu em azul.
Figura 14 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Ni em azul.
47
Figura 15 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Fe em azul.
Figura 16 - Espectro IV da diosmina em vermelho e do complexo diosmina-Co em azul.
Na Tabela 2 são mostradas as principais bandas dos espectros IV da
diosmina em relação aos complexos diosmina-metal.
48
Tabela 2 - Principais bandas na espectroscopia no infravermelho da diosmina e dos complexos.
Composto C=O cm-1(Δ) C=C cm-1 (Δ) C-O-C cm-1(Δ)
Diosmina 1659,75 1610,03 1097,70 - 1056,69
Diosmina-Cu 1631, 80 (27,95) 1556,44 – 1528,07
(53,59) 1046,00 (51,70)
Diosmina-Ni 1633,74 (26,01) 1558,94 (51,09) 1047,35 (50,35)
Diosmina-Fe 1626,80 (32,95) 1521,22 (88,81) 1077,47 (20,23)
Diosmina-Co 1633,09 (26,66) 1557,99 (52,04) 1047,86 (49,84)
As bandas C=O referente à carbonila do anel pirano C, sofreram
deslocamento para frequências mais baixas nos complexos diosmina-Cu, diosmina-
Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co em relação à diosmina. As bandas C=C dos
complexos diosmina-Cu, diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co referentes ao anel
A aromático também sofrem deslocamento para frequências mais baixas. As bandas
C-O-C referente ao éter aromático ao grupamento do anel C dos complexos
(diosmina-Cu, diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co) apresentaram
deslocamentos para frequências menores também. Ocorreram modificações
também nas bandas dos complexos referentes à região de impressão digital das
moléculas. Estes deslocamentos mostram que ocorreram mudanças nos
comprimentos de ligações C=O e C=C do anel aromático da diosmina. Significando
que ocorreram distorções nas ligações, alongando-as, por interações eletrônicas dos
ligantes com os orbitais d dos metais (Fe d6, Co d7, Ni d8 e Cu d9).
5.4 Espectroscopia no Ultravioleta (UV)
Nas Figuras 17, 18, 19 e 20 são mostrados os espectros no UV-VIS da
diosmina e de seus complexos.
49
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
237 262 287 312 337 362 387 412
Diosmina X D-Cu (II)
D-Cu
Diosmina
Ab
sorb
ân
cia
Comprimento de onda (nm)
Figura 17 - Espectro UV da diosmina-Cu em comparação a diosmina.
Figura 18 - Espectro UV da diosmina-Ni em comparação a diosmina.
50
Figura 19 - Espectro UV da diosmina-Fe em comparação a diosmina.
Figura 20 - Espectro UV da diosmina-Co em comparação a diosmina.
No espectro UV-VIS da diosmina foram observadas duas bandas de máxima
absorção, em 262 nm correspondente aos anéis A e C (benzoilpirano) e em 342 nm
correspondente ao anel B (cinamoil) (Fig. 21).
51
Figura 21 - Espectros UV da diosmina em comparação aos complexos D-Cu (II), D-Co (II), D-Fe (II) e D-Ni (II).
Ao comparar os comprimentos de onda no espectro UV da diosmina com os
complexos diosmina-Cu, diosmina-Co e diosmina-Ni, observa-se que ocorre um
deslocamento da banda correspondente ao anel A/C, para comprimentos de onda
maiores, ou seja, um deslocamento batocrômico nos três complexos. O mesmo não
se observa com o complexo diosmina-Fe, para o qual o deslocamento da banda
correspondente ao anel A é do tipo hipsocrômico. Muito provavelmente, devido ao
ferro oxidar-se rapidamente a um estado de Fe3+. Com centros metálicos muito
polarizáveis [Fe(III)], os ligantes H2O e O, do complexo, comportam-se como ligantes
de campo forte, promovendo o deslocamento para comprimentos de onda menores,
devido ao desdobramento do campo ligante (Δ0), ou seja, maior aumento do Δ0.
Os demais metais (M = Cu, Ni e Co) permanecerem no seu estado de
oxidação M2+, e portanto os ligantes H2O e O na série espectroquímica, são ligantes
de campo fraco para estes complexos.
Já com as bandas correspondentes ao anel B, dos quatro complexos, ocorre
uma diminuição da intensidade da banda e uma pequena redução no comprimento
de onda comparado com a diosmina (Tabela 3).
52
O perfil das curvas (ou λ) para todos os complexos são semelhantes,
podendo-se sugerir com estes dados, que a complexação ocorre nos mesmos
ligantes para todos os complexos.
Tabela 3 - Principais bandas na espectroscopia no ultravioleta da diosmina e dos complexos.
Compostos Comprimento de onda
Correspondente ao
Anel A
Comprimento de onda
Correspondente ao
Anel B
Diosmina 262 nm 342 nm
Diosmina-Cu (II) 281 nm 331 nm
Diosmina-Ni (II) 277 nm 330 nm
Diosmina-Fe (III) 253 nm 333 nm
Diosmina-Co (II) 268 nm 327 nm
Estes deslocamentos são característicos da interação dos orbitais d dos
metais, com os ligantes do flavonóide e H2O. Essa interação dos ligantes com os
orbitais d dos centros metálicos (energia de transição) depende não somente das
energias dos orbitais, mas também da repulsão elétron-elétron que ocorre.
5.5 Análise elementar
Na análise elementar dos complexos não foram obtidos resultados
satisfatórios, devido ser esta uma análise onde os compostos devem estar com o
máximo de pureza. Uma das hipóteses para explicar a dificuldade de purificação dos
complexos de diosmina é devido à diosmina comercial utilizada apresentar 95% de
pureza. Os outros 5%, muito provavelmente são de hesperidina, de onde a diosmina
é obtida.
5.6 Espectrometria de massas (EM)
A espectrometria de massas permite determinar a massa molecular de um
composto desconhecido, e a partir de seu padrão de fragmentação propor uma
estrutura molecular para a mesma. Quando suas moléculas são quebradas
(fragmentadas) por um processo de elétron ionização (EI) (bombardeamento por um
53
fluxo de elétrons) em que as moléculas ganham uma carga elétrica os íons são
separados pela relação massa-carga (m/z). O espectro de massas é representado
como um gráfico de barras, com massas (valores m/z) no eixo X e intensidade ou
abundância relativa (%) no eixo Y (MCMURRY, 2011).
O espectro de massas da diosmina-Cu (ANEXO G) obtido, demonstra a
dissociação de 672,2 m/z, referente ao complexo diosmina-Cu. A fragmentação
parcial do primeiro açúcar em 555,1 m/z, e a fragmentação do segundo açúcar em
393,4 m/z (Fig. 22).
Figura 22 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Cu e seus principais fragmentos.
No espectro da diosmina-Co, no modo negativo, o complexo não foi
encontrado, apenas a aglicona diosmetina a 357,1 m/z (ANEXO H).
No modo positivo, (com energia de colisão 40 V) representado na Figura 23, o
composto de coordenação contendo o cobalto foi observado em 666,5 m/z. A
diosmina com um “H” a menos (saindo da hidroxila no anel A) e um cobalto
adicionado na estrutura (entre a carbonila e a hidroxila).
A fragmentação completa do primeiro açúcar ocorre em 520,3 m/z e o
segundo açúcar ocorre em 358,3 m/z.
Em 301,3 m/z muito provavelmente é a diosmetina (aglicona) protonada (H+).
54
Figura 23 - Espectro de massas em modo positivo da diosmina-Co e seus principais fragmentos.
O complexo diosmina-Fe não sofre ionização em modo positivo, e em modo
negativo não foi observado fragmentos contendo íon Fe, apenas sulfato. O mesmo
foi observado para o complexo diosmina–Ni.
Os resultados dos espectros de massa da diosmina com os metais de
transição (cobre, cobalto) indicam que a proporção íon metálico e diosmina nos
complexos é de 1:1 e, levando-se em conta as demais análises espectroscópicas,
que a interação metal-ligante ocorre através da carbonila e da hidroxila no anel A/C
no flavonóide e não no açúcar.
Comparando-se os dados obtidos com os trabalhos de Cuyckens e Claeys
(2004) e de Vukics e Guttman (2010), que estudaram a estrutura de flavonóides
glicosilados (como a flavona apigenina), em vários estágios, na espectrometria de
massas, e demonstraram que a fragmentação dos flavonóides O-glicosídeos, como
a diosmina, ocorre de forma muito similar, o que nos dá segurança para propor a
fragmentação dos complexos.
Na busca por referências bibliográficas que tratem da complexação do
flavonóide diosmina com metais de transição, não foram encontrados relatados de
trabalhos científicos publicados. Portanto, outro parâmetro comparativo são
complexações referentes ao flavonóide hesperidina ou a outros flavonóides
derivados de flavonas e flavanonas.
Trabalhos como os de Grazul e Budzisz (2009), que complexaram flavonóides
com metais de transição como a flavona naringina sugerem que o sítio de
55
complexação ocorreu entre os anéis A e C (benzoilpirona) com íons Cu (II) na
proporção de 1:1, devido à hidroxila (OH) ser mais ácida e favorecer a complexação
neste sítio. Outros autores como Malesev e Kuntic (2007) sugerem que os prováveis
sítios de complexação para flavonóides como a hesperidina, de onde se deriva a
diosmina, sejam entre a carbonila e a hidroxila dos anéis A e C (benzoilpirona) ou
entre a hidroxila e o éter aromático no anel B. Porém, a complexação ocorre
principalmente entre os anéis A e C para a hesperidina.
Com os Espectros no IV, UV e EM, podemos sugerir pelas evidências obtidas
que o principal sítio de complexação do flavonóide diosmina com os metais Cu (II),
Ni (II), Fe (II) e Co (II), sejam entre a carbonila e a hidroxila dos anéis A e C (Fig. 24
e 25).
CH3COO -
OH2
OH2
H2O
OH2
Me = Cu, Ni e Co
O
Me2+
-
C A
B
CH3
H3C
O
OH
O
O
O
OH
OH
HO
OH
OH
HO
O O
O
Figura 24 - Estrutura proposta para os complexos da diosmina-metal (Cu, Ni e Co).
56
SO4
2-
OH2
OH2
H2O
OH2
O
Fe3+
-
C A
B
CH3
H3C
O
OH
O
O
O
OH
OH
HO
OH
OH
HO
O O
O
Figura 25 - Estrutura proposta para o complexo diosmina-Fe.
Desta maneira, as massas moleculares propostas para os complexos são de
802,04 g/mol para diosmina-Cu; 797,24 g/mol para diosmina-Ni; 797,44 g/mol para
diosmina-Co; e 775,62 g/mol para diosmina-Fe.
5.7 Atividade antioxidante da diosmina e dos complexos diosmina-metal
5.7.1 Método ABTS.-
Os complexos que apresentaram melhor atividade antioxidante, nas cinco
concentrações testadas, pelo método do sequestro de radicais ABTS foram a
diosmina-Cu e a diosmina-Fe. A diosmina apresentou atividade antioxidante
semelhante à diosmina-Co e diosmina-Ni.
A curva de decaimento do radical ABTS.- obtida do composto diosmina-Fe,
que apresentou melhor atividade antioxidante esta representada na Figura 26.
57
Figura 26 - Curva de decaimento do radical ABTS˙ˉ pelo composto diosmina-Fe.
Na Figura 27 foi apresentado o gráfico de porcentagem de radicais
sequestrados (% Inibição) versus a concentração dos compostos (µM).
Figura 27 - % Inibitória do radical ABTS˙ˉ pelas concentrações dos complexos e da diosmina.
Observou-se que a capacidade de abstração (% inibitória) de radicais ABTS.-
é muito semelhante para os compostos de coordenação diosmina-Cu e diosmina-Fe.
58
No entanto, ao aumentarmos a concentração da diosmina-Fe, esta apresenta melhor
atividade antioxidante, inibindo 45 % de radicais ABTS.- na maior concentração
testada (7,1 µM). Já a diosmina-Cu inibe 42 % na concentração 5,7 µM,
permanecendo constante sua capacidade de sequestrar os radicais, mesmo
aumentando a sua concentração (7,1 µM). A diosmina-Co, diosmina-Ni e a própria
diosmina, possuem capacidade de abstração muito semelhante.
O gráfico representado na Figura 28 demonstrou o cálculo do fator
estequiométrico (n) da diosmina-Fe, como exemplo.
Figura 28 - Consumo do radical ABTS˙ˉ (µM) versus as concentrações da diosmina-Fe (µM), demonstrando o n = 3,3683 (3,4) calculado da diosmina-Fe.
Na Tabela 4 observa-se que a capacidade de abstração de ABTS.- da
diosmina e dos complexos diosmina-Co, diosmina-Fe e diosmina-Cu, são melhores
que a do Trolox. Apesar do complexo diosmina-Ni não apresentar atividade
antioxidante melhor que a diosmina, como os demais complexos, sua atividade é
superior ao Trolox. A diosmina-Cu, seguida da diosmina-Fe apresentam maior
atividade em comparação à diosmina e aos demais compostos.
59
Tabela 4 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) da diosmina e dos
complexos.
Compostos n TEAC
Trolox 2,0 1
Diosmina-Cu 3,7 ± 0,2 1,9 ± 0,1
Diosmina-Fe 3,4 ± 0,4 1,7 ± 0,2
Diosmina-Co 2,7 ± 0,1 1,4 ± 0,1
Diosmina-Ni 2,3 ± 0,2 1,2 ± 0,4
Diosmina 2,5 ± 0,8 1,3 ± 0,4
Os resultados da atividade antioxidante, obtidos para a diosmina, diosmina-Ni,
diosmina-Cu e diosmina-Co estão nos ANEXOS I, J, K e L respectivamente.
60
6 CONCLUSÃO
Os complexos diosmina-Cu, diosmina-Ni, diosmina-Fe e diosmina-Co
sintetizados neste trabalho, foram caracterizados por espectroscopia no IV e UV e
espectrometria de massas. De acordo com os resultados obtidos, é possível sugerir
que a complexação ocorreu entre os anéis A e C do flavonóide para todos os metais
complexados, ocorrendo ainda na proporção de 1:1 de diosmina:metal.
A caracterização dos complexos por análise elementar não foi possível devido
à presença da hesperidina (a diosmina comercializada apresenta 5% de hesperidina
na sua composição). A separação da hesperidina da diosmina não foi possível
devido à similaridade de solubilidade e polaridade entre os compostos. Além disso,
alguns complexos como a diosmina-Fe são extremamente higroscópicos, devido a
sua instabilidade, impossibilitando determinar sua composição com exatidão por
esta técnica.
A avaliação da atividade antioxidante frente ao radical ABTS.- demonstrou que
a diosmina-Cu e a diosmina-Fe apresentaram um potencial antioxidante superior aos
demais complexos, nas concentrações testadas. Esta maior atividade pode estar
associada aos íons Cu2+ e Fe3+ por serem ácidos de Lewis de fronteira, com caráter
duro. Isto faz com que ocorra uma diminuição da densidade eletrônica no flavonóide,
quando coordenado ao Cu (II) e Fe (III), o que permite que os elétrons livres do
radical sejam mais facilmente acomodados na molécula.
Estes dados corroboram com os relatos de literatura, que sugerem que
flavonóides complexados a metais de transição apresentam melhor potencial
antioxidante.
Como perspectiva para o complemento deste trabalho, encontra-se em
andamento a avaliação da atividade citotóxica dos complexos sintetizados, contra
linhagens de células tumorais, com a colaboração da Profª. e Drª. Susana Diniz
(UNIBAN). Os resultados preliminares apontam o complexo diosmina-Fe com melhor
atividade. O mesmo também apresentou melhor atividade antioxidante in vitro.
61
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75
ANEXO G – Espectro de massas da diosmina-Cu, nos modos negativo e positivo,
(com energias de colisão 20, 25 eV).
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
%
0
100
DIOSNINS CU NEG 79 (1.332) Cm (59:90) Scan ES- 8.23e5339.4250.2
225.1
61.8221.2
93.2216.2
101.0
325.5
299.2607.2340.2
341.1383.1 459.6
663.2
665.1758.2 1035.61007.2
917.5 1268.2
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
%
0
100
DIOSNINS CU NEG AGUA 120 (2.024) Cm (47:196) Scan ES- 3.57e5299.2
62.0
250.2
225.1110.0
220.3112.0
216.2
161.1
607.3339.4
405.4341.2 406.2
459.3 577.1
608.3663.2
665.2 741.1973.2
m/z200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0
100
DIOSMINA CU 1 110 (1.855) Cm (1:132) Scan ES+ 2.05e7287.3
269.3288.3
301.4
m/z150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700
%
0
100
DIOSMINA CU 1 110 (1.855) Cm (1:135) Scan ES+ 2.05e7287.3
269.3195.2163.3 217.2
288.3
301.4 363.5307.4
m/z200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0
100
DIOSMINA CU 2 72 (1.214) Cm (2:101) Scan ES+ 2.84e7287.3
163.3288.3
301.3 609.2
76
ANEXO H – Espectro de massa da diosmina-Co, nos modos negativo e positivo
(com energias de colisão de 30, 40 e 50 eV).
m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
%
0
100
DIOSMINA CO NEG 39 (0.333) Cm (1:115) Scan ES- 5.18e6236.1
178.1
177.1
150.0134.1
208.1
385.2
371.2357.1327.3311.3283.3
413.2478.2
464.2506.2
655.3609.3534.2 683.2711.3
724.5
m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
%
0
100
m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
%
0
100
m/z100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
%
0
100
DIOSMINA CO POS MS 185 (1.577) Cm (126:194) Daughters of 666ES+ 1.32e5666.6
666.2
444.2430.2188.9127.0 358.1301.3276.3220.1 324.6
376.2
665.6520.3
519.1454.4594.4580.3
562.7 663.2604.7667.2
696.9
DIOSMINA CO POS MS 230 (1.961) Cm (209:271) Daughters of 666ES+ 1.12e5358.3
357.9
357.7
357.2301.3276.2204.2127.2 161.8219.9
430.1376.1 418.2
400.2
520.3444.3519.6
475.3
666.5520.5 594.2579.7 663.7603.0 736.7714.1670.0
DIOSMINA CO POS MS 322 (2.745) Cm (311:352) Daughters of 666ES+ 2.27e5358.2
357.9
357.4
356.6301.1204.1123.2 132.2 177.9220.1
430.4376.1 417.8 444.3519.9509.9 665.5578.7554.8
593.3658.0
679.1
79
ANEXO K – Resultados obtidos para diosmina-Cu versus radical ABTS˙ˉ.
y = 3,6636x - 3,7702R² = 0,9388
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8
Co
ns
um
o A
bts
(µ
M)
Concentração D-Cu (µM)
ABTS (48 µM) X D-Cu