Post on 02-Mar-2019
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ISOLASI DAN KARAKTERISASI
BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR
RENDAMAN KACANG KEDELAI
SKRIPSI
ZAKIYAH ZAHRA NUR AMALIAH
1112102000026
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
AGUSTUS 2016
ii
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ISOLASI DAN KARAKTERISASI
BAKTERI ASAM LAKTAT DARI LIMBAH CAIR
RENDAMAN KACANG KEDELAI
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi
ZAKIYAH ZAHRA NUR AMALIAH
1112102000026
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA
AGUSTUS 2016
iii
iv
v
vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRAK
Nama : Zakiyah Zahra Nur Amaliah
Program Studi : Farmasi
Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari
Limbah Cair Rendaman Kacang Kedelai
Tempe adalah makanan tradisional Indonesia, dimana dalam
pembuatannya terdapat limbah cair yang tidak dimanfaatkan kembali yaitu air
rendaman kedelai. Bakteri Asam Laktat (BAL) diketahui terdapat pada setiap
tahap pembuatan tempe termasuk pada saat perendaman kedelai. Penelitian ini
bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi BAL yang terdapat pada
limbah cair air rendaman kacang kedelai. Setelah dilakukan pengenceran sampai
10-7
, limbah cair air rendaman kacang kedelai diinokulasikan ke dalam MRSA
tersuplementasi CaCO3 1%. Diperoleh delapan isolat dengan zona bening
disekitar koloninya dengan morfologi koloni berbeda-beda yang diduga sebagai
BAL. Kemudian dilakukan karakterisasi morfologi, biokimia, serta fisologi.
Kedelapan isolat memiliki karakteristik tidak membentuk spora, non motil,
katalase negatif, dapat tumbuh pada suhu 37° dan 45°C serta NaCl konsentrasi 4%
dan 6,5%. Hasil dari uji keamanan menunjukkan kedelapan isolat negatif untuk uji
aktivitas hemolisis. Tujuh dari delapan isolat merupakan Gram positif, sedangkan
satu adalah Gram negatif. Tetapi hanya bakteri Gram positif yang dipilih karena
memenuhi karakteristik BAL. Tujuh isolat yang memenuhi persyaratan BAL,
diduga termasuk ke dalam genus Lactobacillus dengan tipe fermentasi
heterofermentatif. Pada penelitian ini digunakan Lactobacillus casei ATCC 393
sebagai strain acuan.
Kata Kunci: Air rendaman kacang kedelai, bakteri asam laktat, isolasi,
karakterisasi
vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRACT
Name : Zakiyah Zahra Nur Amaliah
Major : Pharmacy
Title : Isolation and Characterization Lactic Acid Bacteria from Soybean
Soaking Water Liquid Waste
Tempeh is an Indonesia traditional food, which in the manufacturers have
a liquid waste that no use again namely soybean soaking water. Lactic Acid
Bacteria (LAB) has been known at every stage of tempeh production, included at
soaking soybeans. This study aimed to isolate and characterize LAB contained in
soybean soaking water liquid waste. After serial dilution to 10-7
, soybean soaking
water liquid waste was inoculated on the MRSA contained 1% CaCO3. After
incubation, there are 8 isolates which produce clear zone around their colonies
with different colony morphology suspected as LAB. Morphological,
physiological and biochemical characteristics were employed to identify LAB. All
isolates were non-spore forming, non-motile, catalase negative, grow well at 37°
and 45°C, could be able to grow in the presence of 4% and 6.5% sodium chloride.
The results of safety test showed all isolates negative for hemolytic activity. Seven
of eight isolates are Gram-positive, while one is a Gram-negative. But only Gram-
positive were chosen as they represent the LAB characteristic. Seven isolates were
identified as Lactobacillus with heterofermentative as the type fermentation. In
this study, Lactobacillus casei ATCC 393 used as reference strain.
Keywords: Characterization, isolation, lactic acid bacteria, soybean soaking water
viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kepada Allah SWT
yang telah melimpahkan rahmat, dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan menyusun skripsi ini. Shalawat serta salam
senantiasa penulis curahkan kepada Nabi Besar Muhammad SAW beserta
keluarga, para sahabat serta para pengikut di jalan yang diridhoi-Nya.
Skripsi yang berjudul “Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
dari Limbah Cair Rendaman Kacang Kedelai” disusun dalam rangka
memenuhi persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta. Penulis menyadari bahwa dalam penelitian sampai penyusunan skripsi ini
tidak akan terwujud tanpa adanya bantuan, bimbingan, dan dukungan dari
berbagai pihak. Oleh karena itu dalam kesempatan ini penulis tidak lupa
mengucapkan terima kasih banyak kepada:
1. Dr. Arief Sumantri, S. KM., M. Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si, Apt selaku Ketua dan Ibu Nelly Suryani, Ph.D, Apt
selaku Sekretaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Ibu Puteri Amelia, M. Farm., Apt selaku pembimbing I dan bapak Saiful
Bahri, M. Si selaku pembimbing II yang telah tulus ikhlas membimbing,
memberi masukan, ilmu, nasihat, serta semangat kepada penulis.
4. Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt. selaku dosen penasehat akademik yang telah
membimbing dan banyak membantu penulis dari awal perkuliahan.
5. Seluruh dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta atas ilmu yang telah diberikan
selama penulis menempuh pendidikan.
6. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Muhammad Yazid dan Ibunda Ida Farida
yang selalu memberikan dukungan baik moril maupun materil, semangat,
kasih sayang, dan doa yang tidak ada hentinya mengiringi setiap langkah
penulis.
7. Adik-adik tersayang Putra Faris Syafiq Yasir dan Nawra Nurkamila Ghaniya,
serta seluruh keluarga besar atas semangat, dukungan, dan doa kepada penulis.
8. Teman yang selalu mendengarkan keluh kesah, mendampingi, dan memberi
semangat dalam menyelesaikan penelitian ini, Teungku Ahmad Shalahuddin.
9. Sahabat seperjuangan sejak putih abu-abu yang selalu menjadi tempat berbagi
tangis dan tawa, Anindita Putri Hariyani Wimala dan Amanda Terrena Putri
yang juga sedang menyelesaikan tesisnya.
ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
10. Kawan seperjuangan penelitian, Santi Susilawati atas bantuan, kesabaran,
masukan, dan semangat dalam menyelesaikan penelitian ini.
11. Azmi, Moethia, Afina, Endang, Risha, Nisa Utami, Annissa Fadillah, Dian
Aulia, Ade Rachma, Fenny, Nurul, Putri Wulandari, Khorunnisak, Dwi Putri,
Rakha, Gadis, Safizah, Apriliana Nur, Vesty yang telah memberi semangat
dan bantuan baik selama perkuliahan maupun penelitian hingga skripsi ini
dapat selesai.
12. Laila, Ummi Habibah, Wida, Lilis, Eha, Noni, Zulfa, Vano, dan teman-teman
mikrobiologi lainnya, terima kasih atas kerja sama serta suka duka selama
penelitian berlangsung.
13. Laboran Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Mba Rani, Kak Tiwi, Kak
Lisna, Kak Eris, Kak Walid, Kak Yaenap, dan Kak Rahmadi serta Mba Puji
laboran PLT yang banyak membantu selama penulis melakukan penelitian.
14. Keluarga besar pengurus HMPS Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
periode 2014-2015 atas pengalaman dan pelajaran kepada penulis.
15. Teman-teman Farmasi 2012 khususnya kelas AC atas kebersamaan, suka
duka, dan motivasi selama perkuliahan.
16. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis dalam menyelesaikan
skripsi ini baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya tak
dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna
dan banyak kekurangan. Oleh karena itu saran serta kritik yang membangun
sangat diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu
pengetahuan pada umumnya dan bagi ilmu farmasi pada khususnya. Amin Ya
Robbal’alamin.
Jakarta, Agustus 2016
Penulis
x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii
HALAMAN PERSYARATAN ORISINALITAS ......................................... iii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ iv
HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ......................................................... v
ABSTRAK ........................................................................................................ vi
ABSTRACT ...................................................................................................... vii
KATA PENGANTAR ...................................................................................... viii
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ................. x
DAFTAR ISI ..................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiv
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv
BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................. 1
1.1. Latar Belakang ............................................................................................. 1
1.2. Rumusan Masalah ........................................................................................ 3
1.3. Tujuan Penelitian ......................................................................................... 3
1.4. Manfaat Penelitian ....................................................................................... 3
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 4
2.1. Probiotik ...................................................................................................... 4
2.2. Strain Bakteri Asam Laktat ......................................................................... 5
2.3. Efek Menguntungkan Probiotik .................................................................. 7
2.4. Metabolisme Bakteri Asam Laktat ............................................................. 11
2.5. Produksi Asam Organik .............................................................................. 14
2.6. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ........................................................... 15
2.7. Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme ................................................ 16
2.7.1. Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Secara Langsung ...................... 16
2.7.2. Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Secara Tidak Langsung ........... 17
BAB III. METODE PENELITIAN ................................................................. 18
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian ....................................................................... 18
3.2. Alat dan Bahan ............................................................................................. 18
3.2.1. Alat .................................................................................................... 18
3.2.2. Bahan ................................................................................................. 18
3.3. Prosedur Kerja .............................................................................................. 18
3.3.1. Persiapan Alat dan Bahan yang Digunakan ...................................... 18
3.3.1.1. Preparasi Alat ....................................................................... 18
3.3.1.2. Preparasi Sampel .................................................................. 19
3.3.1.3. Pembuatan Medium MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar) 19
3.3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat .............................................................. 19
3.3.3. Pemurnian ......................................................................................... 20
3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................... 20
3.3.4.1. Pengamatan Morfologi Bakteri Asam Laktat ...................... 20
3.3.4.2. Pengamatan Fisiologi dan Biokimia Bakteri Asam Laktat .. 21
3.3.5. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat ....................................... 21
xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 22
4.1. Hasil ............................................................................................................. 22
4.1.1. Isolasi Bakteri Asam Laktat .............................................................. 22
4.1.2. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat ......................................... 22
4.1.2.1. Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat ................................ 23
4.1.2.2. Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri Asam Laktat ............ 23
4.1.3. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat ....................................... 23
4.4 Pembahasan ................................................................................................ 24
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 36
5.1. Kesimpulan ................................................................................................. 36
5.2. Saran ............................................................................................................ 36
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 37
LAMPIRAN ...................................................................................................... 42
xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Mikroorganisme Probiotik .......................................................... 7
Tabel 4.1 Morfologi Koloni Isolat ............................................................. 22
Tabel 4.2 Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan ............................... 24
Tabel 4.3 Identifikasi Tingkat Genus (Generic Assignment) ..................... 33
xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Jalur Metabolisme Homofermentatif .......................................... 12
Gambar 2.2 Jalur Metabolisme Heterofermentatif ......................................... 13
Gambar 4.1 Hasil Isolasi BAL ....................................................................... 25
Gambar 4.2 Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel Bakteri ........................ 26
Gambar 4.3 Hasil Pewarnaan Endospora ....................................................... 27
Gambar 4.4 Hasil Uji Motilitas ...................................................................... 28
Gambar 4.5 Hasil Uji Katalase ...................................................................... 29
Gambar 4.6 Hasil Uji Produksi Gas ............................................................... 30
Gambar 4.7 Hasil Uji Aktivitas Hemolisis .................................................... 34
xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Alur Penelitian ........................................................................... 42
Lampiran 2. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Agar ........................ 43
Lampiran 3. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Broth ....................... 45
Lampiran 4. Hasil Isolasi BAL dari Limbah Cair Tempe .............................. 46
Lampiran 5. Hasil Perhitungan Total Plate Count (TPC) .............................. 47
Lampiran 6. Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel ..................................... 48
Lampiran 7. Hasil Pewarnaan Endospora ....................................................... 49
Lampiran 8. Hasil Uji Katalase ...................................................................... 50
Lampiran 9. Hasil Uji Motilitas ...................................................................... 51
Lampiran 10. Hasil Uji Produksi Gas ............................................................... 52
Lampiran 11. Hasil Uji Ketahanan Suhu .......................................................... 53
Lampiran 12. Hasil Uji Ketahanan NaCl .......................................................... 55
Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Hemolisis .................................................... 57
Lampiran 14. Alat dan Bahan yang Digunakan ................................................ 58
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Proses fermentasi merupakan salah satu metode pengawetan yang dapat
dideskripsikan sebagai suatu proses perubahan secara biokimia pada bahan
pangan oleh aktivitas mikroorganisme (Hidayat dan Sri, 2006). Fermentasi telah
digunakan secara luas oleh masyarakat tidak hanya untuk mengawetkan pangan,
tetapi juga digunakan untuk memproduksi berbagai produk pangan yang
diinginkan dari susu, daging, ikan, telur, biji-bijian, buah, dan sayuran.
Fermentasi pangan melibatkan proses konversi bahan dasar menjadi
pangan fermentasi, oleh pertumbuhan dan aktivitas metabolisme mikroorganisme
yang diinginkan. Mikroorganisme tersebut memanfaatkan beberapa komponen
bahan dasar pangan sebagai substrat untuk menghasilkan energi dan komponen
seluler, meningkatkan populasi, dan menghasilkan beberapa produk yang tidak
digunakan sebagai produk akhir yang disekresikan ke lingkungan. Proses
fermentasi dapat meningkatkan nilai gizi bahan yang berkualitas rendah, yang
merupakan suatu cara untuk menghilangkan zat antinutrisi dan racun yang
terkandung dalam suatu bahan makanan (Sopandi dan Wardah, 2014).
Sejak ditemukannya teknologi fermentasi pangan, produk hasil fermentasi
tidak hanya mempunyai daya awet yang tinggi dengan kualitas sesuai dengan
yang diharapkan, tetapi juga mempunyai efek menyehatkan khususnya terhadap
kesehatan saluran cerna (Sopandi dan Wardah, 2014). Saluran pencernaan
manusia mengandung lebih dari 10 x 1014
mikroorganisme yang berpengaruh
terhadap kesehatan manusia, sebab aktif melakukan bermacam-macam
metabolisme. Sekitar 1.000 spesies bakteri terdapat dalam saluran pencernaan
(Ray, 2004). Berbagai kompartemen dalam saluran pencernaan dihuni oleh
populasi mikroorganisme. Dalam usus besar terdapat populasi dominan yang
penting dan dapat bersimbiosis secara baik dengan inang, sehingga berperan
penting dalam kesehatan (Roberfroid, et al., 2010).
Probiotik merupakan mikroorganisme yang bila dikonsumsi per oral akan
memberikan dampak positif bagi kesehatan manusia (Firmansyah, 2001). Bakteri
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
probiotik dapat menghasilkan berbagai macam senyawa seperti asam laktat, asam
asetat, bakteriosin, dan reuterin yang dapat menghambat pertumbuhan patogen.
Asam organik (asam laktat dan asam asetat) tersebut berfungsi menurunkan pH
sehingga mempengaruhi pertumbuhan patogen serta menjadi racun untuk mikroba
(Sopandi dan Wardah, 2014). Secara tradisional, Bakteri Asam Laktat (BAL)
digunakan sebagai probiotik.
Pangan yang diperoleh dari proses fermentasi banyak berasal dari biji-
bijian, salah satu diantaranya kacang kedelai yang banyak digunakan sebagai
bahan dasar dari pangan fermentasi seperti tempe, kecap, dan tauco. Tempe
adalah makanan hasil fermentasi tradisional Indonesia yang telah mendunia,
dimana telah banyak berada di luaran sebab kandungannya yang sangat bagus
untuk kesehatan. Banyak penelitian dan review telah dilakukan mengenai tempe
serta keberadaan dari BAL pada tempe pun telah dilaporkan (Kormin, et al., 2001;
Moreno, et al., 2002). Seperti yang telah dipaparkan diatas, BAL memiliki
kemampuan dalam menghambat pertumbuhan patogen saat proses fermentasi
tempe.
Pada tahun 2013, Pisol, et al. mengisolasi BAL dari tempe, dimana
dilakukan tidak hanya pada produk tempe namun pada tiap langkah pembuatan
tempe. Didapatkan hasil kandungan BAL tertinggi terdapat pada air rendaman
kedelai, yakni Lactobacillus heterofermentatif. Pada tahun 2015, Pisol, et al.
melakukan isolasi BAL kembali namun didapatkan hasil yang berbeda, dimana
pada air rendaman diisolasi Enterococcus faecium, Leuconostoc lactis, serta
Leuconostoc sp.
Pada proses pembuatan tempe di pabrik, dilakukan terlebih dahulu
perebusan kacang kedelai lalu didiamkan selama semalaman, setelah itu baru
dilakukan proses pembuatan tempe selanjutnya. Air rendaman tersebut biasanya
tidak digunakan kembali sehingga akan dibuang begitu saja atau terkadang
digunakan juga sebagai pakan cair ternak.
Melihat ketersediaannya yang banyak serta tidak dimanfaatkan kembali,
air rendaman kedelai tersebut atau limbah cair ini dapat diteliti lebih lanjut
mengenai kandungan BAL didalamnya. Dari hasil penelitian sebelumnya yang
menyatakan hasil isolasi BAL yang berbeda juga dapat mendasari penelitian ini.
3
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Apakah akan didapatkan isolat yang berbeda pula, mengingat tempat pengambilan
sampel yang juga berbeda. Berdasarkan uraian diatas, maka dapat dilakukan
isolasi dan identifikasi BAL dari limbah cair rendaman kedelai pada produsen
tempe.
1.2. Rumusan Masalah
1. Apakah isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) dapat diperoleh dari limbah cair
rendaman kacang kedelai?
2. Bagaimanakah karakteristik isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) yang telah
diperoleh dari limbah cair rendaman kacang kedelai?
1.3. Tujuan Penelitian
1. Untuk memperoleh isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) dari limbah cair
rendaman kacang kedelai.
2. Untuk mengetahui karakteristik Bakteri Asam Laktat (BAL) yang diperoleh
dari limbah cair rendaman kacang kedelai.
1.4. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi mengenai keberadaan
dan karakteristik Bakteri Asam Laktat (BAL) dari limbah cair rendaman kacang
kedelai pada produsen tempe.
4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Probiotik
Istilah probiotik berasal dari bahasa Yunani, yang berarti ―untuk
kehidupan‖. Para ahli dari Food and Agriculture Organization (FAO) dan World
Health Organization (WHO) mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisme
yang hidup, dimana saat diadministrasikan dalam jumlah yang adekuat akan
memberikan keuntungan di sisi kesehatan pada host-nya. Berdasarkan definisi
tersebut, probiotik tidak seharusnya ditunjuk sebagai agen bioterapeutik (Reid, et
al., 2003).
Probiotik adalah spesies mikroba yang dikonsumsi dengan tujuan
mengubah flora gastrointestinal, dimana akan memberikan manfaat untuk
kesehatan. Penggunaan mikroba dimulai secara tidak sengaja berabad-abad yang
lalu ketika orang mencatat pertama kalinya terdapat efek menguntungkan untuk
kesehatan dari mengkonsumsi makanan fermentasi (Gogineni, et al., 2013).
Probiotik memiliki sejarah yang panjang, dimulai dari pencatatan pertama
dikonsumsinya minuman berbakteri oleh manusia yakni lebih dari 2000 tahun
yang lalu. Awal dari peradaban probiotik ditetapkan secara ilmiah oleh
Metchnikoff pada Pasteur Institue di Paris. Metchnikoff (1907) mengamati umur
petani Bulgarian yang panjang dan dihubungkan dengan tingginya konsumsi susu
asam. Selama penelitian ini, beliau berhipotesis bahwa mikroflora normal usus
dapat memberikan efek samping pada host dan konsumsi beberapa bakteri dapat
memberikan efek sebaliknya. Metchnikoff melakukan pengobatan dengan
menggunakan sesuatu yang sekarang ini dikenal sebagai Lactobacillus delbruckeii
subsp. bulgaricus yang dimana dengan Streptococcus salivarius subsp.
thermopillus digunakan untuk memfermentasi susu pada produksi yogurt
tradisional (Desai, 2008).
Penelitian selanjutnya dilakukan langsung dengan bakteri yang diisolasi
dari usus sebagai probiotik. Setelah itu banyak spesies mikroorganisme yang
digunakan, yaitu bakteri yang memproduksi asam laktat (lactobacilli, streptococci,
enterococci, lactococci, bifidobacteria) dan juga Bacillus spp. serta fungi seperti
5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Saccharomyces spp. dan Aspergillus spp (Desai, 2008). Bakteri asam laktat
(BAL), bakteri non-asam laktat, dan jamur dapat dikatakan sebagai probiotik.
Bakteri asam laktat merupakan probiotik yang paling penting dan paling
memberikan efek yang menguntukan terhadap saluran pencernaan manusia
(Holzapfel, et al., 2001). Berdasarkan Guidelines on Probiotics and Prebiotics,
karakteristik probiotik dapat dijelaskan sebagai berikut (Malago, et al., 2011):
1. Tidak kehilangan sifat aslinya selama masa penyimpanan.
2. Secara normal berada di saluran pencernaan manusia.
3. Harus dapat bertahan hidup, dapat melawan pertahanan barrier
lambung, tahan terhadap kerja pencernaan dari getah lambung, enzim
pencernaan, dan garam empedu, serta harus berkoloni di dalam usus.
4. Harus bisa melekat dan berkoloni dengan sel intestinal. Struktur
membran bakteri berperan dalam mekanisme perlekatan dan
berpasangan langsung dengan mukosa, permukaan protein, dan
mungkin dengan beberapa lainnya yang berlendir.
5. Harus menimbulkan fungsi metabolik pada pencernaan, yang
bermanfaat bagi kesehatan manusia, dan antagonis mikroorganisme
patogen dengan memproduksi zat anti-mikroba.
6. Tidak boleh menyebabkan reaksi berbahaya dan aman terhadap sistem
imun (dinyatakan aman atau status GRAS).
7. Resistensi terhadap antibiotik.
8. Harus dikelola dalam dosis yang adekuat dan memiliki rasio efikasi
biaya yang tepat dan seimbang.
2.2. Strain Bakteri Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang termasuk dalam
filum Firmicute. Bakteri yang termasuk dalam kelompok ini adalah
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera,
Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus dan Weissella (Jay, 1992). Kelompok bakteri ini
termasuk bakteri Gram positif, tidak berspora, tidak berpigmen mesofil, serta
6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
berbentuk kokus dan batang. Bakteri ini dapat hidup pada temperatur antara 5-
50ºC dan bersifat katalase negatif (Perry, et al., 1997).
Nama bakteri asam laktat diperoleh dari kemampuannya dalam
memfermentasi gula menjadi asam laktat. Bakteri asam laktat juga terdapat dalam
tubuh manusia sebagai flora normal tubuh (Prescott, et al., 2002). Bakteri yang
termasuk ke dalam Bifidobacterium dan Lactobacillus secara luas digunakan
sebagai probiotik, dimana terbagi menjadi dua kelompok yakni yang berasal dari
usus dan vagina. Bifidobacteria merupakan kelompok penting dalam kultur
probiotik yang biasanya digunakan dalam produk olahan susu fermentasi.
Bifidobacterium adalah bakteri Gram positif, anaerobik, tidak motil, dan tidak
dapat membentuk spora. Mereka mungkin memiliki beberapa bentuk, seperti
batang yang melengkung pendek, batang berbentuk stik, dan batang berbentuk Y.
Untuk pertumbuhan Bifidobacteria, pH optimumya adalah 6,0-7,0 dan tidak akan
tumbuh pada pH kurang dari 4,5 dan lebih dari 8,5. Temperatur optimum untuk
tumbuh 37-41°C, minimum 25-28°C, dan maksimum 43-45°C. Kultur
Bifidobacterium yang digunakan sebagai probiotik diantaranya B. adolescentis, B.
longum, B. infantis,dan B. breve (Ozyurt, et al., 2014).
Bakteri asam laktat (BAL) biasanya dideskripsikan sebagai
mikroorganisme Gram positif, tidak memiliki sitokrom, menyukai keadaan
anaerob tetapi aerotolerant, tahan asam, dan dapat menyebabkan peragian. Genus
yang sangat penting saat ini diantaranya: Lactobacillus, Lactococcus,
Enterocococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, dan Bifidobacterium
(Ozyurt, et al., 2014)
Pertumbuhan dari L. acidophilus terjadi pada temperatur 45°C, atau
optimum antara 35 dan 40°C. Organisme ini akan tumbuh pada media yang
sedikit asam yaitu pada pH 6,4-4,5, tetapi pertumbuhan akan terhenti pada pH 4,0-
3,6, dengan pH optimum 5,5-6,0. L. rhamnosus adalah BAL dengan kemampuan
probiotik. Aktivitas petumbuhan BAL dipengaruhi oleh kondisi fermentasi,
seperti pH, temperatur, komposisi medium, dan faktor lainnya (Ozyurt, et al.,
2014).
7
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 2.1 Mikroorganisme Probiotik
Spesies Lactobacillus Spesies Bifidobacterium
L. acidophilus
L. amylovorus
L. casei
L. crispatus
L. delbrueckii
subsp. Bulgaricus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
B. adolescentis
B. animalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. lactis
B. longum
BAL lainnya Non BAL
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis
Leuconstoc mesenteroides
Pediococcus acidilactici
Sporolactobacillus inulinus
Streptococcus thermophilus
Bacillus cereus var. toyoi
Escherichia coli strain nissle
Propionibacterium freudenreichii
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces boulardii
(Sumber: Holzapfel, et al., 2001)
2.3. Efek Menguntungkan Bakteri Asam Laktat
Dalam beberapa tahun terakhir berbagai aplikasi dari produk
farmaseutikal dan medisinal telah diidentifikasi, dan probiotik diselidiki lebih
lanjut mengenai efek menguntungkannya untuk kesehatan. Pada dasarnya
karakteristik mikroba berbeda-beda, berbagai bentuk formulasi telah
dikembangkan untuk kondisi klinis yang berbeda-beda pula. Dimana spesies
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan karakteristik yang beragam diindikasikan untuk kondisi klinis yang
berbeda (Aron, et al., 2015).
Efek menguntungkan dari mengkonsumsi sel hidup adalah kemampuan
sel hidup bakteri yang dapat memberi perlindungan terhadap patogen enterik,
memberi enzim yang membantu proses metabolisme beberapa nutrisi pangan
seperti laktase yang menghidrolisis laktosa, detoksifikasi komponen pangan yang
merugikan, menstimulasi sistem imun, dan mengembangkan aktivitas peristaltik
usus. Keuntungan lain dari mengkonsumsi sel hidup bakteri yakni hidrolisis
laktosa dan penurunan kadar kolesterol serum, kanker kolon, gangguan usus,
penyakit alergi, serta modulasi respon imun (Sopandi dan Wardah, 2014).
Berdasarkan karakteristik mikroba, spesies, dan formulasi yang berbeda-
beda, probiotik dapat digunakan diantaranya untuk kondisi sebagai berikut:
a. Penyakit kulit
Kulit adalah organ terluas dan yang kontak langsung dengan lingkungan
luar, dimana secara konstan terekspos dengan mikroorganisme dan bisa menjadi
tempat hidupnya. Mikroba tersebut dapat berinteraksi dengan mikroba lainnya, sel
manusia, serta sistem imun sel yang bisa menimbulkan resiko penyakit kulit
seperti jerawat, dermatitis atropik, dan eczema. Salah satu dari efek
menguntungkan probiotik adalah menekan inflamasi pada jerawat. Setelah
mengkonsumsi Lactobacillus spp. selama 12 minggu, pasien mengalami
kemajuan yang signifikan ditinjau dari lesi pada jerawat. Begitu pula pada
penggunaan L. plantarum, B. lactis Bb-12, dan L. rhamnosus GG (LGG) dalam
pengobatan dermatitis atropik (Aron, et al., 2015).
b. Penyakit saluran cerna
Berbagai penyakit dapat terjadi saluran cerna mulai dari ulser peptic,
diare, konstipasi, dan lain-lain. Beberapa strain BAL dapat mengontrol infeksi H.
pylori (penyebab ulser peptik) jika diberikan bersamaan dengan perawatan medis
(Iqbal, et al., 2014). Strain tertentu dari Lactobacillus dan Bifidobacterium secara
in vitro memiliki efek melawan H. pylori melalui pelepasan bakteriosin atau
produksi asam organik, dan/atau menghambat adhesi ke sel epitel (Vandenplas, et
al., 2014). Probiotik juga diketahui dapat menjadi agen pencahar dengan cara
memodulasi flora normal usus dan mempengaruhi fungsi utama usus yaitu
9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
motilitas usus. Modulasi flora normal usus juga mengubah aktivitas metabolisme
usus, seperti produksi gas dan asam lemak rantai pendek. Dimana asam lemak
rantai pendek ini mempunyai korelasi dengan waktu transit usus (Lee dan
Salminen, 2009 dalam Utami, 2013).
c. Kanker
Probiotik memainkan peran protektif dalam mengikat dan/atau degradasi
karsinogen, awalnya ini didapat dari tipe diet barat, banyak dalam daging merah
yang dipanggang. Banyak penelitian dalam mencit mengindikasikan bahwa
penggunaan beberapa lactobacilli mengurangi ambilan kembali mutagen oleh
jaringan berbeda. Setelah dilakukan pengamatan dengan manusia, menunjukkan
konsumsi olahan yang mengandung lactobacilli dapat mengurangi ekskresi
senyawa mutagen baik pada urin maupun pada feses (Aron, et al., 2015).
Dari hasil uji in vitro dan in vivo, baik pada hewan uji maupun uji klinis
pada manusia, B. lactis Bb12 dan Lb. rhamnosus GG dan kombinasi keduanya
(sinbiotik) diinkubasi dengan campuran prebiotik oligofruktosa dan inulin.
Supernatan dari fermentasi mengandung kuantitas yang besar dari butirat dan
ditempatkan dalam tabung dengan sel kanker HT2 manusia. Sel tumor yang masih
hidup kondisinya lemah dan proliferasi sel dihambat. Tikus dengan kanker kolon
dan diberi makan dengan inulin tipe fruktan menunjukkan penurunan insiden
kanker kolon. Manusia dengan polip pada kolon yang diberikan regimen sinbiotik
menunjukkan penurunan yang nyata pada sel DNA yang rusak (Aron, et al.,
2015).
d. Penurunan kadar kolestrol serum
Konsumsi susu yang mengandung mikroorganisme dan konsumsi sel
hidup bakteri dalam jumlah tinggi yang menguntungkan usus, diketahui berkaitan
dengan kadar kolestrol serum yang rendah pada manusia. Penurunan kadar
kolestrol tersebut diduga disebabkan oleh dua faktor. Faktor pertama, kemampuan
beberapa Lactobacillus dalam usus untuk memetabollisme kolestrol yang berasal
dari pangan, sehingga mengurangi jumlah kolestrol yang diabsorpsi dalam darah.
Dan faktor kedua, beberapa Lactobacillus dapat melakukan dekonjugasi garam
empedu dan mencegah reabsorpsi kolestrol dalam hati, yang pada gilirannya hati
menggunakan lebih banyak kolesterol serum untuk mensistesis garam empedu
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dan secara tidak langsung menurunkan kadar kolesterol dalam serum (Guarner, et
al., 1998 dan Lee, et al., 1999 dalam Sopandi dan Wardah, 2014).
e. Memodulasi respon imun
Mikroorganisme usus dianggap dapat bertindak sebagai penghalang,
membantu sistem regulasi, dan respons imun lokal. Regulasi immunofisiologis
dalam usus bergantung pada pembentukan mikroflora indigenous (Isolauri, et al.,
2001). Sifat atau fungsi mikroorganisme usus tersebut lebih efektif pada usia
muda, selama terjadi perkembangan jaringan limfoid dalam usus. Mikroflora
normal yang berada dalam saluran pencernaan pada usia muda, dapat membantu
pengembangan imunitas melalui pemberian antigen yang berkaitan dengan reaksi
inflamasi dalam usus (Guarner, et al., 1998; Lee, et al., 1999; Ray, 2004 dalam
Sopandi dan Wardah, 2014). Pemberian probiotik secara oral juga dapat
membantu mengatasi permasalahan respon imun, disebabkan oleh mikroflora
yang tidak menguntungkan usus. Efek yang menguntungkan dari probiotik
tersebut diduga dihasilkan oleh perubahan permeabilitas usus, perubahan
mikroflora usus, pengembangan fungsi penghalang imunologi usus, dan
menghambat respons inflamasi usus (Ray, 2004).
f. Bacterial Vaginitis (BV)
Lactobacillus spp, adalah unsur mikroba yang dominan dalam mengatur
keberadaaan, pertumbuhan, kolonisasi, dan persisten mikroorganisme non-
endogen di vagina. Seiring dengan naiknya jumlah Lactobacillus spp., maka
proteksi terhadap uropathogen pun ikut meningkat. Dinyatakan pula bahwa
lactobacilli memproduksi biofilm yang melindungi sel urogenital. Terdapat
penelitian dengan 40 wanita yang mengalami Bacterial Vaginitis (BV), dan
diberikan secara acak pengobatan kapsul mengandung L. rhamnosus GR-1 dan L.
reuteri RC-14 selama 5 hari atau gel metronidazole 0,75% dua kali sehari. Dan
hasilnya menunjukkan terdapat kesembuhan yang signifikan pada subjek yang
menerima probiotik lactobacilli dibandingkan metronidazole (Aron, et al., 2015).
g. Penurunan penyakit alergi
Keberadaan mikroflora normal usus sejak lahir sampai dewasa, dapat
berperan penting dalam menghambat beberapa respon imun spesifik. Mikroflora
normal dalam saluran pencernaan masuk ke dalam tubuh melalui makanan, air,
11
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
udara, dan sumber lingkungan lain (Guarner dan Schaafma, 1998 dan Lee, et al.,
1999 dalam Sopandi dan Wardah, 2014). Pemeliharaan bayi dalam lingkungan
yang sangat steril dan pemberian pangan olahan yang semisteril, dapat
mengganggu pembentukan atau keberadaan mikroflora normal dalam saluran
pencernaan. Hal tersebut menyebabkan sistem imun bayi mengembangkan respon
inflamasi terhadap beberapa antigen pangan. Probiotik mengandung bakteri usus
yang menguntungkan dapat mempunyai efek penekan terhadap reaksi tersebut,
dengan menstimulasi produk sitokin antiinflamasi dan menurunkan reaksi alergi
dalam individu yang sensitif (Ray, 2004).
2.4. Metabolisme Bakteri Asam Laktat
Energi seluler BAL diperoleh dari fermentasi karbohidrat, untuk
menghasilkan asam organik sebagai produknya. Perolehan energi seluler oleh
BAL dilakukan melalui dua jalur yang berbeda. BAL dibagi menjadi dua
kelompok berdasarkan metabolisme karbohidratnya yaitu homofermentatif dan
heterofermentatif (Ozyurt, et al., 2014).
Bakteri homofermentatif hanya menghasilkan laktat sebagai produk
utama dari fermentasi glukosa. Bakteri homofermentatif melakukan jalur
glikolisis Emden-Meyerhof-Parnas (EMP), pada molekul 6 karbon glukosa
difosforilasi dan diisomerisasi sebelum didegradasi oleh enzim aldolase menjadi
gliseraldehid-3-fosfat, kemudian diubah menjadi piruvat. Selama proses
fosforilasi, dihasilkan 2 molekul ATP untuk setiap molekul glukosa yang
difermentasi (Sopandi dan Wardah, 2014). Kelompok homofermentatif terdiri dari
Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus, dan beberapa
lactobacilli (Vasiljevic and Shah 2008 dalam Ozyurt, et al., 2014).
Sedangkan, bakteri heterofermentatif menghasilkan asam laktat, etanol
atau asetat, dan karbon dioksida dari glukosa. Heterofermentatif tidak mempunyai
enzim aldolase dan mengubah heksosa, glukosa menjadi pentosa melalui
serangkaian reaksi (Sopandi dan Wardah, 2014). Kelompok heterofermentatif
terdiri dari Leuconostoc, Weissella, dan beberapa lactobacilli (Vasiljevic and Shah
2008 dalam Ozyurt, et al., 2014).
12
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2.1 Jalur metabolisme homofermentatif (Sumber: Kusuma, 2009)
Fruktosa Glukosa
Fruktosa-6-fosfat
ATP
ADP
Glukosa-6-fosfat
ATP
ADP
2 Gliseraldehid-3-fosfat
ATP
ADP
2-piruvat
2-Laktat
4 ATP
4 ADP
2 Pi
2 NAD+
2 NADH
4 ATP
4 ADP
2 NAD+
2 NADH
13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2.2 Jalur metabolisme heterofermentatif (Sumber: Kusuma, 2009)
Glukosa
Glukosa-6-fosfat
ATP
ADP
Fruktosa-6-fosfat
ATP
ADP
6-fosfoglukonat
2 NAD+
2 NADH
Ribulosa-5-fosfat
2 NAD+
2 NADH CO2
Xilulosa-5-fosfat
Gliseraldehid-3-fosfat Asetil fosfat Asetat
ATP ADP
Piruvat
Laktat
NAD+
NADH 2 ADP
2 ATP
2 Pi
NADH
NAD+
CoA
Pi
Etanol
NADH
NAD+
Asetil CoA
Asetaldehid
NADH
NAD+
Fruktosa
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5. Produksi Asam Organik
Fermentasi mikroorganisme biasanya menghasilkan asam organik seperti
asam asetat, asam glukonat, asam sitrat, asam itakonat, asam giberelat, dan asam
laktat (Pratiwi, 2008). Asam-asam organik dari produk fermentasi merupakan
hasil hidrolisis asam lemak dan juga sebagai hasil aktivitas pertumbuhan bakteri.
Penentuan kuantitatif asam organik pada produk fermentasi adalah penting untuk
mempelajari kontribusi bagi aroma sebagian besar produk fermentasi, alasan gizi,
dan sebagai indikator aktivitas bakteri (Bevilacqua & Califano, 1989 dalam Nur,
2005).
a) Asam glukonat, asam ini diproduksi oleh berbagai bakteri termasuk spesies
Acetobacter dan oleh beberapa fungi seperti Penicillium dan Aspergillus.
Aspergillus niger mengoksidasi glukosa menjadi asam glukonat dalam reaksi
enzimatik tunggal oleh enzim glukosa oksidase. Asam glukonat memiliki
beberapa kegunaan, seperti kalsium glukonat yang merupakan produk farmasi
untuk menyuplai kalsium dalam tubuh (Pratiwi, 2008).
b) Asam sitrat diproduksi oleh Aspergillus niger dengan molasses sebagai
substrat fermentasinya. Transformasi asam sitrat oleh Aspergillus terreus
dapat digunakan untuk mempoduksi asam itakonat dalam dua langkah reaksi.
Langkah pertama yaitu perubahan asam sitrat menjadi asam cis-akonitat
melalui proses hidroksilasi dan langkah kedua yaitu langkah karboksilasi asam
cis-akionat menjadi asam itakonat. Proses fermentasi ini memerlukan pH
berkisar pada 2,2 (Pratiwi, 2008).
c) Asam giberelat diproduksi oleh fungi Gibberella fujikoroi (Fusarium
moniliforme). Diperlukan media glukosa-garam mineral pada saat proses
fermentasi, temperatur inkubasi berkisar pada 25°C dengan pH asam (Pratiwi,
2008).
d) Asam laktat diproduksi oleh Lactobacillus delbrueckii, spesies Lactobacillus
lainnya, Streptococcus, dan Leuconostoc. Asam laktat digunakan untuk
mengawetkan makanan pada industri penyamakan kulit dan industri tekstil.
Media yang digunakan dalam fermentasi asam laktat ini memerlukan glukosa
10-15%, kalsium karbonat 10% untuk menetralisasi asam laktat yang
dihasilkan, amonium fosfat, dan sejumlah kecil sumber nitrogen. Gula jagung,
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pati kentang, dan gandum sering digunakan sebagai sumber karbohidrat.
Temperatur inkubasi antara 45-50°C dengan pH antara 5,5-6,5. Setelah proses
fermentasi 5-7 hari, kurang lebih 90% gula telah diubah menjadi asam laktat,
kalsium karbonat selanjutnya ditambahkan untuk menaikkan pH hingga 10,
kemudian media fermentasi dipanaskan dan disaring. Prosedur ini akan
membunuh bakteri, mengkoagulasi protein, menghilangkan sisa kalsium
karbonat, dan mendekomposisi residu karbohidrat (Pratiwi, 2008).
2.6. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme
Pertumbuhan adalah pertambahan teratur semua komponen suatu
organisme. Pertumbuhan mikroorganisme ditunjukkan adanya peningkatan
jumlah mikroorganisme, bukan peningkatan ukuran sel individu. Fase
pertumbuhan mikroorganisme terdiri dari empat macam (Pratiwi, 2008):
1) Fase lag (fase adaptasi)
Merupakan fase penyesuaian mikroorganisme pada suatu lingkungan baru.
Ciri dari fase ini yaitu tidak adanya peningkatan jumlah sel, yang ada hanya
peningkatan ukuran sel. Lama fase lag tergantung kondisi dan jumlah awal
mikroorganisme dan media pertumbuhan (Pratiwi, 2008).
2) Fase log (fase eksponensial)
Yakni fase dimana mikroorganisme tumbuh dan membelah pada kecepatan
maksimum, tergantung pada genetika mikroorganisme, sifat media, dan
kondisi pertumbuhan. Terdapat hal yang dapat menghambat laju pertumbuhan,
seperti nutrisi yang terkandung dalam kultur habis sehingga hasil metabolisme
yang bersifat racun tertimbun dan dapat menghambat pertumbuhan (Pratiwi,
2008).
3) Fase stasioner
Saat pertumbuhan mikoorganisme terhenti dan terjadi keseimbangan antara
jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati. Fase ini yaitu fase
dimana terjadinya akumulasi produk buangan yang toksik. Terdapat
kehilangan sel yang lambat karena kematian diimbangi pembentukan sel baru
melalui pertumbuhan dan pembelahan dengan nutrisi yang dilepaskan oleh
sel-sel mati (Pratiwi, 2008).
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4) Fase kematian
Pada fase ini, jumlah sel yang mati meningkat. Faktor penyebabnya karena
ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi produk buangan yang toksik (Pratiwi,
2008).
2.7. Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme
Parameter pengukuran pertumbuhan mikroorganisme yaitu konsentrasi sel
(jumlah sel per satuan isi kultur) ataupun densitas sel (berat kering sel per satuan
isi kultur). Pengukuran pertumbuhan mikroorganisme ada dua cara, yakni secara
langsung dan tidak langsung (Pratiwi, 2008)
2.7.1 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme Secara Langsung
a) Pengukuran menggunakan bilik hitung (counting chamber)
Pengukuran bakteri digunakan bilik hitung Petroff-Hausser, sedangkan
pengukuran mikroorganisme eukariot digunakan hemositometer. Keuntungan
metode ini yaitu mudah, murah, cepat, dan dapat diperoleh informasi ukuran dam
morfologi mikroorganisme. Sedangkan kerugiannya yaitu populasi
mikroorganisme yang digunakan harus banyak (minimum berkisar 106 CFU/ml),
karena pengukuran dengan volume dalam jumlah sedikit tidak dapat membedakan
antara sel hidup dan sel mati, serta kesulitan menghitung sel yang motil (Pratiwi,
2008).
b) Pengukuran menggunakan electronic counter
Suspensi mikroorganisme dialirkan melalui lubang kecil (orifice) dengan
bantuan aliran listrik. Elektroda yang ditempatkan pada dua sisi orifice mengukur
tahanan listrik (ditandai dengan naiknya tahanan) pada saat bakteri melalui orifice.
Pada saat inilah sel terhitung. Keuntungannya adalah hasil didapat lebih cepat,
lebih akurat, serta sel dengan ukuran besar dapat terhitung. Namun, metode ini
tidak bisa digunakan untuk menghitung bakteri karena adanya gangguan debris,
filament, dan sebagainya, serta tidak dapat membedakan sel hidup dan sel mati
(Pratiwi, 2008).
c) Pengukuran dengan plating technique
Merupakan metode perhitungan jumlah sel tampak (visible) dan
berdasarkan asumsi bakteri hidup akan tumbuh, membelah, dan memproduksi
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
satu koloni tunggal. Mula-mula dibuat seri pengenceran sampel dan ditumbuhkan
pada media padat. Pengukuran dilakukan pada plate dengan jumlah koloni
berkisar 25-250 atau 30-300 dengan satuan CFU (colony forming unit).
Keuntungannya yakni sederhana, mudah, dan sensitif. Tetapi harus digunakan
media yang sesuai dan penghitungannya kurang akurat karena satu koloni tidak
selalu berasal dari satu individu sel (Pratiwi, 2008).
d) Pengukuran dengan menggunakan teknik filtrasi membran (membrane
filtration technique)
Sampel dialirkan pada suatu sistem filter membran dengan bantuan vacum.
Bakteri yang terperangkap ditumbuhkan pada media yang sesuai dan jumlah
koloninya dihitung. Metode ini memiliki kelebihan dapat menghitung sel hidup
dan sistem peghitungannya langsung, sedangkan kerugiannya adalah tidak
ekonomis (Pratiwi, 2008).
2.7.2 Pengukuran Pertumbuhan Mikroorganisme Secara Tidak Langsung
a) Pengukuran kekeruhan/turbidity
Bakteri yang bermultiplikasi pada media cair akan menyebabkan media
menjadi keruh. Spektrofotometer atau kalorimeter digunakan dengan
membandingkan densitas optik antara media tanpa pertumbuhan dengan yang
terdapat pertumbuhan bakteri (Pratiwi, 2008).
b) Pengukuran aktivitas metabolik
Berdasarkan jumlah produk metabolik tertentu, seperti asam atau CO2
yang menunjukkan jumlah mikroorganisme terdapat didalam media (Pratiwi,
2008).
c) Pengukuran berat sel kering (BSK)
Merupakan metode yang umum digunakan untuk mengukur pertumbuhan
fungi berfilamen. Miselium fungi dipisahkan dari media dan dihitung sebagai
berat kotor. Selanjutnya miselium dicuci dan dikeringkan dengan desikator dan
ditimbang beberapa kali hingga mencapai berat konstan yang dihitung sebagai
berat sel kering (Pratiwi, 2008).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2016 di
Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Formulasi Sediaan
Steril Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
Peralatan yang digunakan pada penelitian adalah kapas, kain kasa, tisu,
kaca objek, jarum ose, batang spreader, spatula, pembakar spirtus, alumunium
foil, plastic wrap, kertas saring, pipet tetes, kaca objek, tabung reaksi, rak tabung
reaksi, beaker glass, erlenmeyer, cawan petri, mikropipet (Thermo Scientific),
tabung eppendorf, termometer, vortex, timbangan analitik (Ogawa Seiki),
anaerobic jar (Oxoid), mikroskop optik, pH meter (Horiba, Jepang), autoklaf
digital (Ogawa Seiki), inkubator (France Etuves), laminar air flow, lemari
pendingin (GEA), dan oven (Memmert).
3.2.2. Bahan
Bahan yang digunakan antara lain sampel limbah cair air rendaman
kacang kedelai dari satu produsen tempe yang berlokasi di Cikoko, Pancoran,
Jakarta Selatan, NaCl, kalsium karbonat (CaCO3), media MRS Agar (Merck),
media MRS broth (Conda pronadisa), media SIM (Merck), pepton water (Merck),
media blood agar, kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin, malakit hijau,
aquadest, hidrogen peroksida (H2O2) 3%, minyak imersi, dan alkohol 70%
3.3. Prosedur Kerja
3.3.1. Persiapan Alat dan Bahan yang Digunakan
3.3.1.1. Preparasi Alat
Peralatan gelas seperti cawan petri, batang spreader, batang pengaduk,
erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi masing-masing dibungkus dengan kertas
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
hvs dan kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf digital pada suhu
121°C selama 15 menit.
3.3.1.2. Preparasi Sampel
Sampel berupa air rendaman kacang kedelai selama satu malam. Sampel
yang diambil yaitu pada tahapan awal pembuatan tempe. Pembuatan tempe
dimulai dari perebusan bahan baku kacang kedelai impor seberat kurang lebih 120
kg selama 2 jam menggunakan air sumur dilanjutkan dengan perendaman
menggunakan air perebusnya selama 24 jam. Kedelai yang telah direndam
ditiriskan dengan pengayak berlubang besar untuk selanjutnya dikupas
menggunakan mesin penggiling dan dicuci dengan air mengalir. Kedelai yang
telah dingin ditaburi dengan ragi kemudian dicetak dan dikemas menggunakan
daun atau plastik.
3.3.1.3. Pembuatan Medium MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar)
Sejumlah 68,2 gram serbuk MRS ditimbang, media ini disuplementasi
dengan CaCO3 sebanyak 1% dan kemudian dilarutkan dalam 1 liter air destilasi
dan dipanaskan hingga mendidih. Lalu media disterilisasi menggunakan autoklaf
pada suhu 121°C selama 15 menit.
3.3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat
Sebanyak 1 mL dari sampel secara aseptis ditambahkan ke dalam 9 mL
larutan pengencer yaitu pepton water steril (0,1%, b/v) dan dihomogenkan yang
merupakan pengenceran ke-1. Kemudian, dilakukan pengenceran bertingkat
sampai pengenceran ke-7. Diambil 0,1 mL cuplikan dari tiga seri pengenceran
terakhir dan dikulturkan pada agar de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA)
tersuplementasi CaCO3 1% menggunakan metode spread plate. Diinkubasi
selama 48 jam pada inkubator suhu 37°C. Koloni yang tumbuh dihitung dan
jumlah totalnya dihitung menggunakan metode total plate count (TPC).
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.3. Pemurnian
Koloni yang tumbuh dengan zona bening disekelilingnya dilakukan
pemurnian sel dengan cara menggoreskan pada media MRSA tersuplementasi
CaCO3 1% dengan metode kuadran diinkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu
37°C agar diperoleh koloni tunggal untuk selanjutnya disubkultur kembali sebagai
isolat tunggal murni.
3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat
3.3.4.1. Pengamatan Morfologi Bakteri Asam Laktat
Pengamatan morfologi dari bakteri asam laktat (BAL) meliputi:
a) Pewarnaaan Gram: diteteskan NaCl fisiologis pada kaca ojek isolat lalu
diambil satu ose isolat dari agar miring. Isolat tersebut disebarkan pada kaca
objek lalu difiksasi. Gentian violet diteteskan diatas preparat dan biarkan
selama 1 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir. Cairan lugol diteteskan
pada preparat kemudian dibiarkan kembali selama 1 menit. Preparat dicuci
dan diteteskan dengan alkohol 96% selama 30 detik. Preparat dicuci dengan
air mengalir. Terakhir, preparat diteteskan dengan safranin dan dibiarkan
selama 45-60 detik. Preparat dicuci dan dikeringkan untuk diamati dibawah
mikroskop. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri Gram
negatif berwarna merah.
b) Pewarnaan endospora: Preparat yang telah difiksasi diletakkan diatas
penangas air lalu ditutup dengan kertas saring. Malakit hijau diteteskan dan
dibiarkan selama 5 menit. Preparat dicuci dengan air mengalir. Dilakukan
kembali pewarnaan dengan safranin kemudian biarkan selama 60 detik.
Preparat dicuci, hasilnya diamati dibawah mikroskop. Endospora akan
berwarna hijau sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah (Harley, 2005)
c) Uji motilitas dilakukan dengan media setengah padat, diambil sebanyak satu
ose isolat bakteri dan diinokulasikan secara vertikal pada media SIM (Sulfida
Indol Motility). Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37° C. Hasil
uji motilitas bakteri positif dapat dilihat dengan adanya pertumbuhan bakteri
pada permukaan media atau tidak hanya bekas pada tusukan, sedangkan
bakteri non motil tumbuh sepanjang tusukan (Harley, 2005).
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.4.2. Pengamatan Fisiologi dan Biokimia Bakteri Asam Laktat
Pengamatan fisiologi dan biokimia dari bakteri asam laktat (BAL)
meliputi:
a) Uji katalase dilakukan dengan menggunakan hidrogen peroksida (H2O2) 3%.
Isolat diambil dari stok kultur dan diletakkan pada kaca objek. Satu sampai
dua tetes H2O2 3% ditambahkan ke isolat. Jika terbentuk gelembung
mengindikasikan bakteri positif katalase, dan jika tidak maka mengindikasikan
bakteri negatif katalase (Harley, 2005).
b) Uji produksi gas dilakukan dengan menumbuhkan kultur isolat dalam media
MRS broth dalam tabung reaksi yang diberi tabung durham dengan keadaan
terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan. Lalu diinkubasi selama 2 hari
pada suhu 37° C (Romadhon, et al., 2012).
c) Ditumbuhkan pada temperatur yang berbeda-beda dengan menggunakan MRS
broth kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan seri temperatur 10°C,
37°C, dan 45°C. Adanya pertumbuhan diamati dengan adanya kekeruhan
dalam tabung (Anastiawan, 2014).
d) Untuk pertumbuhan pada konsentrasi garam 4% dan 6.5%, satu ose kultur
dimasukkan ke dalam MRS broth yang tersuplementasi NaCl masing-masing
berkonsentrasi 4% dan 6.5%. Lalu diinkubasi pada temperatur 37°C selama 24
jam. Kekeruhan menandakan adanya pertumbuhan (Thakkar, et al., 2015).
3.3.5. Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat
Isolat BAL diuji keamanannya dengan blood agar yang mengandung 5%
darah domba. Isolat dari agar miring diambil satu ose lalu diinokulasi ke media
blood agar. Media tersebut kemudian diinkubasi secara anaerob pada suhu 37°C
selama 48 jam. Pengamatan dilakukan terhadap koloni yang tumbuh, jika terdapat
zona jernih disekitar koloni maka menunjukkan reaksi positif beta hemolisis. Pada
uji ini, Staphylococcus aureus digunakan sebagai kontrol positif (Thakkar, et al.,
2015).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Isolasi Bakteri Asam Laktat
Pada tahap awal isolasi, sampel berupa air rendaman kacang kedelai
dilakukan inokulasi ke dalam media MRSA tersuplementasi CaCO3 1%.
Didapatkan data total plate count (TPC) keseluruhan bakteri yang tumbuh
sebanyak koloni/mL sedangkan TPC BAL sebanyak
koloni/mL. Dari keseluruhan kultur bakteri yang tumbuh terpilih delapan isolat
BAL yang memiliki karakteristik secara makroskopik berbeda, yaitu:
Tabel 4.1 Morfologi Koloni Isolat
Isolat Morfologi Koloni
Bentuk Warna Elevasi Tepian Diameter Koloni
ARK 5.1.a Bulat Krem Konveks Halus 3 mm
ARK 5.3.b Bulat Krem Konveks Halus 1 mm
ARK 6.1.c Bulat Putih pudar Rata Halus 4 mm
ARK 6.1.d Bulat Putih pucat Rata Halus 3 mm
ARK 6.2.e Bulat Putih pudar Rata Halus 3 mm
ARK 6.3.f Bulat Putih tulang Rata Halus 3 mm
ARK 7.2.g Bulat Krem Rata Halus 3 mm
ARK 7.3.h Bulat Putih Rata Halus 4 mm
4.1.2 Karakterisasi Isolat Bakteri Asam Laktat
Dalam mengkarakterisasi suatu mikroorganisme perlu mengetahui terlebih
dahulu ciri utamanya yang meliputi ciri morfologi, susunan kimiawi dari sel, sifat
biakan, metabolisme, sifat genetik dan patogenisitas. Untuk menentukan ciri
tersebut, maka diperlukan beberapa uji morfologi, fisiologi, serta aktivitas
biokimia (Lay dan Hastowo, 1992 dalam Candra, 2006). Pada pengujian ini
digunakan Lactobacillus casei ATCC 393 sebagai strain acuan.
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.1.2.1 Morfologi Isolat Bakteri Asam Laktat
Kedelapan isolat yang diuji, memiliki karakteristik morfologi sel yang
serupa yaitu berbentuk sel batang, tidak membentuk spora, dan tidak motil.
Namun, hasil pewarnaan Gram menunjukan isolat ARK 6.2.e adalah Gram
negatif, sedangkan tujuh isolat lainnya adalah Gram positif. Persyaratan BAL
adalah bakteri Gram positif sehingga isolat ARK 6.2.e tidak dilakukan uji
selanjutnya. Untuk strain acuan, memiliki morfologi yang serupa yakni berbentuk
sel batang, Gram positif, tidak membentuk spora, serta tidak motil.
4.1.2.2 Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri Asam Laktat
Uji katalase yang dilakukan menunjukkan kedelapan isolat tidak
menghasilkan enzim katalase dengan tidak terbentuknya gelembung setelah
diteteskan H2O2. Untuk menentukan tipe fermentasi bakteri maka dilakukan uji
produksi gas, tabung durham yang terbalik di dalam tabung berisi media akan
menangkap gas yang dihasilkan. Dari uji produksi gas didapatkan hasil tujuh
isolat yaitu ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK
7.2.g, dan ARK 7.3.h menghasilkan gas, sedangkan Lactobacillus casei tidak
menghasilkan gas. Uji fisiologis meliputi ketahanan pada suhu dan konsentrasi
NaCl berbeda-beda menunjukkan hasil yang seragam, baik ketujuh isolat maupun
Lactobacillus casei tumbuh pada suhu 37° C dan 45° C serta konsentrasi NaCl 4%
dan 6,5%. Namun, pada suhu 10°C ketujuh isolat serta Lactobacillus casei tidak
terdapat pertumbuhan.
4.1.3 Uji Keamanan Isolat Bakteri Asam Laktat
Untuk melihat keamanan dari isolat dilakukan uji aktivitas hemolisis
dengan Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif, ketujuh isolat serta
Lactobacillus casei tidak menghasilkan zona disekitar koloni atau dapat dikatakan
γ (gamma) hemolisis.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.2 Karakteristik Isolat BAL dan Strain Acuan
Pengamatan
Isolat
L. casei ARK
5.1.a
ARK
5.3.b
ARK
6.1.c
ARK
6.1.d
ARK
6.3.f
ARK
7.2.g
ARK
7.3.h
Morfologi Sel
Pewarnaan Gram + + + + + + + +
Bentuk Sel B B B B B B B B
Pewarnaan Endospora - - - - - - - -
Motilitas - - - - - - - -
Biokimia
Katalase - - - - - - - -
Tipe Fermentasi Ho He He He He He He He
Fisiologis
Suhu:
- 10°C - - - - - - - -
- 37°C + + + + + + + +
- 45°C + + + + + + + +
NaCl:
- 4% + + + + + + + +
- 6,5% + + + + + + + + Keterangan:
+ : menunjukkan hasil pewarnaan positif/motil/adanya pertumbuhan bakteri
- : menunjukkan hasil pewarnaan negatif/non motil/tidak adanya pertumbuhan bakteri
B: Batang
Ho: Homofermentatif
He: Heterofermentatif
4.2 Pembahasan
Tahap awal penelitian adalah dengan pengambilan sampel, dimana sampel
yang diambil adalah air rendaman kacang kedelai selama semalaman. Sampel
berupa cairan berwarna kekuningan dengan tekstur lengket dan bau asam. Sampel
diencerkan beberapa kali untuk mengurangi populasi mikroba sehingga
didapatkan koloni terpisah pada cawan yang memudahkan dalam proses
penghitungan koloni (Harley, 2005). Jumlah koloni yang digunakan yaitu 30-30
koloni (Khedid, et al., 2006).
Pengenceran dilakukan sampai 10-7
dengan menggunakan pepton water
0,1% yang berfungsi untuk menjaga mikroba tetap hidup dengan nutrisi tetap
tersedia. Tiga tingkat pengenceran terakhir yakni 10-5
, 10-6
, dan 10-7
diinokulasikan ke dalam media MRSA yang tersuplementasi CaCO3 1%
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menggunakan metode spread plate, metode ini dipilih untuk memudahkan baik
dalam penghitungan jumlah koloni, pengamatan, serta pengambilan koloni.
Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni pada penelitian
ini mempunyai prinsip jika sel bakteri hidup ditumbuhkan pada media yang
cocok, maka sel bakteri akan berkembang dan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung oleh mata sehingga bisa langsung dihitung (Collin, et al., 2004).
Jumlah koloni yang tumbuh terbanyak terdapat pada pengenceran 10-5
dan
pada pengenceran 10-7
jumlah koloni yang tumbuh semakin sedikit. Setelah
diamati secara makroskopik, dipilihlah delapan isolat yang memiliki karakteristik
berbeda baik bentuk, ukuran, maupun warna yaitu isolat dengan kode ARK 5.1.a,
ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK
7.3.h.
Isolat yang dipilih merupakan isolat yang memiliki zona bening disekitar
koloni seperti ditunjukkan pada Gambar 4.1, zona tersebut terbentuk karena
produksi asam organik dari bakteri sehingga CaCO3 pada media MRSA
terhidrolisis (Sun, et al., 2014; Pisol, et al., 2015). Kedelapan isolat ini
dimurnikan terlebih dahulu dengan goresan kuadran untuk mendapatkan koloni
murni yang terpisah sebanyak dua kali pemurnian. Koloni murni yang terpisah
kemudian diinokulasi ke dalam media MRSA agar miring dengan luas permukaan
yang lebih kecil sehingga kemungkinan kontaminasi lebih rendah untuk disimpan
sebagai stok kultur.
Koloni Bakteri
Zona bening
Gambar 4.1 Hasil Isolasi BAL (Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Setelah didapatkan stok kultur, kedelapan isolat serta strain acuan
dikarakterisasi dimana BAL memiliki ciri-ciri katalase negatif, Gram positif, non
motil, dan tidak membentuk spora (Bulut, 2003; Surono, 2004; Sun, et al., 2014).
Pengamatan secara mikroskopik dilakukan terhadap bentuk dan struktur sel, salah
satunya dengan pewarnaan Gram. Dalam hal ini, bakteri Gram positif ditandai
dengan warna ungu pada sel bakteri karena mempunyai kandungan lipid yang
lebih rendah, sehingga dinding sel bakteri akan lebih mudah terdehidrasi akibat
perlakuan dengan alkohol 96%. Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan
ukuran pori-pori sel menjadi kecil dan daya permeabilitasnya berkurang, sehingga
zat warna ungu kristal yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari
sel dan sel akan tetap berwarna ungu (Pelczar dan Chan, 2008).
ARK 6.1.d ARK 6.2.e
Lactobacillus casei
Keterangan:
ARK 6.1.d dan Lactobacillus casei: Gram positif berbentuk batang
ARK 6.2.e: Gram negatif berbentuk batang
Isolat yang digunakan berumur 24 jam dan diamati dengan perbesaran (100x10)
Gambar 4.2 Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel Bakteri (Sumber: Dokumen
pribadi, 2016)
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Bakteri Gram negatif terlihat berwarna merah karena kehilangan pewarna
kristal violet pada waktu pembilasan dengan alkohol 96%, namun mampu
menyerap pewarna tandingan yaitu safranin. Bakteri Gram negatif mengandung
lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam persentase lebih tinggi dari pada
yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri Gram negatif juga lebih
tipis dari pada dinding sel bakteri Gram positif (Pelczar dan Chan, 2008).
Berdasarkan hasil dari pewarnaan Gram kedelapan isolat beserta strain acuan
menunjukkan karakteristik bakteri bentuk sel batang. Tujuh isolat serta strain
acuan merupakan Gram positif dan satu isolat, ARK 6.2.e, merupakan Gram
negatif.
Hasil uji pewarnaan spora menunjukkan ketujuh isolat bakteri serta strain
acuan tidak membentuk spora. Spora bersifat tahan terhadap kondisi lingkungan
ekstrim dan adanya bahan kimia beracun. Spora dibentuk oleh spesies bakteri
yang termasuk dalam genera Clostridium dan Bacillus untuk mengatasi
lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri.
ARK 6.1.d Lactobacillus casei
Keterangan:
ARK 6.1.d dan Lactobacillus casei: tidak membentuk spora
Isolat yang digunakan berumur 24 jam dan diamati dengan perbesaran (100x10)
Gambar 4.3 Hasil Pewarnaan Endospora (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)
Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagi endospora
dan dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora. Jika sel semakin tua, maka sel
vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas dari sel dan membentuk
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
spora bebas. Spora juga lebih tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi sulit untuk
melepaskan zat warna yang telah terserap ke dalamnya, sehingga tidak dapat
mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya (counterstain). Prinsip
pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif (Fardiaz,
1987 dalam Candra, 2006).
Endospora memiliki selubung yang kompak sehingga menyebabkan zat
warna sulit untuk berpenetrasi ke dalam dinding endospora, maka diperlukan
pemanasan pada saat dilakukan pewarnaan. Metode pewarnaan yang umum untuk
mewarnai endospora bakteri adalah pewarnaan Schaeffer-Fulton, dengan malakit
hijau sebagai pewarna utama dan setelah dilakukan pembilasan dengan air
digunakan safranin sebagai counterstain (Pratiwi, 2008). Dimana akan
menghasilkan warna hijau pada bakteri dengan endospora dan akan berwarna
merah untuk sel vegetatif.
Ketujuh isolat dan strain acuan memberikan hasil uji motilitas yaitu non
motil, yang berarti bakteri tidak memiliki flagela. Hasil ini dapat dilihat dari tidak
menyebarnya pertumbuhan bakteri pada media SIM, melainkan hanya tumbuh
pada bekas tusukan jarum inokulum saja. Flagela merupakan filamen yang
mencuat dari sel bakteri dan berfungsi untuk pergerakan bakteri. Flagela
berbentuk panjang dan ramping. Gerakan flagela ini memungkinkan bakteri
mendekati atau menjauhi rangsang (Pratiwi, 2008).
Gambar 4.4 Hasil Uji Motilitas (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)
Katalase merupakan enzim yang dapat mengkatalisasi penguraian
hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2) dan pada reaksi ini
Bakteri tumbuh di
bekas tusukan jarum
inokulum
ARK 6.1.d Lactobacillus casei
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dapat diamati terbentuknya gelembung gas. Dengan terbentuknya gas
mengindikasikan terdapat enzim katalase tersebut (Bulut, 2003). Hidrogen
peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktifkan enzim
dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga
mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob pasti menguraikan bahan
tersebut (Lay, 1994 dalam Dewi, 2013). Umumnya semua BAL tumbuh pada
kondisi anaerob, namun tidak pada kondisi anaerob seperti biasanya, mereka
tumbuh dengan adanya oksigen (O2) sebagai anaerob aerotoleran (Bulut, 2003).
Koloni
bakteri
Galembung
gas
Koloni
bakteri
Keterangan:
A1 & A2: Isolat ARK 5.1.a tidak menghasilkan gelembung gas
(+): Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif katalase menghasilkan gelembung gas
L. casei: tidak menghasilkan gelembung gas
Gambar 4.5 Hasil Uji Katalase (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)
Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada
isolat bakteri. Hasil uji katalase menunjukkan hasil yang negatif pada kedelapan
isolat dan strain acuan, dimana tidak terdapatnya gelembung gas yang terbentuk.
Pada uji ini digunakan Staphylococcus aureus yang sudah diketahui memiliki
enzim katalase sebagai kontrol positif, hasil uji katalase pada bakteri ini
menunjukkan terbentuknya gelembung gas setelah diteteskan H2O2 3% (Dewi,
2013).
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Uji produksi gas dilakukan untuk melihat aktivitas metabolisme BAL,
dimana dikelompokkan menjadi dua sub grup yaitu homofermentatif dan
heterofermentatif. BAL homofermentatif melibatkan jalur Embden Meyerhof,
yaitu glikolisis yang menghasilkan asam laktat, 2 mol ATP dari 1 molekul
glukosa/heksosa dalam kondisi normal, tidak menghasilkan CO2 dan
menghasilkan biomassa sel dua kali lebih banyak dari pada BAL
heterofermentatif.
BAL heterofermentatif melalui jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase, selain
menghasilkan asam laktat, juga menghasilkan etanol, CO2, asam asetat, dan
mannitol serta 1 mol ATP dari heksosa dan tidak mempunyai enzim aldolase
(Surono, 2004). Dapat disimpulkan bahwa karbon dioksida (CO2) hanya
diproduksi oleh BAL heterofermentatif.
Dari hasil uji didapatkan strain acuan tidak memproduksi gas yang berarti
memiliki tipe fermentasi homofermentatif. Sedangkan, tujuh isolat uji lainnya
yakni ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan
ARK 7.3.h memproduksi gas atau termasuk ke dalam tipe fermentasi
heterofermentatif.
Gas
terperangkap
pada tabung
durham
Tidak ada gas
ARK 5.3.b Kontrol negatif Lactobacillus casei
Keterangan:
ARK 5.3.b:Heterofermentatif; L. casei: Homofermentatif
Gambar 4.6 Hasil Uji Produksi Gas (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)
Uji fisiologis selanjutnya adalah uji ketahanan hidup bakteri pada suhu
yang berbeda-beda yaitu 10°, 37°, dan 45°C, didapatkan data yang seragam yakni
tidak adanya pertumbuhan pada suhu 10°C dan tumbuh pada suhu 37° serta 45°C.
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Setiap spesies mikroba memiliki rentang suhu pertumbuhan sendiri yang dapat
ditentukan oleh sensitivitas panas dari enzim, membran, ribosom, dan komponen
lainnya. Akibatnya, pertumbuhan mikroba memiliki karakteristik suhu yang
berbeda-beda tergantung suhu umumnya, seperti suhu minimum, maksimum, dan
optimum (Harley, 2005).
Suhu minimum pertumbuhan merupakan suhu terendah adanya
pertumbuhan, suhu maksimum merupakan suhu tertinggi adanya pertumbuhan,
dan suhu optimum adalah suhu saat laju reproduksi sel terjadi secara cepat. Suhu
optimum pertumbuhan memiliki hubungan dengan suhu normal habitat
mikroorganisme tersebut. Berdasarkan suhu, bakteri umumnya dapat dibagi
menjadi tiga kelompok yaitu psikrofilik, mesofilik, dan thermofilik (Harley,
2005).
Berdasarkan suhu optimum pertumbuhannya, BAL dapat dikelompokkan
menjadi dua grup, yaitu mesofilik dan thermofilik. Bakteri mesofilik memiliki
suhu optimum untuk pertumbuhan 25°C dan suhu maksimum 37°-40°C. Bakteri
thermofilik memiliki suhu optimum untuk pertumbuhan antara 37°-45°C dan suhu
maksimum antara 45°-52°C (Surono, 2004). Berdasarkan hasil pengamatan,
ketujuh isolat beserta strain acuan masih dapat tumbuh pada suhu 45°C sehingga
dapat disimpulkan ketujuh isolat beserta strain acuan merupakan bakteri
thermofilik.
Uji ketahanan hidup bakteri pada konsentrasi garam berbeda-beda
dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri pada kondisi lingkungan dengan
konsentrasi NaCl 4% dan 6,5%. Hasil yang didapatkan pada uji ini pun seragam
yaitu ketujuh isolat serta strain acuan dapat hidup pada kedua konsentrasi
tersebut.
Membran plasma selektif permeabel memisahkan antara bakteri dengan
lingkungan sekitarnya yang menyebabkan membran ini dapat dipengaruhi oleh
perubahan tekanan osmotik. Tekanan osmotik adalah tekanan yang terjadi karena
difusi air melaui membran yang permeabel secara differensial dari suatu tempat
berkonsentrasi tinggi ke tempat berkonsentrasi rendah. Jika bakteri berada pada
larutan hipotonik yaitu larutan dengan konsentrasi zat terlarut lebih rendah
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(tekanan osmotik lebih rendah) akan menyebabkan air bergerak ke dalam sel dan
sel akan pecah (Harley, 2005).
Ketika bakteri ditempatkan pada larutan hipertonik yaitu larutan dengan
konsentrasi zat terlarut lebih tinggi (tekanan osmotik yang lebih tinggi) dari pada
yang lain maka air akan bergerak ke luar sel dan sel akan kehilangan air. Apabila
kehilangan air itu cukup besar, maka ada kemungkinan bahwa volume sel akan
menurun demikian besarnya sehingga tidak dapat mengisi seluruh ruangan yang
dibentuk oleh dinding sel. Membran dan sitoplasma akan terlepas dari dinding sel,
keadaan ini dinamakan plasmolisis. Saat bakteri ada pada larutan isotonis yaitu
suatu larutan yang mempunyai konsentrasi zat terlarut yang sama (tekanan
osmotik yang sama) seperti larutan yang lain, sehingga tidak ada pergerakan air.
Pada kondisi ini tidak akan mengalami perubahan volume (Harley, 2005).
Kategori taksonomi bagi bakteri dimulai dari kingdom, divisi, kelas, order,
famili, tribe, genus, spesies, dan subspesies. Meskipun spesies umumnya
diberikan setelah nama genus merupakan bagian dari kesatuan taksonomi, tetapi
strain mempunyai arti penting yang membedakan antara satu sama lain. Metode
taksonomi untuk identifikasi BAL berdasarkan sifat morfologi, yaitu bentuk sel,
pewarnaan gram, uji katalase, dan fisiologi secara umum hanya mampu
mengelompokkan sampai dengan taraf genus dan tidak dapat mengidentifikasi
sampai tingkat spesies (Surono, 2004)
Pada penelitian ini, kedelapan isolat yang diperoleh diharapkan memiliki
karakteristik bakteri Gram positif, katalase negatif, tidak membentuk spora, dan
tidak motil. Isolat ARK 6.2.e tidak memenuhi syarat pada hasil pewarnaan Gram.
Dimana pada hasil pewarnaan Gram satu isolat memiliki hasil negatif, sedangkan
tujuh isolat lainnya memenuhi karakteristik dari bakteri asam laktat.
Berdasarkan hasil pengujian sifat morfologi dan fisiologi bakteri yang
diisolasi dari limbah cair rendaman kacang kedelai, diduga jenis bakteri yang
terdapat di dalamnya merupakan bakteri asam laktat. Dengan melakukan
penelusuran pada buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, ketujuh
isolat tersebut merupakan genus Lactobacillus, seperti dapat dilihat pada Tabel
4.3.
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hasil penelitian ini, sama seperti pada penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh Pisol, et al. pada tahun 2013 yakni isolat yang diisolasi dari air
rendaman kacang kedelai adalah Lactobacillus heterofermentatif. Sedangkan pada
penelitian Pisol, et al. pada tahun 2015, isolat yang didapatkan adalah
Enterococcus faecium, Leuconoctos lactis, dan Leuconostoc sp.
Selain perbedaan tempat pengambilan sampel atau produsen tempe pada
kedua penelitian tersebut juga terdapat perbedaan cara pembuatan tempe, yang
diduga menyebabkan hasil isolat berbeda. Dimana pada penelitian Pisol, et al.
tahun 2013 hanya melalui satu kali perendaman selama 24 jam, sedangkan
penelitian Pisol, et al. tahun 2015 melalui dua kali perendaman yaitu setelah
perendaman 24 jam, kacang kedelai direbus dan direndam kembali selama 24 jam.
Pada penelitian kali ini, memiliki cara pembuatan yang hampir sama dengan
penelitian yang dilakukan pada tahun 2013, sehingga bisa didapatkan isolat
dengan karakteristik yang sama.
Tabel 4.3 Identifikasi Tingkat Genus (Generic Assignment)
Karakteristik Lactobacillus ARK
5.1.a
ARK
5.3.b
ARK
6.1.c
ARK
6.1.d
ARK
6.3.f
ARK
7.2.g
ARK
7.3.h
Bentuk sel: batang + + + + + + + +
Pewarnaan Gram + + + + + + + +
Endospora - - - - - - - -
Katalase - - - - - - - -
Motilitas - - - - - - - -
Tipe Fermentasi Ho/He Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho
Pertumbuhan pada
45°C +/- + + + + + + +
Pertumbuhan pada
NaCl 6,5% +/- + + + + + + +
Keterangan:
+ : menunjukkan bentuk batang/hasil pewarnaan positif/motil/adanya pertumbuhan bakteri
- : menunjukkan hasil pewarnaan negatif/non motil/tidak adanya pertumbuhan bakteri
Ho: Homofermentatif
He: Heterofermentatif
Isolat bakteri yang didapatkan ini juga dipengaruhi oleh suhu saat
perendaman kedelai (sampel). Pada suhu 20°C mikroba yang dominan adalah
Lactobacillus casei dan Staphylococcus epidermidis dan pada suhu 30°C mikroba
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang dominan adalah Lactobacillus casei, Streptococcus faecium, Strep.
dysgalactiae, dan Staph. epidermidis (Mulyowidarso, et al., 1989 dalam Ashenafi
dan Busse, 1990). Pada penelitian lainnya, dinyatakan lain yaitu suhu 19° dan
25°C didominasi oleh Lact. Plantarum dan suhu 37°C oleh Pedicoccus spp.
(Nout, et al., 1987 dalam Ashenafi dan Busse, 1990).
Seperti yang disyaratkan oleh FAO/WHO pada tahun 2002, probiotik tidak
boleh menyebabkan reaksi berbahaya dan aman terhadap sistem imun (dinyatakan
aman atau status GRAS). Salah satu cara untuk melihat kemanan dari isolat BAL
ini dengan melakukan uji aktivitas hemolisis menggunakan media blood agar.
Lapisan mukosa merupakan target yang dilewati untuk pertukaran zat-zat
penting secara fisiologis. Aktivitas hemolisis dapat menyebabkan pecahnya
lapisan epitel. Kerusakan tersebut dapat mengganggu fungsi normal lapisan
tersebut dan bisa menyebabkan terjadinya infeksi (Thakkar et al, 2015). Pada uji
aktivitas hemolisis digunakan Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif,
dengan hasil terdapat zona bening di sekitar koloni.
Zona bening yang terbentuk merupakan tanda adanya hemolisin, yaitu
enzim yang bersifat toksik, dapat melisiskan sel darah merah, berperan dalam
meningkatkan permeabilitas sel, sehingga sel lebih rentan terhadap agen infeksi
(Khusnan et al., 2002).
Koloni
bakteri
yang
tumbuh
Zona
bening
ARK 7.3.h Staphylococcus aureus
Keterangan:
ARK 6.3.f: warna kekuningan merupakan koloni bakteri yang tumbuh dilihat dengan cara
mengarahkan cawan petri ke cahaya
S. aureus: zona bening terdapat disekitar koloni
Gambar 4.7 Hasil Uji Aktivitas Hemolisis (Sumber: Dokumen pribadi, 2016)
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pada S. aureus, hemolisin memiliki peran sebagai faktor patogenisitas dan
merupakan salah satu toksin penting yang dibentuk (Park et al., 2003). Blood agar
dapat memperlihatkan sifat hemolisis dari isolat, yang dapat dibedakan menjadi
alfa hemolisis, beta hemolisis, dan gamma hemolisis. S. aureus termasuk ke
dalam beta hemolisis yaitu terjadinya lisis sel darah merah dilengkapi kerusakan
dan penggunaan hemoglobin oleh mikroorganisme sehingga menghasilkan zona
bening disekitar koloni (Kusnadi, 2003). Pada penelitian ini, kedelapan isolat
BAL tidak menunjukkan terjadinya hemolisis, baik terjadi perubahan warna
media maupun terbentuk zona bening di sekitar koloni yang menandakan isolat
BAL termasuk gamma hemolisis atau merupakan bakteri non patogen.
36 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat diambil beberapa
kesimpulan, diantaranya :
1. Diperoleh delapan isolat yang berhasil diisolasi dari limbah cair
rendaman kacang kedelai, yaitu ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c,
ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK 7.3.h, tujuh
diantaranya teridentifikasi sebagai BAL yakni isolat ARK 5.1.a, ARK
5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan ARK 7.3.h
yang diduga sebagai anggota genus Lactobacillus.
2. Dari hasil karakterisasi, karakteristik ketujuh isolat BAL seragam yaitu
berbentuk batang, Gram positif, tidak membentuk spora, tidak motil,
tidak dapat tumbuh pada suhu 10°C, dan dapat tumbuh pada suhu 37°
dan 45° C serta konsentrasi NaCl 4% dan 6,5%. Isolat yang diperoleh
aman berdasarkan hasil uji aktivitas hemolisis.
5.2 Saran
Identifikasi BAL yang diisolasi dari limbah cair tempe masih bersifat
dugaan, sehingga disarankan untuk melakukan uji fisiologi dan biokimia lebih
lanjut yang belum dilakukan pada penelitian ini agar dapat mengidentifikasi BAL
sampai ke tingkat spesies.
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Anastiawan. 2014. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik yang Berasal dari
Usus Itik Pedaging Anas domesticus. Skripsi: Universitas Hasanudin
Makassar.
Aron, Nicoleta Maftei, Monica (Găureanu) Boev, dan Gabriela Bahrim. 2015.
Probiotics and Therapeutic Effect in Clinical Practice – Review. Romanian
Biotechnological Letters, Vol. 20, No. 1.
Ashenafi, M. dan M. Busse. 1991. The Microflora of Soak Water During Tempeh
Production from Various Beans. Journal of Applied Bacteriology, 70: 334-
338.
Breed, Robert S., E.G.D. Murray, dan Nathan R. Smith. 1957. Bergeys’s Manual
of Determinative Bacteriology Seventh Edition. United States of America:
The Williams & Wilkins Company.
Bulut, Çisem. 2003. Isolation and Molecular Characterization of Lactic Acid
Bacteria From Cheese. Tesis: Biotechnology and Bioengineering, İzmir
Institute of Technology Turkey.
Candra, Joddi Iryadi. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari
Produk Bekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi: Teknologi Hasil
Perikanan IPB.
Collin and Lyne’s. 2004. Microbial Methods Eight Edition. Arnold, a member of
the Hodder Headline Group, 338 Euston Road, London NW1 3BH.
Desai, Ankur. 2008. Strain Identification, Viability and Probiotics Properties of
Lactobacillus casei. Tesis: School of Biomedical and Health Sciences
Victoria University Australia.
Dewi, Amalia Krishna. 2013. Isolasi, Identifikasi, dan Uji Sensitivitas
Staphylococcus aureus terhadap Amoxicillin dari Sampel Susu Kambing
38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis di Wilayah Girimulyo,
Kulonprogo, Yogyakarta. Jurnal Sain Veteriner 31 (2), ISSN: 0126-0421.
Firmansyah, Agus. 2001. Terapi Probiotik dan Prebiotik pada Penyakit Saluran
Cerna Anak. Sari Pediatri, Vol. 2, No. 4: 210-214.
Fitriyani, Ida. 2010. Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat
(BAL) dari Buah Matang yang Berpotensi Menghasilkan Antimikroba.
Skripsi: Biologi UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta
Gogineni, Vijaya K, Lee E Morrow, dan Philip J Gregory, dan Mark A Malesker.
2013. Probiotics: History and Evolution. Journal of Ancient Diseases &
Preventive Remedies Vol1, No 2: 107. doi:10.4172/2329-8731.1000107.
Harrigan W.F. and McCance M.E. 1976. Laboratory methods in food and dairy
microbiology 1st Ed. London: Acad Press, 25-29.
Harley, John P. 2005. Laboratory Exercises in Microbiology, Sixth Edition. New
York: The McGraw-Hill Companies, Inc
Hidayat, Nur dan Sri Suhartini. 2006. Mikrobiologi Industri. Teknik Industri
Pertanian FTP Universitas Brawijaya Malang.
Holzapfel, Wilhelm H, Petra Haberer, Rolf Geisen, Johanna Björkroth, and Ulrich
Schillinger. 2001. Taxonomy and important features of probiotic
microorganisms in food and nutrition. The American Society for Clinical
Nutrition. Am J Clin Nutr;73(suppl):365S–73S.
Isolauri, Erika, Yelda Sütas, Pasi Kankaanpää, Heikki Arvilommi, and Seppo
Salminen. 2001. Probiotics: effects on immunity. The American Joournal
of Clinical Nutrition;73(suppl):444S–50S.
Jay, M.J. 1992. Modern Food Microbiology, Fermented foods related products of
fermentation. Fourth edition. Chapman & Hall. London, UK, pp. 372-403.
Khedid, K., M.Faid, A.Mokhtari, A.Soulaymani, A.Zinedine. 2006.
Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from The One Humped
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Camel Milk Produced in Morocco. Microbiological Research 164 81—91
doi:10.1016/j.micres.10.008.
Khusnan, Wahyu Prihtiyantoro, dan Mitra Slipranata. 2012. Identifikasi dan
Karakterisasi Fenotipe Staphylococcus aureus Asal Kasus Bumblefoot dan
Arthritis pada Broiler. Jurnal Kedokteran Hewan Vol. 6 No. 2, September
2012 ISSN: 1978-225X.
Kormin, Salasiah, Gulam Rusul, Son Radu, and Foo Hooi Ling. 2001.
Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional
Fermented Food. Malaysian Journal of Medical Sciences, Vol. 8, No. 1,
Januari (63-68).
Kusnadi. 2003. Mikrobiologi. Bandung: JICA IMSTEP.
Kusuma, Sri Agung Fitri. 2009. Bakteri Asam Laktat. Karya Ilmiah: Fakultas
Farmasi Universitas Padjajaran.
Malago, J.J. 2011. Probiotic Bacteria and Enteric Infections-Cytoprotection by
Probiotic Bacteria. London New York: Springer.
Moreno, M.R.F, J.J. Leisner, L.K. Tee, C. Ley, S. Radu, G. Rusul, M.
Vancanneyt, and L. De Vuyst. 2002. Microbial Analysis of Malaysian
Tempeh, and Characterization of Two Bacteriocins Produced by Isolates
of Enterococcus faecium. Journal of Applied Microbiology, 92, 147-157
Neha, Aurora, Singh Kamaljit, Bilandi Ajay, dan Garg Tarun. 2012. Probiotic: As
Effective Treatment of Diseases. International Research Journal of
Pharmacy, 3 (1) ISSN 2230-8407
Nur, Hasrul Satria. 2005. Pembentukan Asam Organik oleh Isolat Bakteri Asam
Laktat pada Media Ekstrak Daging Buah Durian (Durio zibethinus Murr.).
BIOSCIENTIAE Vol 2, No 1: 15-24.
Ozyurt, V. Hazal dan Semih Ötles. 2014. Properties of Probiotics and
Encapsulated Probiotics in Food. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 13(4),
413-424.
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Park, Pyong Woo, Timothy J. Foster, Eiichiro Nishi, Sheila J. Duncan, Michael
Klagsbrun, and Ye Chen. 2003. Activation of Syndecan-1 Ectodomain
Shedding by Stapyhlococcus aureus α-Toxin and β-Toxin. The Journal Of
Biological Chemistry Vol. 279, No. 1, DOI 10.1074/jbc.M308537200
Pelczar, Michael J dan Chan, E.C.S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit
Universitas Indonesia (UI-Press)
Pisol, Balqis, Lilis Nuraida, Noriham Abdullah, Suliantari, dan Khalilah Abdul
Khalil. 2013. Isolation and Characterization of Lactic Acid Bacteria from
Indonesian Soybean Tempe. 4th International Conference on Biology,
Environment and Chemistry IPCBEE vol.58 DOI: 10.7763/IPCBEE.
V58.7
Pisol, Balqis, Noriham Abdullah, Khalillah Abdul Khalil, dan Lilis Nuraida. 2015.
Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Different Stages
of Traditional Malaysian Tempeh production. Malaysian Journal of
Microbiology, Vol. 11(4),pp. 358-364
Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga
Prescott LM, Harley JP, and Kelin DA. 2002. Microbiology Bacteria: The Low
G+ C Gram Positive 5th
edition. Boston: McGraw Hill: 529-530
Ray, B. 2004. Fundamental Food Microbiology. CRC Press: Boca Raton London.
Reid, Gregor, Jana Jass, M. Tom Sebulsky, dan John K. McCormick. 2003.
Potential Uses of Probiotics in Clinical Practice. Clinical Microbiology
Reviews, Vol. 16, No. 4 p. 658–672.
Roberfroid, M., G. R. Gibson, L. Hoyles, A.L. McCartney, R. Rastall, I. Rowland,
D. Wolvers, B. Watzl, H. Szajewska, B. Stahl, F. Gyarner, F. Respondek,
K. Whelan, V. Coxam, M.J. Davicco, L. Léotoing, Y. Wittrant, N.M.
Delzenne, P.D Cani, A.M. Neyrinck, dan A. Meheust. 2010. Probiotic
Effect: Metabolic and Health Benefits. British Journal of Nutrition. Vol
104:2:61-63. DOI: 10.1017/S0007114510003363.
41
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Romadhon, Subagiyo, Sebastian Margino. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri
Asam Laktat dari Usus Udang Penghasil Bakteriosin Sebagai Agen
Antibakteria Pada Produk-Produk Hasil Perikanan. Jurnal Saintek
Perikanan Vol. 8. No. 1.
Sopandi, Tatang dan Wardah. 2014. Mikrobiologi Pangan – Teori dan Praktik.
Yogyakarta: Penerbit ANDI.
Sun, Yalian, Xiuyu Lou, Xuan Zhu, Han Jiang, Qing Gu. 2014. Isolation and
Characterization of Lactic Acid Bacteria Producing Bacteriocin from
Newborn Infants Feces. Journal of Bacteriology and Mycology.Vol 1 (2)
ISSN : 2471-0172
Surono, Ingrid.S. 2004. Probiotik Susu Fermentasi dan Kesehatan. Jakarta: PT.
Tri Cipta Karya (TRICK)
Syafiq, A, Sauriasari R, Fikawati S, Amelia P, Soemijati A, Christy M, dan
Saragih F. 2015. Effect of Inulin Supplemented UHT Milk Consumption
on Faecal Bifidobacterium sp. And Lactobacillus sp. Of Healthy Children
in Depok, Indonesia. Malaysian Journal of Nutrition 21 (2):219 – 230.
Syarief, R., J. Hermanianto, P. Haryadi, S. Wiraatmadja, Suliantari, D. Syah, N.
E. Suyatna, dan Y. P. Saragih. 1999. Wacana Tempe Indonesia. Univ.
Katolik Widya Mandala, Surabaya.
Thakkar, Pooja, H.A. Modi, dan J.B. Prajapati. 2015. Isolation, Characterization,
and Safety Assessment of Lactic Acid Bacterial Isolates from Fermented
Food Products. International Journal of Current Microbiology and
Applied Science Vol 4, No 4: 713-725 ISSN: 2319-7706
Utami, Fauziah. 2013. Pengaruh Suhu Terhadap Daya Tahan Hidup Bakteri Pada
Sediaan Probiotik. Skripsi:Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah
Vandenplas, Yvan, Geert Huys, dan Georges Daube. 2014. Prebiotics: an update.
Sociedade Brasileira de Pediatria J Pediatr (Rio J). 91:6-21
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN
Lampiran 1. Alur Penelitian
\
Preparasi Alat
Isolasi BAL
Identifikasi Makroskopis:
- Bentuk koloni
- Bentuk tepian koloni
- Warna koloni
Air rendaman kacang kedelai selama semalam
Pemurnian dan peremajaan isolat
Stok kultur
Sterilisasi dengan
autoklaf
Uji aktivitas
hemolisis
Karakterisasi Morfologi Karakterisasi Fisilogi dan
Biokimia
Uji Keamanan
Pewarnaan Endospora
Pewarnaan Gram
Uji Motilitas
Uji Katalase
Uji Ketahanan Suhu
Uji Ketahanan NaCl
Uji Produksi gas
43
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 2. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Agar
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
45
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 3. Sertifikat Analisa de Man Rogosa Sharpe Broth
46
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4. Hasil Isolasi BAL dari Limbah Cair Air Rendaman Kacang Kedelai
Pengenceran 10-5
Pengenceran 10-6
Pengenceran 10-7
Keterangan:
Hasil tiga pengenceran terakhir diinokuasikan ke media MRSA tersuplementasi
CaCO3 1% yang dilakukan secara triplo
(Sumber: Dokumentasi prbadi, 2016)
47
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 5. Hasil Perhitungan Total Plate Count (TPC)
Keseluruhan Bakteri:
Koloni/mL koloni/mL
koloni/mL
Bakteri Asam Laktat:
Pengenceran Jumlah koloni Rata-Rata Koloni Jumlah Koloni
10-5
107 133,67
163
131
10-6
55 78,34
63
117
10-7
14 16,33 -
17
18
Koloni/mL BAL koloni/mL
koloni/mL
Pengenceran Jumlah koloni Rata-Rata Koloni Jumlah Koloni
10-5
314 354,67 -
354
396
10-6
143 189,67
186
240
10-7
33 31
24
36
48
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 6. Hasil Pewarnaan Gram dan Bentuk Sel
ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c
ARK 6.1.d ARK 6.2.e ARK 6.3.f
ARK 7.2.g ARK 7.3.h Lactobacillus casei
Keterangan:
- Isolat yang diuji berumur 24 jam dengan perbesaran (100x10)
- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, ARK
7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri Gram positif ditandai
dengan warna ungu
- ARK 6.2.e merupakan bakteri Gram negatif ditandai dengan warna merah
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016
49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 7. Hasil Pewarnaan Endospora
ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c
ARK 6.1.d ARK 6.3.f ARK 7.2.g
ARK 7.3.h Lactobacillus casei
Keterangan:
- Isolat yang diuji berumur 24 jam dengan perbesaran (100x10)
- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, ARK
7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri non-spora ditandai dengan
warna merah
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
50
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 8. Hasil Uji Katalase
ARK 5.1.a ARK 5.3.b
ARK 6.1.c ARK 6.1.d
ARK 6.2.e ARK 6.3.f
ARK 7.2.g ARK 7.3.h
Lactobacillus casei
Keterangan:
- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.2.e, ARK 6.3.f, ARK
7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri katalase negatif
ditandai dengan tidak terbentuk gelembung gas
- Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif katalase menghasilkan
gelembung gas
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
51
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 9. Hasil Uji Motilitas
ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c ARK 6.1.d
ARK 6.3.f ARK 7.2.g ARK 7.3.h L.casei
Keterangan:
- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, ARK
7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri non motil ditandai dengan
pertumbuhan hanya tempat penusukan inoculum
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
52
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 10. Hasil Uji Produksi Gas
ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c ARK 6.1.d
ARK 6.3.f ARK 7.2.g ARK 7.3.h L.casei
Keterangan:
- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, dan
ARK 7.3.h merupakan bakteri heterofermentatif ditandai dengan adanya gas
pada tabung durham
- Lactobacillus casei merupakan bakteri homofermentatif ditandai dengan tidak
adanya gas pada tabung durham
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
53
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11. Hasil Uji Ketahanan Suhu
Isolat Suhu
10° C 37° C 45° C
L. casei
ARK 5.1.a
ARK 5.3.b
ARK 6.1.c
ARK 6.1.d
54
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ARK 6.3.f
ARK 7.2.g
ARK 7.3.h
Keterangan:
- Pada suhu 10° C ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,
ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei tidak terdapat pertumbuhan
ditandai dengan tidak adanya kekeruhan
- Pada suhu 37° C ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,
ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei terdapat pertumbuhan
ditandai dengan adanya kekeruhan
- Pada suhu 45° C ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,
ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei terdapat pertumbuhan
ditandai dengan adanya kekeruhan
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
55
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 12. Hasil Uji Ketahanan NaCl
Isolat Konsentrasi NaCl
4% 6,5%
L. casei
ARK 5.1.a
ARK 5.3.b
ARK 6.1.c
ARK 6.1.d
56
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ARK 6.3.f
ARK 7.2.g
ARK 7.3.h
Keterangan:
- Pada NaCl 4% ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,
ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei terdapat pertumbuhan
ditandai dengan adanya kekeruhan
- Pada NaCl 6,5% ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f,
ARK 7.2.g, ARK 7.3.h, dan Lactobacillus casei terdapat pertumbuhan
ditandai dengan adanya kekeruhan
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
57
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Hemolisis
ARK 5.1.a ARK 5.3.b ARK 6.1.c
ARK 6.1.d ARK 6.3.f ARK 7.2.g
ARK 7.3.h Lactobacillus casei Staphylococcus aureus
(Kontrol +)
Keterangan:
- ARK 5.1.a, ARK 5.3.b, ARK 6.1.c, ARK 6.1.d, ARK 6.3.f, ARK 7.2.g, ARK
7.3.h, dan Lactobacillus casei merupakan bakteri yang aman ditandai dengan
tidak adanya zona bening disekitar koloni
- Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif menghasilkan zona bening
disekitar koloni
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
58
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 14. Alat dan Bahan yang Digunakan
(Sumber: Dokumentasi pribadi, 2016)
Alat gelas Autoklaf manual Autoklaf digital Inkubator
Laminar Air Flow Refrigerator Oven Batang L & Ose
Pewarna Gram Pewarna
Endospora Timbangan analitik Mikropipet & tip
Media MRSB Media MRSA Pepton water Media SIM
Hot plate Bunsen Anaerobic jar