Post on 08-Dec-2015
description
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes Pèptids
L’enllaç peptídic és geomètricament pla perquè l’enllaç és més curt del que seria si fos simple, això implica que té cert “caràcter” de doble enllaç, es dóna per tant, una estabilització per ressonància
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes Pèptids
La “mobilitat” queda restringida, doncs, al carboni α. Ara bé, no tots els moviments són possibles, tot dependrà del grup “R” de cadascun dels aminoàcids Així cada enllaç pot formar dos angles (dièdrics ψ i contra φ) Per a una determinada seqüència es pot determinar el corresponent gràfic de Ramachandran que es pot fer servir per ajudar a esbrinar l’estructura secundària d’un pèptid
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes
Els pèptids són cadenes relativament curtes d’aminoàcids, entre 12 i 20 residus s’anomena oligopèptids i més enllà d’uns 20 amonoàcids es diu polipèptids* Les proteïnes poden estar formades per un determinat nombre de polipèptids i aquest ser iguals o no
*Aquesta classificació és variable segons les fonts
El citocrom c de cavall està format per un polipèptid (α1) de 104 aminoàcids i un pes molecular de 12500 Da
L’hemoglobina per 2 cadenes α i dues β de 141 i 146 aminoàcids respectivament i un pes molecular de 64500 Da
Pèptids
En els infants està constituïda per 2α i 2γ
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Els estudis sobre proteïnes poden tenir dos grans objectius:
1.- Determinar un patró proteic diferent entre dues mostres. Es tracta d’observar modificacions en el contingut de totes o quasi totes les proteïnes d’una o de vàries mostres 2.- Purificar una o vàries proteïnes amb un determinat grau de puresa. Aquesta ha de ser màxima per exemple en la purificació de preparats farmacèutics intravenosos
Metodologies per a l’estudi de les proteïnes
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes
Extracció
Els majors problemes que es poden trobar en l’extracció són: desnaturalització, proteòlisi i contaminació amb pirògens, àcids nucleics, bactèries i virus
Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Els dos primers es solen solucionar treballant sempre a baixa temperatura. També és sempre recomanable que els tractaments siguin el més curts possibles
Els elements a considerar respecte al medi d’homogeneïtzació són: pH, tipus de sal del tampó, detergents/agents caotròpics, quelants o ions metàl·lics, agents reductors, inhibidors de la proteòlisi i bacteriostàtics
Els coneixements previs de la proteïna són molt importants, per exemple si la seva desnaturalització és reversible o no
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes
Extracció
Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
La manera més usual d’eliminar els contaminants és per precipitació selectiva de les proteïnes
La solubilitat de les proteïnes depèn del seu contingut en aminoàcids hidrofòbics i hidrofílics. Així aminoàcids hidrofòbics a la superfície de la proteïna la fa manco soluble
L’objectiu és eliminar la capa de solvatació que envolta les proteïnes i que impedeix la seva interacció i pos te r io r ag regac ió pe rquè “ a l l i b e r a ” e l s a m i n o à c i d s hidrofòbics que així poden interaccionar amb els d’altres proteïnes afavorint la precipitació d’aquestes (agents anticaotròpics o “Kosmotropers”)
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes
Extracció
Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Aquests són alguns dels agents precipitants més emprats
Sèrie de Hofmeister
Més precipitació Manco precipitació
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Una vegada feta l’extracció els passos següents dependran de si es vol purificar una proteïna activa en concret o fer un anàlisi de les proteïnes presents en la mostra (proteòmica)
La purificació pot incloure diversos passos depenent del tipus de proteïna, en casi tots els cassos les tècniques cromatogràfiques són les més importants
En canvi, en proteòmica es vol conèixer el patró proteic d’una determinada mostra i comparar-la, si escau, amb una altra. El darrer pas pot ser la seqüenciació d’una o varies proteïnes
Cromatografia
Font: Protein Purifica2on Handbook. Amersham Biosciences
h=p://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/ca/GELifeSciences/service-‐and-‐support/handbooks/
Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
El coneixement previ de les característiques de la proteïna ajuda molt en la seva preparació
Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
IEX (cromatografia de bescanvi iònic)
GP (cribatge molecular, permeació en gel)
HIC (cromatografia d’interacció hidrofòbica)
AC (cromatografia d’afinitat)
RF (fase reversa)
Dessalació
La mida de porus ha de se molt petita perquè la/les proteïnes d’interès no hi entrin Si la proteïna és massa petita, una alternativa és la diàlisi
Captura
P u r i f i c a c i ó intermèdia
Polit
MALDI TOF-‐TOF
5209.96
4434.966045.75
7202.08
6674.96
5736.25
6346.95
8354.77
9696.32
4848.25
4893.75
3616.707930.212604.59
3294.15 9087.2310227.117612.142984.57
11436.96
3965.29
0
1
2
3
4
5
4x10Intens
. [a.u.]
4000 6000 8000 10000 12000 14000m/z
Tema 2. Estructura i funcions de les proteïnes Tècniques per a l’estudi de les proteïnes
Diferents proteases tallen a seqüències també diferents, segons quina s’usi es generaran fragments diferents
La seqüenciació de proteïnes també es pot fer a partir de la seqüència d’ADN/ARN, encara que cal tenir present que la proteïna final pot ser diferent a la seqüència del gen
La primera seqüenciació fou de la insulina (Sanger, 1951 i 1952) mitjançant procediments químics - Separació de les diferents cadenes polipeptídiques si escau - Rompre i neutralitzar els enllaços disulfur - Identificar els terminals C i N - Rompre els fragments i determinar la seva composició (normalment s’utilitza el fenilisotiocianat que reacciona amb el terminal N i llavors l’aminoàcid “marcat” és fàcilmenent escindit i analitzat per cromatografia - Les ruptures han de ser diferents, per exemple emprant diferents proteases - Reconstruir la seqüència gràcies als solapaments
Starting with 1mm x 1mm gel piece: 1. Wash gel plug in 100 ul solution B for 20 min (to equilibrate to pH 8ish and to remove the coomassie blue). 2. Repeat step 1. 3. Wash briefly with 100 ul acetonitrile to remove aqueous solutions. 4. Shrink plug by washing in 100 ul acetonitrile for 10 to 15 min. 5. Air dry for 10 min to remove all of the acetonitrile. 6. Add DTT soln: 100ul of 10mM DDT in 50mM Ammonium bicarbonate - 30 min @ 60C in heating block. 7. Remove liquid (do not shrink gel) 8. Add Iodoacetamide soln: 100ul of 100mM in 50mM Ammonium bicarbonate - 30 min @ room temp in dark. Use a brown (UV resistant) eppendorf. 9. Remove liquid. 10. Repeat step 1. 11. Repeat step 1. (The sample can be frozen at this point if necessary). 12. Wash briefly with 100 ul acetonitrile. 13. Shrink plug by washing in 100 ul acetonitrile 10-15 min 14. Remove all acetonitrile and Air dry for 10 min 15. Add trypsin soln: 5 ul containing 50 ng in 10 mM ammonium bicarbonate (Promega modified porcine trypsin) 16. Incubate in 37 degree water bath for 3 hr with tube lids on (2-4 h works OK) 17. Do not recover condensation on lid. Add 5 ul 5% formic acid, agitate by tapping tube, stand for 10 min. 18. Flash freeze in liquid nitrogen & store in minus 80 freezer until needed. 19. Defrost. Sonicate in ultrasonic bath for 10 mins (this is optional). Spot 0.25 - 0.5 ul on MALDI target. Wash spot with 3 ul 5% formic when dry. Solution B is freshly prepared 400 mM ammonium bicarbonate : 100% acetonitrile in a ratio of 1:1 Alternatively: 0.1 mM TCEP in 50 mM ammonium bicarbonate can be used inplace of DTT in step 6. DDT: 154 mw => 2.31 mg/ 1.5 ml. Iodoacetamide: 185 mw => 27.75 mg/ 1.5 ml. Trypsin: add 100 ul of promega re-suspension buffer to one vial of promega trypsin. Aliquot as 5 ul, flash freeze in liquid nitrogen and store at -20C. To one aliquot add 95 ul of 10 mM ammonium bicarbonate and use 5 ul per digest
ZFPL1: zinc finger protein-‐like 1
Required for cis-‐Golgi integrity and efficient ER to Golgi transport. I n v o l v e d i n t h e maintenance of the integrity of the cis-‐Golgi, possibly via its i n t e r a c ? o n w i t h GOLGA2/GM130
Green: protein Yellow: Golgi
ZFPL1: zinc finger protein-‐like 1