STUDIO DELLE PROTEINE

cromatografia

Frazionamento

Metodi non meccanici:

:

centrifugazione

Chiarificazione dell’estratto

• L’estratto grezzo deve essere “pulito” prima di procedere al frazionamento

• Conviene allontanare subito gli acidi nucleici, ribosomi mediante precipitazione (protamina solfato)

• Nel caso contiene molto materiale insolubile si può centrifugare

• Molto efficaci sono le tecniche che sfruttano la diversa solubilità delle singole proteine

• Solubilità differenziale

Sviluppo passaggi di purificazione

= 1/2ciZ2i

• Punto isoelettrico

• Calore

• Precipitazione frazionata con Sali (salting-in/salting out)

• Solventi organici

• Con polimeri organici (PEG)

• pH estremi

METODI DI PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE

Esempio di precipitazione frazionata

• Sviluppo di passaggi cromatografici

• Per stabilire la tecncica cromatografia più utile per la nostra proteina bisogna tenere conto di alcuni parametri generali:

-la capacità e la resa del processo cromatografico;

-la diluizione della proteina nel passaggio cromatografico;

-la velocità,-la conservazione dell’attività durante il passaggio;-il costo dell’intero processo.

Criterio generale: assemblare una serie di passaggi che separano le proteina secondo proprietà diverse.

Concentrazione per ultrafiltrazione e conservazione• La concentrazione si realizza forzando acqua e piccole

molecole attraverso una membrana semipermeabile usando alta pressione o centrifugazione.

• • Sono disponibili commercialmente diverse membrane

con intervallo di peso molecolare tra 500 e 300.000 (Amcon, Millipore) con dimensioni di pori 0,1-10 mm.

• Le proteine purificate in genere vengono conservate a basse temperature (-80°C). Spesso si aggiungo agenti criogeni (glicerolo, glicole etilenico, DMSO) per stabilizzare la proteina durante il congelamento e scongelamento.

Dialisi