Post on 18-Jun-2022
Spectrométrie de Masse
Couplages CLHP-MS
UE 6 – Sciences Analytiques & Qualité
DFGSP3 2021-2022
C. PERRIN
2
A. Détection en Chromatographie
0 5 10 15 20
A
B
C
D
E
Temps
Inte
nsit
é
Amobile Astationnaire
Séparation
Détection
3
Chromatographie : Identification des composés (analyse qualitative)
0 5 10 15
20
A
B
C
D
E
Temps
Inte
nsité
Détecteurs classiques (UV)
Temps de rétention(Comparaison étalon)
Mais Des composés différents peuvent avoir des temps de rétention identiques !!
Identification pas suffisamment spécifique pour des mélanges complexes et/ou inconnus
A. Détection en Chromatographie
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Détecteur UV à barette de diodes
Nécessité d’augmenter la spécificité de l’identification
Détecteurs + spécifiques
Chromatographie : Identification des composés (analyse qualitative)
A. Détection en Chromatographie
5
0 5 10 15
20
A
B
C
D
E
Temps
Inte
nsit
é
Mais Spectres quasi identiquespour structures proches !
Nécessité d’augmenter la spécificité de l’identification
A. Détection en Chromatographie
6
Solutions pour augmenter la spécificité de l’identification
Spectrométrie de masse
A. Détection en Chromatographie
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Qu’est ce que la spectrométrie de masse ?
Moléculeséchantillon
IonsPhase gazeuse
Mesurem/z
Détermination de la masse moléculaire des espèces à analyser:composition, structure…..
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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1. Identification qualitative- analyse organique et bio-organique structurale
masse moléculaireidentification fonctions chimiques (structurale)
2.Analyse quantitative- couplage avec techniques séparatives (CPG, CLHP, Electrophorèse)
Quelles sont les utilisations de la MS ?
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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- Applicable à des molécules très variées (petites molécules, macromolécules…)
- Très grande sensibilité: quelques µg d’analytes suffisent (jusqu’à quelques pg)
- Identification très spécifique (MM)
- Possibilité de réactions ions molécules (études d’interactions, mécanismes dedégradation….)
Quelles sont les spécificités de la MS ?
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules ionisées isolées
Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes:
1- Volatiliser les molécules de l’échantillon
2- Ioniser les molécules de l’échantillon
3- « Trier » les ions en fonction de leurs rapports m/z et mesurer leurs abondances
MM / nb de charges (m/z)
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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Echantillon Source Analyseur Détecteur
Passage en phase gazeuseIonisation des molécules
Séparation des ions en fonction de m/z
Comptage des ions
Mesure de l’abondance
Traitement du signal
Spectre de masse
Vide poussé (~10-4 Pa)
Détermination m/z
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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Spectre de masse
L'enregistrement de l'abondance des espèces ioniques formées en fonction de leur rapport masse/charge(m/z) dans l'ordre croissant des masses
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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Spectre de masse
Ibuprofène MM : 206
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative
Ibuprofène
Fragments
CH3
CH3
. m/z = 43
CH3
CH3
CH3
.
m/z = 91
CH2.
Spectre de masse
m/z = 161
z = 1
m/z = 206
MM
B. Spectrométrie de masse - Généralités
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C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
CLHP Spectromètre de masse
Introduction des composés « purs » dans le MS
Obtention de pics de forme symétrique= dimensions d’aires (ou hauteur)
précises
Analyse quantitative
Identification par le poids moléculaire
Information sur la structure des composés
Développement de méthode + rapide
Limite de détection : 20 à 50 pg
Séparation + Détection ultra spécifique
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• Les composés sont séparés les uns des autres au cours de l’analyse chromatographique
• Les composés élués de la colonne pénètrent directement dans la source d’unspectromètre de masse où ils ont ionisés.
•Le balayage de la gamme de masse est répété durant le temps d’élution des composés.
•Les spectres de masse complets de tous les composés sont obtenus.
Principe
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
17
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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Somme des abondances quelque soit m/z = f(temps)
TIC: Total Ionic Current
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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Obtention d’un spectre de masse pour un temps de rétention donné
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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NN
N
N
NO
O
OH
100 200 300 400 500m/z
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
402
386
100 200 300 400 500m/z
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
402
386
9 10 11 12 13 14 15 16
Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
11.62
13.84
13.16
14.40
12.1310.45
15.45
9 10 11 12 13 14 15 16
Time (min)
25
50
75
100
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
11.62
13.84
13.16
14.40
12.1310.45
15.45
NN
N
N
NO
O
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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TIC
Selected Ion Monitoring (SIM)
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
• Différents modes de détection
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TIC
SIM
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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CLHP
- Extraction de l’analyte du solvant- Ionisation des molécules en phase gazeuse- Transfert Pression Atmosphérique Vide
DétectionMS
Propriétés:- Transmettre quantitativement les composés à analyser- Ne pas dégrader les molécules- Ne pas altérer la séparation chromatographique
Interface/Source d’ionisation
Vide poussé
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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Mode d’ionisation privilégié en CLHP-MS
Analytes élués en phase liquide à pression atmosphérique
Source d’ionisation à pression atmosphérique
Electrospray(ESI)
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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Interface Electrospray (ESI)
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
27
Electrospray
• Formation d’ions pseudo-moléculaires ou d’adduits
[M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+
M/Z2 M/Z1
Déconvolution(Algorithme)
MM
• Formation d’ions multichargés pour les molécules possédant plusieurs sites basiques ou acides
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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Spectre ESI sulfaméthazine (MM 278)
cf TD
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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Spectre ESI de la Trypsinogène (MW 23983)
1599.8
1499.9
1714.1
1845.91411.9
1999.6
2181.6
M + 15 H+
M + 13 H+
M + 14 H+M + 16 H+
m/z Mass-to-charge ratio
cf TD
C. Couplage Chromatographie Liquide - MS
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D. Applications du couplage CLHP-MS
Mélange d’aflatoxines
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Mélange de benzodiazépines
D. Applications du couplage CLHP-MS
32Produits de dégradation du salbutamol
D. Applications du couplage CLHP-MS
SIM
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Identification protéines
SEC-UV-MS
D. Applications du couplage CLHP-MS
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Analyse d’aggrégats
SEC-UV-MS
MyoglobineMonomère
D. Applications du couplage CLHP-MS
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Identification protéines
Spectres de masse
Myoglobine
1
2
16 951
16 95133 986
D. Applications du couplage CLHP-MS
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E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS
Obtention d’information structurale en CLHP-MS (fragmentation)
Modifier le potentiel du cône d’échantillonnage
Ions + Gaz MS
Ions
Cône d’éch.
Tous les ions présents dans la sourceseront fragmentés.Obtention de spectres complexes !
Spectrométrie de masse en tandem (MS-MS)
MS 1 MS 2 MS 3
Fragmentation d’ions sélectionnés
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Spectrométrie de masse en tandem
E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS
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Isolement m/z 194,0495
Fragmentation
E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS
MM: 195 g/mol
MM: 193 g/mol
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E. Spectrométrie de masse en tandem: CLHP-MS-MS