Post on 23-Feb-2016
description
Špecifická humorálna imunita
Imunológia – 2. blok
Špecifická humorálna imunita
-schopnosť organizmu reagovať na cudzorodý antigén špecifickou imunitnou odpoveďou protilátkového typu
Protilátky: IgA IgD IgE IgG IgM
Stanovenie IgG radiálnou imunodifúziou (RID):
Princíp: Molekuly IgG (v sére pacienta) difundujú z jamiek v agaróze do okolia a reagujú s protilátkou proti IgG, ktorá je inkorporovaná v agaróze. Výsledkom interakcie je precipitačný prstenec. Veľkosť prstenca zodpovedá množstvu stanovovanej protilátky (Ab) v sére. Pomocou štandardov možno zostrojiť kalibračnú krivku a odčítať množstvo IgG v sére pacienta.
Materiál: preparáty RID, RID šablóny, milimetrový papier
Postup: 1. Zmerať priemery prstencov séra a štandardov.
2. Zostrojiť kalibračnú krivku.
3. Vypočítať množstvo protilátky IgG v sére.
RID je imunoprecipitačná metóda, založená na interakciiAg-Ab, pri ktorej vzniká zrazenina. Pre obmedzenú citlivosťsa stanovuje IgG, IgA, IgM. Pre stanovenie nízkych hladín, akosú IgD a IgE, nie je vhodná (tam RIA, ELISA).
RID
ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
-je viac typov (sendvičová, priama, nepriama,...)
-buď sa dokazuje prítomnosť špecifických protilátok alebo prítomnosť určitého antigénu vo vyšetrovanej vzorke
ELISA na detekciu protilátok IgE:
Princíp: ELISA je sérologická metóda kvantifikácie Ag alebo Ab prostredníctvom kovalentne nadviazaného enzýmu (peroxidáza, alkalická fosfatáza) : množstvo farebného produktu sa stanoví
fotometricky
Pomôcky: 1. komerčné stripy (v jamkách adherované monoklo- nové protilátky + anti-IgE + blok 3% BSA) 2. premývací roztok 3. konjugát (Ab značená chrenovou peroxidázou) 4. substrát (H2O2 + indikátor farebnej zmeny = TMB) TMB = tetrametylbenzidín
5. STOP roztok (H2SO4)
6. vzorky séra
Postup: 1. Do jamiek 50 μl séra a inkubovať 45 min. pri 37 °C.
2. Premyť 2 x 200 μl premývacieho roztoku a vytriasť dosucha.
3. Pridať 50 μl konjugátu a inkubovať 30 min pri 37 °C v termostate.
4. Ako krok 2.
5. Pridať 50 μl substrátu a čakať 2 min. na farebnú zmenu.
6. Pridať STOP roztok a zmerať absorbanciu na ELISA reader-i.
IMUNOKOMPLEXY
-väzba Ab-Ag-v nadbytku môžu indukovať zápal (ukladanie IK do steny ciev, synovie kĺbov, glomerulov, plexus chorioideus a pod.
Hodnotenie cirkulujúcich imunokomplexov (CIK):
1) Zmerať absorbanciu prázdnej mikroplatničky.2) Zo vzorky pridať 20 μl do jamky A1 a B1.3) Do A1 pridať 150 μl borátového tlmivého roztoku.4) Do B1 pridať 150 μl polyetylénglykolu (PEG).5) Premiešať a inkubovať 60 min. pri laboratórnej teplote.6) Zmerať absorbanciu pri 450 nm.7) Výpočet hodnoty CIK.
Najprv vypočítať výslednú hodnotu absorbancie v danejjamke ako rozdiel absorbancie plnej jamky a prázdnej.
POTOM:
(výsledná hodnota B1 – výsledná hodnota A1) x 1000
Referenčné hodnoty: do 50
Metóda IMUNOFIXÁCIE
• pri gamaglobulinopatiách, Waldenströmovej makroglobulinémii, myelómoch
• netvoria sa niektoré imunoglobulíny v dostatočnom množstve, alebo je chyba v produkcii Ig reťazcov• detekcia a typizácia monoklonálnych Ab alebo Ig v
sére alebo moči• precipitácia viditeľná voľným okom• náhrada proteínovej elektroforézy, lebo je rýchlejšia,
citlivejšia, jednoduchšie čitateľná a interpretovaná
Detekcia autoprotilátokNepriamy imunofluorescenčný test
• IFA je podobná ELISA metóde, môže sa stanovovať aj na sklíčku
• na značenie sa používa fluorochróm (pri ELISE enzým, ktorý po pridaní substrátu indukuje farebnú zmenu)
• fluorescenčný mikroskop
Postup: 1. Na sklíčko „potiahnuté“ antigénom sa kvapne sérum. 2. Inkubuje sa 30 min. vo vlhkej komôrke. 3. Premytie. 4. Aplikácia antiséra konjugovaného s fluorochrómom (napr. SwAHu/Ig). 5. ako krok 2 6. Premytie. 7. Odčítanie preparátu vo fluorescenčnom mikroskope.
- infikované bunky fluoreskujú na tmavom pozadí
- IFA sa využíva pri niektorých infekciách, autoimunitných ochoreniach (napr. štítnej žľazy,...)
Ďakujem za pozornosť