Primena i proizvodnja

Aminokiselina

God. proiz. (t)

Cena (US$/kg)

Primena

L-glutamat 1 700 000 1 poboljšanje ukusa

L-lizin 850 000 2 dodatak hrani

D,L-metionin 350 000 2 dodatak hrani

L-treonin 70 000 5 dodatak hrani

L-asparaginska

10 000 10 Aspartam

L-fenilalanin 10 000 10 Aspartam, medicina

glicin 25 000 10 zaslađivač

L-arginin 1000 20 medicina, kozmetika

L-triptofan 1000 20 dodatak hrani

ostale 3000 medicina i dr.

Načini proizvodnje

• ekstrakcija iz hidrolizata proteina• hemijska sinteza• biotransformacija hemijskih prekursora• mikrobna proizvodnja

Ekstrakcija iz hidrolizata proteina

Prvi postupak za proizvodnju aminokiselina. Primenjuje se za proizvodnju L-cisteina, L-cistina, L-leucina, L-

asparagina, L-arginina i L-tirozina. Sirovine: pšenični gluten, proteini soje ili kukuruza, životinjska

dlaka ili nokti ili nus-proizvodi mesne industrije.

protein

kiselinskahidroliza

hidrolizat proteina

frakciono taloženje

hidrofobne aminokiseline

rastvorne aminokiselin

ehromatografskorazdvajanje

kristalizacija

Hemijska sinteza Nedostatak: dobija se racemska smeša.

Metionin I dalje se dobija hemijskom sintezom.

Akrolein hidantoin metionin

Metil-merkaptan

• Glicin• Iz hlorsirćetne kiseline i amonijaka

•Štrekerova sinteza aminokiselina

NaOH

ClCH2COOH + NH3 H2NCH2COOH + HCl

ClCH2COOH + NH3 H2NCH2COOH + HCl

Biotransformacije Prednost: lako prečišćavanje proizvoda Mana: skupe sirovine

Mikrobni postupci Prednost: jeftine sirovine Mana: kompleksna fermentaciona smeša, skuplje prečišćavanje. Zahtevi

Stimulisanje sinteze enzima neophodnih za produkciju i njihova aktivacija

Represija ili inhibicija enzima koji katalizuju reakcije degradacije odgovarajućih aminokiselina

Stimulisanje resorpcije supstrata Stimulisanje ekskrecije aminokiselina

Rešenja Klasične mutacije i metode rekombinantne DNK

L-glutaminska kiselina Primena

Primenjuje se uglavnom kao prehrambeni aditiv ˝Umami˝ ukus

U manjoj meri u farmaceutskoj industriji i kozmetici Neurotransmiter

Proizvodnja Prvobitno hidrolizom proteina Konbu algi, a zatim hidrolizom

pšeničnog glutena. Hemijski postupci – bazirani na Štrekerovoj sintezi

Dupont proces acetilen - akrilna kiselina - metil-β-formilpropionat - D,L-glutaminska kis.

Ajinomoto proces akrilonitril - β-cijanopropionaldehid - D,L-glutaminska kis.

Mikrobiološki postupak razvijen u Japanu 1957. godine i danas se gotovo isključivo koristi.

Proizvodni mikroorganizam Corynebacterium glutamicum (raniji naziv

Micrococcus glutamicus) Nesporogena, Gram-pozitivna bakterija, podleže

pleomorfizmu, neophodan biotin za rast. Pored melase i hidrolizata skroba mogu da koriste i

metanol i aceton, ali ne i parafine

Koriste se i: Brevibacterium flavum Corynebacterium efficiens Corynebacterium alkanolyticum (za rast na parafinima)

BiosintezaKljučni enzimi:

• α-ketoglutarat-dehidrogenaza

• L-glutamat-dehidrogenaza

Kod proizvodnih sojeva:• Vm GDH veća 150 puta

Važna je i reakcija karboksilovanja fosfoenolpiruvata

• Biotin je neophodan za funkcionisanje PEP-karboksilaze

Izocitrat-dehidrogenaza ima isti koenzim (NADP) kao GDH.

Uslov:

Divlji sojevi C. glutamicum ne proizvode glutaminsku kiselinu pri visokoj koncentraciji biotina u podlozi.

Kada je visoka koncentracija biotina nakuplja se mlečna kiselina, umesto glutaminske.

Biotin ˝ne smeta˝ kada su prisutne površinski aktivne supstance ili β-laktamski antibiotici.

Razlog: uticaj ovih supstanci na propustljivost membrana.

Za propustljivost mebrana ključan je sadržaj lipida:

• u novije vreme utvrđeno da su ključne mikolne kiseline• mikolne kiseline imaju preko 30 C-atoma• ustanovljeno je da se sadržaj ovih kiselina smanjuje kada je limitiran biotin, ili kada sa dodaju antibiotik ili površinski aktivna supstanca Tween 40.

Auksotrofni mutanti

U ovoj proizvodnji auksotrofni mutanti rešavaju problem propustljivosti membrana.

Auksotrofi zavisni od oleata

Auksotrofi zavisni od glicerola

Danas se primenjuju genetski modifikovani sojevi koji imaju višestruke kopije gena za sintezu glutamat-dehidrogenaze

ProizvodnjaIzvor C: melasa ili hidrolizati skroba.

Izvor N: amonijačne soli ili urea.

Limitirana koncentracija biotina ili dodavanje Tween-a.

pH: 7-8• Sinteza glutaminske kiseline se ubrzava pri kraju eksponencijalne faze rasta.

•Dolivni postupak – zbog kataboličke represije•Nakon 14 h počinje dolivanje• održava se sadržaj glukoze oko 0,5 %

• Prinos glutaminske kiseline je 50-60 % ili 150-200 g/l nakon 60 h.

fermentacionačorba vakuum

filtracijaultrafiltracij

a

Jonoizmenjivčka

hromatografija

Izdvajanje proizvoda

Enzimska transformacija D,L-glutaminske kiseline

CH

CH2

CH2

C

OH

O

NH2

COOH

racemaza izL. fermentii

CH

CH2

CH2

C

OH

O

COOH

H2N

L-glutamat dehidrazaiz P. crucivicae

NH

O COOH

L-pirolidon karboksilnakiselina

L-lizin

Koristi se kao dodatak stočnoj hrani jer je esencijalna aminokiselina.

Dodaje se kao čista supstanca da se izbegne prevelika koncentracija azota.

Proizvodni mikroorganizmi: iste bakterijske vrste kao kod proizvodnje glutaminske

kiseline- C. glutamicum drugačiji tip auksotrofnih mutacija.

Biosinteza

aspartil-fosfataspartat aspartil-semialdehid L-homoserin L-treonin

L-izoleucinL-metionin

L-lizin

dihidropikolinska kiselina

diaminopimelinska kiselina

• U prvobitnom procesu se primenjuju auksotrofni mutanti kojima je neophodan homoserin za rast.

• Izbegava se “feedback” inhibicija aminokiselinama koje nastaju iz homoserina.

Nove strategije: •Izoluju se mutirani sojevi koji su dobri producenti lizina u prisustvu analoga lizina, što upućuje na izostanak “feedback” regulacije lizinom.

• Mutanti koji nemaju piruvat-karboksilazu i nižu koncentraciju citrat-sintaze.

• Primena tehnika rekombinantne DNK – fuzija protoplasta.

Proizvodnja

C. glutamicum Dolivni postupak, 60 h Prinos: 120 g/l

Separacija: Filtracija Ultrafiltracija Jonoizmenjivačka hromatografija ili vakuum-sušenje

Mikrobna transformacija D,L-α-aminokaprolaktama

HN

O

NH2

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

CH2

NH2

HN O

NH2

H

D,L-α-amino-ε-kaprolaktam

Criptococcus laurentii

D-α-amino-ε-kaprolaktam

Achromobacter obae

D,L-α-aminokaprolaktam je jeftin intermedijer u proizvodnji sintetskih polimera.

Indirektni ili dvojni postupak proizvodnje lizina 1. stupanj:

Koristi se auksotrof E. coli koji je izgubio sposobnost sinteze dekarboksilaze diaminopimelinske kiseline.

Neophodan lizin za rast. Mora se pažljivo kontrolisati. Ako je preniska konc. Razvijaju se prototrofi.

Nakuplja se DAP. 2. stupanj:

Koristi se prototrof E. coli ili Aerobacter aerogenes. Ovi mikroorganizmi ne smeju imati aktivnu lizin-

dekarboksilazu

L – treonin• Proizvodi se na industrijskom nivou pomoću mutanata E. coli.

• Selektirani su sojevi koji imaju deregulisan metabolizam sa aspartat-kinazom i homoserin-dehidrogenazom neosetljivom na feedback-inhibiciju.

•Prinosi: 80 g/l za 30 h.

•Separacija proizvoda• odvajanje ćelija centrifugiranjem ili ultrafiltracijom• vakuum-uparavanje• kristalizacija

Proizvodnja aspartama Veštački zaslađivač, god. proizvodnja oko 10000 t.

Za sintezu su neophodni L-fenilalanin i asparaginska kiselina

Asparaginska kiselina Kontinualni postupak

Reaktor sa ćelijama E. coli imobilisanim u κ-karagenanske ili poliakrilamidne mikrokapsule.

Ćelije imaju 30 puta veću aktivnost aspartaze jer sadrže plazmid sa genom za sintezu ovog enzima.

Aspartat nastaje adicijom amonijaka na fumarat

Visoka produktivnost imobilisanih ćelija – 140 g/(l h) Visoka operativna stabilnost – poluživot 2 godine. Primenjuju se i postupci sa E. coli imobilisana u poliuretanske čestice ili

Pseudomonas putida imobilisana u κ-karagenanske mikrokapsule.

C C

COOH

H

H

HOOC

H2N CH C

CH2

OH

O

C

OH

O

Fenilalanin

•Adicija amonijaka na trans-cimetnu kiselinu.Reakciju katalizuje fenilalanin-amonijum liaza iz

Rhodotorula glutinis ili Rhodotorula rubra.

Enzimski postupak

• Hidroliza N-acetilfenilalanina

• Primenjuju se aminoacilaze.

•Dobija se fenilalanin čistoće adekvatne za primenu u farm. industriji, ali je neophodna racemizacija D-enantiomera i recikliranje.

Razvijen i kontinualni postupak sa imobilisanim ćelijama

Dostignuta finalna koncentracija proizvoda oko 50 g/l, prinos oko 83%.

Dva ključna enzima u regulaciji biosinteze:DAHP sintaza (2) i prefenat dehidrataza (PDH, 9).

Rešenja:• Auksotrofni mutanti C. glutamicum.

• U novije vreme prinosi povećani primenom rekombinantnih sojeva Brevibacterium flavum ili E.coli koji sadrže amplifikovane gene za sintezu PDH ili gene za sintezu PDH ili DAHPS koji ne podležu feedback regulaciji jer postoji više izoenzima.•

Fermentacija

L-tirozin auksotrofni mutanti E. coli

Proizvodnja aspartama Enzimski postupak

Imob. termolizin iz B. stearothermophilus

60 oC2 h

D-fenilalanin-OMe

racemizacija

hemijsko hidrogenovanje ZH

L-Z-α-aspartil-L-fenilalanin-OMe

Z: benziloksikarbonil grupa

Triptofan Tri tipa proizvodnje

Enzimska transformacija prekursora Kondenzacija indola i serina. Postupak je neekonomičan jer su polazni reaktivi

skupi. Stereoselektivna hidroliza N-acetil-D,L-triptofana aminoacilazama.

Mikrobna transformacija prekursora Konverzija metaboličkih prekursora triptofana- indola ili antranilne kiseline. Postupak sa antranilnom kiselinom kao prekursorom i genetski modifikovanim

sojem Bacillus amyloliquefaciens komercijalizovan. Postupak je zabranjen jer finalni proizvod sadrži nečistoću koja izaziva eozinofilija-mialgija sindrom.

Fermentacija na ugljenohidratnim sirovinama Razvijeni su postupci sa auksotrofnim mutantima E. coli i C. glutamicum. Primenjuju se i proizvodni mikroorganizmi dobijeni primenom tehnike

rekombinantne DNK sa višestrukim kopijama operon koji sadrži enzime neophodne za biosintezu triptofana.

Aminokiseline dobijene enzimskim transformacijama Prednost: mogu se dobiti neproteinogene a.k. i

a.k. koje ne postoje u prirodi.

N N

O

OR

hidantoinaza N

CH

NH2

O

R

COOHkarbamoilaza

H2N CH C

R

OH

O

L-aminokiselina

R - CH -C

O

R1

NHR2

esteraza, amino-acilaza, amidaze

R-C

O

H

+ CN - oksinitrilazaR - C - CN

H

HO

Aminoacilaza

• primenjuje se već 30 godina

• razdvajanje racemske smeše acetilaminokiselina

• ovako se proizvode:

L-metionin, L-triptofan, L-valin, L-tirozin i L-prolin (za infuzione rastvore)

N-acetil-D,L-aminokiselina

Imob.amino-acilaza

Kontinualni uparivač

kristalizator

separator

L-aminokiselina

(kristalizuje)

N-acetil-D-

aminokiselina

(ne kristalizuje)

racemizacija

Hidantoinaza/karbamoilaza sistem

• Primenjuje se na industrijskom nivou za proizvodnju D-fenilglicina i p-hidroksi-D-fenilglicina.

• bočni lanci polusintetskih antibiotika ampicilina i amoksicilina.

Oksido-redukcione reakcije• Najviše se primenjuje leucin-dehidrogenaza za proizvodnju L-terc-leucina (prekursor u sintezi lekova).• Dobija se iz trimetilpiruvata.

• Problem: regeneracija NADH

• Rešenje: upotreba format-dehidrogenaze kao enzima za regeneraciju koenzima.

• oslobađa se gasoviti CO2 i pomera položaj ravnoteže ka L-Tle.• koristi se i PEG-NADH da bi se koenzim zadržao u membranskom reaktoru