Post on 08-Jul-2022
PCR
Julián Sanz Ortega
Índice
• Concepto
• Técnica
• Puesta a punto, problemas
• PCR- transcripción inversa
• ¿Qué hacer con el producto de PCR?
• Aplicaciones
Genoma humano
3.1 x 109 pb
22,000 genes = 5% of genome 30% con instrucciones
para hacer proteínas
70% con instrucciones para regular la translación a proteínas de otros genes:
• Ribosomal (rRNA) • Transfer RNA (tRNA) • Small nucleolar RNA
(snoRNA) • Micro RNA (miRNA)
1.- Concepto
RNA transcription
pre-mRNA
splicing
mRNA
ribosome
mRNA A(n)
exon intron exon intron exon Gene
translation
protein
Genética y epigenética 1.- Concepto
Concepto
1.- Concepto
2.- Técnica
3 PASOS 2.- Técnica
2.- Técnica
PCR a “tiempo real”
• “Semicuantitativa”.
2.- Técnica
Diseño oligonucleótidos
• Longitud: 18-24 nucleótidos.
• “Melting temperatures” (Tm)(G+Cx4,A+Tx2), “Annealing temperatures” (Ta) similares en ambos primers. (Ta = Tm - 2-4º)
• No complementarios: evitar “primer dimer”.
• No secuencias palindrómicas . Distancia óptima entre oligos: 100-500 bp (parafina preferiblemente menos de 300).
2.- Técnica
Diseño de oligos
• Revisar literatura
• Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Nucleotide) , buscar “amplimer” y “protocols” para cada gen.
• Online. Ej: – Primer3: WWW primer tool (University of
Massachusetts Medical School, U.S.A.)
– GeneFisher - Interactive PCR Primer Design (Universitat Bielefeld, Germany)
– PCR Now (Computational Biology Group, PathoGene, Southwestern Medical Center, U.S.A.)
2.- Técnica
Confirmar amplificación
• Electroforesis: Tamaño
adecuado ¿?
• Enzimas de restricción
(al menos 2).
• PCR nested
• Secuenciación.
• Hibridación.
2.- Técnica
Optimización de PCR
• SIEMPRE examen histopatológico previo. (¿Microdisección?)
• SIEMPRE ajustar condiciones a nuestro laboratorio.
• Sensibilidad y especificidad. Trucos:
– Ta: bajar si no hay producto, subir si bandas inespecíficas.
– MgCl2: Bajar si bandas inespecíficas.
– Otras: Taq, temperaturas y tiempos, nº ciclos
• SIEMPRE CONTROLES.
3.- Puesta a punto, problemas
Controles
• Control calidad de ADN
• Control positivo
• Control negativo: No ADN.
• ¿Control normal del mismo paciente?
3.- Puesta a punto, problemas
Evitar contaminaciones
• 2 habitaciones: Pre y post-PCR
• Cabinas con RX UV.
• Cuidado con “Hot-Start” !!
• Hacer alícuotas.
• Sentido común.
3.- Puesta a punto, problemas
RT-PCR
4.-PCR- trascripción inversa
Paso1: Extracción de ARN
Paso2: Transcriptasa inversa: cADN
Paso 3: Amplificación- PCR
Paso 4: Visualizar en gel
METILACION ONLINE: www.urogene.org/methprimer
3´-CTACTGATTGCAGG-5´ m
3´-CTACTGATTGCAGG-5´
3´-UTAUTGATTGCAGG-5´ m
5´-AATAACTAACG-3 3´-UTAUTGATTGCAGG-5´ m
3´-UTAUTGATTGUAGG-5´
PCR
5´-AATAACTAACG-3 3´-UTAUTGATTGUAGG-5´
mismatch
No PCR
Bisulfite treatment
MS PCR
• Identificar secuencias “intrusas”: infeccioso.
• Identificar mutaciones:
– Mutaciones puntuales: secuenciación, SSCP, RFLP, DGG…
– Deleciones: secuenciación, análisis fragmentos
– Amplificaciones: PCR tiempo real
– Traslocaciones: RT-PCR
• Identificar polimorfismos
• Expresión:
– ARNm: RT-PCR
– Hipermetilación
• Electroforesis
• Análisis de fragmentos
• Restricción
• Técnicas adicionales
5.-¿Qué hacer con el producto de PCR?
microARN?
Diagnóstico
• Traslocaciones específicas: linfomas,
sarcomas
• Mutaciones específicas tumores sólidos:
GIST, renal, tiroides.
• Cáncer familiar: Colon, mama, riñon..
• Reordenamientos en linfomas.
• Errores filiación, metástasis de laboratorio
• Infeccioso
6.- Aplicaciones
El cáncer de riñón no es una única enfermedad:
6.- Aplicaciones
THYROID TUMORS
• PAX8/PPARg rearrangement • RAS mutation
• RET mutation • bRAF mutation
• Mitochondrial DNA mutation
FOLLICULAR CA
PAPILLARY CA
6.- Aplicaciones
TUMOR CLS. HÜRTHLE
GIST www.ensembl.org (SNPs) K
ACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTTTCCCAGAAACAGGCTGAGT
-L--P--Y--D--H--K--W--E-=F=-P--R--N--R--L--S--F--G--K--T--
6.- Aplicaciones
Tumour Chrom. abnormality Fusion gene Prevalence Prognosis
-Rhabdomyosarcoma
Botryoid NA NA NA Good
Spindle cell NA NA NA Good
Embryonal Gains of 2, 7, 8, 12, 13; GF2, GOK, NA Good
losses of 1, 6, 9, 14, 17 PTCH TP53
Alveolar t(2;13)(q35;q14); PAX3-FKHR 75% Poor
t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR 10%
Undifferentiated NA NA NA Poor
- EWS family
EWS/PNET t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI-1 85–95%
Good (type I) t(21;22)(q22;q12) EWS-ERG 5–10%
t(7;22)(p22;q12) EWS-ETV1 <1%
t(17;22)(q21;q12) EWS-E1AF <1%
t(2;22)(q33;q12) EWS-FEV <1%
Inversion of 22q EWS-ZSG <1%
- DSRCT t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1 >95% Poor
6.- Aplicaciones
Type of tumor Chrom. abnormality Fusion gene Prevalence Prognosis
Clear cell sarcoma t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 90% Poor
Extraskeletal myxoid t(9;22)(q22–23;q11–12) EWS-TEC (CHN) 75% Good
chondrosarcoma t(9;15)(q22;q21) TCF12-TECNA
t(9;17)(q22;q11) TAF2N-TEC 25%
Extraskeletal mesenchymal CS der(13;21)(q10;q10) NA Poor
Synovial sarcoma t(X;18)(p11;q11) SYT-SSX1 65% Poor
SYT-SSX2 35%
SYT-SSX4 rare
Congenital/infantile-fibrosarcoma t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 80%
Inflammatory myofibroblastic tumor t(1;2)(q25;p23) TPM3-ALK NA Good
t(2;19)(p23;q13) TPM4-ALK NA t(2;17)(p23;q23) CLTC-ALK NA
t(2;11;2)(p23;p15;q31) CARS-ALKNA
Myxoid/round cell liposarcoma t(12;16)(q13;p11) TLS-CHOP 95% Good
t(12;22)(q13;q12) EWS-CHOP rare
6.- Aplicaciones
Type of tumor Chrom. abnormality Fusion gene Prevalence Prognosis
Tenosynovial giant cell tumor t(1;2)(p11;q35–37) NA 40% NA Good
t(1;5)(p11;q22–31) 10%
t(1;11)(p11;q11–12) 10%
t(1;8)(p11;q21–22) 10%
Lipoblastoma Rearrang. 8q12, polysomy 8 PLAG1 70% Good
Malignant peripheral nerve sheath tumor
Complex changes NA NA Poor
DFSP Ring chromosome with sequences from chromosomes 17 and 22,
t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB >99% Good
Giant cell fibroblastoma (juvenile form of DFSP)
t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB
Desmoid tumor +8, +20, Deletion (5)(q21–22) NA
Alveolar soft part sarcoma t(X;17)(p11;q25) ASPL-TFE3 > 90% NA
6.- Aplicaciones
Ej: Diagnosis of the Small Round Blue Cell
Tumors Using Multiplex Polymerase Chain
Reaction (Chen at al, JMD 2007)
Chen et al., JMD 2007, Vol. 9,
Pronóstico
• Mutaciones específicas: GIST, carcinomas
renales y de tiroides.
• Inestabilidad de microsatélites en
carcinoma colo-rectal
• Pérdidas 1p/19q en oligodendroglioma
• Diferentes genes de fusión
(traslocaciones) en sarcomas?
• Otros: N-myc (neuroblastoma), HPV…
6.- Aplicaciones
Tratamiento
• Enfermedad mínima residual (mama
aprobado por FDA), micrometástasis.
• Tratamiento “a la carta”:
– Respuesta a inhibidores de EGFR
(Gefitinib) en Cáncer de pulmón.
– Respuesta a Imatinib en GIST. – Her2 (FISH)
6.- Aplicaciones
Conclusiones
• PCR es una técnica de amplificación.
• Útil para detectar mutaciones genómicas
(deleciones, puntuales, reordenamientos ..),
polimorfismos o agentes infecciosos.
• Útil para estudiar la expresión de ARNm
(RT-PCR) y la metilación.
• Aplicaciones al diagnóstico, pronóstico y
tratamiento.