Outline

Lecture 2

1. Production of Polyclonal Antibodies

2. Production of Monoclonal Antibodies

Monoclonal Antibodies (โมโนโคลนอลแอนติบอด้ี)- Dr. Cesal Milstein และ Dr. George

Kohler ซึง่เป็นนักวจิยัแห่งมหาวทิยาลัยแคมบรคิจ ์ ได้ค้นพบโมโนโคลนอลแอนติบอดี และได้รบัรางวลัในสาขาการแพทยด้์านวทิยาภมูคิุ้มกันเมื่อปี 1984 - ในอดีตการเตรยีมแอนติบอดีจะได้โพลีโคลนอลแอนติบอดี (Polyclonal antibody) ซึง่เป็นการยากท่ีจะให้ได้ antibodies (Ab) หรอื immunoglobulin ท่ีมคีวามจำาเพาะและมีคณุสมบติัตามท่ีต้องการสงู- โดยปกติรา่งกายของมนุษยแ์ละสตัวจ์ะสามารถสรา้ง Ab ขึน้มาได้มากกวา่ 2 ล้านชนิด เน่ืองจากปรมิาณของ Ab ท่ีรา่งกายสรา้งขึน้มามมีากมายหลายชนิดจงึทำาให้ Ab ท่ีรา่งกายมนุษยผ์ลิตขึน้มามปีรมิาณท่ีตำ่าและไมม่คีวามบรสิทุธิ ์ ดังนัน้ความสามารถท่ีจะทำาลายทั้งแบคทีเรยีและไวรสัเมื่อมกีารติดเชื้อเขา้มาในรา่งกายจะตำ่า

Polyclonal Antibodies (โพลีโคลนอลแอนติบอด้ี)- Polyclonal antibodies

แต่ละชนิดจะเป็นกลุ่มของ immunoglobulin (Ig) ท่ีมีความไมเ่หมอืนกัน (heterogeneous) เพราะถกูสรา้งมาจากเซลล์ หรอื clone ต่างชนิดกันและมคีวามจำาเพาะตำ่า

Production of Polyclonal Antibodies

Advantages of Polyclonal Antibody

• Multiple clones give high levels of labeling for a single antigen because they contain many antibodies to different epitopes on the same protein.

Disadvantages of Polyclonal Antibody • Shared epitopes on different proteins can label

multiple proteins that are not the antigen protein.

• Obtaining the antibody depends on a living animal and the ultimate death of the rabbit means no more antibody.

Monoclonal AntibodiesMilstein และ Kohler  ได้

อาศัยหลักการและแนวทางในการทำาให้ Ab ท่ีต้องการให้บรสิทุธิ์และมคีวามเฉพาะเจาะจงท่ีจะยดึตัวเองบนแอนติเจน (antigen; Ag) ของแบคทีเรยี หรอืไวรสั เพยีงชนิดเดียว ซึง่วธิกีารน้ีได้ถกูเรยีกวา่ Monoclonal Antibodies (MAbs)

http://www.youtube.com/watch?v=Gykx5FrQbvUhttp://www.youtube.com/watch?v=lcHy8THENXo

Monoclonal Antibodies (โมโนโคลนอลแอนติบอด้ี)

ลักษณะสำาคัญของ Monoclonal Antibodies - Monoclonal antibodies แต่ละ

ชนิดจะเป็นกลุ่มของ immunoglobulin (Ig) ท่ีมคีวามเหมอืนกัน (homogeneous) เพราะถกูสรา้งมาจากเซลล์ หรอื clone ชนิดเดียวกันและมคีวามจำาเพาะสงู

- การนำาเอาวธิขีอง Monoclonal Antibodies มาใชใ้นการรกัษาโรคจะสามารถใชร้ะยะเวลาในการรกัษาท่ีสัน้ ตรงสาเหตขุองโรค ได้ผลท่ีแน่นอน และรวดเรว็

มี Ab ชนิดเดียว และจบักับ Epitope ชนิดเดียวบน Ag นัน้

มี Ab หลายชนิด และจบักับ Epitope หลายชนิดบน Ag นัน้

เปรยีบเทียบ polyclonal และ monoclonal antibodies คณุสมบติั Polyclonal

AntibodiesMonoclonal Antibodies

ความจำาเพาะ (Specificity) 

- พบปฏิกิรยิาขา้มกลุ่ม- พบ Ab ท่ีต้องการน้อย- พบ Ab หลายชนิด

- อาจพบปฏิกิรยิาขา้มกลุ่มได้- อาจพบ Ab ท่ีมคีวามจำาเพาะมากเกินต้องการ- คงท่ี สามารถเลือกได้เป็นมาตรฐาน (standard)Affinity -ไมค่งท่ีเปล่ียนแปลง

ตามเวลาท่ี เจาะเลือดสตัวท์ดลอง

- คงท่ีโดยสามารถคัดเลือกได้สงู หรอืตำ่าตาม ต้องการในระหวา่งทำา cloningปรมิาณ Ab ท่ี

เป็นประโยชน์ - ประมาณ 1 mg/ml 

- ประมาณ 100 ug/ml ในเซลเพาะเล้ียง - ประมาณ 20 mg/ml ใน ascitic fluidImmunoglo

bulin ท่ีปนเป้ือน 

- อาจสงูถึง 100% -ไมพ่บในเซลเพาะเลี้ยง แต่พบประมาณ 10% ใน ascitic fluid

 ความบรสิทุธิ์ของ Ag 

- ต้องใช ้Ag ท่ีบรสุิทธิ์มากหรอื ต้องทำา serum absorption 

- ใช ้Ag ท่ีบรสุิทธิพ์อสมควร 

ราคาในการผลิต  - ตำ่า -สงู โดยเฉพาะในเวลาเริม่ต้น 

โรคท่ีถกูรกัษาโดยใชว้ธิ ีmonoclonal antibodies - โรคไขขอ้อักเสบ โรคเสน้โลหิต

ตีบ มะเรง็หลาย ๆ ชนิด และการติดเชื้อจากไวรสั - ในปัจจุบนัม ี Ab ประมาณ 100 ชนิด และอีกจำานวนนึงท่ีรอการยอมรบัเพื่อใชใ้นการรกัษาโรค - การพฒันางานด้านนี้ต่อไปของ Dr. Milstein คือความพยายามท่ีจะทำาให้ Ab แทรกซมึเขา้สูผ่ิวของเซลล์มะเรง็ และรกัษาโปรตีนท่ีไมป่รกติภายในเซลล์

กรรมวธิแีละขัน้ตอนในการผลิต Monoclonal Antibodies

1 . การเตรยีมแอนติเจน (Antigen preparation)

2. การฉีดกระตุ้นในหนู (Immunization)

3. ฆา่หนูเพื่อนำาเอาเซลล์มา้ม (Spleen cells) ของหนูออกมา

4. การรวมเซลล์ (Cell fusion)5. การคัดเลือกเซลล์ลกูผสม (hybrid

cell) หรอื hybridomas6. การทำา Cell cloning และการเพิม่

ปรมิาณของ clone (Clonal expansion)7. การแยกสกัดบรสิทุธิข์องโมโนโคลนอลแอนติบอด้ี (Purification of MAbs)

1. Antigen preparation2. Immunization

3. Isolation of spleen cells

4. Cell fusion

5. Hybridomas

6. Clonal expansion

7. Purification of MAbs

การเตรยีมแอนติเจน

-Ag ท่ีใชจ้ะต้องมคีวามบรสิทุธิ์มากท่ีสดุ และมปีรมิาณพอเพยีงท่ีจะกระตุ้นให้สตัวท์ดลองสรา้ง Ab สนองต่อ Ag ท่ีฉีดเขา้ไป

-สามารถตรวจสอบ (Characterized) monoclonal antibodies ท่ีสรา้งขึน้มาวา่มคีวามจำาเพาะต่อสว่นใดของ Ag ตัวอยา่งให้เห็นวา่ม ี 2 antigen sites คือตำาแหน่งของ a และ b

Methods to Prepare Antigen1 .เตรยีมแอนติเจนจากการเพาะเล้ียงเชื้อไวรสั นำามาทำาให้

อนุภาคไวรสัแตก (viral lysate) และแยกโปรตีนบรสิทุธ ์โดยวธิปีั่ นรอบสงูแยกชัน้ ในสารละลายท่ีมคีวามหนาแน่นแตกต่างกัน (zonal sucrose gradient ultracentrifugation)

ขอ้ดี: แอนติเจนมลัีกษณะครบในสภาพธรรมชาติ ขอ้เสยี: เตรยีมได้ยาก ต้นทนุสงู

2. การพฒันาการเตรยีมแอนติเจนขึ้นใหมโ่ดยใช ้recombinant protein สามารถเลือกโปรตีนเฉพาะสว่นท่ีสำาคัญ ขอ้ดี: มคีวามไวและความจำาเพาะมากขึ้นขอ้เสยี: มปัีญหาในแง่ของผลบวกเทียม เน่ืองจากอาจมโีปรตีนของแบคทีเรยีท่ีใชใ้นการเตรยีมแอนติเจนปนอยู่ 3. แอนติเจนเป็นเปปไทด์สงัเคราะห ์ โดยเลือกเปปไทด์ท่ีจำาเพาะ เปปไทด์ท่ีสงัเคราะหน้ี์มลัีกษณะโครงสรา้งต่างจากลักษณะในธรรมชาติ อาจทำาใหค้วามไวของการทดสอบลดลง และพบผลลบปลอม

Recombinant protein

Synthetic peptide

การฉีดกระตุ้นสตัว์ทดลอง

- Ag ท่ีใชก้ระตุ้นหนูจะถกูฉีดเขา้ทางชอ่งใต้ผิวหนัง (subcutaneous injection) อาจมีการฉีดซำ้าภายหลังฉีดครัง้แรก 1, 2 หรอื 4 อาทิตย ์ (booster)- หนูจะสรา้ง Ab คือ ANTI-

a และ ANTI-b ขึน้มาตอบสนองต่อ Antigen a และ b ท่ีฉีดกระตุ้นเขา้ไป

สตัวท์ดลอง (Experimental animal) ใชห้นู Mouse สายพนัธุ์ Balb/c ซึ่งเป็นInbred strain ท่ีสามารถตอบสนองทางภมูคิุ้มกันต่อแอนติเจนชนิดต่างๆ

ได้ดี

Rattus rattus

Mouse Balb/c

ฆา่หนูเพื่อนำาเอาเซลล์มา้ม

-ทดสอบหาระดับของ Ab ท่ีต้องการโดยทำาการเจาะเลือดจากขา้งเป้าตาหรอืจากหางของหนู ถ้าระดับไตเตอร์สงูมากจะมโีอกาสได้ clone cell สงู

-ก่อนฆา่หนูเพื่อนำาเซลล์มา้มมาใชจ้ะต้องมกีารกระตุ้น (booster) ก่อน โดยละลาย Ag ในนำ้าเกลือแล้วฉีดเขา้เสน้เลือดทางหาง หรอืเขา้ชอ่งท้อง 3 วนัก่อนท่ีจะฆา่เอามา้มหนู

ไตเตอร์ มคีำาจดักัดความวา่ ปรมิาณของสารหนึ่งทำาปฏิกิรยิากับอีกสารหนึ่งท่ีมปีรมิาณคงท่ี หรอืปรมิาณของสารหน่ึงท่ีพอเหมาะกับอีกสารหนึ่งท่ีมปีรมิาณคงท่ี

ในทาง Clinical immunology หมายถึง สว่นกลับของ dilution สดุท้ายของแอนติบอดีย์ (หรอืแอนติเจนบางกรณี) ท่ียงัใหผ้ลบวกกับการทดสอบนัน้ ๆ สมมุติวา่ 1:160 ของซรีัม่ ยงัใหผ้ลบวก

กับ Widal test ( เกิดการจบักลุ่มของเชื้อ Salmonella typhi) เรยีกวา่ซรีัม่นัน้มี titer = 160

การรวมเซลล์

- ทำาการรวมเซลล์จากมา้มหนูกับเซลล์มะเรง็ (Myeloma cell หรอื plasmacytoma cell) เซลล์มะเรง็จะมคีณุสมบติัในการเจรญิเติบโตอยา่งรวดเรว็เพราะเป็น Immortal B Tumour และขาดเอ็นไซม ์ Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase (HPRT หรอื HGPRT) เซลล์มะเรง็ท่ีนำามาใชเ้ล้ียงจะต้องไมม่กีารปนเปื้ อนจากเชื้อราหรอืแบคทีเรยี และมจีำานวนของเซลล์ท่ีมชีวีติ (viable cell) ไมต่ำ่ากวา่ 90% - Myeloma cell สว่นใหญ่ใช ้ P3-X63-Ag-8.653 สาร polyethylene glycol (PEG) จะถกูนำามาใชใ้นการรวมเซลล์ (fusion) จากมา้มหนูกับเซลล์มะเรง็ - ผสมสารละลายเซลล์จากมา้มหนูและสารละลายเซลล์มะเรง็ ในอัตราสว่น spleen cell ต่อ myeloma cell = 5:1 (ซึง่บางกรณีอาจใชถึ้ง 10:1 หรอื 20:1) - นำาสารละลายเซลล์ไปเพาะเลี้ยงใน HAT medium

การคัดเลือกเซลล์ลกูผสม (hybrid cell) หรอื hybridomas

• HAT medium ซึง่เป็นอาหารเฉพาะ (selective medium) ท่ีประกอบไปด้วยสารท่ีชื่อ Hypoxanthine, Aminopterin และ Thymidine • อาหาร HAT medium ถกูพบโดย Littlefield เมื่อปี ค.ศ. 1964 และเฉพาะเซลล์ลกูผสม (hybrid cell) หรอื hybridomas เท่านัน้ท่ีสามารถเจรญิในสารอาหารนี้ได้• เซลล์ท่ีจะรอดชวีติใน HAT medium จะต้องมเีอ็นไซมท่ี์สำาคัญสองชนิดคือเอนไซมท่ี์ชื่อ Thymidine Kinase (TK) และเอ็นไซม์ Hypoxanthine Guanine Phoepnoribosyl Transferase (HPRT หรอื HGPRT)

การคัดเลือกเซลล์ลกูผสม (hybrid cell) หรอื hybridomas

เอ็นไซม ์Thymidine Kinase (TK) และเอ็นไซม ์ Hypoxanthine Guanine Phoepnoribosyl Transferase (HGPRT) มคีวามสำาคัญต่อการสรา้ง DNA

การสรา้ง DNA จะไมเ่กิดขึน้ถ้าเซลล์ขาดเอ็นไซมตั์วใดตัวหนึ่ง การนำาเอาเซลล์มะเรง็ท่ีไมม่เีอ็นไซม ์HGPRT ไปทำารวมกับเซลล์ปกติจากมา้มของหนูแล้วนำาไปเล้ียงใน HAT medium เซลล์ท่ีจะรอดชวีติอยูไ่ด้ก็คือ hybrids ระหวา่งเซลล์มะเรง็และเซลล์ปกติจากมา้มของหนูเท่านัน้

Hypoxanthine, Aminopterin และ Thymidine (HAT medium)Substrate Inhibitor Substrate

De novo DNA Synthesis Pathways

Savage pathway

Savage pathway

*Immortal B Tumour (Myeloma cells) จะให้คณุสมบติัของเซลล์มะเรง็ท่ีจะเจรญิเติบโตได้ดีในการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง* เซลล์ปกติจากมา้มของหนู (Plasma cells) จะให้คณุสมบติัในการสรา้งเอ็นไซม ์ HGPRT และคณุสมบติัให้การสรา้ง Ab

• เซลล์ปกติจากมา้มของหนูซึง่ไมไ่ด้รวมตัวกับ Immortal B Tumour จะตายไปเองตามภายหลังจาก fuse cell ท้ัง 2 ชนิดประมาณ 10-14 วนั สว่นเซลล์ Immortal B Tumour จะตายเน่ืองจากขาดเอ็นไซม ์HGPRT

* เซลล์ท่ีมชีวีติอยูใ่น HAT medium จะเป็น hybridoma cell เท่านัน้ ซึง่จะแบง่ตัวเป็น colony มองเห็นได้ด้วยตาเปล่าจากนัน้จงึนำาไปตรวจหา specific monoclonal antibody ต่อ Antigen a และ b ท่ีต้องการ ถ้า Colony ไหนให้ผลบวกก็จะยา้ย Colony นัน้ไปเล้ียงต่อใน media เพื่อเพิม่จำานวนให้มากขึน้

HGPRT+ TK+

TK+TK+

ไมส่ามารถมชีวีติอยูน่อกรา่งกาย ไมม่ี HGPRT

การทำา Cell cloning และการเพิม่ปรมิาณของ clone

การทำา Cell cloning เมื่อได้ colony ท่ีสรา้ง monoclonal antibodies ท่ีต้องการแล้ว อาจมกีารปนเปื้ อนของ colony อ่ืน ท่ีไมไ่ด้สรา้ง Ab ติดมา ดังนัน้จำาเป็นต้องคัดเลือกเอาเฉพาะ colony ท่ีต้องการเท่านัน้โดยใชว้ธิ ี•Limiting Dilution Technique ซึง่ทำาโดย

การเจอืจางเซลล์ให้มคีวามเขม้ขน้ท่ีต้องการแล้วเพาะเล้ียงลงใน tissue culture plate ชนิด 96 หลมุ โดยให้ความเขม้ขน้ของเซลล์แต่ละหลมุมปีรมิาณ 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 และ 0.25 cell ต่อหลมุ ตามลำาดับ •ทำาการเพาะเลี้ยงประมาณ 10-15 วนั เลือก

colony ท่ีเกิดขึน้ในหลมุ ท่ีระดับความเขม้ขน้ 1 cell/well และให้ผลบวกในการสาร Ab •เก็บเอา colony นัน้มาทำาการเพาะเลี้ยงและเพิม่

จำานวนเซลล์ต่อไป

Freeze in Liquid Nitrogen Tank and stored at -70C freezer.

For further use, dissolve hybridomas with nutrient media andculture them on flasks and allow them to grow.

Purification of Monoclonal AntibodiesSmall-Molecule-Based Affinity Chromatography Method for Antibody Purification

Take Home Message

1. Polyclonal vs Monoclonal Antibodies

2. Steps in producing MAbs

3. HAT selection