OTRAS TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

SISTEMA DE AMPLIFICACIÓN BASADO EN LA TRANSCRIPCIÓN, REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA

SISTEMA DE AMPLIFICACIÓN BASADO EN LA TRANSCRIPCIÓN

• TMA es un sistema de amplificación basado en la transcripción del ARN con dos enzimas para producir la reacción– ARN polimerasa– transcriptasa inversa (o reversa).

• TMA es isotérmica, toda la reacción se lleva a cabo a la misma temperatura en un baño de agua o bloque de calor.

• Esto está en contraste con otras reacciones de amplificación como la PCR o LCR que requieren un instrumento termociclador para cambiar rápidamente la temperatura para producir la reacción.

REACCIÓN EN CADENA DE LA LIGASA

• La técnica de la ligasa no está tan desarrollada y es más compleja que la de la polimerasa, además requiere mínimo 1000 fragmentos para poder amplificar, pero este mínimo es suficiente para su aplicación en el diagnóstico prenatal.

• La técnica se utiliza principalmente para el diagnóstico de enfermedades víricas y genéticas.

PROCESO DE LCR

• Cuatro cebadores se alinean en regiones inmediatamente adyacentes al molde.

• Dos de ellos se alinean con la cadena superior.• El segundo par de cebadores es

complementario del primero y se alinea con la cadena opuesta.

• La hibridación entre los cebadores se evita incluyendo ADN portador y una cola 3' en cebadores opuestos.

• Estos cebadores se mezclan con el molde y la ligasa termoestable, y se incuban a 95 °C durante 1 minuto para la desnaturalización, y a continuación a 65 °C durante 4 minutos, para la alineación del cebador y la ligazón.

• Los pasos de desnaturalización y alineación/ligazón se repiten 10-20 ciclos.

• Cuatro cebadores se alinean en regiones inmediatamente adyacentes al molde.

• Dos de ellos se alinean con la cadena superior.• El segundo par de cebadores es complementario

del primero y se alinea con la cadena opuesta.• La hibridación entre los cebadores se evita

incluyendo ADN portador y una cola 3' en cebadores opuestos.

• Los pasos de desnaturalización y alineación/ligazón se repiten 10-20 ciclos.

Estos cebadores se mezclan con el molde y la ligasa termoestable, y se incuban a 95 °C durante 1 minuto para la desnaturalización, y a continuación a 65 °C durante 4 minutos, para la alineación del cebador y la ligazón.

Proceso de amplificación de la reacción en cadena de la ligasa