Post on 05-Nov-2019
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING
ANTIBIOTICARESIDUEN IN GROENTEN
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Bioanalyse
Laboratorium voor Bromatologie
Academiejaar 2009-2010
ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VOOR DE OPSPORING VAN
ANTIBIOTICARESIDUEN IN GROENTEN VIA LC-MS/MS
Maaike DE PAUW
Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Dr. C. Van Poucke
Commissarissen Prof. C. Van Peteghem Dr. K. Van Uytfanghe
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
ONTWIKKELING VAN EEN METHODE VAN
ANTIBIOTICARESIDUEN IN GROENTEN
DANKWOORD
Deze thesis kon slechts tot stand komen dankzij
de hulp en steun van verschillende mensen. Bijzondere dank gaat uit naar mijn promotor en begeleider,
Dr. C. Van Poucke, voor het interessante onderwerp, de goede begeleiding en het kritisch verbeteren van de tekst.
Daarnaast ook een gemeend woord van dank aan de commissarissen, Prof. C. Van Peteghem en Dr. K. Van Uytfanghe,
voor het kritisch evalueren van de thesis. Bijkomend wil ik Prof. C. Van Peteghem en Prof. S. De Saeger
Bedanken voor het ter beschikking stellen van het laboratorium. Verder wil ik ook mijn medestudenten bedanken en
alle medewerkers van het laboratorium. Tenslotte wil ik mijn vrienden en familie bedanken
voor hun morele steun gedurende de voorbije maanden.
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING ........................................................................................................... 1
1.1. SITUERING ................................................................................................... 1
1.2. ANTIBIOTICA ................................................................................................ 1
1.2.1. Algemeen .......................................... ..................................................... 1
1.2.2. Werkingsmechanismen ............................... ......................................... 2
1.2.3. Resistentie ....................................... ...................................................... 4
1.3. DIERGENEESKUNDE .................................................................................. 6
1.3.1. Klassen antibiotica ............................... ................................................ 6
1.3.2. Coccidiostatica ................................... ................................................ 11
1.4. VOEDSELVEILIGHEID ............................................................................... 11
1.4.1. Prioriteren ....................................... ..................................................... 11
1.4.2. Wetgeving ......................................... ................................................... 12
1.4.3. Analysemethoden ................................... ............................................ 13
2. OBJECTIEVEN ....................................... ........................................................... 15
3. MATERIAAL EN METHODEN.............................. ............................................. 16
3.1. MATERIAAL ................................................................................................ 16
3.1.1. Antibiotica ....................................... .................................................... 16
3.1.2. Reagentia ......................................... .................................................... 17
3.1.3. Instrumenten ...................................... ................................................. 17
3.2. STANDAARD OPLOSSINGEN ................................................................... 17
3.2.1. Standaard stockoplossingen ........................ ..................................... 17
3.2.2. Tuneoplossingen ................................... ............................................. 18
3.2.3. Standaard mengsels ................................ ........................................... 18
3.3. UPLC-MS/MS .............................................................................................. 20
3.3.1. Principe .......................................... ...................................................... 20
3.3.2. Praktische uitvoering ............................. ............................................ 24
3.4. STAALVOORBEREIDING ........................................................................... 25
3.4.1. Extractie & clean-up experimenten ................. .................................. 25
3.4.2. Pre-validatie: inschatting gevoeligheid............ ................................. 28
3.4.3. Extra testen ...................................... ................................................... 30
3.4.4. Finale procedure voor extractie en clean-up ....... ............................. 30
3.5. VALIDATIE .................................................................................................. 30
3.5.1. Selectiviteit ..................................... ..................................................... 30
3.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvinding e n intra-lab
reproduceerbaarheid ............................... ...................................................... 31
4. RESULTATEN & DISCUSSIE ............................ ............................................... 33
4.1. TUNEN ........................................................................................................ 33
4.2. EXTRACTIE EN CLEAN-UP EXPERIMENTEN .......................................... 35
4.3. PRE-VALIDATIE.......................................................................................... 37
4.4. EXTRA TESTEN ......................................................................................... 38
4.5. VALIDATIE .................................................................................................. 39
4.5.1. Selectiviteit ..................................... ..................................................... 39
4.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvinding e n intra-lab
reproduceerbaarheid ............................... ...................................................... 40
4.5.3. Conclusie validatie ............................... .............................................. 47
4.6. VERDER ONDERZOEK .............................................................................. 48
5. CONCLUSIE ...................................................................................................... 49
6. LITERATUURSLIJST .................................. ...................................................... 51
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
4EACTC: 4epi-anhydro-chloortetracycline 4EAT: 4epi-anhydro-tetracycline 4ECTC: 4epi-chloortetracycline 4ET: 4epi-tetracycline ACN: Acetonitrille ACTC : Anhydro-chloortetracycline AHT: Anhydrotetracycline AMOX: Amoxicilline AMP: Amprolium API: Atmospheric pressure ionisation BAC: Bacitracine BEH: Bridged ethane hybrid COC: Coccidiostatica CTC: Chloortetracycline CV: Variatiecoëfficiënt CVr: Variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid CVR: Intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt DC: Doxycycline DHPS : Dihydropteroaat synthetase DIC: Diclazuril DIV: Diverse mengsel met macroliden, stretograminen, β-lactam antibiotica en polypeptiden DMC: Demeclocycline DMF: Dimethylformamide DMSO: Dimethylsulfoxide DNA: Desoxyribonucleïnezuur DNC: 4,4’-dinitrocarbanilide EDTA: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur ESI: Elektrospray ionisatie FA: Formic acid HLB: Hydrofiele-lipofiele balans HPLC: High performance liquid chromatography ICT: Isochloortetracycline LAS A : Lasalocid A LC: Liquid chromatography LOD: Detectielimiet LOQ: Kwantificatielimiet m/z: massa/lading MeOH: Methanol MON: Monensine MRL: Maximum residu limiet
MRM: Multiple reaction monitoring MRPL: Minimale vereiste prestatielimieten MS: Massaspectrometer N4AS: N4-acetyl-sulfamethazine NAR: Narasine NIC: Nicarbazine OTC: Oxytetracycline PBP: Penicilline bindende proteïnes PEN G: Penicilline G Q1: Quadrupool 1 Q2: Quadrupool 2 RNA: Ribonucleïnezuur SAL: Salinomycine SA : Sulfonamide SCP: Sulfachloropyridazine SDM: Sulfadimethoxine SDX: Sulfadoxine SDZ: Sulfadiazine SGD: Sulfaguanidine SIX: Sulfisoxazole SMP: Sulfamethoxypyridazine SMR: Sulfamerazine SMT: Sulfamethazine SMTX: Sulfamethoxazol SMZ: Sulfamethizol S/N: Signaal/ruis SPD: Sulfapyridine SPE: Solid phase extraction SPI: Spiramycine SQX: Sulfaquinoxaline STZ: Sulfathiazole TC: Tetracycline TRI: Trimethoprim TYL: Tylosine UPLC: Ultra performance liquid chromatography VGM: Virginiamycine
1
1. INLEIDING
1.1. SITUERING
Antibiotica worden intensief gebruikt bij dieren: therapeutisch of preventief om
infecties te bestrijden of als groeipromotor (Ungemach et al., 2006). Lage
hoeveelheden zorgen voor de selectie van antibioticaresistente stammen in het
milieu. Bovendien is er vaak onvolledige absorptie uit het gastro-intestinaal stelsel
waardoor antibiotica in de faeces en urine terechtkomen. Op deze manier komt
ongeveer 90% van bepaalde antibiotica onveranderd terecht in mest. In de landbouw
wordt mest universeel gebruikt op gewassen omwille van de voedingswaarde en als
manier om overtollige hoeveelheden kwijt te geraken. Alhoewel er richtlijnen zijn
omtrent bemesting in functie van de noden van de gewassen en de bodem, worden
deze toch niet altijd gevolgd. De aanwezige antibiotica in de mest zorgen voor
potentiële schade aan het milieu door resistentieontwikkeling en toxiciteit aan fauna
en flora (Kumar et al., 2005).
Veel gebruikte antibiotica zijn bijvoorbeeld tetracyclines, tylosine, sulfamethazine,
amprolium, monensine, virginiamycine, penicilline en nicarbazine. Ze blijven meestal
stabiel bij bewaren van de mest en komen zo op de gewassen terecht. Kumar et al.
(2005) toonde de opname van antibiotica, afkomstig van mest, door planten aan in
laboratoriumomstandigheden. Dit resultaat deed een aantal nieuw vragen rijzen
omtrent allergische reacties, toxische reacties, interacties en resistentieontwikkeling
na de consumptie van groenten, die antibiotica kunnen opnemen uit mest (Kumar et
al., 2005).
1.2. ANTIBIOTICA
1.2.1. Algemeen
Antibiotica worden geproduceerd door schimmels en bacteriën, als
verdedigingsmechanisme tegen andere bacteriën. Naast de natuurlijk geproduceerde
antibiotica zijn er ook een hele reeks synthetische en semisynthetische.
Antibacteriële middelen hebben ofwel een bactericide werking, zullen dus micro-
organismen doden, of zijn bacteriostatisch, waarbij de groei van micro-organismen
verhinderd wordt. (Blasco et al., 2007). Ze worden toegediend bij mensen en dieren
om een infectie te helpen bestrijden, door bacteriën te doden of hun groei te
verhinderen. Het organisme krijgt zo de kans afweermechanismen in gang te zetten
om bacteriën te elimineren en om
Antibiotica genezen de infectie zelf dus
versnellen.
1.2.2. Werkingsmechanismen
Antibiotica werken in op een specifieke target, een aangrijpingspunt dat enkel bij
de bacterie voorkomt en niet of onder een andere vorm bij de gastheer (mens of dier).
Zo zijn er 5 grote aangrijpingspunten (
eiwitsynthese, het celmembraan, de nucleïnezuursynthese en de foliumzuursynthese
(Tenover, 2006; Chander et al., 2007)
FIGUUR 1.1.: DE VERSCHILLENDE AANGRIJPINGSPUNTEN VAN ANTIBIOTICA.(http://microblog.me.uk/wp
1.2.2.1. Inhibitie van de celwandsynthese
Bacteriën bestaan uit een celwand, opgebouwd uit een complexe structuur van
verschillende soorten polymeren waaronder het peptidoglycaan die
en zorgt voor het behoud van de celwandstructuur
Peptidoglycaan bestaat uit lange repeterende ketens van aminosuikers met
afwisselend N-acetylglucosamine en N
β-(1,4)-glycosidische binding
verbonden met een stikstof van een korte aminozuurketen
1972).
verhinderen. Het organisme krijgt zo de kans afweermechanismen in gang te zetten
bacteriën te elimineren en om uiteindelijk te herstellen van een infectie.
Antibiotica genezen de infectie zelf dus niet, maar helpen om het genezingsproces te
Werkingsmechanismen
Antibiotica werken in op een specifieke target, een aangrijpingspunt dat enkel bij
de bacterie voorkomt en niet of onder een andere vorm bij de gastheer (mens of dier).
er 5 grote aangrijpingspunten (figuur 1.1.): de celwandsynthese, de
eiwitsynthese, het celmembraan, de nucleïnezuursynthese en de foliumzuursynthese
over, 2006; Chander et al., 2007).
FIGUUR 1.1.: DE VERSCHILLENDE AANGRIJPINGSPUNTEN VAN ANTIBIOTICA.http://microblog.me.uk/wp-content/uploads/Antibiotic_actions.jpg, 13
Inhibitie van de celwandsynthese
Bacteriën bestaan uit een celwand, opgebouwd uit een complexe structuur van
verschillende soorten polymeren waaronder het peptidoglycaan die
en zorgt voor het behoud van de celwandstructuur (Blumberg & Strominger, 1974)
Peptidoglycaan bestaat uit lange repeterende ketens van aminosuikers met
acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur, verbonden via
glycosidische bindingen. Elke N-acetylmuraminezuur is via een
verbonden met een stikstof van een korte aminozuurketen (Schleifer & Kandler,
2
verhinderen. Het organisme krijgt zo de kans afweermechanismen in gang te zetten
uiteindelijk te herstellen van een infectie.
niet, maar helpen om het genezingsproces te
Antibiotica werken in op een specifieke target, een aangrijpingspunt dat enkel bij
de bacterie voorkomt en niet of onder een andere vorm bij de gastheer (mens of dier).
1.1.): de celwandsynthese, de
eiwitsynthese, het celmembraan, de nucleïnezuursynthese en de foliumzuursynthese
FIGUUR 1.1.: DE VERSCHILLENDE AANGRIJPINGSPUNTEN VAN ANTIBIOTICA. content/uploads/Antibiotic_actions.jpg, 13-03-2010)
Bacteriën bestaan uit een celwand, opgebouwd uit een complexe structuur van
verschillende soorten polymeren waaronder het peptidoglycaan die de cel verstevigt
(Blumberg & Strominger, 1974).
Peptidoglycaan bestaat uit lange repeterende ketens van aminosuikers met
, verbonden via
een carboxylgroep
(Schleifer & Kandler,
3
Cross-linking tussen de verschillende ketens van aminosuikers gebeurt door de
korte aminozuurketens met behulp van een transpeptidase, een penicilline bindende
proteïne (PBP) (Blumberg & Strominger, 1974).
Eukaryoten hebben geen celwand, dus geen peptidoglycaan, hierdoor is de
synthese van het peptidoglycaan een geschikt aangrijpingspunt voor antibiotica.
Wanneer de biosynthese van peptidoglycaan verhinderd wordt, door het crosslinken
van peptidebindingen te voorkomen, wordt de celwand minder stevig, de cel lyseert
en de bacterie zal afsterven (Haggett & Wilson, 2008).
1.2.2.2. Inhibitie van de eiwitsynthese
Eiwitsynthese is universeel voorkomend en bestaat steeds uit een transcriptie-
en een translatiefase, met een initiatie-, elongatie- en terminatiestap, eventueel
gevolgd door verdere modificaties. Toch is er ook hier een goede target voor
antibiotica aangezien de structuur van de ribosomen, nodig voor de translatie,
varieert bij de verschillende organismen. Eukaryoten (zoals mens en dier) hebben
80S ribosomen, terwijl prokaryote organismen (bijvoorbeeld bacteriën) 70S
ribosomen hebben. Door in te werken op de subeenheden van 70S ribosomen kan
de intitiatie, elongatie of terminatie specifiek verhinderd worden. Wanneer er geen of
een onvolledig eiwit aangemaakt wordt, mist de bacterie essentiële onderdelen om te
overleven of te groeien (Haggett & Wilson, 2008).
1.2.2.3. Inhibitie van de nucleotidesynthese
De nucleïnezuursynthese kan geremd worden door de replicatie of de transcriptie
van DNA (desoxyribonucleïnezuur) te verhinderen. DNA-replicatie is de verdubbeling
van het DNA-materiaal voor de celdeling. Dit DNA wordt gedeeld onder de
dochtercellen. Omdat de inhibitie van de DNA-replicatie een weinig specifieke reactie
is zijn antibiotica die de DNA-replicatie remmen zeer toxisch en worden ze zo weinig
mogelijk gebruikt. Transcriptie is het ‘overschrijven’ van DNA naar RNA
(ribonucleïnezuur) voor de aanmaak van messenger-RNA, ribosomaal-RNA of
transport-RNA. Deze moleculen spelen een rol bij de eiwitsynthese. Door een
inhibitie van de transcriptie wordt ook de eiwitsynthese geïnhibeerd (Haggett &
Wilson, 2008).
4
1.2.2.4. Inhibitie van de foliumzuursynthese
Remming van de foliumzuursynthese zorgt voor de inhibitie van de
nucleotidensynthese, aangezien foliumzuur een belangrijke bouwsteen is voor de
aanmaak van nucleotiden. Inhibitie van de foliumzuursynthese is specifiek omdat
zoogdieren in staat zijn foliumzuur op te nemen via de voeding, terwijl mirco-
organismen zoals bacteriën deze volledig zelf moeten aanmaken. Afhankelijk van het
type antibioticum kan een verschillende stap in de synthese aangepakt worden
(Haggett & Wilson, 2008).
1.2.2.5. Beschadiging van het celmembraan
Het celmembraan is opgebouwd uit een fosfolipidedubbellaag met daarin
negatief geladen fosfaatgroepen. Antibiotica met positief geladen aminogroepen
kunnen hieraan elektrostatisch binden. Hierdoor worden Ca+ en Mg2+ moleculen die
de fosfolipiden stabiliseren verplaatst. De permeabiliteit wordt verstoord, nutriënten
ontsnappen en de bacterie sterft af. Antibiotica die inwerken op het celmembraan
hebben als nadeel dat ze weinig specifiek zijn. Eukaryote cellen hebben namelijk een
celmembraan met gelijkaardige samenstelling. Als gevolg van mogelijke toxiciteit
worden deze antibiotica zoveel mogelijk vermeden (Haggett & Wilson, 2008).
1.2.3. Resistentie
Resistentie is de eigenschap van bepaalde bacteriën om ongevoelig te worden
voor bepaalde antibiotica. Als het aangrijpingspunt ontbreekt, spreken we van
natuurlijke resistentie. Anders is er sprake van verworven resistentie, zoals
geïllustreerd in figuur 1.2. Verworven resistentie kan chromosomaal ontstaan bij een
mutatie in een bepaalde stam, gevolgd door selectie waarbij niet-gemuteerde
bacteriën afsterven, terwijl gemuteerde overleven. Er is dan sprake van verticale
evolutie (McDermott et al., 2002; Bennett, 2008).
Resistentie kan ook extrachromosomaal verworven worden. Nieuw genetisch
materiaal wordt van een ander micro-organisme overgedragen. Dit is de horizontale
gentransfer. Plasmiden kunnen resistentie overdragen via conjugatie, transductie of
transformatie. Een andere mogelijkheid is de transpositie van transposons, korte
stukjes DNA die op een chromosoom of een plasmide kunnen verspringen.
Door deze genetische uitwisseling is het mogelijk dat een bacterie resistent wordt
tegen verschillende klassen van antibiotica
contact gekomen zijn. Een bacterie kan zo multiresistent worden
2002; Bennett, 2008).
FIGUUR 1.2.: VERWORVEN RESISTENTIE OMWILLE VAN SELECTIEVE DRUK BIJ BACTERIËN.
1.2.3.1. Mechanismen
Er zijn uiteenlopende mechanismen voor verworven resistentie. Als eerste is er
de enzymatische inactivatie of modificatie van het antibioticum, waardoor het niet
meer in staat is in te werken op een target
kan de antibioticaconcentratie verminderd worden door een verworven effluxpomp,
het antibioticum wordt dan continu naar buiten gepompt. Analoog resultaat wordt
bekomen door gewijzigde permeabiliteit bij downregulatie van porines
antibioticum kan niet opgenome
opname, aanwezig zijn. Op deze manier kan de intracellulaire target niet bereikt
worden. Gewijzigd metabolisme zorg
het antibioticum heeft zo geen target
andere mogelijkheid is overproducti
overmaat aan targets waarbij het antibioticum overrompeld
uitmaakt. Vaak komen verschillende mechanisme
2002; Tenover, 2006).
Door deze genetische uitwisseling is het mogelijk dat een bacterie resistent wordt
illende klassen van antibiotica en antibiotica waar ze
contact gekomen zijn. Een bacterie kan zo multiresistent worden (McDermott et al.,
VERWORVEN RESISTENTIE OMWILLE VAN SELECTIEVE DRUK BIJ BACTERIËN. (McDermott et al., 2002)
Er zijn uiteenlopende mechanismen voor verworven resistentie. Als eerste is er
de enzymatische inactivatie of modificatie van het antibioticum, waardoor het niet
te werken op een target en de bacterie ongehinderd blijft. Verder
ntibioticaconcentratie verminderd worden door een verworven effluxpomp,
het antibioticum wordt dan continu naar buiten gepompt. Analoog resultaat wordt
bekomen door gewijzigde permeabiliteit bij downregulatie van porines
antibioticum kan niet opgenomen worden omdat er te weinig porines, kanalen voor
opname, aanwezig zijn. Op deze manier kan de intracellulaire target niet bereikt
ewijzigd metabolisme zorgt voor een verandering in het aangrijpingspunt,
et antibioticum heeft zo geen target meer om op in te werken, dus geen effect
overproductie van de target door een bypass.
overmaat aan targets waarbij het antibioticum overrompeld wordt en zijn effect weinig
uitmaakt. Vaak komen verschillende mechanismen tegelijk voor (McDermott et al.,
5
Door deze genetische uitwisseling is het mogelijk dat een bacterie resistent wordt
en antibiotica waar ze zelfs niet mee in
(McDermott et al.,
VERWORVEN RESISTENTIE OMWILLE VAN SELECTIEVE DRUK BIJ BACTERIËN.
Er zijn uiteenlopende mechanismen voor verworven resistentie. Als eerste is er
de enzymatische inactivatie of modificatie van het antibioticum, waardoor het niet
en de bacterie ongehinderd blijft. Verder
ntibioticaconcentratie verminderd worden door een verworven effluxpomp,
het antibioticum wordt dan continu naar buiten gepompt. Analoog resultaat wordt
bekomen door gewijzigde permeabiliteit bij downregulatie van porines. Het
te weinig porines, kanalen voor
opname, aanwezig zijn. Op deze manier kan de intracellulaire target niet bereikt
ndering in het aangrijpingspunt,
om op in te werken, dus geen effect. Een
e van de target door een bypass. Er ontstaat een
en zijn effect weinig
(McDermott et al.,
6
1.2.3.2. Gevolgen
Wanneer antibiotica aan een lage concentratie toegediend worden, is er een
selectieve druk waardoor er resistentie ontstaat door wijzigingen in het DNA.
Bepalende factoren hierbij zijn doel, dosis, duur, toedieningsweg en
resistentiemechanisme van de bacterie. Door het overdreven gebruik van antibiotica
is er een versnelde ontwikkeling van resistentie. Die verhoogde tolerantie maakt het
moeilijker om bepaalde ziekten te bestrijden, het duurt langer om een bacterie te
isoleren en om de antibioticasusceptibiliteit te bepalen. Aangezien antibioticagebruik
een belangrijke hoeksteen is in de moderne geneeskunde kan een ziekte fataal
worden wanneer de behandelingsmogelijkheden uitgeput raken en bovendien is de
ontwikkeling van alternatieven duur (McDermott et al., 2002; Chander et al., 2007).
1.3. DIERGENEESKUNDE
1.3.1. Klassen antibiotica
Strikt genomen zijn er 5 klassen van antibiotica: β-lactam antibiotica,
tetracyclines, macroliden, aminoglycosiden en amfenicolen. Daarnaast wordt de term
antibiotica ook vaak gebruikt voor antibacteriële, gesynthetiseerde geneesmiddelen
(bijvoorbeeld sulfonamiden) of substanties met een hoog moleculair gewicht
(bijvoorbeeld polypeptide antibiotica) (Blasco et al., 2007). Chemisch
gesynthetiseerde antibiotica worden ook chemotherapeutica genoemd. Voor de
bespreking van een aantal klassen beperken we ons tot de antibiotica die relevant
zijn voor het onderzoek.
1.3.1.1. β-lactam antibiotica
β-lactam antibiotica zijn een uitzonderlijke groep antibiotica met een breed
spectrum en weinig toxiciteit voor dieren. Ze hebben een kenmerkende β-lactam ring
(figuur 1.3.) met daarop zijketens die van belang zijn voor chemische modificaties,
zoals bijvoorbeeld resistentie tegen β-lactamase enzymen die de β-lactam afbreken
(Blumberg & Strominger, 1974). Ze zijn bactericide door een inhibitie van de
celwandsynthese (Tenover, 2006; Haggett & Wilson, 2008). Resistentie wordt
veroorzaakt door een β-lactamase die de β-lactamring opent met verlies van
bactericide activiteit, of door een gewijzigd PBP met lagere affiniteit voor de β-lactam
antibiotica (Li et al., 2007).
7
β-lactam antibiotica worden natuurlijk geproduceerd in schimmels. Penicillines
worden geproduceerd door Penicillum spp. en hebben goede activiteit tegen gram-
positieve bacteriën, uitgezonderd bepaalde Staphylococcus spp. Ze werken minder
tegen gram-negatieve bacteriën (Haggett & Wilson, 2008).
FIGUUR 1.3.: STRUCTUUR VAN PENICILLINE G (LINKS) MET KENMERKENDE Β-LACTAMRING (RECHTS).
1.3.1.2. Tetracyclines
Tetracyclines, die kenmerkend opgebouwd zijn uit vier partieel geconjugeerde
ringen met een carboxyamide als functionele groep (figuur 1.4.), binden reversibel op
de 30S subeenheid van het ribosoom. Zo inhiberen ze de vorming van het
inititatiecomplex bij de eiwitsynthese. Ze zijn bacteriostatisch tenzij bij hoge dosissen
(Haggett & Wilson, 2008). Resistentie wordt bekomen door een effluxpomp (Tenover,
2006). Tetracyclines zijn werkzaam tegen zowel gram-positieve als gram-negatieve
bacteriën, op enkele uitzonderingen na zoals Pseudomonas spp. en Proteus spp.
(Haggett & Wilson, 2008). Ze worden natuurlijk geproduceerd door Streptomyces spp.
(Zakeri & Wright, 2008). Wanneer tetracyclines blootgesteld worden aan extreme
condities van warmte, pH of vochtigheid, vormen ze degradatieproducten omwille
van epimerisatie aan C4. Extreem zure of basische condities veroorzaken
respectievelijk anhydro- of isotetracyclinevorming (figuur 1.4.), die ook epimerisatie
aan C4 kunnen ondergaan. Deze producten hebben lage antibacteriële activiteit en
sommige zijn toxisch (Monser & Darghouth, 2000; Spisso et al., 2009).
FIGUUR 1.4.: ALGEMENE STRUCTUUR VAN TETRACYCLINES (MIDDEN), ANHYDROTETRACYCLINE (LINKS) EN ISOTETRACYCLINES (RECHTS).
8
1.3.1.3. Sulfonamiden
Sulfonamiden zijn synthetische geneesmiddelen met een sulfonamide als
functionele groep, een sulfongroep met een zwavelatoom is hierbij gekoppeld op een
amidefunctie (figuur 1.5.). Het zijn competitieve inhibitoren van dihydropteroaat
synthetase (DHPS), een enzym dat tussenkomt bij de foliumzuurproductie. Dit
verklaart ook hun selectiviteit: DHPS komt enkel voor bij bacteriën, aangezien
zoogdieren in staat zijn foliumzuur op te nemen uit hun voeding. Sulfonamiden
verhinderen dus de werking van bacteriën via een inhibitie van de
foliumzuursynthese en zo ook de DNA-synthese (Skold, 2000).
Wanneer sulfonamiden alleen gebruikt worden hebben ze bacteriostatische
activiteit, in combinatie met diaminopyrimidines zoals trimethoprim (figuur 1.6.)
werken ze synergistisch met bactericide effect tot gevolg. Trimethoprim inhibeert
dihydrofolaatreductase, een ander enzym dat de foliumzuursynthese katalyseert
(Skold, 2000; Haggett & Wilson, 2008). Sulfonamiden worden synthetisch
aangemaakt, ze hebben een breedspectrum tegen gram-positieve en -negatieve
bacteriën. Pseudomonas spp., Mycoplasma spp. en Klebsiella spp. zijn echter
resistent (Haggett & Wilson, 2008).
FIGUUR 1.5.: STRUCTUUR VAN SULFAGUANIDINE, FIGUUR 1.6.: STRUCTUUR VAN DE MET KENMERKENDE SULFONAMIDEGROEP. DIAMINOPYRIMIDINE: TRIMETHOPRIM. 1.3.1.4. Macroliden
Macroliden hebben een macrocyclische lactonring (figuur 1.7.) met 14, 15 of 16
atomen die via glycosidische bindingen gebonden zijn op suikers (McGlinchey et al.,
2008). Ze binden reversibel op de 50S subeenheid van het ribosoom, bijgevolg is er
geen transpeptidatie, geen translocatie en onvolledige proteïnesynthese. Macroliden
zijn bactericide bij hoge dosissen (Haggett & Wilson, 2008). Resistentie wordt
veroorzaakt door modificatie van de target door methylatie of mutatie, door een
effluxpomp of door wijziging van de macrolide (Jindal et al., 2006). Ze hebben betere
activiteit tegen gram-positieve en aërobe bacteriën, dan tegen gram-negatieven of
9
anaëroben (Haggett & Wilson, 2008). Biosynthese gebeurt door polyketide
synthetasen die te vinden zijn in bacteriën, schimmels en planten (Park et al., 2010).
Macroliden worden aangemaakt door Streptomyces spp. (Lee & Rho, 1999).
FIGUUR 1.7.: TYLOSINE, EEN MACROLIDE MET TYPISCHE MACROCYCLISCHE LACTONRING.
1.3.1.5. Polypeptiden
Polypeptiden, zoals bijvoorbeeld bacitracine (figuur 1.8.), zijn verbindingen die
bestaan uit verschillende peptidenketens (Wan et al., 2006). Ze verhinderen de
celwandsynthese. Bacteriën van het genus Bacillus produceren polypeptiden zoals
bacitracine (Jamil et al., 2007). Het spectrum voor bacitracine omvat gram-positieve
aërobe en anaërobe bacteriën (http://www.cbip-vet.be/, 25-03-2010).
FIGUUR 1.8.: STRUCTUUR VAN BACITRACINE A, EEN POLYPEPTIDE ANTIBIOTICUM.
1.3.1.6. Streptogramine
De streptograminen bestaan uit twee groepen: polyonverzadigde macrolactonen
en cyclische hexadepsipeptides. De twee groepen werken synergistisch om de
eiwitsynthese te verhinderen gedurende de translatie. Een effluxpomp of inactivatie
van de streptogramine veroorzaakt resistentie (Barriere et al., 1998).
10
Streptograminen (bijvoorbeeld quinupristin/dalfopristin) zijn belangrijke antibiotica
bij de bestrijding van vancomycine-resistente enterococcus, die ernstige infecties
veroorzaakt in ziekenhuizen. Het gebruik van de streptogramine virginiamycine
(figuur 1.9.) in de landbouw werd verboden omdat het de efficiëntie van
quinupristin/dalfopristin verlaagt. Virginiamycine zorgt voor de ontwikkeling van
streptogramine resistente enterococcus bij dieren die overgedragen kan worden op
E. faecium bij gehospitalisserde patiënten (Smith et al., 2003). Streptogramines
worden gesynthetiseerd in de Streptomyces spp. De voornaamste targets zijn
S. pneumonae, S. aureus en E. faecium (Barriere et al., 1998).
FIGUUR 1.9.:VIRGINIAMYCINE M1-STRUCTUUR
1.3.1.7. Gebruik
Antibiotica kunnen therapeutisch of metafylactisch gebruikt worden bij dieren en
uitzonderlijk profylactisch. Gewoonlijk worden antibiotica oraal toegediend (80%) via
voeder of drinkwater, waardoor dieren in groep behandeld kunnen worden.
Individuele toediening via injectie komt in minder dan 20% van de gevallen voor
(Ungemach et al., 2006). Bij gebruik als voederadditief in lage dosis wordt de groei
bevorderd, er zijn minder kosten en dieren worden sneller verkocht (Boxall & Long,
2005). Er zijn verschillende mogelijke verklaringen voor de groeibevorderende
werking van antibiotica: vermindering van subklinische infecties, vorming van
groeideprimerende microbiële metabolieten wordt gereduceerd, minder verbruik van
nutriënten door bacteriën en verhoogde opname van nutriënten door de dunne
darmwand (Kumar et al., 2005).
11
1.3.2. Coccidiostatica
1.3.2.1. Coccidiose
Coccidiose is een infectieuze ziekte veroorzaakt door protozoa van het geslacht
Eimeria of Isospora. Deze protozoa verblijven het grootste deel van hun leven in de
intestinale tractus van de gastheer, het dier. Ze zullen snel vermenigvuldigen,
oöcysten vormen die met de ontlasting in het milieu komen. Zo dragen ze bij tot een
vicieuze cirkel van besmetting, wanneer een ander dier in contact komt met de
besmette faeces. In de darm zullen de protozoa de darmcellen beschadigen, er
ontstaat diarree en groei wordt verhinderd, met bijhorende economische gevolgen
(Dubreil-Cheneau et al., 2009; Olejnik et al., 2009).
1.3.2.2. Gebruik
Er zijn twee belangrijke klassen van coccidiostatica: natuurlijk geproduceerde
ionofore polyether antibiotica (door Streptomyces spp.) en chemisch
gesynthetiseerde coccidiostatica. Coccidiostatica worden gebruikt als voederadditief,
om coccidiose te voorkomen of te genezen. Door de snelle verspreiding van de
protozoa kunnen de economische verliezen bij een uitbraak van coccidiose hoog
oplopen, daarom is voorkomen beter dan genezen. Vooral bij intensieve landbouw is
dit belangrijk, omdat daar de verliezen veel groter zullen zijn. Dit verklaart waarom
coccidiospreventie- en bestrijding heel belangrijk is bij pluimveebedrijven (Dubreil-
Cheneau et al., 2009; Olejnik et al., 2009).
1.4. VOEDSELVEILIGHEID
1.4.1. Prioriteren
Het is moeilijk om informatie te verzamelen over het gebruik van individuele
veterinaire geneesmiddelen in de landbouw, dit bemoeilijkt ook het opstellen van
experimentele studies. Men gaat beroep doen op gegevens omtrent verkoop en
gebruik van verschillende chemische klassen van geneesmiddelen. Op basis hiervan
werd bepaald dat antibiotica en coccidiostatica de meest verkochte klassen van
veterinaire geneesmiddelen zijn. In het Verenigd Koninkrijk werden prioriteiten
toegekend aan de verschillende geneesmiddelklassen, rekening houdend met
informatie over hoeveelheden, verspreiding in de omgeving en metabolisme om zo
12
de veterinaire geneesmiddelen te bepalen die een grote kans hebben om in het
milieu terecht te komen en toxiciteit te veroorzaken (Boxall et al., 2003). Op basis
hiervan hebben wij bepaalde veterinaire geneesmiddelen gekozen uit volgende
antibioticagroepen om verder te onderzoeken in groenten: tetracyclines,
sulfonamiden, coccidiostatica, β-lactam antibiotica, macroliden, polypeptide
antibiotica en streptograminen.
1.4.2. Wetgeving
Omtrent antibioticaresiduen in planten is er momenteel nog geen wetgeving, voor
dierlijke producten zijn er echter wel wettelijke bepalingen. In dierlijke producten,
afkomstig van dieren die behandeld werden met bepaalde geneesmiddelen, vindt
men vaak residuen van veterinaire geneesmiddelen terug. Residuen zijn
farmacologisch actieve bestanddelen, omzettingproducten of andere substanties die
op dierlijke producten kunnen worden overgedragen en potentieel schadelijk zijn voor
de mens. Volgens richtlijn 96/23/EG van de Europese Gemeenschap worden
residuen en substanties in 2 groepen ingedeeld. Groep A zijn stoffen met anabolisch
effect en niet-geautoriseerde substanties. In groep B zitten contaminanten en
veterinaire geneesmiddelen, waaronder ook antibacteriële middelen (Europese
Gemeenschap, 1996).
Maximum residu limieten (MRL’s) werden voor dierlijke producten (bijvoorbeeld
vlees, eieren, melk) vastgelegd in verordening 470/2009/EG. Dit zijn maximale
residugehalten, afkomstig van het gebruik van veterinaire geneesmiddelen, die in
voedingsproducten mogen voorkomen, uitgedrukt in ppb (µg/kg) (Europese
Gemeenschap, 2009). Sinds 1996 zijn er in alle lidstaten van de Europese Unie
richtlijnen (96/23/EG) voor het opsporen van residuen en stoffen in dierlijke weefsels,
producten, voeders en drinkwater (Europese Gemeenschap, 1996). Om ervoor te
zorgen dat de MRL niet overschreden wordt moet er volgens richtlijn 2001/82/EG ook
rekening gehouden worden met de wachttijd. Dit is de tijd die moet verstrijken tussen
de laatste toediening van het veterinair geneesmiddelen en het slachten van het dier
voor consumptie, of de periode waarin melk, eieren en honing niet mogen gebruikt
worden (Europese Gemeenschap, 2001).
13
Vereisten voor de analysemethoden van dierlijke producten en de interpretatie
van de resultaten werden vastgelegd door de Europese Gemeenschap in richtlijn
2002/657/EG. Hoewel deze niet rechtstreeks van toepassing zijn voor de methode
voor planten zullen een aantal criteria uit deze richtlijn gebruikt worden voor de
validatie van de methode voor planten. (Europese Gemeenschap, 2002).
1.4.3. Analysemethoden
Er zijn gevoelige en specifieke methodes nodig om voedingsmiddelen te
controleren op antibioticaresiduen. Vroeger werd de analyse in verschillende stappen
onderverdeeld: screening, post-screening en confirmatie. Screening gebeurde via
een microbiologische inhibitietest van microtiter plaatjes, gevolgd door kwantificatie
en confirmatie met klasse-specifieke LC-methoden. Om het proces te versnellen ging
men op zoek naar een methode waarbij in één stap meerdere klassen van residuen
kunnen worden bepaald. Tegenwoordig wordt de massaspectrometer met single of
triple quadrupool algemeen gebruikt voor de detectie van antibioticaresiduen in
voedsel door voedselveiligheidsagentschappen, aangezien identificatie en
kwantificatie mogelijk is bij zeer lage concentraties (Aguilera-Luiz et al., 2008;
Gaugain-Juhel et al., 2009; Granelli et al., 2009).
Er zijn vier belangrijke analytische risicopunten voor multi-residu, multi-klasse
analyses: we werken met een grote hoeveelheid componenten, van verschillende
antibioticaklassen, bij zeer lage concentraties (ppb) en in complexe matrices (Blasco
et al., 2007). De condities voor het experiment moeten zorgvuldig gekozen worden
aangezien we werken met antibiotica met zeer verschillende fysicochemische
eigenschappen. Hierbij zal er een compromis moeten gesloten worden, dit wil
zeggen dat de condities niet altijd optimaal zullen zijn voor alle componenten, maar
wel zo optimaal mogelijk moeten zijn (Gros et al., 2006).
Door Chico et al. (2008) werd een methode beschreven voor de multi-residu,
multi-klasse analyse van 39 antibiotica in spierweefsel van kippen met UPLC (Ultra
performance liquid chromatography) gekoppeld aan een triple quadrupool
massaspectrometer. Onder andere tetracyclines, sulfonamiden, diaminopyrimidine-
derivaten, macroliden en β-lactam antibiotica werden onderzocht. Extractie gebeurde
met MeOH/H2O 70/30 (v/v), zonder clean-up fase en scheiding gebeurde op een
reversed phase kolom met ACN/H2O als mobiele fase. De ingestelde gradiënt moest
14
ervoor zorgen dat de componenten binnen korte tijd achtereenvolgens elueren. MS-
parameters werden getuned door de infusie van standaard oplossingen in ACN
(Chico et al., 2008).
Bohm et al. (2009) maakte methode voor de analyse van 47 substanties van
verschillende antibioticaklassen (o.a. tetracyclines, sulfonamiden, macroliden en
diaminopyrimidinederivaten) in melk met HPLC (high performance liquid
chromatography) gekoppeld met MS (massaspectrometer). De stalen werden
onderworpen aan solid phase extraction (SPE) met Oasis HLB kolommen, die eerst
bevochtigd en geconditioneerd werden met respectievelijk MeOH en H2O. Na elutie
met MeOH werden de stalen drooggedampt bij 40°C ond er N2 (Bohm et al., 2009).
Granelli et al. (2009) valideerde een LC-MS/MS screening methode voor
verschillende antibioticaklassen in spierweefsel (o.a. tetracyclines, sulfonamides, β-
lactams en macroliden). Aan 3 g staal werd EDTA toegevoegd, vervolgens werd het
staal belast en geëxtraheerd met 70% MeOH. Centrifugeren gebeurde gedurende 5
min bij 3800 g en het extract werd verder verdund in H2O om te analyseren (Granelli
et al., 2009).
Een multiresidu LC-MS/MS methode voor de bepaling van coccidiostatica in
kippenlever werd beschreven door Olejnik et al. (2009). Extractie gebeurde met ACN,
gevolgd door clean-up met OASIS HLB SPE. De componenten werden gescheiden
op een fenylhexyl kolom met een gradiënt met MeOH, ACN en ammonium formaat.
Twee fragment ionen werden onderzocht voor validatie (Olejnik et al., 2009).
Ferraz Spisso et al. (2009) werkte een gevalideerde methode uit voor de
bepaling van verschillende tetracyclines in melk. Oxytetracycline, tetracycline en
chloortetracycline hebben dezelfde moleculaire massa als hun 4-epimeervorm,
daarom was een scheiding met gradiënt in de HPLC noodzakkelijk (Spisso et al.,
2009).
15
2. OBJECTIEVEN
In laboratoriumomstandigheden werd reeds aangetoond dat antibiotica via de
mest opgenomen worden door planten (Kumar et al., 2005). In het licht van de
voedselveiligheid is het noodzakelijk om na te gaan of het ook in reële
omstandigheden voorkomt en of dit een probleem vormt voor de volksgezondheid.
De aanwezigheid van antibioticaresiduen in groenten zorgt er immers voor dat de
mens door consumptie van groenten kan blootgesteld worden aan antibiotica. Op die
manier kunnen hypersensitieve mensen allergische reacties ontwikkelen, toxische
producten kunnen ontstaan door de interactie tussen bepaalde antibiotica en
resistentie tegen antibiotica neemt toe door de voortdurende blootstelling aan lage
concentraties van antibiotica.
Het doel van de thesis is het ontwikkelen van een methode om antibiotica in
groenten te analyseren. Aan de hand van deze methode kan later gecontroleerd
worden of antibioticaresiduen in reële omstandigheden voorkomen in groenten en in
welke concentraties. Verder kan dan in functie van de gedetecteerde concentraties
en het consumptiepatroon vastgesteld worden of er MRL waarden dienen te worden
bepaald.
Voor de analyse van voedsel gaan we op zoek naar een procedure die gebruik
gemaakt van UPLC/MS-MS in MRM-mode. Omwille van de matrix van groenten, die
mogelijk interfererend is, volgt er na extractie een clean-up stap. Er worden
verschillende antibiotica uit verschillende klassen gebruikt in de diergeneeskunde,
daarom is er het meest baat bij één methode die tegelijk verschillende residuen van
verschillende klassen antibiotica bepaalt. Bovendien willen we de antibiotica ook
kwantificeren, wat belangrijk is voor mogelijk toekomstige wetgeving voor maximale
residugehalten van antibiotica in groenten.
De methode moet gevalideerd worden om na te gaan of de gevonden resultaten
juist en precies zijn en of de methode algemeen toepasbaar is. De LOD en de LOQ
geven een indicatie van de gevoeligheid van de methode, de terugvinding geeft een
beeld van de juistheid, de intralaboratoriumreproduceerbaarheid en de
herhaalbaarheid weerspiegelen de precisie. De selectiviteit toont tenslotte aan of de
methode algemeen toepasbaar is op verschillende matrices.
16
3. MATERIAAL EN METHODEN
3.1. MATERIAAL
3.1.1. Antibiotica
3.1.1.1. Sulfonamiden
Sulfaguanidine (SGD), sulfapyridine (SPD), sulfadiazine (SDZ), sulfathiazole
(STZ), sulfamerazine (SMR), sulfamethizol (SMZ), sulfamethazine (SMT),
Sulfamethoxypyridazine (SMP), sulfachloropyridazine (SCP), sulfisoxazole (SIX),
Sulfamethoxazol (SMTX), N4-acetyl-sulfamethazine (N4AS), sulfaquinoxaline (SQX),
sulfadimethoxine (SDM) worden aangekocht bij Sigma Alderich (Steinheim,
Duitsland). Verder wordt sulfadoxine (SDX) in 5:1 verhouding in combinatie met
trimethoprim (TRI), een diaminopyrimidinederivaat, bij Sigma Alderich (Steinheim,
Duitsland) aangekocht.
3.1.1.2. Tetracyclines
De tetracyclines: 4epi-tetracycline (4ET), demeclocycline (DMC), 4epi-
chloortetracycline (4ECTC), isochloortetracycline (ICT), anhydrotetracycline (AHT),
doxycycline (DC), 4epi-anhydro-tetracycline (4EAT), anhydro-chloortetracycline
(ACTC), 4epi-anhydro-chloortetracycline (4EACTC), oxytetracycline (OTC),
chloortetracycline (CTC) en tetracycline (TC) zijn afkomstig van Sigma Alderich
(Steinheim, Duitsland).
3.1.1.3. Coccidiostatica
Amprolium (AMP), monensine (MON), nicarbazine (NIC), lasalocid A (LAS A),
diclazuril (DIC), narasine (NAR) en salinomycine (SAL) worden allemaal gekocht bij
Sigma Alderich (Steinheim, Duitsland).
3.1.1.4. Diverse
Het diverse mengsel bestaat uit de β-lactam antibiotica amoxicilline (AMOX) en
penicilline G (PEN G), de macroliden spiramycine (SPI) en tylosine (TYL), de
polypeptide bacitracine (BAC) en tenslotte de streptogramine virginiamycine (VGM).
Eveneens worden ze aangekocht bij Sigma Alderich (Steinheim, Duitsland).
17
3.1.2. Reagentia
Methanol (MeOH) hipersolve chromanorm van VWR (Leuven, België) wordt
gebruikt, uitgezonderd voor de bereiding van mobiele fase: methanol LC-MS
Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Verder worden dimethylformamide (DMF) van
Acros (Geel, belgië), acetonitrille (ACN) HPLC R van Biosolve (Valkenswaard,
Nederland), formic acid (FA) van Fluka (Neu-Ulm, Zwitserland), azijnzuur van Merck
(Darmstadt, Duitsland), Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) van Fluka (Buchs,
Zwitserland) en dimethylsulfoxide (DMSO) van Vel (Leuven, België) gebruikt. Het
water (H2O) wordt gedeïoniseerd en gedestilleerd met een Milli Q apparaat voor
waterzuivering (Millipore, Billerica, VS).
3.1.3. Instrumenten
Analyses worden uitgevoerd op een Acquity UPLC van Waters (Milford,VS),
gekoppeld aan een Quattro premier XE massaspectrometer van Waters (Milford,VS).
Er wordt gebruik gemaakt van een BEH (Bridged Ethane Hybrid) C18-kolom (2,1 x
100; 1,7 µm) van Waters (Milford, VS). Het verwerken van de data gebeurt met
Masslynx-software van Waters (Milford, VS). Voor SPE worden C18 (GracePure,
500 mg, 6 mL, Discovery science, Deerfield, VS) en OASIS HLB (200 mg, 6 mL,
Waters, Milford, VS) kolommen aangekocht. Bij het ultracentrifugeren worden cupjes
gebruikt met 0,22 µm filter van Millipore (Billerica, VS).
3.2. STANDAARD OPLOSSINGEN
3.2.1. Standaard stockoplossingen
Standaard stockoplossingen worden gemaakt met concentraties en solventen
afhankelijk van hun oplosbaarheid (tabel 3.1.). Alle oplossingen worden bewaard in
het donker in de diepvriezer bij een temperatuur van -20°C, uitgezonderd NIC wordt
bewaard bij kampertemperatuur, omdat de standaard oplossing in DMSO gemaakt
wordt. De tetracyclines en VGM moeten zoveel mogelijk afgeschermd worden
omwille van hun degradatie onder invloed van licht.
18
TABEL 3.1.: STANDAARD STOCKOPLOSSINGEN
concentratie solvent antibioticum
5 mg/mL MeOH SDXa
3 mg/mL MeOH PEN G, AMP, MON, SAL, 4ET, DMC, 4ECTC, ICT, AHT, DC, 4EAT, ACTC, 4EACTC, OTC, TC
3 mg/mL DMF DIC 1,5 mg/mL MeOH CTC
1 mg/mL MeOH SGD, SPD, SDZ, STZ, SMR, SMZ, SMT, SMP, SCP, SFX, SDM, N4AS, SQX, SMTX, TRIa, SPI, BAC, TYL
1 mg/mL ACN/H2O (50/50 v/v) AMOX 0,5 mg/mL MeOH VGM, NAR 0,5 mg/mL DMSO NIC 100 ng/µL ACN LAS Ab
aTRI wordt aangekocht in 1:5 verhouding met SDX, we maken hiervan een stockoplossing met 1 mg/mL TRI en 5 mg/mL SDX in MeOH. bLAS A wordt aangekocht in een oplossing van 100 ng/µL in ACN.
3.2.2. Tuneoplossingen
Vertrekkende van de stockoplossingen uit 3.2.1. (tabel 3.1.) wordt een
verdunning gemaakt van 10 ng/µL in MeOH. Voor een stockoplossing van 3 mg/mL
brengen we 10 µL over in een proefbuis en lengen aan met 2990 µL MeOH. Deze
verdunning gebruiken we vervolgens voor de aanmaak van de tuneoplossing.
Hiervoor wordt 100 µL verdunning in een proefbuis met 900 µL ACN met 0,3% FA
gedaan, om de gevoeligheid in de positieve elektrospray ionisatie mode (ESI+) te
verhogen. Tuneoplossingen worden bewaard bij -20°C.
3.2.3. Standaard mengsels
3.2.3.1. Standaard mengsels voor clean-up en extractie experimenten
Voor de extractie en clean-up experimenten gebruiken we standaard mengsels
van 30 ng/µL. Er wordt een sulfonamidenmengsel (SA), een tetracyclinemengsel
(TC), een coccidiostaticamengsel (COC) en een diverse mengsel met daarin
streptograminen, β-lactam antibiotica, polypeptiden en macroliden (DIV) bereid op
basis van de standaard stockoplossingen uit 3.2.1. (tabel 3.1.). De mengsels worden
verder verdund in MeOH tot de gewenste concentratie (30 ng/µL) bekomen wordt.
De standaard mengsels worden bewaard bij -20°C.
Voor de analyse maken we eerst een zogenaamde “mix” van de standaard
mengsels. Hiervoor brengen we van elk mengsel 10 µL in een vial met insert en
lossen het na droogdampen bij 40 °C onder N 2 op in 100 µL H2O/MeOH 90/10 (v/v),
19
om een goede scheiding te krijgen. Na extractie en clean-up worden stalen in vials
met insert voor LC-MS/MS gebracht. Op basis van de “mix” kan de aanwezigheid van
bepaalde antibiotica in het staal worden gecontroleerd, door een vergelijking van de
pieken en de retentietijden. Deze “mix” wordt dus gebruikt als referentie, om te
controleren of de apparatuur correct werkt en welke componenten in het staal
aanwezig zijn. De signaal-ruisverhouding voor elk ion moet groter zijn dan 3:1, de
retentietijden moeten binnen een marge van 5 % identiek zijn en de piekverhouding
van de 2 ionen moet binnen een marge van 10 % overeenkomen (Europese
Gemeenschap, 2002).
3.2.3.2. Standaard mengsels voor validatie
Uitgaande van de standaard stockoplossingen uit 3.2.3.1 (tabel 3.1.) worden
mengsels (A) bereid in MeOH (tabel 3.2.). Hierbij wordt elk antibioticum toegevoegd
op basis van de gevoeligheid die gevonden werd bij de pre-validatie. Deze mengsels
(tabel 3.2.) worden verder verdund: aan 10 µL mengsel A wordt 990 µL MeOH
toegevoegd, om heel lage concentraties te bekomen (mengsel B). De standaard
mengsels worden bewaard bij -20°C.
TABEL 3.2.: STANDAARD MENGSELS (A) VOOR VALIDATIE DEEL 2
Voor de analyse wordt een “mix” bereid op basis van de standaard mengsels (B)
uit tabel 3.2. Hiervoor brengen we van elk mengsel 10 µL in een vial en lossen het na
droogdampen bij 40 °C onder N 2 op in 100 µL H2O/MeOH 90/10 (v/v). Deze “mix”
wordt opnieuw gebruikt als referentie voor de te analyseren stalen zoals beschreven
bij 3.2.3.1.
mengsel concentratie antibioticum
SA
2 ng/µL TRI
10 ng/µL SGD, SPD, SMR, N4AS, SIX, SDM
50 ng/µL SDZ, STZ, SMT, SMZ, SQX
100 ng/µL SMP, SCP, SMTX
TCA
20 ng/µL TC 50 ng/µL DMC
100 ng/µL 4ETC, ICTC, ATC, 4EATC
300 ng/µL 4ECTC, OTC, CTC,
DOX, 4EACTC, ACTC
COC 2 ng/µL NAR, NIC, AMP,
SAL, LAS A 100 ng/µL MON, DIC
DIV 10 ng/µL AMOX, TYL
100 ng/µL SPIR, VGM, PEN G 500 ng/µL BAC
20
3.3. UPLC-MS/MS
3.3.1. Principe
3.3.1.1. UPLC
Vloeistofchromatografie wordt gebruikt voor een scheiding van de te analyseren
componenten in een staal. Het staal wordt geϊnjecteerd in mobiele fase aan het begin
van een kolom gepakt met sferische partikels (stationaire fase) . De mobiele fase is
best niet reactief, niet ontvlambaar, heeft een lage viscositeit en een hoge
zuiverheidsgraad. De te scheiden componenten verdelen zich tussen de mobiele en
de stationaire fase, door interactie met de stationaire fase worden ze selectief
vertraagd en zullen ze één voor één de kolom verlaten. Bij gradiëntelutie begint men
met een zwakker eluens en wordt er geleidelijk overgeschakeld op een sterker
eluens.
Meestal worden omgekeerde fase kolommen gebruikt, bestaande uit een
hydrofiele mobiele fase (bijvoorbeeld H2O, MeOH of ACN) en een hydrofobe
stationaire fase (bijvoorbeeld C2, C8 of C18). Hydrofobe substanties blijven langer
geadsorbeerd aan de stationaire fase en hebben langere retentietijd (Jakobsen,
2009).
De conventionele HPLC-techniek werd de laatste jaren sterk verbeterd om de
scheiding van componenten te versnellen en/of om de piekcapaciteit te verhogen.
Deze techniek wordt ultra performance liquid chromatography genoemd (UPLC).
Bij UPLC wordt er gewerkt met partikels onder 2 µm, veel kleiner dan bij HPLC.
Het belang hiervan wordt aangetoond met de Van Deemtertheorie (figuur 3.1.) Deze
theorie beschrijft de processen aan de basis van de piekverbreding, wat zeer
belangrijk is voor de scheidingsefficiëntie. Voor 2 van die processen, de Eddydiffusie
en de massatransfer, is de partikeldiameter van belang. Hoe kleiner de
partikeldiameter, hoe kleiner de Eddydiffusie en de massatransfer. Dit beïnvloedt het
Van Deemterplot (figuur 3.1.) die bepalend is voor de schotelhoogte en de snelheid
van de mobiele fase. Hoe kleiner de partikelgrootte, hoe beter de
scheidingsefficiëntie, hoe sneller de scheiding kan worden uitgevoerd.
21
FIGUUR 3.1.: INVLOED VAN PARTIKELGROOTTE OP VAN DEEMTERPLOT
Door de kleinere partikelgrootte wordt er bij UPLC een veel hogere druk (tot
15000 psi) opgebouwd dan bij HPLC. Er wordt gewerkt met hoge temperaturen (tot
200 °C) om de viscositeit van de mobiele fase te ve rminderen (Guillarme et al., 2010).
3.3.1.2. MS/MS
Wanneer de UPLC gekoppeld wordt met een MS-detector krijgt men gunstige
gevoeligheid en selectiviteit voor een snelle analyse van componenten in complexe
matrices en bij lage concentraties. Op die manier vormt de UPLC-MS/MS een snelle
multi-residu screening methode voor voedselmatrices (Guillarme et al., 2010). Door
de combinatie van LC en MS/MS krijgen we een scheiding en bovendien structurele
informatie, waardoor LC-MS/MS uiterst geschikt is voor de confirmatie van bepaalde
substanties (Bohm et al., 2009).
De massaspectrometer (figuur 3.2.) bestaat uit een bron met een capillair waarop
de kolom van de UPLC wordt aangesloten. In de bron heerst atmosferische druk.
Doorheen het capillair wordt het staal met behulp van verwarmd N2-gas gesproeid.
Door een voltage van ongeveer 3 - 4 kV aan te brengen aan het capillair worden
sterk geladen druppels gevormd. De druppel wordt verwarmd door het N2-gas,
hierdoor komen ionen dichter bij elkaar. Door een stijging van het elektrisch veld
bewegen ze naar de oppervlakte en evaporeren (figuur 3.3.) (Quattro-LC-operator-
training-course)
FIGUUR 3.2.: OPBOUW VAN DE QUATTRO PREMIER XE MASSASPECTROMETER
FIGUUR 3.3.: STERK GELADEN DRUPPEL VERDAMPT, EN IONEN EVAPOREREN (Quattr
Door de sterke elektrische lading ontstaat dus elektrospray ionisatie (ESI). Op die
manier kunnen positieve, geprotoneerde (
([M-H]-) ionen gevormd worden, afhankelijk van de eigensc
en de polariteit van de aangelegde spanning. We spreken van pseudomoleculaire
ionen, aangezien het exact gewicht niet
De beschreven ionisatiemethode bij atmosferische druk (atmospheric
ionization = API) is een zachte ionisatietechniek, alle gevormde
worden ook gedetecteerd
operator-training-course).
De gevormde ionen worden naar de massaspectrometer geleid via 2 cones: de
sample en de extraction cone. Langs de sample cone
tegengestelde richting van de spray waardoor ongewenste, ongeladen moleculen
weggeduwd worden, terwijl alle ionen aangetrokken worden door een spanning op
de sample cone. De cones zullen het drukverval tussen de bron, waar atmosferische
druk heerst, en de quadrupolen,
training-course).
FIGUUR 3.2.: OPBOUW VAN DE QUATTRO PREMIER XE MASSASPECTROMETER(Waters, 2005).
.: STERK GELADEN DRUPPEL VERDAMPT, EN IONEN EVAPOREREN (Quattro-LC-operator-training-course).
Door de sterke elektrische lading ontstaat dus elektrospray ionisatie (ESI). Op die
manier kunnen positieve, geprotoneerde ([M+H]+), of negatieve, gedeprotoneerde
) ionen gevormd worden, afhankelijk van de eigenschappen van de molecule
en de polariteit van de aangelegde spanning. We spreken van pseudomoleculaire
ionen, aangezien het exact gewicht niet zichtbaar is door de protonatie/
De beschreven ionisatiemethode bij atmosferische druk (atmospheric
zachte ionisatietechniek, alle gevormde
worden ook gedetecteerd en fragmenteren in de fragmentatiecel
De gevormde ionen worden naar de massaspectrometer geleid via 2 cones: de
sample en de extraction cone. Langs de sample cone stroomt N
van de spray waardoor ongewenste, ongeladen moleculen
weggeduwd worden, terwijl alle ionen aangetrokken worden door een spanning op
de sample cone. De cones zullen het drukverval tussen de bron, waar atmosferische
en de quadrupolen, onder vacuum, opvangen (Quattro
22
FIGUUR 3.2.: OPBOUW VAN DE QUATTRO PREMIER XE MASSASPECTROMETER
.: STERK GELADEN DRUPPEL VERDAMPT, EN IONEN EVAPOREREN
Door de sterke elektrische lading ontstaat dus elektrospray ionisatie (ESI). Op die
), of negatieve, gedeprotoneerde
happen van de molecule
en de polariteit van de aangelegde spanning. We spreken van pseudomoleculaire
zichtbaar is door de protonatie/ deprotonatie.
De beschreven ionisatiemethode bij atmosferische druk (atmospheric pressure
zachte ionisatietechniek, alle gevormde precursor ionen
en fragmenteren in de fragmentatiecel (Quattro-LC-
De gevormde ionen worden naar de massaspectrometer geleid via 2 cones: de
stroomt N2-gas in
van de spray waardoor ongewenste, ongeladen moleculen
weggeduwd worden, terwijl alle ionen aangetrokken worden door een spanning op
de sample cone. De cones zullen het drukverval tussen de bron, waar atmosferische
(Quattro-LC-operator-
23
De massaspectrometer wordt zowel gebruikt voor kwantitatieve als kwalitatieve
doeleinden. Na ionisatie worden de componenten in MRM-mode (multiple reaction
monitoring, figuur 3.4.) gescheiden volgens massa/lading verhouding (m/z-waarde),
door de combinatie van twee quadrupolen (Q1 en Q2) en één fragmentatiecel
(Jakobsen, 2009).
FIGUUR 3.4.: MULTIPLE REACTION MONITORING, MET Q1 EN Q2 = QUADRUPOLEN. ZEER SELECTIEVE MODE OMDAT BEIDE QUADRUPOLEN GEBRUIKT WORDEN ALS MASSAFILTER.
IN DE COLLISION CELL VINDT DE FRAGMENTATIE PLAATS (Quattro-LC-operator-training-course).
De eerste quadrupool (Q1) bestaat uit 4 molybdene staven, met circulaire
doorsnede en op gelijke afstand van een centrale as. De staven hebben 2 aan 2
parallel een wisselspanning, waardoor bepaalde ionen een sinusfunctie beschrijven
doorheen de quadrupool en doorgelaten worden, terwijl anderen door de spanning
uit hun baan geraken en doorgang verhinderd wordt. Scheiding gebeurt in vacuüm,
er is een luchtvrije buis nodig om te voorkomen dat O2-moleculen de vlucht van de
ionen gaan hinderen. Vacuüm wordt bereikt door een direct drive rotary pomp en drie
turbomoleculaire pompen die via verschillende compartimenten geleidelijk de druk
opbouwen, dit wordt aangetoond op figuur 3.2.
Na de scheiding op de quadrupool volgt de fragmentatiestap in de
fragmentatiecel (collision cell), waarin via collision induced decombustion met een
inert gas, argon als botsingsgas, fragmenten gevormd worden. De fragmentatiecel
maakt gebruik van T-wave technologie voor hoge gevoeligheid en snelheid van de
analyse. Fragmentatie wordt gevolgd door een nieuwe scheiding volgens m/z met Q2,
die analoog aan Q1 is opgebouwd (Quattro-LC-operator-training-course).
Bij de MRM mode (figuur 3.4.) wordt Q1 ingesteld zodat enkel ionen met een
bepaald m/z-waarde doorgelaten worden en vervolgens gefragmenteerd worden in
de fragmentatiecel. Hierna worden met Q2 de geselecteerde fragment-ionen met een
bepaalde m/z-waarde doorgelaten. Voor kwantitatieve doeleinden wordt het meest
intense fragment-ion geselecteerd (Quattro-LC-operator-training-course).
24
Detectie gebeurt door de combinatie van een conversiedynode, fosfor en een
fotomultiplier detectie systeem. De gevormde ionen worden via de conversiedynode
omgezet naar elektronen die botsen met fosfor. Door die excitatie worden fotonen
uitgezonden die door een fotokathode opnieuw naar elektronen worden omgezet, de
fotomultiplier zorgt dan voor amplificatie in vacuüm, de elektrische signalen worden
geanalyseerd via software (Quattro-LC-operator-training-course).
3.3.2. Praktische uitvoering
3.3.2.1. Chromatografische condities bij de start
We werken bij een temperatuur van 40°C in de kolomo ven. Voor de scheiding
van de stalen wordt er gewerkt met een gradiënt. Mobiele fase A bestaat uit H2O met
0,1 % FA, mobiele fase B bestaat uit MeOH (LC-MS Biosolve) en 0,1 % FA. In Tabel
3.3. wordt de opbouw van de gradiënt weergegeven. Er wordt gestart met een
zwakker eluens (mobiele fase A), geleidelijk wordt overschakeld naar een sterker
eluens (mobiele fase B) om een mooie scheiding van de componenten te krijgen.
3.3.2.2. Aangepaste chromatografische condities
De temperatuur wordt aangepast naar 60°C in de kolo moven, bovendien wordt
een sterkere gradiënt ingesteld zoals weergegeven in tabel 3.4.
TABEL 3.3.: TIJDSTABEL GRADIENT 1 TABEL 3.4.: TIJDSTABEL GRADIENT 2 (flow rate 0,5 mL/min) (flow rate 0,5 mL/min)
3.3.2.3. MS-Tuning
De te analyseren componenten moeten eerst getuned worden om een aantal
parameters in te stellen zodat de verschillende componenten afzonderlijk doorheen
de quadrupolen passeren. We bepalen: de m/z-waarde van het precursor ion,
rekening houdend met eventueel waterverlies of adductvorming, het voltage nodig op
Tijd (min) %A %B Curve
0 100 0 -
0,5 100 0 -
6 76 24 lineair
8 36 64 lineair
9 18 82 lineair
11 18 82 -
13 100 0 lineair
Tijd (min) %A %B Curve
0 100 0 -
0,5 100 0 -
6 76 24 lineair
8 36 64 lineair
9 0 100 lineair
11 0 100 -
13 100 0 lineair
25
de cone om het signaal van het precursor ion te optimaliseren en de spanning op de
fragmentatiecel zodat moleculen botsen met argon en fragmenten vormen. Tenslotte
wordt ook de m/z-waarde bepaald van de fragment-ionen die gevormd worden, wat
belangrijk is voor de verdere identificatie en kwantificatie van de antibiotica.
De tuneoplossing wordt in de massaspectrometer geïnfuseerd met een snelheid
van 20 µL/min. Op basis van de brutoformule kan voor elk antibioticum het pseudo
moleculair gewicht berekend worden van het precursor ion. Eerst werken we alleen
met API-gas, er is dus enkel ionisatie en nog geen fragmentatie. Er wordt vervolgens
een MS-scan uitgevoerd met het masslynx-programma. De conespanning wordt
aangepast tot we de sterkste piekintensiteit vinden voor het precursor ion (tussen 20
en 55 V). Vervolgens voeren we een MS/MS-scan uit waarbij de gewenste spanning
voor de cone ingesteld wordt voor de te bepalen component. Het collison gas wordt
aangezet, de precursor ionen worden gefragmenteerd. Door de collision spanning op
te drijven (tussen 10 en 55 eV) gaan we op zoek naar de 2 meest intense fragment-
ionen.
3.4. STAALVOORBEREIDING
3.4.1. Extractie & clean-up experimenten
We voeren verschillende experimenten uit om de factoren te bepalen die een
significante invloed hebben op de extractie en clean-up. Deze testen gebeuren op
basis van het Plackett-Burman design voor de vergelijking van significante factoren
op 2 niveaus in N stalen, waarbij tot N – 1 factoren kunnen worden bepaald (N =
veelvoud van 4) (Srinubabu et al., 2008). Via lineaire regressie in SPSS worden
vervolgens de significante factoren op het 5% significantieniveau bepaald.
Voor extractie wordt gebruik gemaakt van een solvent (MeOH, H2O, aceton of
ACN) waarin het antibioticum oplost en met zo weinig mogelijk co-extractie van
interfererende stoffen uit de matrix van de groente geëxtraheerd wordt. Voor de
clean-up en aanconcentrering werken we met solid phase extraction (SPE). Er wordt
een extractie uitgevoerd tussen vaste en vloeibare fase, waarbij de te bepalen
component absorbeert aan een stationaire fase in een kolom. Interfererende stoffen
worden verwijderd door een wasstap. Vervolgens wordt het analyt met een geschikt
solvent (mobiele fase) geëlueerd.
26
Er zijn SPE kolommen met verschillende stationaire fasen: aluminium, amino of
sterke kationuitwisselaars voor geïoniseerde antibiotica. Voor neutrale antibiotica
worden polymere kolommen, zoals HLB (hydrofiele lipofiele balans) omgekeerde
fase of C18-kolommen gebruikt (Blasco et al., 2007; McGlinchey et al., 2008; Gorp,
2009). Alle geteste combinaties zijn voor elk experiment terug te vinden in de
bijhorende tabel.
3.4.1.1. Extractie en clean-up experiment 1
Bij deze test is wortel de matrix, deze worden eerst gemalen in een moulinette
om te homogeniseren en bewaard in de diepvriezer bij -20°C. Er wordt 8 keer 3 g
groente afgewogen in gosselin buizen van 50 mL.
Elk staal belasten we met 10 µL van elk mengsel uit 3.2.3.1. Dit komt overeen
met een concentratie van 100 ppb. We wachten 10 minuten om de antibiotica met de
matrix te laten reageren, zo worden natuurlijke omstandigheden nagebootst. Voor de
extractie wordt 200 µL 0,1M EDTA (32,2 g/L H2O) toegevoegd om complexvorming
van tetracyclines te verminderen. Tetracyclines hebben de neiging om chelaten te
vormen met divalente metaalionen in de matrix, waardoor ze minder goed
geëxtraheerd kunnen worden en hun terugvinding verlaagt (Chico et al., 2008).
Voor de extractie maken we 4 verschillende extractiesolventen aan: MeOH/H2O,
MeOH/Aceton, ACN/H2O en tenslotte ACN/Aceton, telkens in 50/50 (v/v) verhouding
(tabel 3.5., MeOH/ACN en H2O/Aceton). Aan elke buis wordt 7,5 of 15 mL van 1 van
de 4 extractiesolventen toegevoegd (tabel 3.5., mL extractie). Daarna vortexen we
elk staal gedurende 30 seconden voor mixen en homogeniseren, gevolgd door 15
minuten schudden en 10 minuten centrifugeren met een kracht van 3600 g, waardoor
een supernatans bekomen wordt. Van de bovenstaande fase wordt 3 of 6 mL (tabel
3.5., mL SPE) in een andere gosselin buis overgebracht en hieraan voegen we 27
mL H2O toe, om het extract polairder te maken voor de clean-up.
Bij de clean-up wordt gebruik gemaakt van C18 of OASIS HLB kolommen (tabel
3.5., SPE). We bevochtigen de kolommen met 4 mL MeOH, hierdoor zal de packing
in de kolom strekken en is er een groter contactoppervlakte voor de clean-up. De
uniforme packing is belangrijk om de efficiëntie van de clean-up procedure te
garanderen (McGlinchey et al., 2008). Daarna conditioneren we met 4 mL H2O om
27
de kolommen aan dezelfde omstandigheden bloot te stellen als het extract. Er moet
opgelet worden dat de kolommen nooit droog komen te staan, want hierdoor is er
een verlies van strekking in de packing. De clean-up wordt zo minder efficiënt.
Het extract gaat vervolgens over de kolom en loopt traag door met een snelheid
van ongeveer 1 mL/min, zodat voldoende interactie mogelijk is tussen het extract en
de kolom. Hierna drogen we de kolommen door het vacuüm te verhogen gedurende
10 min. De componenten elueren uit de kolom in een glazen proefbuis met 1 of 2 mL
MeOH (tabel 3.5., mL elutie) en de kolom wordt opnieuw gedroogd door het vacuüm
te verhogen. Het bekomen extract wordt indampt in een warmwaterbad bij 40°C
onder N2.
Voor de analyse lossen we de stalen opnieuw op in 200 µL H2O/MeOH 90/10
(v/v). Na grondig vortexen gaan de stalen in vials met insert voor de LC-MS analyse.
Elk staal wordt geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities
uit 3.3.2.1.
TABEL 3.5.: BEPALEN SIGNIFICANTE FACTOREN 1
3.4.1.2. Extractie en clean-up experiment 2
Voor extractie en clean-up experiment 2 werken we analoog als onder punt
3.4.1.1., met een aantal kleine aanpassingen. Er wordt uitsluitend met C18-
kolommen gewerkt. Na de clean up is er een wasstap met 5 mL H2O. De stalen
worden na heroplossen in MeOH/H2O 90/10 (v/v) geültracentrifugeerd in cupjes met
een filter, waardoor de extracten zuiverder zijn.
Er wordt opnieuw gewerkt met 8 keer 3 g wortel. We testen de verhouding MeOH
en H2O voor de extractie (MeOH/H2O), het volume van het extract nodig voor SPE
(mL voor SPE), het volume MeOH voor de elutie (mL elutie), de wasstap en tenslotte
staal mL extractie MeOH/ACN H 2O/Aceton mL voor SPE SPE mL elutie
1 15 ACN Aceton 6 C18 2
2 15 MeOH Aceton 3 OASIS 1
3 15 MeOH H2O 3 C18 2
4 7,5 MeOH H2O 6 C18 1
5 15 ACN H2O 6 OASIS 1
6 7,5 MeOH Aceton 6 OASIS 2
7 7,5 ACN H2O 3 OASIS 2
8 7,5 ACN Aceton 3 C18 1
28
wordt de ultracentrifugatie getest (tabel 3.6.). De stalen worden geanalyseerd zoals
beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.
TABEL 3.6.: BEPALEN SIGNIFICANTE FACTOREN 2
Staal MeOH/H2O mL voor SPE mL wassen mL elutie ultracentrifugeren
1 70/30 6 0 4 nee
2 70/30 7,5 0 2 ja 3 70/30 7,5 5 2 nee
4 50/50 7,5 5 4 nee 5 70/30 6 5 4 ja
6 50/50 7,5 0 4 ja 7 50/50 6 5 2 ja
8 50/50 6 0 2 nee
3.4.1.3. Extractie en clean-up experiment 3
De procedure van 3.4.1.2. wordt gevolgd voor 8 keer 3 g wortel. We testen
opnieuw de SPE-kolommen (SPE) en daarnaast ook de verhouding MeOH en H2O
voor de extractie (MeOH/H2O), het volume van het extract nodig voor SPE (mL voor
SPE), het volume MeOH voor de elutie (mL elutie), de wasstap (mL wassen) en
tenslotte wordt de ultracentrifugatie getest (tabel 3.7.). De stalen worden
geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.
TABEL 3.7.: BEPALEN SIGNIFICANTE FACTOREN 3
Staal MeOH/H2O mL voor SPE mL wassen SPE mL elutie ultracentrifugeren
1 70/30 3 0 OASIS 2 ja
2 70/30 6 0 C18 4 nee
3 70/30 6 5 C18 2 ja
4 50/50 6 5 OASIS 2 nee
5 70/30 3 5 OASIS 4 nee
6 50/50 6 0 OASIS 4 ja
7 50/50 3 5 C18 4 ja
8 50/50 3 0 C18 2 nee
3.4.2. Pre-validatie: inschatting gevoeligheid
Voor de pre-validatie werken we met 12 keer 3 g groene paprika. Er worden 2
reeksen gemaakt, waarbij de buizen per twee belast worden met een verschillende
concentratie van de mengsels (tabel 3.8.). Hiervoor maken we eerst een verdunning
van 1/10 (v/v) van elk standaard mengsel van 30 ng/µL uit 3.2.3.1., zodat we
standaard mengsels van 3 ng/µL bekomen. Twee buizen worden niet belast, deze
gelden als blanco van elke reeks.
29
TABEL 3.8.: BELASTING VAN DE VERSCHILLENDE STALEN
a µL van elke mengsel waarmee het staal belast wordt b concentratie (in ng/µL) van de gebruikte mengsels
De stalen worden voorbereid met de geoptimaliseerde methode. Na 10 minuten
wachten voegen we 200 µL 0,1M EDTA (32,2 g/L H2O) toe. Als extractiemiddel wordt
MeOH/H2O 50/50 (v/v) gebruikt. We voegen aan elke buis 7,5 mL toe, daarna wordt
elke buis gevortext gedurende 30 sec, gevolgd door 15 min schudden en 10 min
centrifugeren met een kracht van 3600 g. Van de bovenstaande fase brengen we
6 mL in een andere gosselin buis en voegen hieraan 27 mL H2O toe.
Voor de clean-up wordt uitsluitend gebruik gemaakt van OASIS kolommen, die
bevochtigd worden met 4 mL MeOH en geconditioneerd met 4 mL H2O. Het extract
brengen we over de kolom, laten we traag doorlopen met een snelheid van ongeveer
1 mL/min en vervolgens wassen we met 5 mL H2O. Hierna worden de kolommen
gedroogd door het vacuüm te verhogen gedurende 10 minuten. We plaatsen glazen
proefbuizen in een rekje in het vacuüm elutiebakje. De componenten elueren met 1
mL MeOH (reeks B) of 2 mL MeOH (reeks A). De kolommen worden opnieuw
gedroogd door het vacuüm te verhogen.
De bekomen extracten van reeks A drogen we door in te dampen bij 40°C in een
warmwaterbad onder N2. Daarna worden de stalen heroplost in 200 µL H2O/MeOH
90/10 (v/v) en overgebracht in vials met insert voor de LC-MS analyse. Bij reeks B
wordt er niet drooggedampt, maar lengen we de extracten aan met 9 mL H2O.
Hiervan wordt 200 µL overgebracht in vials met insert voor LC-MS en geanalyseerd
zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.
Staal µL a ng/µL b ppb
1 0 0 0 2 1 3 1
3 10 3 10 4 50 3 50
5 10 30 100
6 15 30 150
30
3.4.3. Extra testen
3.4.3.1. Bacitracine
Met 8 keer 3 g wortel wordt de clean-up en extractie uitgevoerd zoals beschreven
onder 3.4.2. De extracten worden opgevangen in 4 glazen en 4 plastic proefbuizen.
We drogen 2 glazen en 2 plastic proefbuizen bij 40°C in een warmwaterbad onder N2.
De andere 2 glazen en 2 plastic proefbuizen worden bij 37°C in een verwarmblok
onder N2 gedroogd. Voor de analyse worden de extracten opgelost in 200 µL
H2O/MeOH 90/10 (v/v), daarna overgebracht in vials met insert voor LC-MS en
geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.
3.4.3.2. Diclazuril en coccidiostaticamengsel
We wegen 4 keer 3 g wortel en belasten 2 buizen met 10 µL van het oude COC-
mengsel en 2 buizen met 10 µL van het vers bereide COC-mengsel uit 3.2.3.1. Een
staal met verse en één met oude COC-mengsel wordt op C18 kolommen gebracht,
voor de overige 2 stalen wordt er met OASIS kolommen gewerkt. De procedure van
3.4.2. wordt gevolgd en de stalen worden geanalyseerd zoals beschreven onder punt
3.2.3.1. met de condities uit 3.3.2.1.
3.4.4. Finale procedure voor extractie en clean-up
De uiteindelijke procedure voor extractie en clean-up verloopt zoals beschreven
onder 3.4.2., vervolgens worden de extracten gedroogd in glazen proefbuizen in een
verwarmblok bij 37°C onder N 2. Voor de analyse worden de stalen heropgelost in
200 µL H2O/MeOH 90/10 (v/v) en overgebracht in vials met insert voor LC-MS/MS.
3.5. VALIDATIE
3.5.1. Selectiviteit
Er worden 12 blanco matrices in tweevoud getest: wortel, aardappel, groene
paprika, tomaat, ajuin, erwten, witloof, prei, komkommer, venkel, champignons en sla.
Elke groente wordt gemalen in de moulinette tot een homogene massa en
vervolgens wordt telkens 3 g afgewogen in een gosselinbuis van 50 mL. Na de
extractie en clean-up procedure (3.4.4.) worden de stalen geanalyseerd zoals
beschreven onder punt 3.2.3.2. met de condities uit 3.3.2.2.
31
3.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvi nding en intra-lab
reproduceerbaarheid
Blanco materiaal wordt in triplicaat belast met 0.5, 1, 1.5 en 2 keer de MRPL
(minimaal vereiste prestatielimieten) die bepaald werden in 3.4.2. De MRPL is het
minimale gehalte van een analyt in een staal dat aangetoond en bevestigd moet
worden met de methode (Europese Gemeenschap, 2002). Dit komt overeen met 15,
30, 45 of 60 µL van de mengsels (B) uit 3.2.3.2. In tabel 3.9. worden de bekomen
concentraties in ppb weergegeven. Er wordt een reeks van 3 keer 4 stalen gemaakt
met groene paprika en met aardappel en 2 reeksen van 3 keer 4 stalen met wortel
als matrix. De stalen worden op 3 dagen geanalyseerd (dag 1: wortel, dag 2:
aardappel en dag 3: paprika). De clean-up en extractie procedure is beschreven
onder 3.4.4. Het staal wordt geanalyseerd zoals beschreven onder punt 3.2.3.2. met
de condities uit 3.3.2.2.
TABEL 3.9. DE PPB-WAARDEN DIE GEBRUIKT WORDEN VOOR VALIDATIE
3.5.2.1. Detectielimiet (LOD)
De detectielimiet is het laagst gemeten gehalte waaruit de aanwezigheid van het
analyt met redelijke statistische zekerheid kan worden afgeleid
(= aantoonbaarheidsgrens). We werken met 4 concentratieniveaus, waarbij elke
concentratie 3 keer bepaald wordt. Dit wordt nog 2 keer herhaald met andere
matrices, op die manier bekomen we 9 stalen per niveau. Aan de hand van de
gemiddelde piekoppervlakte per concentratieniveau wordt een kalibratiecurve
opgesteld. De LOD wordt met vergelijking 3.1 berekend op basis van die curve.
LOD = 3 seb/m (3.1) Waarin: LOD = detectielimiet
seb = standaarddeviatie op het snijpunt van de kalibratiecurve met de y-as
m = richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve
concentratie standaard mengsel (B) ng/µL
0,02 0,1 0,2 0,5 1 2 3 5
µL
15 0,1 0,5 1 2,5 5 10 15 25 → 0,5*MRPL
30 0,2 1 2 5 10 20 30 50 →1*MRPL
45 0,3 2 3 7,5 15 30 45 75 →1,5*MRPL
60 0,4 2,5 4 10 20 40 60 100 → 2*MRPL
32
3.5.2.2. Kwantificatielimiet (LOQ)
De kwantificatielimiet is het gehalte waarbij twee verschillende resultaten
duidelijk te onderscheiden zijn (= bepaalbaarheidsgrens). Deze wordt bepaald aan
de hand van formule 3.2.
LOD = LOQ * 2 (3.2) Waarin: LOD = detectielimiet uit 3.5.2.1. LOQ = kwantificatielimiet
3.5.2.3. Relatieve terugvinding
De relatieve terugvinding is de fractie van een analyt die gemiddeld bij een
analyse wordt teruggevonden, uitgedrukt in percentage ten opzichte van de
doelwaarde (formule 3.3). De gemiddelde gemeten concentratie wordt berekend bij 4
concentratieniveaus (9 stalen per niveau met 3 stalen per matrix). De gemeten
concentraties worden vergeleken met theoretisch toegevoegde concentraties.
gemeten concentratie % relatieve terugvinding = 100 * _________________________ (3.3)
toegevoegde concentratie
3.5.2.4. Intra-laboratoriumreproduceerbaarheid (R)
De intra-laboratoriumreproduceerbaarheid is de precisie die binnen 1 labo
verkregen wordt bij vastgelegde omstandigheden: er wordt 1 methode gebruikt voor
verschillende matrices, op verschillende dagen geanalyseerd, door dezelfde analist
en met dezelfde apparatuur. De gemiddelde gemeten concentratie wordt berekend
bij 4 concentratieniveaus (9 stalen per niveau met 3 stalen per matrix), aan de hand
van de standaarddeviatie wordt de variatiecoëfficiënt (CV) bepaald voor elke
concentratie.
3.5.2.5. Herhaalbaarheid (r)
De herhaalbaarheid is de precisie onder herhaalbaarheidsomstandigheden. Er
wordt gewerkt met dezelfde methode bij identiek analysemateriaal, in hetzelfde
laboratorium, door dezelfde analist en met dezelfde apparatuur. Hiervoor wordt de
gemiddelde gemeten concentratie berekend bij 4 concentratieniveaus met wortel als
matrix (6 stalen per niveau). Aan de hand van de standaarddeviatie wordt de CV
bepaald voor elke concentratie.
33
4. RESULTATEN & DISCUSSIE
4.1. TUNEN
Voor het tunen kan zowel met ESI+ of ESI- mode gewerkt worden. In het labo
was reeds ervaring voor een aantal componenten met positieve mode, bovendien
bleek uit literatuuronderzoek dat verschillende andere componenten in ESI+ mode
bepaald kunnen worden. Indien mogelijk worden daarom de componenten in ESI+
mode getuned (tabel 4.2.). NIC en DIC (tabel 4.1.) kunnen enkel in ESI- mode
getuned worden omdat in de positieve mode geen ionisatie van de componenten
waarneembaar is.
Voor bepaalde antibiotica wordt er gewerkt met een merker. BAC is een mengsel
van polypeptiden waarvan BAC A de belangrijkste component is, aangezien die
verantwoordelijk is voor de therapeutische activiteit (Wan et al., 2006). NIC bestaat
uit een equimolair mengsel van 4,4’-dinitrocarbanilide (DNC) en 2-hydroxy-4,6-
dimethylpyrimidine, omdat DNC meer persistent is wordt het gebruikt als
merkerresidu (Danaher et al., 2008). SPI is een mengsel van SPI I, SPI II en SPI III,
die alle drie afzonderlijk bepaald worden. SPI I is de belangrijkste component (Wang
& Leung, 2009). VGM is een streptogramine die opgebouwd is uit VGM M1 en VGM
S1, waarvan VGM M1 de merker is (Boison et al., 2009). Lasalocid is opgebouwd uit
5 homologen (A – E). LAS A bestaat voor meer dan 99% uit homoloog A en minder
dan 1% uit B, C, D en E (Focht, 2008).
CTC en 4ECTC hebben een zelfde precursor ion met gelijke
fragmentatiepatronen en hebben daarom dezelfde tuneparameters. Ook kunnen ze
met de huidige chromatografische methode niet gescheiden worden, ze zullen bij de
analyses dezelfde retentietijd hebben en worden daarom samen bepaald.
TABEL 4.1.: TUNEGEGEVENS VOOR ANTIBIOTICA MET ESI- MODE
Antibioticum
(merker) Precursor
(Da) Fragmenten
(Da) Cone
(V) Coll. (eV)
DIC 406,6 335,7 45 20
NIC (DNC) 301,2 107,3 30 40 137,0 30 10
34
TABEL 4.2.: TUNEGEGEVENS VOOR ANTIBIOTICA MET ESI+ MODE
Antibioticum (merker)
Precursor (Da)
Fragmenten (Da)
Cone (V)
Coll. (eV)
Antibioticum (merker)
Precursor (Da)
Fragmenten (Da)
Cone (V)
Col . (eV)
4EATC 427,1 153,5 22 28
SDX 311,2 92,1 28 30
409,7 22 18 155,9 28 15
4ETC 445,2 153,5 22 25
SDZ 251,2 91,9 20 25
409,5 22 18 156,1 20 15
ACTC 461,1 153,5 22 25
SGD 215,2 92 20 25
443,6 22 18 155,9 20 15
AMOX 366,2 114 26 16
SIX 268,2 112,9 22 15
349,2 26 8 156,1 22 12
AMP 243,2 94,0 15 15
SMP 281,2 91,1 25 30
150,1 15 12 156 25 15
ATC 427,1 153,5 22 28
SMR 265,2 107,8 25 18
409,7 22 18 155,8 25 15
BAC (BAC A) 475,4
85,7 30 20 SMT 279,2
91,9 25 30
670 30 15 124,2 25 20
CTC/ 4ECTC 479,2
444 38 22 SMTC 254,2
92,2 22 25
462 38 16 156 22 15
DC 445,1 153,5 22 30
SMZ 271,2 91,9 20 30
427,7 22 22 156,1 20 15
DMC 465,2 153,5 25 25
SPD 250,2 92 25 25
447,7 25 18 156 25 15
ICT 479,1 196,5 22 38
SPI I 422,5 540,6 25 12
461,5 22 20 699,7 25 12
LAS A 613,2 377,2 55 34
SPI II 443,5 741,7 27 11
577,5 55 34 744,6 27 11
MON 693,2 462,2 40 55
SPI III 450,5 596,6 30 16
676,4 40 45 755,7 30 12
N4AS 321,2 134 30 25
SQX 301,2 92,2 30 25
198,1 30 20 156,1 30 15
NAR 787,2 431,2 44 52
STZ 256,2 91,9 22 22
531,2 44 50 156 22 15
OTC 461,2 426,2 32 20
TC 445,2 154 35 24
444 32 18 410 35 16
PEN G 357,2 181,8 35 20
TRI 291,2 123,1 35 28
197,7 35 15 230,2 35 25
SAL 773,2 431,2 55 52
TYL 916,7 174,2 42 40
531,2 55 48 772,5 42 25
SCP 285,2 91,8 25 30 VGM
(VGM M1) 526,6 337,6 28 20
155,8 25 15 355,6 28 18
SDM 311,2 108,1 30 28
156,1 30 18
35
4.2. EXTRACTIE EN CLEAN-UP EXPERIMENTEN
Om tot een optimale extractie en clean-up procedure te komen voor zoveel
mogelijk componenten werden verschillende experimenten gedaan om de factoren te
bepalen die een significante invloed hebben op de resultaten. Uit literatuuronderzoek
(1.4.3) werden een aantal factoren bepaald die getest werden: het volume van het
extractiesolvent, de samenstelling van het extractiesolvent met MeOH of ACN en
H2O of Aceton, het type van SPE-kolom, het volume van het extract dat op de SPE-
kolom gebracht wordt, het volume MeOH voor elutie van de kolom, de wasstap en
ultracentrifugatie.
Voor de opbouw van de experimenten werd gebruik gemaakt van het Plackett-
Burman design. De bekomen resultaten uit de experimenten werden verwerkt in
SPSS via lineaire regressie van de piekoppervlaktes van elke component.
Significante factoren werden voor elk antibioticum getest in het 95%
betrouwbaarheidsinterval.
Uit de resultaten van het eerste extractie en clean-up experiment blijkt dat er een
significant verschil is voor het volume van extractiesolvent dat gebruikt wordt. Voor
een aantal componenten is 7,5 mL solvent optimaal voor de extractie. Aangezien
voor geen enkele component 15 mL tot betere resultaten leidt, wordt verder gewerkt
met 7,5 mL extractiesolvent. Ook voor het extractiesolvent vinden we een significant
verschil, voor geen enkele component is ACN een betere keuze. Omdat MeOH voor
een aantal componenten betere resultaten geeft wordt hiermee verder gewerkt.
Aangezien er met aceton als extractiesolvent geen betere resultaten bekomen
worden dan met H2O wordt er gekozen om met H2O verder te werken. Voor het
volume voor clean-up met SPE is er een sigificant verschil: 6 mL is optimaal voor de
meerderheid van de componenten, geen enkel antibioticum heeft betere resultaten
met 3 mL. Ook het volume dat voor elutie gebruikt wordt is significant verschillend,
daarom wordt verder gewerkt met 2 mL MeOH. Voor de SPE-kolommen zijn de
resultaten voor C18 en OASIS optimaal voor een gelijk aantal componenten. Er
wordt echter gekozen om verder te werken met C18, omwille van de kostprijs. Alle
tetracyclines geven problemen en ook BAC, SPI II en SPI III zijn nauwelijks
detecteerbaar.
36
Bij het tweede extractie en clean-up experiment werd de samenstelling van de
extractiesolventen verder geoptimaliseerd. MeOH/H2O 50/50 (v/v) geeft voor de
meerderheid van de componenten betere resultaten, MeOH/H2O 70/30 (v/v) is enkel
voor BAC en MON optimaal, daarom wordt gekozen voor MEOH/H2O 50/50 (v/v).
Het volume van het extract dat op de kolommen gebracht wordt is weinig significant
verschillend wanneer met 6 of 7,5 mL wordt gewerkt, daarom wordt bij het volgende
experiment geopteerd voor 6 mL extract. We vergeleken 4 en 2 mL MeOH voor de
elutie. De bekomen resultaten tonen een significant verschil aan dat erop wijst dat 2
ml de optimale keuze is. Voor de wastap en de ultracentrifugatie zijn de bekomen
resultaten niet significant verschillend. De tetracyclines geven bij dit experiment geen
goede resultaten, net zoals bij experiment 1, daarom worden de resultaten van
experiment 1 en 2 voor de tetracyclines vergeleken. Daaruit blijkt dat voor
tetracyclines de clean-up beter is wanneer gewerkt wordt met OASIS kolommen.
Om te testen of er inderdaad betere resultaten bekomen worden voor de
tetracyclines met OASIS kolommen werd bij het derde experiment opnieuw gewerkt
met OASIS en C18 kolommen. Hierdoor moesten ook een aantal van de voorgaande
testen hernomen worden.
MeOH/H2O 50/50 (v/v) blijkt nog steeds de beste resultaten te geven, behalve
voor TYL, BAC en DIC. Voor SPE is 6 mL volume van het extract dat op de kolom
gebracht wordt voor de meeste componenten optimaal, behalve voor BAC en SIX,
waar beter gewerkt wordt met 3 mL. 4ETC, SPI I en SPI III worden best gewassen
met 5 mL H2O, enkel voor DIC is de wasstap nadelig. De wasstap wordt daarom
behouden. Uit de test blijkt dat OASIS kolommen duidelijk voor de meerderheid van
de componenten de beste resultaten geven, inclusief de tetracyclines, daarom wordt
verder gewerkt met OASIS kolommen, ondanks de kostprijs. Enkel DIC heeft meer
voordeel bij C18-kolommen. Het volume MeOH voor elutie is niet significant
verschillend wanneer gewerkt wordt met 2 of 4 mL MeOH, we gebruiken daarom 2
mL voor de finale methode omwille van de resultaten uit experiment 2. De
ultracentrifugatiestap is nadelig voor STZ, SIX, 4ETC, SPI I, SPIII, TYL, MON en DIC.
Bovendien heeft geen enkele component voordeel door de ultracentrifugatie, daarom
wordt deze stap weggelaten.
37
Er is weinig DIC te zien in de meeste stalen, dit kan te wijten zijn aan de keuze
van de kolom. Het is mogelijk dat DIC niet aan OASIS-kolommen gaat binden,
bijgevolg zal DIC bij de clean-up onmiddellijk elueren en wegwassen bij de wasstap.
Er bevindt zich dan geen DIC in het te analyseren staal. Ook kan er invloed zijn van
het drogen of het droog bewaren.
Voor de finale methode wordt gebruik gemaakt van 7,5 mL MeOH/H2O 50/50 (v/v)
als extractiesolvent. Voor de clean-up met SPE wordt 6 mL extract overgebracht op
een OASIS HLB-kolom, gewassen met 5 mL H2O en vervolgens geëlueerd met 2 mL
MeOH.
4.3. PRE-VALIDATIE
De pre-validatie bestaat uit 2 experimenten die tegelijk uitgevoerd werden. De
gevoeligheid van de componenten werd ingeschat door de stalen met verschillende
concentraties te belasten, zowel lagere als hogere dan de concentratie (100 ppb) die
bij de extractie en clean-up testen gebruikt werd. Het tweede deel van de pre-
validatie was een experiment waarbij getest wordt of de gevoeligheid verschillend is
wanneer een staal heropgelost of aangelengd wordt om te testen of dit invloed heeft
op de stabiliteit van DIC. Er was immers weinig DIC te zien in de stalen van de
voorgaande experimenten, dit kan te wijten zijn aan verlies van DIC door drogen of
droog bewaren. Reeks A werd geëlueerd met 2 mL MeOH, gedroogd onder N2 bij
40°C en vervolgens opnieuw opgelost in 200 µL H 2O/MeOH 90/10 v(v). De extracten
van reeks B werden geëlueerd met 1 mL MeOH, aangelengd met 9 mL H2O en
hiervan werd 200 µL in vials met insert voor LC-MS/MS analyse gebracht.
De gevoeligheid ligt tussen 1 en 100 ppb voor reeks A en tussen 50 en meer dan
150 ppb voor reeks B. Zoals verwacht is reeks B veel minder gevoelig dan reeks A,
er zit ongeveer een factor van 50 verschil op de resultaten. Er is echter 1
uitzondering: voor BAC zijn de 2 methodes ongeveer even gevoelig. Dit kan er op
wijzen dat BAC op één of andere manier verloren gaat door het drogen bij 40°C.
Verder vinden we geen pieken voor DIC voor beide reeksen. Dit wijst er op dat zowel
drogen als droog bewaren geen invloed hebben op de resultaten voor DIC, zoals
voorgesteld bij 4.2., experiment 2. Mogelijk zijn er slechte resultaten voor DIC omdat
dit antibioticum enkel bindt op C18-kolommen bij SPE, door gebruik van OASIS
kolommen gaat DIC verloren bij de clean-up.
38
4.4. EXTRA TESTEN
Een aantal extra testen werden een uitgevoerd met BAC en DIC om een aantal
hypothesen uit 4.2. en 4.3. te testen. Tijdens de pre-validatie werd vastgesteld dat
BAC zowel bij drogen en heroplossen, als bij aanlengen dezelfde gevoeligheid
vertoont (50 ppb). Voor alle andere componenten werd er echter een verschil in
gevoeligheid gevonden met factor 50, waaruit besloten kan worden dat de methode
waarbij het extract aangelengd wordt minder gevoelig is. Dit kan erop wijzen dat BAC
instabiel is bij droogdampen onder 40°C en afgebrok en wordt of door het drogen blijft
kleven aan de proefbuis. De gevoeligheid van de methode vermindert hierdoor.
Voor de test met BAC werd de temperatuur voor droogdampen en het materiaal
van de proefbuizen getest. Het materiaal zou immers significante invloed kunnen
hebben op de gevoeligheid van een methode wanneer de component blijft kleven
aan de wand. Hoewel de pieken hoger zijn bij drogen in verwarmblok bij 37°C in
plastic proefbuizen blijkt er geen significant verschil op het 0,5% significantieniveau
met SPSS. Voor de finale methode wordt er gekozen voor glazen proefbuizen en
wordt er toch gedroogd bij 37°C, omwille van de res ultaten uit de bovenstaande
resultaten.
Bij het extractie en clean-up experiment 3 (4.2.) werd vastgesteld dat van DIC
slechts sporen aanwezig zijn in de stalen. Dit is te wijten aan de kolomkeuze, het
drogen of het droog bewaren. Uit de pre-validatie (4.3.) bleek dat drogen en droog
bewaren weinig invloed heeft, aangezien DIC in beide reeksen niet zichtbaar was.
Daarom werden in deze test de OASIS en C18-kolommen vergeleken. Bovendien
werd ook de stabiliteit van coccidiostatica getest omdat bij de laatste reeksen geen
reproduceerbare resultaten gevonden werden. Een oud mengsel werd vergeleken
met een vers bereid mengsel.
Bij DIC vinden we piekoppervlaktes van 3800 na C18 clean-up, voor OASIS zijn
deze 10 keer lager (± 300). Voor de clean-up bindt DIC beter aan C18-kolommen.
We werken echter verder met OASIS voor de finale methode omdat dit optimaler is
voor de tetracyclines en dus voor de meerderheid van de componenten.
39
Er is geen verschil in de resultaten tussen het oude en het nieuwe COC-mengsel.
Om te testen of er problemen zijn met de kolom wordt een nieuwe kolom gebruikt. De
druk is even hoog als bij de vorige kolom, bovendien zijn er ook hier slechte pieken
voor NAR en SAL, daarom wordt een sterkere gradiënt (3.3.2.2.) ingesteld. De
gradiënt wordt opgedreven naar 100% MeOH omdat anders geen reproduceerbare
elutie bekomen wordt. Door het gebruik van 100% MeOH krijgen we goede pieken
voor de coccidiostatica. Eveneens wordt de temperatuur in de kolomoven verhoogd
naar 60°C om de druk in de kolom te verlagen.
4.5. VALIDATIE
4.5.1. Selectiviteit
Verschillende blanco matrices werden geanalyseerd om na te gaan of er
interferentie is bij bepaalde matrices. Bij bepaalde stalen vinden we voor bepaalde
componenten pieken die mogelijk kunnen wijzen op de aanwezigheid van
componenten. Om een piek te kunnen identificeren als een component moet aan 4
criteria voldaan zijn (Europese Gemeenschap, 2002). Er moeten 2 ionen simultaan
voorkomen, de retentietijd moet overeenkomen met de retentietijd voor de
component uit de zogenaamde “mix” (3.2.3.2.) binnen een marge van 5%, de S/N-
verhouding voor elk ion moet groter zijn dan 3:1 en de piekverhouding van de 2
ionen moet overeenkomen met de piekverhouding in de “mix” binnen een marge van
10%. Bij het gebruik van de MRM-mode en bovenstaande identificatiecriteria is de
kans op vals positieve resultaten als gevolg van interfererende pieken klein.
In een komkommerstaal vinden we sporen van TYL (figuur 4.1.). Er zijn
simultaan 2 ionen aanwezig, de retentietijd, de S/N-verhouding en de piekverhouding
liggen binnen de criteria. Daarom kunnen we vermoeden dat de component TYL
gedetecteerd werd bij komkommer als matrix, dit moet verder bevestigd worden. Bij
champignons tenslotte zijn er sterke pieken te vinden voor TRI. Er zijn simultaan 2
ionen aanwezig, de retentietijd is goed en ook de S/N-verhouding en de
piekverhouding liggen binnen de criteria. Dit staal moet verder worden onderzocht
omdat we vermoeden dat TRI aanwezig is in de stalen.
FIGUUR 4.1.: TYLOSINE IN BLANCO KOMKOMMERSTAAL, RETENTIETIJD VOOR TYL IS
In alle stalen zijn pieken bij
contaminatie van de gebruikte solventen voor extractie en clean
worden onderzocht, maar er w
onderzocht worden waarom in alle stalen spor
het werkelijk om SAL gaat.
4.5.2. LOD, LOQ, herhaalbaarheid,
reproduceerbaarheid
De resultaten van de pre
de gevoeligheid van de methode. Aa
worden. Dit wordt gebruikt bij het maken van
de validatie.
Er worden bij de validatie
A en DIC. Voor DIC werd bij de extra testen a
gebruik van OASIS kolommen. Voor de overige componenten is dit onduidelijk, het is
mogelijk dat de factoren voor clean
antibiotica of het is te wijten aan een instabiliteit
Omdat in bepaalde stalen geen pieken voor de componenten bepaald konden
worden, vinden we onvolled
de paprikastalen bij SPI I en voor de aarda
FIGUUR 4.1.: TYLOSINE IN BLANCO KOMKOMMERSTAAL, RETENTIETIJD VOOR TYL IS 8,22 MIN.
zijn pieken bij SAL terug te vinden, dit wijst op mogelijke
contaminatie van de gebruikte solventen voor extractie en clean-up. Alle solventen
rden onderzocht, maar er wordt geen contaminatie gevonden.
onderzocht worden waarom in alle stalen sporen van SAL terug te vinden zijn en of
LOD, LOQ, herhaalbaarheid, relatieve terugvinding en intra
reproduceerbaarheid
De resultaten van de pre-validatie (4.3.) worden gebruikt voor het inschatten van
de gevoeligheid van de methode. Aan de hand hiervan kan de MRPL bepaald
worden. Dit wordt gebruikt bij het maken van standaard mengsels voor belasting bij
bij de validatie geen pieken gevonden voor AMOX, NIC, PEN G, LAS
Voor DIC werd bij de extra testen aangetoond dat dit te wijten is aan het
gebruik van OASIS kolommen. Voor de overige componenten is dit onduidelijk, het is
factoren voor clean-up en extractie niet optimaal zijn voor deze
antibiotica of het is te wijten aan een instabiliteit van de standaarden.
Omdat in bepaalde stalen geen pieken voor de componenten bepaald konden
nvolledige gegevens voor de wortelstalen bij ATC en AMP, voor
de paprikastalen bij SPI I en voor de aardappelstalen bij NAR, SAL en MON.
40
FIGUUR 4.1.: TYLOSINE IN BLANCO KOMKOMMERSTAAL, RETENTIETIJD VOOR TYL IS
SAL terug te vinden, dit wijst op mogelijke
up. Alle solventen
geen contaminatie gevonden. Er moet verder
AL terug te vinden zijn en of
terugvinding en intra -lab
validatie (4.3.) worden gebruikt voor het inschatten van
n de hand hiervan kan de MRPL bepaald
s voor belasting bij
gevonden voor AMOX, NIC, PEN G, LAS
angetoond dat dit te wijten is aan het
gebruik van OASIS kolommen. Voor de overige componenten is dit onduidelijk, het is
up en extractie niet optimaal zijn voor deze
van de standaarden.
Omdat in bepaalde stalen geen pieken voor de componenten bepaald konden
voor de wortelstalen bij ATC en AMP, voor
ppelstalen bij NAR, SAL en MON.
Op dag 1 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met wortel gemaakt, op dag
2 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met aardappel en de laatste reeks die
gemaakt werd op dag 3 was 6 stalen op 4 concentratieniveaus met groene paprika.
Omdat er een probleem wa
geplande dag uitgevoerd worden en werden uitgesteld. Dit had als gevolg dat stalen
de stalen van wortel een week lang droog bewaard werden bij
andere stalen onmiddellijk of na slechts
Het effect hiervan is vooral te vinden bij de anhydrovormen
ACTC. In figuur 4.2. vergelijken we de c
van ATC met wortel en paprika als matrix. Voor de paprikastalen worden duidelijke
pieken gevonden die overeenkomen met de retentietijd van ATC, op de
chromatogrammen van de wortelstalen is geen duidelijke piek te zien voor ATC.
Mogelijk is er een gebrek
droog bewaren van de stalen
vooraleer ze heropgelost w
componenten wordt enkel rekening gehouden me
aardappel en van paprika.
FIGUUR 4.2.: VERGELIJKING VAN DE CHROMTOGRAMMEN VAN ATC, MET WORTEL (LINKS) EN PAPRIKA (RECHTS)
CONCENTRATIE VAN 20 PPB.
1 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met wortel gemaakt, op dag
2 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met aardappel en de laatste reeks die
gemaakt werd op dag 3 was 6 stalen op 4 concentratieniveaus met groene paprika.
Omdat er een probleem was met de Quattro Premier konden de analyses niet op de
geplande dag uitgevoerd worden en werden uitgesteld. Dit had als gevolg dat stalen
de stalen van wortel een week lang droog bewaard werden bij
andere stalen onmiddellijk of na slechts een paar dagen verder geanalyseerd werden.
Het effect hiervan is vooral te vinden bij de anhydrovormen:
ACTC. In figuur 4.2. vergelijken we de chromatogrammen voor de fragment
van ATC met wortel en paprika als matrix. Voor de paprikastalen worden duidelijke
pieken gevonden die overeenkomen met de retentietijd van ATC, op de
chromatogrammen van de wortelstalen is geen duidelijke piek te zien voor ATC.
brek aan stabiliteit bij de anhydrovormen omwille van het
droog bewaren van de stalen voor de reeksen van wortel gedurende een week
vooraleer ze heropgelost werden in H2O/MeOH 90/10 (v/v) voor analyse.
componenten wordt enkel rekening gehouden met de resultaten uit de reeks van
.: VERGELIJKING VAN DE CHROMTOGRAMMEN VAN ATC, MET WORTEL (LINKS) (RECHTS) ALS MATRIX. BEIDE STALEN WERDEN BELAST MET EEN
CONCENTRATIE VAN 20 PPB. DE RETENTIETIJD VOOR ATC IS 8,01 MIN.
41
1 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met wortel gemaakt, op dag
2 werden 6 stalen op 4 concentratieniveaus met aardappel en de laatste reeks die
gemaakt werd op dag 3 was 6 stalen op 4 concentratieniveaus met groene paprika.
s met de Quattro Premier konden de analyses niet op de
geplande dag uitgevoerd worden en werden uitgesteld. Dit had als gevolg dat stalen
de stalen van wortel een week lang droog bewaard werden bij -20°C. Terwijl de
een paar dagen verder geanalyseerd werden.
4EATC, ATC en
hromatogrammen voor de fragment-ionen
van ATC met wortel en paprika als matrix. Voor de paprikastalen worden duidelijke
pieken gevonden die overeenkomen met de retentietijd van ATC, op de
chromatogrammen van de wortelstalen is geen duidelijke piek te zien voor ATC.
vormen omwille van het
gedurende een week
O/MeOH 90/10 (v/v) voor analyse. Voor deze
t de resultaten uit de reeks van
.: VERGELIJKING VAN DE CHROMTOGRAMMEN VAN ATC, MET WORTEL (LINKS) EIDE STALEN WERDEN BELAST MET EEN
DE RETENTIETIJD VOOR ATC IS 8,01 MIN.
4.5.2.1. LOD & LOQ
De gevonden LOD en LOQ waarden zijn
hoger dan verwacht op basis
wijten aan de methode die gebruikt wordt voor het
komt overeen met drie keer de standaard
gedeeld door de richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve.
een kalibratiecurve voor de 4 belaste concentraties van elke com
vertekend beeld, omdat er
SPI III vinden we via de ijklijn een LOD van
zichtbaar zijn bij 50 ppb (figuur 4.3.)
ppb, terwijl er reeds duidelijke pieken zijn bij 1,5 ppb. Verder vinden we ook bij SPI I,
SPI II, BAC A, VGM M1 en SAL afwijkende resultaten.
Omwille van de vertekening
targetlynx wordt op de chromatogrammen gekeken naar de waarde waarbij de
verhouding groter is dan 3, omdat hierbij het signaal zeker te onderscheiden is van
de ruis ten gevolge van de matrix.
SPI III een LOD van 50 ppb. Om m
antibioticaresiduen aanwezig zijn in een staal moet het antibiotica in een concentratie
aanwezig zijn die gelijk is aan de LOD. Om te kwantificeren moet de concentratie
minimaal gelijk zijn aan de LOQ.
FIGUUR 4.3.: CHROMATOGRAMDE MATRIX IS GROENE PAPRIKA
De gevonden LOD en LOQ waarden zijn voor een aantal componenten veel
hoger dan verwacht op basis van de toegevoegde concentraties antibiotica. Dit is te
die gebruikt wordt voor het bepalen van de waarden.
komt overeen met drie keer de standaarddeviatie van het snijpunt op de y
gedeeld door de richtingscoëfficiënt van de kalibratiecurve. Door het opstellen van
een kalibratiecurve voor de 4 belaste concentraties van elke com
vertekend beeld, omdat er te veel spreiding zit op de resultaten. Bijvoorbeeld bij
vinden we via de ijklijn een LOD van 211,5 ppb, terwijl reeds duidel
zichtbaar zijn bij 50 ppb (figuur 4.3.). Ook bij N4AS vinden we een LOD van 29,05
ppb, terwijl er reeds duidelijke pieken zijn bij 1,5 ppb. Verder vinden we ook bij SPI I,
SPI II, BAC A, VGM M1 en SAL afwijkende resultaten.
Omwille van de vertekening wordt de LOD op een andere manier bepaald:
op de chromatogrammen gekeken naar de waarde waarbij de
verhouding groter is dan 3, omdat hierbij het signaal zeker te onderscheiden is van
de ruis ten gevolge van de matrix. Op die manier bekomen we voor bijvoorbeeld
SPI III een LOD van 50 ppb. Om met deze methode aan te tonen dat
antibioticaresiduen aanwezig zijn in een staal moet het antibiotica in een concentratie
aanwezig zijn die gelijk is aan de LOD. Om te kwantificeren moet de concentratie
minimaal gelijk zijn aan de LOQ.
CHROMATOGRAMMEN VOOR SPI III, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 50 PPB,
DE MATRIX IS GROENE PAPRIKA, DE RETENTIETIJD VOOR SPI III IS 7,79 MIN.
42
voor een aantal componenten veel
van de toegevoegde concentraties antibiotica. Dit is te
bepalen van de waarden. De LOD
eviatie van het snijpunt op de y-as
het opstellen van
een kalibratiecurve voor de 4 belaste concentraties van elke component is er een
veel spreiding zit op de resultaten. Bijvoorbeeld bij
ppb, terwijl reeds duidelijke pieken
en LOD van 29,05
ppb, terwijl er reeds duidelijke pieken zijn bij 1,5 ppb. Verder vinden we ook bij SPI I,
de LOD op een andere manier bepaald: via
op de chromatogrammen gekeken naar de waarde waarbij de S/N-
verhouding groter is dan 3, omdat hierbij het signaal zeker te onderscheiden is van
Op die manier bekomen we voor bijvoorbeeld
et deze methode aan te tonen dat
antibioticaresiduen aanwezig zijn in een staal moet het antibiotica in een concentratie
aanwezig zijn die gelijk is aan de LOD. Om te kwantificeren moet de concentratie
VOOR SPI III, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 50 PPB, , DE RETENTIETIJD VOOR SPI III IS 7,79 MIN.
43
4.5.2.2. Relatieve terugvinding
Afhankelijk van de toegevoegde concentraties antibioticum moet de relatieve
terugvinding (in %) zich in een bepaald interval bevinden dat slechts beperkt mag
afwijken van de doelwaarde van 100%. De criteria die worden gehandhaafd voor de
relatieve terugvinding kunnen teruggevonden worden in richtlijn 2002/657/EG
(Europese Gemeenschap, 2002) en staan samengevat in tabel 4.3.
TABEL 4.3.: CRITERIA VOOR RELATIEVE TERUGVINDING
Voor de meeste componenten is er een goede relatieve terugvinding. De
gevalideerde waarden variëren van 75,24% voor AMP (2*MRPL) tot 119,21% voor
TRI (1*MRPL).
Bij de sulfonamiden zijn de resultaten voor SMTX licht afwijkend van de
bovengrens van 110%. De relatieve terugvinding bedraagt 111,34%, 114,02%, 86,10%
en 111,50% voor massafracties van respectievelijk 5, 10, 15 en 20 ppb. Enkel voor
1,5 keer de MRLP (15 ppb) voldoet de relatieve terugvinding aan de vooropgestelde
criteria. De overige sulfonamiden hebben goede relatieve terugvinding, variërend
tussen 86,57% voor SQX (massafractie 5 ppb) en 116,77% voor SDM (massafractie
1 ppb).
Bij de tetracyclines is er slechte relatieve terugvinding voor 4EATC, met
onmogelijke waarden boven 7000%. Zoals reeds opgemerkt bij 4.6. is dit te wijten
aan problemen met de stabiliteit van anhydrovormen bij het droog bewaren van de
wortelstalen gedurende een week. Daarom worden de resultaten opnieuw berekend
met weglating van de resultaten met wortel als matrix. Dan blijkt er een goede
relatieve terugvinding op 0.5, 1, 1.5 en 2 keer de MRPL (98,01%, 107,41%, 103,29%
en 108,00%). De waarden voor de relatieve terugvinding variëren bij de andere
tetracyclines tussen 91,21% voor OTC (massafractie 15 ppb) en 109,77% voor DC
(massafractie 15 ppb).
Massafractie Interval
≤ 1 µg/kg -50% - + 20 %
> 1 µg/kg tot 10 µg/kg -30% - + 10 %
≥ 10 µg/kg -20% - + 10%
Voor de coccidiostatica vinden we geen
overige componenten (SAL, MON, NAR en AMP) zijn er
boven 150%. Bijvoorbeeld bij SAL vinden we een relatieve terugvinding van 150,20%,
91,99%, 154,71% en 117,70% voor massafracties van respectievelijk 0.1, 0.2, 0.3 en
0.4 ppb.
Bij het diverse mengsel tenslotte zijn er geen pieken voor AMPR en PEN G
te nemen. TYL heeft een goede relatieve terugvinding voor alle
BAC A, SPI I en SPI II hebben ook goede relatieve terugvinding. SPI III heeft een
licht afwijkende relatieve terugvinding voor 0.5, 1 en 1.5 keer de MRPL (77,51%,
113,01% en 116,70%). Er is heel
20,01%, 20,72% en 23,48%), toch zijn er duidelijk pieken en
stellen dat VGM M1 detecteerbaar is indien aanwezig bij
10 ppb (figuur 4.4.)
FIGUUR 4.4.: CHROMATOGRAM VAN VGMMATRIX IS PAPRIKA
4.5.2.3. Intra-laboratoriumreproduceerbaarheid (R)
Om te evalueren of er een goede
gebruik gemaakt van de criteria uit richtlijn 2002/657/EG
2002). Via de vergelijking van Horwitz
intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt (CVR) berekend.
Voor de coccidiostatica vinden we geen pieken voor LAS A, DIC en NIC. Voor de
onenten (SAL, MON, NAR en AMP) zijn er sterke uitschieters van
Bijvoorbeeld bij SAL vinden we een relatieve terugvinding van 150,20%,
91,99%, 154,71% en 117,70% voor massafracties van respectievelijk 0.1, 0.2, 0.3 en
Bij het diverse mengsel tenslotte zijn er geen pieken voor AMPR en PEN G
. TYL heeft een goede relatieve terugvinding voor alle belaste
BAC A, SPI I en SPI II hebben ook goede relatieve terugvinding. SPI III heeft een
terugvinding voor 0.5, 1 en 1.5 keer de MRPL (77,51%,
113,01% en 116,70%). Er is heel lage relatieve terugvinding voor VGM
,72% en 23,48%), toch zijn er duidelijk pieken en daarom kunnen we
stellen dat VGM M1 detecteerbaar is indien aanwezig bij concentraties
.: CHROMATOGRAM VAN VGM M1, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 10 PPB, DE IS PAPRIKA, RETENTIETIJD VOOR VGM M1 IS 8,64 MIN.
laboratoriumreproduceerbaarheid (R)
Om te evalueren of er een goede intra-laboratoriumreproduceerbaarheid
gebruik gemaakt van de criteria uit richtlijn 2002/657/EG (Europese Gemeenschap
. Via de vergelijking van Horwitz (4.1) wordt de maximale waarde voor de
intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt (CVR) berekend.
44
LAS A, DIC en NIC. Voor de
sterke uitschieters van
Bijvoorbeeld bij SAL vinden we een relatieve terugvinding van 150,20%,
91,99%, 154,71% en 117,70% voor massafracties van respectievelijk 0.1, 0.2, 0.3 en
Bij het diverse mengsel tenslotte zijn er geen pieken voor AMPR en PEN G waar
belaste concentraties.
BAC A, SPI I en SPI II hebben ook goede relatieve terugvinding. SPI III heeft een
terugvinding voor 0.5, 1 en 1.5 keer de MRPL (77,51%,
terugvinding voor VGM M1 (25,61%,
daarom kunnen we
concentraties van ongeveer
1, DE BELASTE CONCENTRATIE IS 10 PPB, DE , RETENTIETIJD VOOR VGM M1 IS 8,64 MIN.
laboratoriumreproduceerbaarheid is wordt
Europese Gemeenschap,
(4.1) wordt de maximale waarde voor de
45
CV = 2(1 – 0,5 log C) (4.1) Waarbij: CV = variatiecoëfficiënt (%) C = massafractie als macht van 10
Voor massafracties onder 100 µg/kg (CV = 23%) zijn er onaanvaardbaar hoge
waarden wanneer met vergelijking 4.1 gewerkt wordt. Daarom moet de CVR zo klein
mogelijk zijn. We nemen als criteria dat de CVR best onder 23% ligt, met maximale
uitschieters tot 30%. Op figuur 4.5. zijn de chromatogrammen te vinden voor STZ in
de 3 matrices met belaste concentratie van 10 ppb, wat overeen komt met 2*MRPL.
STZ is een voorbeeld van een component met goed reproduceerbare resultaten.
Voor de sulfonamiden waarvoor tijdens de validatie aanvaardbare resultaten voor
de reproduceerbaarheid werden bekomen variëren de waarden tussen 9,56% voor
SMP (1*MRLP) en 29,06% voor SMTX (0,5*MRPL). Voor TRI, N4AS en SQX zijn de
resultaten op geen enkel niveau reproduceerbaar, de waarden variëren tussen 31,40%
voor TRI (2*MRPL) en 79,85% voor SQX (1*MRPL).
Ook bij de tetracyclines is de reproduceerbaarheid goed, de waarden liggen
tussen 11,99% voor TC (1*MRPL) en 29,28% voor 4ETC (2*MRPL). Slechte
reproduceerbaarheid is er voor de resultaten van ATC en 4EATC, wat mogelijk te
wijten is aan de lange, droge bewaring van de wortelstalen. De waarden variëren
tussen 32,91 voor ATC (1,5*MRPL) en 243,85% voor 4EATC (2*MRPL). Daarom
worden de resultaten voor de wortelstalen weggelaten. De reproduceerbaarheid is
dan goed voor ATC bij 0,5*MRPL (26,92%). Voor 4EATC vinden we 31,66%, 47,12%,
28,12% en 49,51%. Enkel voor 1,5 keer de MRPL is de reproduceerbaarheid goed,
maar de waarden liggen wel in een meer realistische range.
Voor NIC, LAS A en DIC zijn geen pieken, vanzelfsprekend kan de
reproduceerbaarheid voor deze componenten niet bepaald worden. Voor de overige
coccidiostatica valt alleen de reproduceerbaarheid voor AMP bij 1*MRPL (26,41%)
binnen de vastgelegde criteria. In alle andere gevallen is voldoet de
reproduceerbaarheid niet en varieert tussen 36,71% voor AMP (2*MRPL) en 77,66%
voor NAR (0,5*MRPL).
Voor TYL zijn de waarden reproduceerbaar voor alle
(13,25 %, 11,33%, 18,55% en
27,73%) en BAC A (24,74%)
87,18% en 33,36% is de reproduceerbaarheid bij SPI I, II en III
criteria. We vinden geen pieken voor PEN G en AMOX, reproduceerbaarheid kan
dus niet bepaald worden.
FIGUUR 4.5.: CHROMATOGRAM VOOR STZ IN AARDAPPEL (10 PPB
4.5.2.4. Herhaalbaarheid (r)
De maximale CV voor analyses onder herhaalbaarheidsomstandigheden is de
helft van de waarde berekend voor reproduceerbaar
(Europese Gemeenschap
(variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid) kleiner moet zijn dan 15%.
De herhaalbaarheid is voor de
de sulfonamiden zijn enkel de resultaten op 2*MRPL herhaal
SPD en SMP (13,08%, 14,91%, 13,72%, 13,75% en 10,59%). De overige CVr’s
variëren tussen 16,41% voor SPD en 79,68% voor N4AS
De CVr ligt onder 15% bij de tetracyclines voor TC (10,36% en
OTC (10,93%) en voor DC
wortel als matrix, bovendien werd er reeds aangehaald dat er mogelijk instabiliteit is
bij de anhydrovormen door lange tijd droog bewaren van de wortelstalen.
Voor TYL zijn de waarden reproduceerbaar voor alle belaste
%, 11,33%, 18,55% en 14,28%). Ook voor VGM M1 (21,57%, 28,14% en
%) zijn er reproduceerbare resultaten. Met waarden tussen
87,18% en 33,36% is de reproduceerbaarheid bij SPI I, II en III
. We vinden geen pieken voor PEN G en AMOX, reproduceerbaarheid kan
.: CHROMATOGRAM VOOR STZ IN AARDAPPEL (LINKS) EN PAPRIKA (PPB, RETENTIETIJD VOOR STZ IS 3,48 MIN.
Herhaalbaarheid (r)
De maximale CV voor analyses onder herhaalbaarheidsomstandigheden is de
helft van de waarde berekend voor reproduceerbaarheid met vergelijking 4.1.
p, 2002). We nemen als criteria dat de CVr
(variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid) kleiner moet zijn dan 15%.
De herhaalbaarheid is voor de resultaten van de meeste componenten slecht. Bij
de sulfonamiden zijn enkel de resultaten op 2*MRPL herhaalbaar bij SGD, SDZ, STZ,
SPD en SMP (13,08%, 14,91%, 13,72%, 13,75% en 10,59%). De overige CVr’s
variëren tussen 16,41% voor SPD en 79,68% voor N4AS
De CVr ligt onder 15% bij de tetracyclines voor TC (10,36% en
%) en voor DC (13,50%). De herhaalbaarheid werd getest op stalen met
, bovendien werd er reeds aangehaald dat er mogelijk instabiliteit is
bij de anhydrovormen door lange tijd droog bewaren van de wortelstalen.
46
belaste concentraties
%). Ook voor VGM M1 (21,57%, 28,14% en
zijn er reproduceerbare resultaten. Met waarden tussen
87,18% en 33,36% is de reproduceerbaarheid bij SPI I, II en III afwijkend van de
. We vinden geen pieken voor PEN G en AMOX, reproduceerbaarheid kan
) EN PAPRIKA (RECHTS) BIJ
De maximale CV voor analyses onder herhaalbaarheidsomstandigheden is de
heid met vergelijking 4.1.
. We nemen als criteria dat de CVr
(variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid) kleiner moet zijn dan 15%.
meeste componenten slecht. Bij
baar bij SGD, SDZ, STZ,
SPD en SMP (13,08%, 14,91%, 13,72%, 13,75% en 10,59%). De overige CVr’s
De CVr ligt onder 15% bij de tetracyclines voor TC (10,36% en 14,16%), voor
herhaalbaarheid werd getest op stalen met
, bovendien werd er reeds aangehaald dat er mogelijk instabiliteit is
bij de anhydrovormen door lange tijd droog bewaren van de wortelstalen.
47
Ondanks de slechte relatieve terugvinding zijn er resultaten herhaalbaar voor
AHTC (4,80% op 1,5*MRPL) en 4EATC (13,55% op 1*MRPL). Voor ACTC zijn er
geen pieken gevonden, de herhaalbaarheid kan niet bepaald worden voor deze
component. De CVr’s van de resultaten die niet herhaalbaar zijn schommelen tussen
18,04% voor TC (2*MRPL) en 46,93% voor DMC (0,5*MRPL).
Voor geen enkele component uit de groep coccidiostatica zijn de resultaten
herhaalbaar. Alle CVr’s hebben een waarde boven 15% met variatie tussen 17,38%
voor MON (1*MRPL) en 151,29% voor AMP (0,5*MRPL). Slechte herhaalbaarheid uit
deze groep zou ook te wijten kunnen zijn aan de lange bewaring van de wortelstalen.
Geen pieken werden gevonden voor NIC, LAS A en DIC, bijgevolg kan de
herhaalbaarheid van de methode voor deze componenten niet bepaald worden.
In de diverse groep zijn enkel de resultaten voor de macrolide TYL herhaalbaar
(13,87%, 14,16%, 7,75% en 13,89%). Voor de spiramycines schommelen de CVr’s
tussen 33,51% en 122,16%. BAC A heeft waarden tussen 25,83% en 36,06%. Voor
VGM M1 tenslotte zitten de CVr’s tussen 29,10% en 52,43%.
4.5.3. Conclusie validatie
Door de spreiding op de resultaten, die werd vast gesteld tijdens de validatie,
werden slechte waarden bekomen voor de reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid.
Bijgevolg kan er besloten worden dat de methode niet optimaal is om te gebruiken
als een kwantitatieve methode. De variatie van de resultaten voor
anhydrotetracyclines is te wijten aan de instabiliteit van de componenten in de
wortelstalen. Voor screening is de methode wel goed, bovendien kan een eerste
schatting gemaakt worden van de concentratie aanwezig in het staal. Dit wordt
bewezen door de goede relatieve terugvinding van de meeste componenten. Bij de
selectiviteitstesten werd reeds aangetoond dat antibiotica in reële omstandigheden
kunnen voorkomen in groenten.
48
4.6. VERDER ONDERZOEK
Bij de selectiviteit werden een aantal blanco matrices getest op mogelijke
interferentie, contaminatie of reële aanwezigheid van bepaalde componenten. Hierbij
werd TYL gedetecteerd in komkommer en TRI in champignons. Deze stalen moeten
verder onderzocht worden om de aanwezigheid te bevestigen. Verder moet de
concentratie bepaald worden om te kijken of het om significante of verwaarloosbare
hoeveelheden gaat. Om te onderzoeken of de aanwezigheid van antibioticaresiduen
in reële omstandigheden een significant probleem is moet een groter aantal stalen
geanalyseerd worden. De aanwezigheid van SAL in alle matrices bij de testen voor
de selectiviteit kon niet opgehelderd worden. Hier moet verder onderzoek naar
gedaan worden.
Er moeten ook verdere testen gebeuren voor de detectie van AMOX, NIC, PEN
G, LAS A en DIC. Bij DIC werd aangetoond dat het gebruik van OASIS-kolommen
nadelig is. DIC bindt beter met C18-kolommen voor clean-up. Voor de overige
componenten kan getest worden of een bepaalde factor van de clean-up en extractie
ook niet optimaal is. Ook de stabiliteit van de componenten kan getest worden door
de procedure voor extractie en clean-up te vergelijken met oude en vers bereide
standaard mengsels.
De resultaten voor anhydrotetracyclines zijn afwijkend omwille van mogelijke
instabiliteit bij lang en droog bewaren van de extracten bij -20°C. De stalen met
wortel als matrix werden immers een week op voorhand bereid en gedroogd,
vooraleer ze geanalyseerd werden op de LC-MS/MS. De 2 reeksen wortel werden
niet hernomen omdat de slechte resultaten bij de reeks van aardappel en van
paprika er reeds op wijzen dat de methode niet voldoet aan de validatiecriteria voor
een kwantitatieve methode. Om te testen of de bewaring invloed heeft op de
stabiliteit van bepaalde componenten moet de validatie hernomen worden. Hierbij
moeten de gemaakte stalen na drogen heropgelost worden in H2O/MeOH 90/10 (v/v)
om onmiddellijk te analyseren.
49
5. CONCLUSIE
Er werd gezocht naar een methode om groenten te analyseren op antibiotica.
Deze methode moet toelaten om in de toekomst vast te stellen of er een reëel
probleem is met antibioticaresiduen in groenten als gevolg van het gebruik van
antibiotica in de veeteelt.
Uit de testen voor de extractie en clean-up kan besloten worden dat de extractie
voor de meerderheid van de componenten optimaal is wanneer gewerkt wordt met
7,5 mL MeOH/H2O 50/50 (v/v) als extractiesolvent. Voor de clean-up met SPE wordt
6 mL extract overgebracht op een OASIS HLB-kolom, gewassen met 5 mL H2O, en
vervolgens geëlueerd met 2 mL MeOH.
Bij de selectiviteit werden een aantal blanco matrices getest op mogelijke
interferentie, contaminatie of reële aanwezigheid van bepaalde componenten. Door
aanwezigheid van 2 ionen, S/N-verhouding, retentietijd en piekverhouding van de
ionen te controleren kunnen componenten gedetecteerd worden. Op die manier werd
TYL gedetecteerd in komkommer en TRI in champignons. Deze stalen dienen verder
te worden onderzocht om hun aanwezigheid te bevestigen en aanwezige
concentraties te bepalen.
Er werd gewerkt met een ijklijn die de lineaire trend bepaald voor de berekening
van de LOD en de LOQ. Hierdoor wijken de resultaten sterk af van de resultaten
verwacht aan de hand van de chromatogrammen, waarbij de LOD gelijk staat aan
een S/N van minstens 3. De relatieve terugvinding is voor de meeste componenten
goed, de methode geeft een goede indicatie van de aanwezige concentratie
antibioticaresiduen. Er zit wel te veel spreiding op de resulaten, die zorgt voor een
slechte intralaboratoriumreproduceerbaarheid en vooral heel slechte herhaalbaarheid.
Enkel voor TYL kan de methode gevalideerd worden voor alle criteria bij alle belaste
concentraties.
De multi-klasse, multi-residu methode is niet geschikt voor de kwantitatieve
bepaling van antibiotica in groenten. Door de verschillende fysico-chemische
eigenschappen van de diverse componenten moest er een compromis gesloten
worden bij de extractie en clean-up waardoor deze stap niet optimaal is voor alle
componenten.
50
Er is geen kwantificering mogelijk van de verschillende antibiotica, daarom kan
de methode niet gebruikt worden voor het bepalen van maximale residugehalten. De
methode is echter wel geschikt voor de screening van antibiotica in groenten,
uitgezonderd AMOX, NIC, PEN G, LAS A en DIC. Deze componenten kunnen niet
gedetecteerd worden. Bij DIC is dit te wijten aan het gebruik van OASIS HLB
kolommen. DIC bindt beter aan C18-kolommen voor clean-up, maar de methode is
optimaal voor de meerderheid van de componenten wanneer met OASIS kolommen
gewerkt wordt.
De resultaten van de selectiviteit bevestigen dat de methode als
screeningsmethode kan gebruikt worden. De resultaten tonen aan dat
antibioticaresiduen mogelijk in reële omstandigheden in groenten worden
opgenomen. Hoewel het op basis van deze resultaten lijkt dat het om een
verwaarloosbaar probleem zou gaan dienen er aanzienlijk meer stalen te worden
geanalyseerd om een gegronde uitspraak te doen met betrekking tot de prevalentie
van antibiotica in groenten.
51
6. LITERATUURSLIJST
Aguilera-Luiz, M. M.; Vidal, J. L.; Romero-Gonzalez, R.; Frenich, A. G. (2008). Multi-residue determination of veterinary drugs in milk by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1205, 10-16.
Barriere, J. C.; Berthaud, N.; Beyer, D.; Dutka-Malen, S.; Paris, J. M.; Desnottes, J. F. (1998). Recent developments in streptogramin research. Current Pharmaceutical Design, 4, 155-180.
Bennett, P. M. (2008). Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. Br J Pharmacol, 153 Suppl 1, S347-357.
Blasco, C.; Torres, C. M.; Pico, Y. (2007). Progress in a antibacterials analysis of residual in food. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 26, 895-913.
Blumberg, P. M.; Strominger, J. L. (1974). Interaction of penicillin with the bacterial cell: penicillin-binding proteins and penicillin-sensitive enzymes. Bacteriol Rev, 38, 291-335.
Bohm, D. A.; Stachel, C. S.; Gowik, P. (2009). Multi-method for the determination of antibiotics of different substance groups in milk and validation in accordance with Commission Decision 2002/657/EC. Journal of Chromatography A, 1216, 8217-8223.
Boison, J.; Lee, S.; Gedir, R. (2009). Analytical Determination of Virginiamycin Drug Residues in Edible Porcine Tissues by LC-MS with Confirmation by LC-MS/MS. Journal of Aoac International, 92, 329-339.
Boxall, A.; Long, C. (2005). Veterinary medicines and the environment. Environ Toxicol Chem, 24, 759-760.
Boxall, A. B.; Kolpin, D. W.; Halling-Sorensen, B.; Tolls, J. (2003). Are veterinary medicines causing environmental risks? Environ Sci Technol, 37, 286A-294A.
Chander, Y.; Gupta, S. C.; Goyal, S. M.; Kumar, K. (2007). Perspective - Antibiotics: Has the magic gone? Journal of the Science of Food and Agriculture, 87, 739-742.
Chico, J.; Rubies, A.; Centrich, F.; Companyo, R.; Prat, M. D.; Granados, M. (2008). High-throughput multiclass method for antibiotic residue analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1213, 189-199.
Danaher, M.; Campbell, K.; O'Keeffe, M.; Capurro, E.; Kennedy, G.; Elliott, C. T. (2008). Survey of the anticoccidial feed additive nicarbazin (as dinitrocarbanilide residues) in poultry and eggs. Food Additives and Contaminants, 25, 32-40.
Dubreil-Cheneau, E.; Bessiral, M.; Roudaut, B.; Verdon, E.; Sanders, P. (2009). Validation of a multi-residue liquid chromatography-tandem mass spectrometry confirmatory method for 10 anticoccidials in eggs according to Commission Decision 2002/657/EC. J Chromatogr A, 1216, 8149-8157.
Europese Gemeenschap (1996). Richtlijn 96/23/EG van de Raad van 29 april 1996 inzake controlemaatregelen ten aanzien van bepaalde stoffen en residuen daarvan in levende dieren en in produkten daarvan en tot intrekking van de Richtlijnen 85/358/EEG en 86/469/EEG en de Beschikkingen 89/187/EEG en 91/664/EEG. Publicatieblad, L 125, 10 - 32.
Europese Gemeenschap (2001). Richtlijn 2001/82/EG: tot vaststelling van een communautair wetboek betreffende geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik. Publicatieblad, L 311, 1–66.
52
Europese Gemeenschap (2002). Beschikking 2002/657/EG van de Commissie van 12 augustus 2002 ter uitvoering van Richtlijn 96/23/EG van de Raad wat de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten betreft. Publicatieblad, L 221, 8–36.
Europese Gemeenschap (2009). Verordening 470/2009/EG tot vaststelling van communautaire procedures voor het vaststellen van grenswaarden voor residuen van farmacologisch werkzame stoffen in levensmiddelen van dierlijke oorsprong, tot intrekking van Verordening (EEG) nr. 2377/90 van de Raad en tot wijziging van Richtlijn 2001/82/EG van het Europees Parlement en de Raad en van Verordening (EG) nr. 726/2004 van het Europees Parlement en de Raad. Publicatieblad van de Europese Unie, L 152,11-22.
Focht, C. (2008). Determination of lasalocid sodium in animal feeds and premixes by reversed-phase liquid chromatography: Collaborative study. Journal of Aoac International, 91, 479-488.
Gaugain-Juhel, M.; Delepine, B.; Gautier, S.; Fourmond, M. P.; Gaudin, V.; Hurtaud-Pessel, D.; Verdon, E.; Sanders, P. (2009). Validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry screening method to monitor 58 antibiotics in milk: a qualitative approach. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 26, 1459-1471.
Gorp, N. V. (2009). Ontwikkeling van een procedure voor de evaluatie van de bindingscapaciteit van mycotoxineadsorberende kleimaterialen, master thesis at Katholieke hogeschool Kempen, Belgium.
Granelli, K.; Elgerud, C.; Lundstrom, A.; Ohlsson, A.; Sjobery, P. (2009). Rapid multi-residue analysis of antibiotics in muscle by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 637, 87-91.
Gros, M.; Petrovic, M.; Barcelo, D. (2006). Development of a multi-residue analytical methodology based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for screening and trace level determination of pharmaceuticals in surface and wastewaters. Talanta, 70, 678-690.
Guillarme, D.; Schappler, J.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L. (2010). Coupling ultra-high-pressure liquid chromatography with mass spectrometry. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 29, 15-27.
Haggett, E. F.; Wilson, W. D. (2008). Overview of the use of antimicrobials for the treatment of bacterial infections in horses. Equine Veterinary Education, 20, 433-448.
http://microblog.me.uk/wp-content/uploads/Antibiotic_actions.jpg. (13-03-2010). http://www.cbip-vet.be/. (25-03-2010). Jakobsen, I. H. (2009). Analysis of selected benzodiazepines in the environment by
HF-LPME and LC-MS/MS. Master thesis at University of Tromsø, Noorwegen. .
Jamil, B.; Hasan, F.; Hameed, A.; Ahmed, S. (2007). Isolation of bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production. Pak J Pharm Sci, 20, 26-31.
Jindal, A.; Kocherginskaya, S.; Mehboob, A.; Robert, M.; Mackie, R. I.; Raskin, L.; Zilles, J. L. (2006). Antimicrobial use and resistance in swine waste treatment systems. Applied and Environmental Microbiology, 72, 7813-7820.
Kumar, K.; Gupta, S. C.; Baidoo, S. K.; Chander, Y.; Rosen, C. J. (2005). Antibiotic uptake by plants from soil fertilized with animal manure. J Environ Qual, 34, 2082-2085.
53
Lee, S. H.; Rho, Y. T. (1999). Improvement of tylosin fermentation by mutation and medium optimization. Lett Appl Microbiol, 28, 142-144.
Li, X. Z.; Mehrotra, M.; Ghimire, S.; Adewoye, L. (2007). beta-Lactam resistance and beta-lactamases in bacteria of animal origin. Vet Microbiol, 121, 197-214.
McDermott, P. F.; Zhao, S.; Wagner, D. D.; Simjee, S.; Walker, R. D.; White, D. G. (2002). The food safety perspective of antibiotic resistance. Animal Biotechnology, 13, 71-84.
McGlinchey, T. A.; Rafter, P. A.; Regan, F.; McMahon, G. P. (2008). A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matrices. Anal Chim Acta, 624, 1-15.
Monser, L.; Darghouth, F. (2000). Rapid liquid chromatographic method for simultaneous determination of tetracyclines antibiotics and 6-Epi-doxycycline in pharmaceutical products using porous graphitic carbon column. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 23, 353-362.
Olejnik, M.; Szprengier-Juszkiewicz, T.; Jedziniak, P. (2009). Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216, 8141-8148.
Park, S. R.; Han, A. R.; Ban, Y. H.; Yoo, Y. J.; Kim, E. J.; Yoon, Y. J. (2010). Genetic engineering of macrolide biosynthesis: past advances, current state, and future prospects. Appl Microbiol Biotechnol, 85, 1227-1239.
Quattro-LC-operator-training-course. Schleifer, K. H.; Kandler, O. (1972). Peptidoglycan types of bacterial cell walls and
their taxonomic implications. Bacteriol Rev, 36, 407-477. Skold, O. (2000). Sulfonamide resistance: mechanisms and trends. Drug Resist
Updat, 3, 155-160. Smith, D. L.; Johnson, J. A.; Harris, A. D.; Furuno, J. P.; Perencevich, E. N.; Morris, J.
G. (2003). Assessing risks for a pre-emergent pathogen: virginiamycin use and the emergence of streptogramin resistance in Enterococcus faecium. Lancet Infectious Diseases, 3, 241-249.
Spisso, B. F.; de Araujo, M. A., Jr.; Monteiro, M. A.; Lima, A. M.; Pereira, M. U.; Luiz, R. A.; da Nobrega, A. W. (2009). A liquid chromatography-tandem mass spectrometry confirmatory assay for the simultaneous determination of several tetracyclines in milk considering keto-enol tautomerism and epimerization phenomena. Anal Chim Acta, 656, 72-84.
Srinubabu, G.; Ratnam, B. V. V.; Rao, A. A.; Rao, M. N. (2008). Development and validation of LC-MS/MS method for the quantification of Oxcarbazepine in human plasma using an experimental design. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 56, 28-33.
Tenover, F. C. (2006). Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. American Journal of Infection Control, 34, S3-10; discussion S64-73.
Ungemach, F. R.; Mueller-Bahrdt, D.; Abraham, G. (2006). Guidelines for prudent use of antimicrobials and their implications on antibiotic usage in veterinary medicine. International Journal of Medical Microbiology, 296, 33-38.
Wan, E. C.; Ho, C.; Sin, D. W.; Wong, Y. C. (2006). Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem, 385, 181-188.
54
Wan, E. C. H.; Ho, C.; Sin, D. W. M.; Wong, Y. C. (2006). Detection of residual bacitracin A, colistin A, and colistin B in milk and animal tissues by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 385, 181-188.
Wang, J.; Leung, D. (2009). Determination of spiramycin and neospiramycin antibiotic residues in raw milk using LC/ESI-MS/MS and solid-phase extraction. Journal of Separation Science, 32, 681-688.
Waters (2005). Quattro premier XE. infobrochure. Zakeri, B.; Wright, G. D. (2008). Chemical biology of tetracycline antibiotics. Biochem
Cell Biol, 86, 124-136.