Post on 23-Sep-2019
Molekularno genetske preiskave pri AML
v Sloveniji
dr. Tadej Pajič, dr. Martina Fink, Marija Jedrt Mandelc Mazaj,
Špela Ţula, Nejc Lamovšek, Anica Mihajlović, prof. dr. Peter
Černelč
Specializirani hematološki laboratorij KO za hematologijo,
Interna klinika, UKC Ljubljana
Akutna mieloična levkemija
je bolezen v mieloično vrsto usmerjene krvotvorne celice (okvara mieloične multipotentne celice)
maligna klonska bolezen
razrast blastnih mieločnih celic, ki ne dozorevajo:
- v kostnem mozgu, krvi in drugih tkivih,
posledična odpoved KM anemija, trombocitopenija, nevtropenija
Molekularna patogeneza AML
Večstopenjska patogeneza
FLT3-ITD
FLT3-TKD
KIT
JAK2
RAS
PTPN11
RUNX1- RUNX1T1
CBFβ-MYH11
PML-RARA
preureditve gena MLL
CEBPA
NPM1
oslabljena (blokirana)
diferenciacija celic
AML
Proliferacija in/ali
preživetje
Aktivacija signalnih
poti v celici
Okvara transkripcijsko
ko-aktivatorskega kompleksa
Mutacije razreda I Mutacije razreda II
SZO razvrstitev AML
AML s ponavljajočimi genetskimi nenormalnostmi
AML z MDS sorodnimi spremembami
Mieloična neoplazija, posledica predhodnega zdravljenja (t-AML; t-MDS; t-MDS/MPS)
AML brez določene opredelitve (M0-2,M4-7,akutna panmieloza z mielofibrozo)
Mieloidni sarkom
AML pri Downovem sindromu
Novotvorba blastnih plazmacitoidnih dendritičnih celic
Swerdlow SH, Campo E, Lee Harris N, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW. WHO
Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues, IARC Press, Lyon, 2008
AML s ponavljajočimi genetskimi
nenormalnostmi
- AML t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
- AML inv(16)(p13.1q22) ali t(16;16)(p13.1q22);CBF-MYH11
- APL t(15;17)(q22;q12); PML-RARA
- AML t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL
- AML t(6,9)(p23;q34): DEK-NUP214
- AML inv(3)(q21q26.2) ali t(3;3)(q21q26.2); RPN1-EVI1
- AML t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1
Začasni entiteti:
- AML z mutacijo gena NPM1
- AML z mutacijo gena CEBPA
Citogenetske prognostične skupine AML
pri odraslih
Nizko tveganje
t(15;17)
t(8;21)
inv(16) ali t(16;16)
Visoko tveganje
del(5q)/-5
del(7q)/-7
inv(3)/t(3;3)
t(6;9)
t(v;11)(v;q23) – ne t(9;11)
t(9;22)
>3 citogenetske
nenormalnosti
Srednje tveganje
normalen kariotip
+ 8
t(9;11)
druge spremembe Prirejeno po NCCN Guidelines Version 2.2012 Acute Myeloid Leukemia
AML in citogenetske spremembe
Normalen
Inv16
t(8;21)
t(15;17) kompleksne
Visoko
tveganje
Druge
+8
Normalen
Inv16 t(8;21)
t(15;17)
kompleksne
Visoko
tveganje
Druge
+8
Bolniki < 60 let Bolniki > 60 let
~ 45 % AML z normalnim kariotipom (CN-AML) Heterogena skupina
AML z normalnim kariotipom
Mutacije Pojavnost
NPM1 45 do 62 %
FLT3-ITD 28 do 34 %
CEPBA 10 do 15 %
MLL-PTD 5 do 11 %
NRAS 9 %
FLT3-TKD 11 do 14 %
WT1 10 %
Genske ekspresije
- ERG
- BAALC
- MN1
Preiskave za opredelitev AML
Krvna slika
Citologija KM (histologija KM)
(citokemija)
Imunofenotipizacija
Citogenetika
Molekularna genetika: • postavitev bolezni,
• ocena prognoze,
• spremljanje minimalne preostale bolezni (MRD)
Molekularna genetski pristop pri postavitvi
diagnoze AML
Pomoč pri postavitvi diagnoze (v določenih primerih).
Opredelitev označevalca za spremljanje minimalne preostale
bolezni s kvantitativnim PCR.
Preiskave
• na osnovi kliničnih, morfoloških, imunofenotipskih podatkov
ciljano izvedemo preiskavo obratno prepisovanje in PCR (RT-PCR)
za prepise zlitih genov
PML-RARA, CBF -MYH11, RUNX1-RUNX1T1
• Presejalni in potrditveni multipleks RT-PCR:
Zaznamo več kot 80 specifičnih mRNA 28 najpomembnejših
kromosomskih sprememb pri levkemijah (mDx HemaVision).
• ? ? Določitev mutacij v genu NPM1 in CEBPA
Ocena prognoze AML
Mutacija FLT3 ITD
Mutacija v NPM1
Mutacije v CEBPA
Mutacije v KIT pri
AML s t(8;21)(q22;q22) in
AML s inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1q22)
Mutacija FLT3 ITD
Gen FLT3: fms-related tyrosine kinase 3
• kromosom 13q12.2;
• kodira zapis za transmembranski protein, ki ga uvrščamo v razred III družine tirozin-
kinaznih receptorjev; ima pomembno vlogo pri proliferaciji in preživetju zgodnjih,
nezrelih hematopoetskih celic
Mutacija FLT3 ITD (notranja tandemska podvojitev)
• Podvojitev ali tandemska insercija majhnega, različno velikega (3 do 400
nukleotidov) odseka gena FLT3.
• Povzroči konstitutivno aktivacijo receptorja; aktivacija je neodvisna od vezave
liganda na receptor
• Pojavi se v različnih citogenetskih podskupinah; pri CN-AML v ~ 30 %.
• Napovedni pomen pri CN-AML: NEUGODEN
• Identifikacija mutacije: PCR,
in gelska elektroforeza,
ki omogoča razlikovanje produktov
glede na velikost.
P P N N
Mutacija v NPM1
Gen NPM1: nukleofozmin - nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein
B23, numatrin)
• kromosom 5q35.1
• kodira zapis za fosfoprotein; predvsem v jedrcu celice, prehaja med jedrom in
citoplazmo
Večfunkcijski protein:
biogeneza ribosomov
odgovor na stresne dejavnike (hipoksija, UV)
ohranjanje genomske stabilnosti
regulacija aktivnosti in stabilnosti tumor supresorskih genov (npr. p53 in ARF)
regulacija transkripcije
Pomembna vloga v proliferaciji celic, v poteh zaviranja rasti celic in celični
diferenciaciji
Mutacija v NPM1
• večinoma insercija tetra/ali več nukleotidov v eksonu 12 gena NPM1.
• znanih več kot 40 mutacij; najpogostejše mutacije so tri: tip A (75-80%), B (~ 10 %)
in D (~ 5 %).
• povzroči nenormalno zadrževanje nukleofozmina v citoplazmi
• pojavi se v ~ 30 % novo odkritih AML; pri CN-AML v 50 do 60 %.
• 40 % bolnikov ima sočasno še mutacijo FLT3-ITD.
• napovedni pomen pri CN-AML: UGODEN, vendar če ni prisotne mutacije FLT3 ITD
• Identifikacija mutacije:
- presejalno: PCR in gelska elektroforeza,
ki omogoča razlikovanje produktov
glede na velikost.
- potrditev (za MRD): sekvenčna analiza
Mutacije v CEBPA
Gen CEBPA: CCAAT/pospeševalec vezavni protein alfa, CCAAT/enhancer binding
protein (C/EBP), alpha
• kromosom 19q13.1;
• kodira zapis za transkripcijski dejavnik; v hematopoezi ključen za regulacijo
granulopoeze; zaradi dodatnega notranjega startnega kodona se normalno sočasno se
izražata dve beljakovini (p42 in p30)
Utišanje gena CEBPA: rezultat visoke ravni metilacije otočkov CpG – Napovedni pomen
NEUGODEN ?
Mutacije v CEBPA
• duplikacije, insercije, delecije, točkovne mutacije (zamenjave nukleotidov)
• najdemo jih lahko v vsej kodirajoči regiji; glede na mesto notranjega startnega kodona
razlikujemo N- (nt od 1-360) in C- (nt od 361 do 1077; ref. Zap. NM_004364.2) terminalne
mutacije
• mutacije pri AML povzročijo izgubo funkcijske sposobnosti beljakovine CEBPA in
posledično blokado diferenciacije granulocitov; pojavi se v 5 do 9 % novo odkritih
AML; pri CN-AML v ~ 15 %.
Mutacije v CEBPA
• napovedni pomen pri CN-AML: UGODEN, če ni mutacije FLT3 ITD in sta prisotni dve
mutaciji v CEBPA (običajno N- in C-terminalni mutaciji in na različnem alelu-bialelni)
• Identifikacija mutacije: sekvenčna analiza DNA (po Bentahaus T. et al. BJH 2008;143:230-239.)
Naši preliminarni izsledki (ob vpeljavi metode): Dg. AML
Bolnik Starost/sp
ol
Mutacija CEBPA Genotip
NPM1/FLT3
BP 68 let/M Tiha T230 (c. 690G>T;
rs34529039), ni spr. AK
+/-
GV 58 let/M Mutacija c.649A>T
(p.217T>S), čaka na
potrditev
-/-
VRN 40 let/Ž NI -/-
JM 56 let/M Mutacija; čaka na
potrditev
+/+
GR 46 let/Ž NI +/+
ŠK 41let /M Tiha T230 (c. 690G>T;
rs34529039), ni spr. AK
-/+
KM 77 let/Ž Tiha T230 (c. 690G>T;
rs34529039), ni spr. AK
+/+
Bolnik JM; 56 let/M, Mutacija; katera?
Tiha mutacija rs34529039: frekv. minor alela 15,2%
v globalni populaciji (dbSNP) in 22% pri bolnikih s
AML (Green et al. JCO 2012; 28:2739-47).
Mutacije v KIT pri AML s t(8;21)(q22;q22) in AML
s inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1q22)
Gen KIT: v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog
• kromosom 4q12;
• kodira zapis za transmembranski protein, ki ga uvrščamo v razred III družine tirozin-
kinaznih receptorjev; po vezavi liganda se spremeni in aktivirajo se signalne poti v
celici, ki so vključene v proliferacijo, diferenciacijo in preživetje celice.
Mutacije v KIT pri AML s t(8;21)(q22;q22) in AML s inv(16)(p13.1q22) ali
t(16;16)(p13.1q22)
• večinoma v eksonu 17 (najpogosteje kodon D816) in eksonu 8
• ugotovimo v 20 do 40 %,
• Napovedni pomen: NEUGODEN, večje tveganje za relaps
• Identifikacija mutacije:
- mutacija D816V s alelno specifičnim PCR,
- sekvenčna analiza – v vpeljavi v redno delo
90 bp
184 bp
M S01wS01mS02wS02mKw+Km+Kw-Km-NTCmNTCwM
Citogenetske in molekularno genetske
prognostične skupine AML pri odraslih
Tveganje Citogenetika Molekularne nepravilnosti
Nizko inv(16) ali t(16;16)
t(8;21)
t(15;17)
CN-AML: mutacija NPM1 ali mutaciji v CEBPA brez sočasno prisotne mutacije FLT3 ITD
Srednje normalen kariotip
+ 8
t(9;11)
druge spremembe
t(8;21), inv(16), t(16;16): z mutacijo v KIT
Visoko >3 citogenetične nenormaln.
del(5q)/-5, del(7q)/-7,
t(v;11)(v;q23) – ne t(9;11),
inv(3), t(3;3), t(6;9), t(9;22)
CN-AML: z mutacijo FLT3-ITD
Prirejeno po NCCN Guidelines Version 2.2012 Acute Myeloid Leukemia
Spremljanje minimalne preostale bolezni
Molekularna genetika o Kvalitativna preiskava RT-PCR za določitev prepisa PML-RARA
o Obratno prepisovanje RNA (cDNA) in kvantitativni PCR (RT-qPCR) za
prepise zlitih genov :
PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1, CBF -MYH11
o RT-qPCR za določitev ravni izražanje (cDNA) gena Wilms Tumour 1 (WT1)
o RT-qPCR za določitev ravni celic z mutacijo v genu NPM1 (cDNA;
mutacija tip A, B in D) – NOVO!
Pretočna citometrija
– določanje z levkemijo povezanih aberantnih imunofenotipov na
levkemičnih celicah
HVALA ZA POZORNOST!