Doc. dr. sc. Mirna Curkovic Perica

Sveucilište u Zagrebu, Biološki odsjek PMF-a, Botanicki zavod sBotaničkim vrtom, Grupa za molekularnu mikrobiologiju

Marulicev trg 9a, 10000 Zagreb

Tel/Fax **385-1- 4843-851, e-mail: mirna@botanic.hr

-molekularna fitopatologija, kultura biljnog tkiva, transformacijabiljnih tkiva (bazična i primjenjena istraživanja – važnost zapoljoprivredu i šumarstvo)

-rak kestena (biološka kontrola)

-utjecaj bioaktivnih supstancija na biljne patogene – viruse i fitoplazme

-(haploidi i dihaploidi, fiziološke posljedice)

-transformacija biljnog tkiva – utjecaj na sekundarne produktemetabolizma i horizontalni transfer gena

Prirodni arealameričkogpitomog kestenaprije unosapatogena Prirodni areal europskog pitomog

kestena

Američkipitomi kesten –osjetljiv

Gljiva Cryphonectria parasitica –uzročnik raka kestenove kore - slabparazit na azijskim kestenima

Europski pitomi kesten – osjetljiv – ali gljivahipovirulentna zbog dsRNA u citoplazmi

Cryphonectria parasitica –karantenski organizam

izaziva rane na stablu, ljuštenjekore i odumiranje

hipovirus smanjuje virulentnostgljive i sposobnost njezinograzmnožavanja

mogućnost biokontrolehipovirusom ovisi o tipuvegetativne kompatibilnosti gljive injezinom načinu razmnožavanja,te o tipu i izolatu hipovirusa

Cryphonectria hypovirus

• dsRNA u citoplazmi gljive• nema strukturnih proteina

ni viriona• U Europi samo CHV1 (od 4

vrste identificiranesekvenciranjem)Modifikacija transkriptomagljive

Širenje hipovirusa krozpopulacije gljive

• Prirodno širenje:- vertikalno – kroz aseksualne spore

(konidije) 1-99%- horizontalno – fuzija hifa između

vegetativno kompatibilnih jedinki gljive• Ljudskom aktivnošću – pokušaji biokontrole

Test vegetativne kompatibilnosti• 2 su izolata kompatibilnaako im se hife spoje

• 2 su izolata nekompatibilnaako se između njih pojavibaražna linija i/ili linijapiknida

C. parasitica – spolno razmnožavanje

Oplodnja se događa samo između gameta koje imajurazličite alele na (bialelnom) MAT lokusu

Cilj rada• ispitati proširenost hipovirusa u populacijama gljive

Cryphonectria parasitica i napraviti molekularnukarakterizaciju izolata (već radi mr.sc Lj. Krstin)

• ispitati značajke populacija gljive C. parasitica koje utječu naširenje hipovirusa:

raznolikost vc tipovaocijeniti mogućnosti rasta broja vc tipovauloga spolnog razmnožavanja gljive u oblikovanjustrukture istraživane populacije kroz ispitivanje omjeraMAT alela (PCR)molekularna karakterizacija populacija pomocu “sequence-characterized amplified regions” (SCARs) markera (Daviset al. 2005) (multiplex PCR i gene analyser)

-transformacija gljive čitavim virusom ili dijelovim NA virusa

-biološka kontrola, primjena u šumarstvu

• Fitoplazme - biljni patogeniiz razreda Mollicutes(prokarioti bez staničnestijenke, slični mikoplazmama)

•Fitoplazme - uzročnici višestotina bolesti biljaka širomsvijeta

OGROMNE ŠTETE UPOLJOPRIVREDI (PRINOS IKVALITETA

•Istraživanja otežana, jer se fitoplazme ne mogu uzgojiti nahranidbenim podlogama (tek započela klasifikacijafitoplazmi) – karakterizacija fitoplazmi na lozi, voćkama,cvijeću...

- nepoznate metode za dobivanje biljaka oslobođenih odfitoplazmi

Krčenje bolesnih biljaka

Mehanizmi interakcije biljka-fitoplazma

• simptomi su posljedica poremećaja normalne hormonskeravnoteže

• utjecaj na ekspresiju određenih gena domaćinske biljke

METODE

• izolacija ukupnih nukleinskih kiselina (TNA)

• umnožavanje fitoplazmatskog gena za 16S rRNAugnježđenom lančanom reakcijom polimeraze (nestedPCR) koristeći univerzalne i specifične parove početnica

• analiza polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata(RFLP) i sekvenciranje

-uzgoj haploida iz polena

-testiranje na patogene

-fiziologija zaraženihbiljaka

-diploidizacija

Gene silencing u haploidimai dihaploidima (odgovor narazličite viruse)

Agrobacterium tumefaciens

Biljna stanica

gen za selekciju transformanata (nptII)gen za željeno svojstvo

Transformirana biljna stanica

Hranidbena podloga za selekcijutransformiranih biljnih stanica

regeneracija biljaka iztransformiranih stanica

Dobivanje biljaka željenih svojstava. Transformirane biljnestanice selekcioniraju se na hranidbenoj podlozi s dodatkom antibiotika.Iz transformiranog tkiva moguce je potaknuti regeneraciju biljakapomocu biljnih regulatora rasta. Sve stanice regenerirane biljke sadržegen za željeno svojstvo, ali i gen za rezistenciju na antibiotik.

horizontalni transfer gena iztransformiranih biljaka unemodificirane, te u prirodnokompetentne bakterije u tlu

HPLC, vakumski uparivac

multifunkcionalni mikrotitarski citac fluorescencije, spektrofotometar

termostatirana tresilica, vodena kupelj s tresilicom

inkubator, autoklav, Millipore sustav za procišcavanje vode

Eppendorf centrifuga s hladenjem (ultracentrifuga)

PCR uredaji

oprema za razlicite izvedbe elektroforeze

UV-transiluminator, VIS-transiluminator, polaroid kamera

mini centrifuge, analiticka vaga, pH-metar, vrtložne mješalice

sterilna komora (laminar)

zamrzivac (-80°C), hladna komora, hladnjaci, zamrzivaci

mikroskopi (elektronski mikroskop)