Post on 06-Sep-2019
Molekulare Diagnostik
1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Krankheitserreger und ihre Diagnostik
•Bakterien
•Viren
•Parasiten/Protozoen
•Pilze
•Prionen
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Definitionen
• Pathogene (Krankheitserreger, Keim)– Mikroorganismus oder Virus welcher eine infektiöse Krankheit
hervorrufen kann
• Mikroorganismen (Mikroben)– Mikroskopisch kleine Lebewesen (ausgenommen Viren)
• Infektion– Eindringen und Vermehren einer Mikrobe in einem Makroorganismus
• Virulenz– Maß der krankmachenden Eigenschaft eines Pathogens (auch
Bakterien)
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Übertragungswege
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Virulenzspektrum
Klinische Auswirkung:•Poliomyelitis bei Kindern: 0.1-1%•Röteln: 50%•Tollwut: 100%
AsymptotischeAsymptotischeInfektionInfektion
Klinische FKlinische Fäällelle
Latente InfektionLatente Infektion
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Todesursachen im Vergleich Europa / Afrika
WHO, World Health Report 2002, Geneva, 2003
6%8%
86%
Infektionen,perinatale Urs.,ErnährungTumor, D.m., KHK,cerebrovask.,Psych.Verletzungen,Unfälle, Straftaten
71%
22%7%
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6Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
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Bakterien• Einzeller• Simple Struktur (Plasmamembran, keine Organellen)• Einteilung in grampositive und –negative Bakterien• Feinere Einteilung nach Morphologie (Kokken, Spirillen)
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Koch's postulates (1876):
•The microorganism must be found in abundance in all organisms suffering from the disease, but should not be found in healthy organisms.
•The microorganism must be isolated from a diseased organism and grown in pure culture.
•The cultured microorganism should cause disease when introduced into a healthy organism.
•The microorganism must be reisolated from the inoculated, diseased experimental host and identified as being identical to the original specific causative agent.
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Bakterielle Krankheiten
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10Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Mechanismen bakterieller Pathogenizität
• Invasion– Kolonialisierung (Adherenz (Adhesine) und
Multiplikation)– Produktion von Substanzen, welche die Invasion
unterstützen (Invasine)– Entwicklung von Resistenz gegen Immunantwort des
Wirtes
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11Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
A macrophage extends a semiliquidprojection (a so-called pseudopodium) towards some bacteria in the foreground.
Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH
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• A series of images shows (top left to bottom right) the process – called phagocytosis – by which some bacteria are ingested by a macrophage.
Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH
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Mechanismen bakterieller Pathogenizität
• Invasion– Kolonialisierung (Adherenz (Adhesine) und
Multiplikation)– Produktion von Substanzen, welche die Invasion
unterstützen (Invasine)– Entwicklung von Resistenz gegen Immunantwort des
Wirtes• Toxigenizität
– Exotoxine (von Bakterien freigesetzt)– Endotoxine (ursprünglich nicht freigesetzt, können
aber auch in Zirkulation gelangen)
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Beispiele für Exotoxine
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Bakterielle Krankheiten• Tuberkulose• Cholera• Pest• Keuchhusten (Pertussis)• Botulismus• Lepra• Tetanus• Streptokokken• Staphylokokken• Neisserien
GonokokkenMeningokokken
• Enterokokken
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Diagnostik bakterieller Krankheiten•Kultivierung auf Nährmedium
•Mikroskopie von Patientenproben• z.B. Gram-Färbung
•ELISA zur Detektion von Exotoxinen
•Real time PCR und/oder Sequenzieren zur Detektion bakterieller Nukleinsäuren• meistens: 23S oder 16S ribosomale RNA gene• Spezifische Gene (Heat shock proteins)• Spezies-spezifische Gene• Antibiotika-Resistenz-Marker (Bsp.: MRSA)
•Microarrays zur Multiplex-Detektion• Hybridisierung bakterieller DNA• Antikörper-Mikroarrays zur Detektion von Antigenen
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Definition „Virus“Viren sind keine echten Lebewesen, sondern
replikationsfähige Nukleoproteinkomplexe
Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel
Viren sind für ihre Vermehrung (Replikation) auf eine Wirtszelle angewiesen
Viren vermehren sich nicht durch Zweiteilung, sondern durch Zusammenlagerung (assembly) der einzelnen Molekülkomponenten
Viren besitzen im Allgemeinen nur eine Art von Nukleinsäure (DNA oder RNA)
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Viren• Die meisten viralen Infektionen verlaufen subklinisch!!!
Ausbruch der Krankheit auch für Virus lebensbedrohlich.• Jeder Virus kann nur in bestimmten Zelltypen oder Geweben überleben.
• Virale Replikation:– Adsorption– Penetration– Enthüllung– Replikation des Genoms– Reifung– Freisetzung
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Einteilung von Viren
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Viren• DNA Viridae
Parvo- (Fetusfehlbildung, Hauterkrankungen)
Papova- (Papillomaviren: Warzen, Zervixkarz.)
Adeno- (Erkältungen, Durchfall)
Herpes-Alpha-Virinae (orale, genitale Erkrankung, Windpocken)Beta-Virinae (CMV: Fieber, Lungen-, Leber-, Netzhautentzündg.)Gamma-Virinae (Epstein Barr Virus: Pfeiffer-Drüsenfieber)
Pox- (Pocken)
• BakteriophagenViren, deren Wirte Bakterien sind
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• RNA ViridaePicorna-
Enterovirus Poliomyelitis V-Kinderlähmung, Coxsackie-V-abakterielle Meningitis, FieberHepatitis A (Serotyp 72)-Hep A
Revo-Rota- und Coloradoviren (Magen-Darmtrakt)
Paramyxo-Paramyxo V
Mumps-VirusMorbilli V
Masern-VirusRinderpest-VirusHundestaupe-Virus
Pneumo VMäusepneumonie-Virus
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• RNA ViridaeRhabdo-
Vesiculo VLyssa V
Tollwutvirus (Virus gelangt ins ZNS-bis zur Herzlähmung)
Bunya- (fieberhafte Erkrankungen)
Toga-Alpha-VFlavi-V (West Nil V, FSME:Frühsommer-Meningo-Enzephalitis, Gelbfieber)
Rubi-V (Rötelnvirus-Missbildungen in Schwangerschaft)
Retro-Spumavirinae (biolog. Wirkung unbekannt)
Oncovirinae (für Mensch und Tier gefährlich-Krebs)
Lentivirinae (HIV-AIDS)
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Diagnose von Viren• Virusisolierung (Anzüchten in Tieren, Bakterien- oder Zellkultur)• Direkter Virennachweis (Elektronenmikroskop, Nukleinsäuren)• Indirekter Nachweis (Plaquemethode)• Serodiagnose (z.B. ELISA zum Antiköpernachweis: IgG, IgM)
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VirusisolierungEventuell infiziertes Probenmaterial (z.B. von Menschen) wird auf Testsysteme übertragen:
Hühnerembryonen (bebrütete Hühnereier-selten)SäuglingsmäuseZellkulturen (Monolayer)
Das Auftreten von typischen Krankheitssymptomen im Testsystem zeigt Virus in Probenmaterial an:
CPE (zytopathischer Effekt)Plaques (Lysen)
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Direkter Virusnachweis• Elektronenmikroskopie (hohe Viruskonz. nötig)
PockenvirenRotavirenCoronaviren (SARS)
• Elektronenmikroskopische Viruspartikelzählung (Zugabe einer bekannten Menge an Latexpartikeln-interner Standard)
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Indirekter Virusnachweis• Plaque Methode
Aussäen von Monolayer auf festem Nährboden (Agar)
Infektion mit Probenmaterial (verschiedene Verdünnungen herstellen)
Virus lysiert Zelle, diese wiederum nur Nachbarzellen, dabei entstehen Plaques (Löcher im Zellrasen)
Pro Virus entsteht ein Plaque
Automatisches Zählen von Plaques durch „colony counting“
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28Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Serodiagnostik
• Komplementbingungsreaktion (KBR)• Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Neutralisationstest (NT)• Immunfloureszenz• Nukleinsäurehybridisierung
• Diagnostik Influenza Virus
Nachweis von Antikörper gegen den Virus
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29Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Komplementbingungsreaktion (KBR)• Patientenserum (inaktiviert)
zufügen von Testantigenen mit bekannter Menge
• Sind Antikörper im PatientenserumKomplex aus Antigen und Antikörper bildet sich
Zugabe von Komplement, gefolgt von Erythrozyten und Antikörper: Kein Farbumschlag-Infektion:
Sind Antikörper im Patientenserum, bindet das Komplement zur Gänze an den entstandenen Antikörper-Antigen Komplex-Kein Komplement übrig für die Hämolyse der Erys!
Farbumschlag-keine InfektionSind keine Antikörper im Patientenserum, bindet Komplement an die Erys, es kommt zur Hämolyse, diese zeigt somit an, dass keine Infektion besteht!!
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31Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Hämagglutinine sind Oberflächenstrukturen mancher Viren
(Rötelvirus)• Hämagglutinine verklumpen rote Blutkörperchen (Agglutination)• Vom Körper gebildete Antikörper richten sich gegen diese
Hämagglutinine
• Testprinzip: Patientenserum werden Hämagglutinine zugegebenAntikörper in der Patientenprobe: Hämagglut. werden
gebunden. Eryzugabe führt zu keiner AgglutinationKeine Infektion: Hämagglutinine binden an zugegebene
Erythrozyten: Agglutination
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33Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Neutralisationstest (NT)
• Testprinzip: Patientenprobe wird def. Menge an Antigen (zu testendes Virus z.B.) zugegeben.
Infektion: Antikörper der Patientenprobe neutralisieren zugegebenes Antigen und Lösung ist nicht mehr imstande Zellkultur zu infizieren.
Keine Infektion: Keine Antikörper, damit wird zugegebenes Antigen nicht von Patientenprobe neutralisiert und kann damit Zellen infizieren!!
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Immunfluoreszenz• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum• Testprinzip: empfindliche Zellkultur wird mit dem zu
untersuchenden Virus infiziert
Zugabe von Patientenserum: Bei Infektion: Antikörper des Serum neurtalisieren Virus und Zellen werden nicht zytopathischKeine Infektion: keine Antikörper, daher ist Virus imstande Zellen zu infizieren
Zugabe von fluoreszensmarkierten Antikörpern, die den Erstantikörper binden
Bei Infektion: Antikörper-Antikörper Komplex, damit enststeht Fluoreszenz, im Mikroskop zu beobachten.Keine Infektion: Kein Erstantikörper, keine Bindung an fluoreszenzmarkierten Antikörper möglich, keine Fluoreszenz
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35Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
NukleinsäurehybridisierungDient dem Nachweis viraler Gene in der Patientenprobe
Testprinzip Southern Blot:DNA aus Patientenprobe wird isoliert, fragmentiert, auf Gel
aufgetragen und auf Nitrozellulose geblottet. Verwendung radioaktiv markierter Gensonden (DNA Fragmente
des nachzuweisenden Virus) zur Hybridisierung mit der Blot-DNA.
Infektion: es kommt zu einer Hybridisierung, auf der Photoplatteentstehen Schwärzungen
Keine Infektion: Gensonden sind nicht homolog zur Patientenprobe, keine Hybridisierung, keine Schwärzung.
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36Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Sothern blot:
Molekulare Diagnostik
37Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Microarrays zur parallelen Detektion mehrerer Pathogene
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38Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Diagnostik Influenza VirusNachweis viraler Antigene
• Nur 1-4 Tage nach Krankheitsbeginn möglich!• Proben: Nasen-, Rachen-, Alveolarsekret
ImmunfluoreszenzELISAVirusanzucht in Zellkultur
• Hoch spezialisiert, nur in wenigen Labors möglich:PCR
Retrospektiv: serologischer Antikörpernachweis
KBR, ELISA, Immunfloureszenz