Post on 31-Oct-2018
Microscòpia de fluorescència
Marta Valeri-Sala, MSc, Biòloga
Responsable de la Unitat de Microscòpia
UAT - VHIR
Fluorescència Diagrama de Jablonski
S1’
S1
S0
1 3
2
Es tracta d’un tipus de luminiscència on, seguidament a l’absorció de
l’energia de la llum es produeix una emissió d’una longitud d’ona major
durant un curt període de temps (nanosegons).
Fluorescència Fluorocroms
Cromòfors
Els grups cromòfors són aquells components de les molècules capaços d’absorbir
la llum.
Generalment es tracta d’anells aromàtics.
Fluorescència Fluorocroms
Espectres dels fluorocroms
Stokes shift: descriu la diferència d’energia entre l’espectre d’emissió
i el d’absorció.
A major nº d’Stokes, major resolució espectral.
Fluorescència Fluorocroms
Propietats dels fluorocroms
Coeficient d’extinció molar ( e )
El coeficient d’extinció molar es calcula a una longitud d’ona concreta que coincideix
amb el seu màxim d’absorció.
Producció quàntica ( Q )
És la capacitat que tenen els fluorocroms d’absorbir fotons quan són excitats.
És la capacitat que tenen els fluorocroms d’emetre fotons quan aquests han estat
absorbits.
La intensitat de fluorescència emesa per un fluorocrom és proporcional al producte de
e x Q.
Fluorescència Fluorocroms
Propietats dels fluorocroms
Fotodestrucció
És la disminució de la intensitat de fluorescència de la mostra degut a la destrucció
irreversible d’un fluorocrom excitat.
Fer servir agents antifading en la preparació o fer servir
fluorocroms més resistents.
Està directament relacionada amb la intensitat d’excitació i el temps durant el qual
estem il·luminant la mostra.
Per reduir el seu efecte
es pot: Disminuir la intensitat de la llum excitadora i/o reduir el temps
d’adquisició.
Fer servir objectius d’elevada NA i/o filtres de banda ampla.
Fluorescència Fluorocroms
Propietats dels fluorocroms
Quenching
Es refereix, en general, a qualsevol procés que causi la reducció de la producció
quàntica d’un fluorocrom. Es produeix una pèrdua de fluorescència degut a la
transferència d’energia no radiant.
Es produeix bàsicament per la interacció amb l’entorn on es troba el fluorocrom.
FRET
Fluorescència Fluorocroms
Quantums Dots
Feature Benefit
Bright, photostable Ultrasensitive, even single molecule
detection possible.
Large Stokes Shift Avoid autofluorescence and can be
used with other fluorescence markers.
Same excitation range (UV-
Violet, 405 nm laser)
Multiplexing off single excitation
source.
Inert and Biologically stable Long term in vivo tracking.
Small animal in vivo imaging.
Emissions across the
spectrum, 525, 545, 565,
605, 655, 705, 800 nm.
Many choices for multiplexing and
multiparameter labeling.
Fluorescència Fluorocroms
Tria dels fluorocroms:
S’ha de saber el tipus i configuració del microscopi que farem servir.
S’haurien d’intentar evitar les zones de l’espectre on hi hagi
autofluorescència provinent del propi teixit o de la mostra.
Quan es trien sondes s’haurien de triar aquelles que siguin específiques de
molècules diana i que minimitzin la toxcicitat cel·lular.
Intentar escollir fluorocroms que tinguin espectres d’excitació i emissió
estrets (multicolor assay).
Triar fluorocroms amb una bona eficiència quàntica i que no es
descomposin ràpidament (fotoestables).
Millor descartar els fluorocroms de primera generació ( ex: FITC vs
Alexa488…).
Fluorescència Microscòpia
Microscòpia d’epifluorescència
convencional
Microscòpia Làser Confocal
Microscòpia spinning disk
Microscòpia multifotònica
Deconvolució
Microscòpia super-high resolution
Fluorescència Microscòpia
Compromís
Resolució espacial
Sensibilitat
(ràtio senyal/soroll de fons) Velocitat d’adquisició
Wide-field (CCD)
Scannig
Confocals (PMT)
Fluorescència Microscòpia Wide field
Sistema òptic
Filtre d’excitació
Mirall dicroic
Filtre d’emissió
Objecte Imatge
Pla focal
Fluorescència Microscòpia
El principi de confocalitat
En microscòpia de fluorescència convencional
El punt de focus es sobreposa amb els que estan fora de focus.
Hi ha reducció de la resolució lateral i axial.
Hi ha reducció del contrast de la imatge.
Objecte Imatge
Pla focal
Fluorescència Microscòpia
El principi de confocalitat
En microscòpia confocal, els dos pinholes s’insereixen en plans focals
conjugats
S’elimina la llum dispersa dels plans no focals.
S’incrementa la resolució axial i lateral.
Es poden obtenir seccions òptiques i fer reconstruccions 3D.
Les imatges tenen més contrast i nitidesa.
Fluorescència
Resolució lateral Resolució axial Resolució lateral Resolució axial
Fórmula 0.61 lem/NA 2 n lem/NA2 0.4lem/NA 1.4 n lem/NA2
63X 1.4NA oil l488 213nm 756nm 140nm 530nm
Mida píxel 93nm 328nm 61nm 230nm
Resolució
Interval de rastreig seguint el criteri de Nyquist: ≤ r /2.3
Microscòpia de
fluorescència
Microscòpia
confocal
Microscòpia WF vs Confocal
WF MLC
Fluorescència
Microscòpia de fluorescència vs confocal
Captura simultània de
tota la imatge.
Captura de la imatge
punt per punt.
Velocitat d’adquisició WF > Velocitat d’adquisició MLC
Microscòpia WF vs Confocal
Imatges monocromes
Imatges policromes
CCD de superfície: Xips de polisilici on els píxels es disposen en forma de matriu.
L’adquisició de la imatge és simultània.
Fluorescència Microscòpia Widefield
Detecció: càmeres CCD
Gain de la càmera
IS0 100, 200...
Fluorescència Microscòpia Confocal
Detecció: PMT
Es tracta d’una superfície capaç d’emetre electrons
com a resposta a la incidència de fotons.
Aquests electrons són accelerats i multiplicats en
etapes successives per generar un corrent elèctric
mesurable que posteriorment serà digitalitzat al
convertidor analògic- digital.
Rep seqüencialment la llum emesa per la mostra.
Hv
Gain
Imatge digitalitzada
Microscòpia Imatge digital
S’hauria de tractar com un objecte matemàtic ja que és una matriu de números on el
valor numèric m(x,y) es tradueix en el valor d’intensitat de gris de la imatge al punt (x,y).
60 70 115
65 80 123
69 110 125
39
82
83
103
88
59
112
96
67
35
73
72
60
120
40
218
229
169
228
236
194
229
237
197
231
241
200
Resolució espacial Resolució cromàtica
Microscòpia Microscòpia WF vs Confocal
WF MC
Il·luminació simultània de tota la mostra.
Incidència simultània de la llum emesa
de tota la mostra en tot el CCD.
Detecció mitjançant càmera CCD.
Obtenció de seccions òptiques no
confocals, és a dir, amb contaminació de
la llum emesa provinent dels plans fora
de focus.
Il·luminació de la mostra punt per punt.
Rastreig de la mostra punt per punt i
detecció seqüencial de l’emissió.
Detecció mitjançant PMT.
Obtenció de seccions òptiques amb
informació únicament provinent del pla focal.
Microscòpia Microscopis Institut de Recerca
Widefield
Nikon Eclipse TE-2000-S
Olympus IX71
FSX100
DICT
Contrast Fases
- Microscopi d’alta velocitat
- Platina motoritzada (diferents
condicions, n significativa)
-Control de Condicions ambientals
(Tª i C02)
- Stacks en Z sense treure
informació fora de focus
Olympus BX61
CellR
Microscòpia Microscòpia WF vs Confocal
Tècniques de contrast (DICT , contrast de fases)
Són tècniques que presenten una fototoxicitat mínima.
Es fan servir per assajos de llarga durada, de migració i wound-healing.
Tècniques de marcatge fluorescent
Wide filed convencional: es fan servir per assajos d’alta resolució temporal
Bona ràtio S/N: obtenim imatges ben contrastades.
Possibilitat de marcar diferents molècules diana.
Es fa servir sovint en assajos en viu.
Es poden aplicar algoritmes de deconvolució de la imatge per millorar
el contrast.
CellR
Laser Scanning Confocal: es fa servir per assajos d’alta resolució espacial
Eliminació del senyal fora de focus.
Adquisicions 3D combinades amb t i l.
Tot i que els làsers són més invasius, també es poden fer adquisions en viu.
FV1000
Microscòpia CellR
Dr. Héctor G Palmer
Cèl·lules mare i càncer
Histones Fluorescents
Objectiu: 40X
Mida píxel: 0,2 micres
Temps exposició: 800ms
NºCamps: 64
Tipus d’imatge: FL / DICT
Interval de temps: 20min
Temps: 7,6h (550
frames/camp).
Microscòpia CellR
Dr. Kim Petersen
Factors de creixement i càncer
Objectiu: 10X
Mida píxel: 0,8 micres
Temps exposició: 500ms
(534ms)
Nº camps: 27
Tipus d’imatge: FL / DICT
Interval de temps: 15 min
Temps: 75h (272
frames/camp).
Cell GFP positives
Microscòpia CellR
Dra.María López Cavanillas
Teràpia del cor
Cordó de teixit cardíac
Objectiu: 4X
Mida píxel: 2micres
Temps exposició:
80ms
Nºcamps: 1
Tipus d’imatge: BF
Interval de temps: free
run
Temps: 32s (400
frames).
Microscòpia CellR
Fototoxcicitat
La causa majoritària és deguda a la formació de radicals d’oxigen degut a la transferència
d’energia no radiant dels fluorocroms en interaccionar amb l’entorn.
La longitud d’ona d’excitació i la seva intensitat i durada estan fortament correlacionades
amb la fototoxcicitat i per tant és conveninent triar fluorocromos que s’excitin a longituds
d’ona grans i disminuir el temps d’exposició i la intensitat de la font llumínica.
Disposar de sistemes de detecció altament sensibles.
Observar amb objectius d’obertura numèrica elevada.
Disminuir el factor de zoom.
Paràmetres del microscopi
Paràmetres ambientals
Comprovar les condicions fisiològiques : estabilitat de la temperatura i pH.
L’evaporació afecta a l’osmolaritat.
Microscòpia
Spinning disk
El pinhole de detecció es substitueix per un
disc giratori amb centenars d’obetures
agrupades en parells.
La font d’il·luminació no ha de ser
necessàriament un làser.
La velocitat de captura pot arribar fins a 360
imatges per segon.
El disc giratori tant sols transmet un 1% de la
il·luminació i es generen imatges molt tènues.
El gruix de la secció òptica és superior al gruix
obtingut amb microscòpia làser confocal.
Microscòpia
Microscòpia
Microscopi Multifotó
S’aconsegueix excitar un fluorocrom amb l’absorció
de dos o més fotons de menor energia que, sumats,
aconsegueixen l’energia suficient per excitar els
electrons del fluorocrom.
Es fa servir un làser intermitent (polsos de durada molt
curta però enorme densitat):
Femtosegons (100)
Picosegons (10)
Només s’il·lumina el pla focal que es captura.
S’excita amb fotons infrarojos: Menor toxcicitat
Major poder de
penetració
Permet estudiar processos en cèl.lules vives i
teixits sense infringir un mal significatiu:
Microscòpia