Post on 15-Sep-2018
Les outils non génétiques de diagnostic pour les Maladies Rares
Roseline Froissart
Laboratoire des Maladies Héréditaires du Métabolisme
et Dépistage Néonatal
Centre de Biologie Est
Hospices Civils de Lyon
Bron
24 Octobre 2012
Maladies rares
• Difficultés du diagnostic
– Extrême diversité des maladies
– Hétérogénéité pour une même maladie • Expression à tout âge (anténatal / adulte)
– Complexité
• Approche multidisciplinaire (expertise)
– Clinique
– Anatomopathologique
– Biochimique
– Génétique
Les différentes étapes d’une analyse
Demande d’analyse
avec données cliniques Prélèvement
(respect des conditions)
Envoi au laboratoire (délai
de transport)
Réception et identification
Préanalytique
(centrifugation, isolement des leucocytes, stockage)
Analyse Contrôle de qualité
(interne, +/- externe)
Recueil des résultats
Interprétation
Compte-rendu écrit
Réponse du biologiste
Diversité des prélèvements
• Sang (sérum, leucocytes, lymphocytes…)
• Urines
• LCR
• Biopsie organe (muscle, foie..)
• Biopsie de peau (culture de cellules, microscopie électronique…)
• Villosités choriales, cellules amniotiques (diagnostic prénatal)
– Sang foetal
• Sang séché sur papier buvard (Guthrie)
Le prélèvement de Guthrie
Prélèvement de sang déposé sur buvard: Au talon pour dépistage néonatal systématique à J3 Au bout du doigt Sang veineux (prise de sang) déposé sur papier
Après séchage, transport à température ambiante
Excellente conservation (métabolites, enzymes, protéines…)
Utilisation d’un spot de 3mm de diamètre (environ 2,5µl sang total)
Méthodes de diagnostic
Analyses « de routine »: orientation
• Glycémie, corps cétoniques, ammoniémie, acide lactique, cholestérol, triglycérides, acide urique, enzymes hépatiques, CPK, LDH…..
Bien réalisé peut orienter vers un type de pathologie
• Numération/Formule sanguine, frottis sanguin (cellules de surcharge …)
Examen anatomopathologique • Etude morphologique
• Batterie standard de colorations
• Techniques spéciales: enzymo-histochimiques (enzymes) et immuno-histochimique (antigènes), en fonction renseignements cliniques et hypothèses diagnostiques
• Orientation ou diagnostic
Podocytes, HE, x600 Dr R. Bouvier, Lyon
Déficit enzymatique dans une voie métabolique
7
GENES G1 G2 G3
ENZYMES E1 E3 E2
METABOLITES A B C D
Déficit enzymatique dans une voie métabolique
8
GENES G1 G2 G3
ENZYMES E1 E3 E2
METABOLITES A B C D
Accumulation Déficit
Méthodes de diagnostic
Métabolites:
Anomalie: reflet déficit enzymatique ou transporteur
• Urines, plasma, LCR…
• Qualitatif: examen d’orientation
chromatographie couche mince
électrophorèse……
OLIGOSACCHARIDES (urines) Chromatographie couche mince
Mucopolysaccharidose type I
11
MPS IV
MPS I
MPS III
Profil normal
Profil normal
Malade
Malade traité
HS
KS
CS
DS
MPS III
Exploration biochimique par
méthode globale : profil des
mucopolysaccharides
urinaires (électrophorèse,
colorimétrie)
Mucopolysaccharidose de type I :
maladie de surcharge lysosomale
liée à un déficit en -L-
iduronidase, transmission
autosomique récessive
Traitement : perfusion d’enzyme
produite par génie génétique
Méthodes de diagnostic
Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur
• Urines, plasma, LCR
• Qualitatif: examen d’orientation
chromatographie couche mince, électrophorèse…
• Quantitatif: méthodes complexes
– Spectrométrie de masse en tandem MS/MS (acides aminés, acylcarnitines, hormones…..)
– Spectrométrie de masse couplée à la chromatographie gazeuse : GC-MS (acides organiques…)
Analyse protéique
Etude génétique souvent dans un 2° temps (si test biochimique fiable)
Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)
• Implantation dans les laboratoires de diagnostic depuis environ 20 ans
• Séparation très fine d’un grand nombre de métabolites qui peuvent être quantifiés (étalon interne du composé à doser, marqué par isotope stable)
• Injection directe ou étape de séparation (chromatographie liquide)
• Composition: source d’ionisation / 2 quadripôles en série / détecteur
Principe MS/MS
– Principe: séparation des molécules (préalablement ionisées) en
fonction de leur rapport masse/charge (m/z)
– Source Electrospray (ESI): ionisation à pression atmosphérique
des métabolites à analyser, mode positif [M+H]+ ou négatif [M-H]-
– Triple quadripôle
• Q1 détermine le poids moléculaires des ions (ions parents)
• Q2 est une chambre de collision : fragmentation des ions
• Q3 analyse les fragments produits par Q2 (ions fragments)
– Détecteur : multiplicateur d’électrons
Q3 D ES
I
Q1 Q2
Source
d’ionisation
Echantillon
m/z
Ab
on
da
nce
Analyseur Détecteur
*
* * * * *
C0
C2
C8
C10:1
* *
déficit en MCAD (beta-oxydation des acides gras à chaîne moyenne)
* * *
*
* *
Control *
* * * *
*
C0
C2
* *
C3 C4 C5
C6
15
*Étalons internes (acylcarnitines deutérées)
MS/MS
Avantages: – Spécificité
– Grande sensibilité
– Grande variété des applications (sur un même appareil)
– Multiplex: dosage simultané de nombreux composés
– Analyse de nombreuses molécules sur faible volume d’échantillon (ex: quelques µl de sérum, tache de sang…)
– Temps d’analyse court (2’ au lieu de 2h pour Phénylalanine): de nombreux pays l’ont adopté pour le dépistage néonatal
– Ex: acides aminés: 15’ pour identifier 76 composés (avant: 2h30 avec moins de composés)
– Ex: Profil des acylcarnitines: 30 maladies testées en 3’ (temps machine)
MS/MS
Limites:
– Composés ionisables
– Séparation préalable indispensable si composés isomasses
– Étapes préparatives de l’échantillon (extraction, purification…), assez longues
– Coût: investissement important >200.000 euros mais coût des réactifs faible
– Personnel qualifié: technicien spécialisé et interprétation des données nécessitant un niveau d’expertise élevé
– Ingénieur nécessaire (appareillage sophistiqué)
Méthodes de diagnostic
Métabolites: reflet déficit enzymatique ou transporteur
• Urines, plasma, LCR
• Qualitatif: examen d’orientation
chromatographie couche mince, électrophorèse…
• Quantitatif: méthodes complexes
Analyse protéique
• Cellules sanguines, cultivées, tissus, plasma…
• Western blot: CDG, protéines musculaires…
• Etude enzymatique (activité): MS/MS (multiplex), fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif…
Etude génétique souvent dans un 2° temps
Western blot • Principe: séparation des protéines par électrophorèse + Immunodétection =
séparation en fonction du poids moléculaire
• Intérêt pour protéines non enzymatiques
• Analyse qualitative et quantitative
• Ex: CDG (Carbohydrate Deficient Glycoprotein):
= anomalies de glycosylation des glycoprotéines
• Diagnostic de certaines myopathies Ex: dystrophine (taille, quantité)
• Limites: peut être normal
80 kDa
77 kDa
74 kDa
N CDG I CDG II
Western Blot (transferrine)
Etudes enzymatiques • Utilisation substrat spécifique:
– fluorimétrie, colorimétrie, substrat radioactif
– MS/MS (multiplex)
• Recherche déficit
• Activité résiduelle: seuil?
– Il peut être difficile de différencier un malade et un hétérozygote (non atteint): rare
• Enzyme non mesurable (activité trop faible)
• Enzyme exprimée dans un seul tissu (ex: foie, rein, cerveau…)
• Pseudodéficits (variants non pathologiques)
• Déficits multiples (sulfatases)
• Déficits protéines activatrices
• Tissu ou cellules fraîches parfois nécessaires
Contrôle de qualité/ Validation
• Interne (échantillon normal, pathologique, étalon interne)
• Externe (ERNDIM….)
• Validation de méthode
– Chaque labo valide sa méthode (protocole peut être variable d’un labo à l’autre)
– Valeurs usuelles (parfois fonction de l’âge)
– Connaître les limites de chaque test (faux positifs et faux négatifs)
Expertise
• Un résultat normal exclut-il le diagnostic?
• Un résultat anormal affirme t’il le diagnostic?
• Confrontation à la clinique
• Si conclusion impossible:
– Nouveau prélèvement
– Analyse complémentaire: autre méthode biochimique, étude génétique
• Pas d’intérêt à multiplier les labos
– Surtout important pour des maladies rares!
– Plusieurs biologistes doivent être formés
Pourquoi est ce parfois si long?
• Sauf urgence+++ si urgence vitale et si maladie traitable (étude métabolites)
• Analyses très spécialisées • Techniques manuelles chronophages • Analyses regroupées pour raisons économiques (séries) • Analyses faites à fréquence variable • Faites par peu de laboratoires
– (ex: sulfite oxydase: 2 laboratoires dans le monde)
• Vérification parfois nécessaire • Autre technique requise • Temps de culture
Risques de passer à côté du diagnostic?
• Qualité du prélèvement – Conservation (enzymes+++) – Ex: urines: lactates d’or bactérienne ou endogène – Labilité du composé (ex: sulfocystéine, homocystéine…)
• Moment du prélèvement – Normalisation biochimique peut exister entre les crises (AA, AO, cycle de
l’urée…): prélever au moment accès aigu ex: déficit beta-oxydation des acides gras, cycle de l’urée (OCT)
– Intérêt de prélèvement avant toute mesure thérapeutique (quand une maladie métabolique est suspectée)
• Formes tardives et frustes: dialogue avec le clinicien +++ – Ex: acidémie glutarique – Déficit enzymatique partiel – Profils atypiques
• Nécessité d’une expertise pour chaque test et pour un diagnostic dans son ensemble (réseaux nationaux)
Conclusions
• Les résultats doivent être interprétés par le biologiste
• Garder l’expertise biochimique même pour les maladies très rares
• Etude génétique: permet de confirmer ou est nécessaire au diagnostic
• Utilité des tests biochimiques +++ pour confirmer les résultats des explorations génétiques (séquençage haut débit)
• Techniques récentes mais coûteuses et d’interprétation difficile (non disponible en labo de diagnostic): – Spectro RMN in vitro (nouvelles maladies identifiées)
– MALDI/TOF
• Identification de nouveaux biomarqueurs (« omique »)