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MODULO IX.
4.0 INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA DE PROCARIOTES
4.1. Ácidos nucleicos.
4.1.1. Composición, estructura y función genética.
4.2. Biología molecular de genes procariontes.
4.2.1. Replicación del ADN.
4.2.2. Transcripción de la información genética.
4. 2.3. Traducción de la información genética.
4.3. Mutación y reparación del ADN.
4.3.1. Espontanea e inducida.
4.3.2. Mecanismos de reparación.
Antecedentes históricos
1893-1900. Miesher, Wohler: Química y Estructura de las bases nitrogenadas.
4.1. Ácidos nucleicos. 4.1.1. Composición, estructura y función genética.
http://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/nucleic-acids.html
Abreviatura Base Nucleósido 5´Nucleótido Ácido
nucléico
A Adenina
2´ Desoxiadenosina dAMP ADN
Adenosina AMP ARN
G Guanina
2´ Desoxiguanosina dGMP ADN
Guanosina GMP ARN
C Citosina 2 Desoxicitidina dCMP ADN
Citidina CMP ARN
T Timina 2´Desoxitimidina (timidina) dTMP ADN
U Uracilo Uridina TMP ARN
2´desoxi guanosina monofosfato dAMP
2´ ribo guanosina monofosfato AMP
Nucleósidos y nucléotidos de los ácidos nucléicos
http://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/nucleic-acids.html
Antecedentes históricos
LA MOLÉCULA ENCARGADA DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. ADN o PROTEÍNAS?
1923. Griffith . Experimento de
Transformación. Factor transformante?
http://www.visionlearning.com/en/library/Biology/2/DNA-I/149
1944. O. Avery.McLeod, La información genética
esta en el ADN (transformante) y no en una
proteína.
1952. Hershey y Chase. Experimento con
fagos marcados.
Antecedentes del modelo Watson-Crick
Chargaff Erwin. 1952. Relación de bases púricas y pirimídicas. A-T/ G-C
Estas observaciones, conocidas como las leyes de Chargaff, se basaron en sus estudios del DNA utilizando técnicas recientes como la
cromatografía de papel y el espectrómetro ultravioleta.
Primera regla: en la molécula natural de DNA las cantidades de guanina igualan las cantidades de citocina, mientras que las cantidades de
adenina igualan las cantidades de timina. Esto llevó a pensar en la estructura doble y complementaria del DNA.
Segunda regla: las cantidades de DNA varían de una especie a otra. Esto llevó a pensar que el DNA, y no las proteínas como se presumía,
era el portador de la herencia
Experimentos de (cristalografía) de difracción con rayos X. Rosalind Franklin y Maurice Wilkins. 1952
Las sustancias regulares como los cristales difractan los rayos X con un patrón característico de acuerdo con su estructura física.
El experimento coloca una fibra (cristal) de ADN en la trayectoria de un haz de rayos X.
El patrón de difracción se obtiene en películas colocadas a pocos centimetros del cristal.
El patrón de difracción es bidimensional que muestra la simetría helicoidal de una molécula en lugar de una tridimensional como si
fuera una cristalografía de rayos X.
“ the molecule had a "helical shape" with repeating distances of 0.34 nm 2nm and 3.4 nm.
Antecedentes del modelo Watson-Crick
http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Nucleic_Acid/DNA/Franklin's_DNA_X-ray_Crystallography
4 cuadrantes simétricos, los ejes
alineados al meridiano y los ejes
perpendiculares a la fibra de ADN se
denominan ecuador:
La fotografía muestra el patrón de
difracción de una fibra de una molécula
«cristalizada» de ADN.
periodicidad de
los repetidos
El patrón en cruz es característica de
una molécula helicoidal con
estructuras repetidas regulares.
Se encontró un patrón que corresponde
a una estructura de dos cadenas de
forma helicoidales
También observaron que los patrones
coinciden y que el diametro de la helice
debera ser constante
El “esqueleto” de fosfato de la pentosa se encuentra hacia el exterior de la
helice y no hacia el interior como se pensaba. Llegaron a esta conclusión
porque trabajaron con las formas hidratadas y deshidrtadas A y B de DNA y
mostraron que el agua se puede unir más facilmente al DNA, lo cual puede
ocurrir si el fosfato esta hacia afuera.
J.D.Watson and F.H.C. Crick. Molecular Structure of Nucleic Acids. Nature 171 (4358) ; 1953 (Apr,25): 737-738.
We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest.
A structure for nucleic acid has already been proposed by Pauling and Corey (1). They kindly made their manuscript available to us in advance of publication. Their model consists of three intertwined chains, with the phosphates near the
fibre axis, and the bases on the outside. In our opinion, this structure is unsatisfactory for two reasons: (1) We believe that the material which gives the X-ray diagrams is the salt, not the free acid. Without the acidic hydrogen atoms it is
not clear what forces would hold the structure together, especially as the negatively charged phosphates near the axis will repel each other. (2) Some of the van der Waals distances appear to be too small.
Another three-chain structure has also been suggested by Fraser (in the press). In his model the phosphates are on the outside and the bases on the inside, linked together by hydrogen bonds. This structure as described is rather ill-defined,
and for this reason we shall not comment on it.
We wish to put forward a radically different structure for the salt of deoxyribose nucleic acid. This structure has two helical chains each coiled round the same axis (see diagram). We have made the usual chemical assumptions, namely,
that each chain consists of phosphate diester groups joining ß-D-deoxyribofuranose residues with 3',5' linkages. The two chains (but not their bases) are related by a dyad perpendicular to the fibre axis. Both chains follow right- handed
helices, but owing to the dyad the sequences of the atoms in the two chains run in opposite directions. Each chain loosely resembles Furberg's2 model No. 1; that is, the bases are on the inside of the helix and the phosphates on the outside.
The configuration of the sugar and the atoms near it is close to Furberg's 'standard configuration', the sugar being roughly perpendicular to the attached base. There is a residue on each every 3.4 A. in the z-direction. We have assumed an
angle of 36° between adjacent residues in the same chain, so that the structure repeats after 10 residues on each chain, that is, after 34 A. The distance of a phosphorus atom from the fibre axis is 10 A. As the phosphates are on the outside,
cations have easy access to them.
The structure is an open one, and its water content is rather high. At lower water contents we would expect the bases to tilt so that the structure could become more compact.
The novel feature of the structure is the manner in which the two chains are held together by the purine and pyrimidine bases. The planes of the bases are perpendicular to the fibre axis. The are joined together in pairs, a single base from
the other chain, so that the two lie side by side with identical z-co-ordinates. One of the pair must be a purine and the other a pyrimidine for bonding to occur. The hydrogen bonds are made as follows : purine position 1 to pyrimidine
position 1 ; purine position 6 to pyrimidine position 6.
If it is assumed that the bases only occur in the structure in the most plausible tautomeric forms (that is, with the keto rather than the enol configurations) it is found that only specific pairs of bases can bond together. These pairs are :
adenine (purine) with thymine (pyrimidine), and guanine (purine) with cytosine (pyrimidine).
In other words, if an adenine forms one member of a pair, on either chain, then on these assumptions the other member must be thymine ; similarly for guanine and cytosine. The sequence of bases on a single chain does not appear to be
restricted in any way. However, if only specific pairs of bases can be formed, it follows that if the sequence of bases on one chain is given, then the sequence on the other chain is automatically determined.
It has been found experimentally (3,4) that the ratio of the amounts of adenine to thymine, and the ration of guanine to cytosine, are always bery close to unity for deoxyribose nucleic acid.
It is probably impossible to build this structure with a ribose sugar in place of the deoxyribose, as the extra oxygen atom would make too close a van der Waals contact. The previously published X-ray data (5,6) on deoxyribose nucleic
acid are insufficient for a rigorous test of our structure. So far as we can tell, it is roughly compatible with the experimental data, but it must be regarded as unproved until it has been checked against more exact results. Some of these are
given in the following communications. We were not aware of the details of the results presented there when we devised our structure, which rests mainly though not entirely on published experimental data and stereochemical arguments.
It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.
Full details of the structure, including the conditions assumed in building it, together with a set of co-ordinates for the atoms, will be published elsewhere.
We are much indebted to Dr. Jerry Donohue for constant advice and criticism, especially on interatomic distances. We have also been stimulated by a knowledge of the general nature of the unpublished experimental results and ideas of
Dr. M. H. F. Wilkins, Dr. R. E. Franklin and their co-workers at King's College, London. One of us (J. D. W.) has been aided by a fellowship from the National Foundation for Infantile Paralysis.
J. D. WATSON F. H. C. CRICK
Medical Research Council Unit for the Study of Molecular Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge. April 2.
1. Pauling, L., and Corey, R. B., Nature, 171, 346 (1953); Proc. U.S. Nat. Acad. Sci., 39, 84 (1953).
2. Furberg, S., Acta Chem. Scand., 6, 634 (1952).
3. Chargaff, E., for references see Zamenhof, S., Brawerman, G., and Chargaff, E., Biochim. et Biophys. Acta, 9, 402 (1952).
4. Wyatt, G. R., J. Gen. Physiol., 36, 201 (1952).
5. Astbury, W. T., Symp. Soc. Exp. Biol. 1, Nucleic Acid, 66 (Camb. Univ. Press, 1947).
6. Wilkins, M. H. F., and Randall, J. T., Biochim. et Biophys. Acta, 10, 192 (1953).
EL MODELO DEL ADN DE WATSON Y CRICK.
J.D.Watson and F.H.C. Crick. Molecular Structure of Nucleic Acids. Nature 171 (4358) ; 1953 (Apr,25): 737-738.
Melting Temperature (Tm)
Tm es el punto medio de la transición entre el estado
nativo y desnaturalizado de la molécula del DNA.
Depende en mucho de la proporción de pares AT/GC
It has not escaped our notice that the specific pairing that we have postulated immediately
suggests a possible copying mechanism for the genetic material". -- Nobel Laureates James Watson and Francis Crick, after solving the structure of DNA in 1953.
La replicación del DNA es de tipo semiconservativa.
Cada una de las cadenas se usa como molde para copiar su información.
Existe un sistema que lleva a cabo el proceso de duplicación o replicación
4.2. Biología molecular de genes procariontes.4.2.1. Replicación del ADN.
Conservativa: podría mantener intacta la molécula de ADN original y
generar una completamente nueva.
Dispersiva: podría producir dos moléculas de ADN con secciones de
ADN viejo (molde) y nuevo.
Semiconservativa: podría producir moléculas con ADN híbrido (viejo y
nuevo) pero, cada molécula híbrida podría estar formada por una
cadena vieja y una nueva.
Experimento de Messelson y Stahl
James Cairns. Autoradiogramas del ADN en replicación
E.coli en crecimiento exponencial. Pulsos de timina marcada.
Lisis celular y obtención de ADN.
Autorradiograma
Horquillas de replicación, en ambas direcciones.
Replicación in vitro. Arthur Kornberg Sr.
La replicación como un proceso mediado por enzimas. DNA polimerasa.
Extractos «crudos» celulares de cultivos de E.coli , purificación de proteínas.
Primer ensayo para la síntesis de ADN.: El ADN es insoluble en TCA, los
nucleótidos sí. El ADN liberado puede separarse por centrifugación. Se
pueden usar nucléotidos radiactivos. si ocurrió la síntesis de ADN alguna
etiqueta de radioactividad será incorporado en el ADN insoluble en TCA. Esto
provee evidencia de que algunos de los nucleótidos etiquetados fueron
polimerizados en una nueva molécula de ADN. Este ensayo de síntesis de
ADN es muy fácil de ejecutar y así mismo es cuantitativo, lo cual significa que
proporciona valores muy confiables y reproducibles que pueden ser utilizados
para calcular cuanto ADN fue hecho y que tan rápido fue la síntesis.
1. Polimerización in vitro DNA con extracto celular (polimerasa) y citosina no
radiactiva.
2. Adición de C radiactiva por periodos cortos, incorporación y detienen la
reacción.
3. Digestión del DNA con fosfodiesterasas 3´y 5´ periodos cortos, detiene la
reacción.
4. Unicamente la fosfodiesterasa 3´libera fragmentos radiactivos.
5. Polimerasa actua 5´a 3´
4.2. Biología molecular de genes. Replicación del ADN
http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture10.html
Función E. coli Eucariontes
Unión al origen
Helicasa
Prot. de unión a monocadenas
Primasa
Polimerasa 5´-3´
Pinza
Cargador de pinza
Transferencia primasa
a Pol III
Excisión primer RNA
Ligasa
DnaA
DnaB
SSB
DnaG
Pol III (a)
Pol III (b)
Pol III (complejo g)
Pol III ()
Pol I
ligasa
ORC
Mcm2-7
RP-A
primasa (Unida a Pol a)
Pol d (Cad. Retrasada),
Pol a (Cad adealantda)
PCNA
RF-C
RNasaH1, FEN1/RTH1
DNA ligasa I
La maquinaria de replicación en eucariontes es en general similar a la de E. coli
El replisoma es un complejo
proteínico codificado en al
ADN y cuya función
específica es la replicación
exacta del ADN y mantiene la
información genética con el
menor número de cambios.
DNA polimerasas de mamiferos
Asociación con primasa
>>> sintesis de 100-150 nt en
ambas cadenas
Interacción con PCNA (pinza)
>>> elongacion cadena conductora
Las DNA polimerasas de E. coli
exonuclease 5´: excision primer RNA
exonuclease 3´: proofreading Holoenzima DNA pol III
Holoenzima DNA polimerasa III de E. coli
600 kDa
10 polipéptidos
Núcleo catalítico
Dimerización
Switch primer
RNA/ DNA
“pinza”
Complejo g
(cargador de pinza o clamp loader)
10
25
130
´
g
exo 3´-5
(proofreading)
pol 5´-3
g
ETAPA 2
- Cambio de conformacion del dimero b >>
afinidad por el nucleo catalitico (a, e y ZZ) de la
DNA pol >> acercamiento al DNA
núcleo catalítico
g
g
cargador de pinza
(complejo g)
pinza
ETAPA 1
- Formación del complejo de preiniciación:
complejo g + dimero b + DNA
- Hidrólisis de ATP >> energía para la unión del
dimero b al DNA
ATP >>> ADP +P
DNA
Mecanismo de acción del cargador de pinza (“clamp loader”)
La función de las topo isomerasas en la replicación del DNA en procariontes
Durante la replicación, la desnaturalización del duplex de DNA y la progresión de la horquilla de replicación, producen cambios en
la topología de las moléculas de DNA, tales como super enrollamientos positivos y negativos, los cuales deben de ser eliminados
para que pueda progresar la maquinaria de replicación.
Las topoisomerasas son las enzimas responsables de la relajación del DNA
• las toposiomerasas del tipo I relajan el DNA por el corte y la ulterior reparación de una cadena del DNA duplex
• las topoisomeras del tipo II cambian la topología del DNA mediante la rotura y reparación del DNA bicatenario
Las toposiomerasas del tipo I relajan el DNA por el corte y la ulterior reparación de una cadena del DNA duplex
La topoisomerasa I de E. coli elimina superenrollamientos negativos
Importante para eliminar el superenrollamiento negativo producido por otra toposiomerasa ( topoisomerasa II ) y mantener la
densidad superhelicoidal del cromosoma
Mutaciones no letales
Regulación de la transcripción y reparación DNA dañado
1) La DNA girasa (topo II) de E. coli
- 2 subunidades que se activan por hidrólisis del ATP
- esencial para el inicio y la realización de la replicación:
- produce superenrollamientos negativos cerca del oriC, lo que permite la unión de la DnaA
- elimina el superenrollamiento positivo que se forma por delante de la horquilla
Las topoisomeras del tipo II cambian la topologia del DNA mediante la rotura y reparacion del DNA
bicatenario
2) la Topo IV de E. coli es esencial para la terminación de la replicación: proceso de “decatenation”
DNA pol I: exonucleasa 5´-3´y polimerasa 5´-3´
5’-----A-C-A-A A-G-C-A-U-A-C-T-T-A-A-C-T----3’
3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’
5’-----A-C-A-A-T A-G-C-A-U-A-C-Y-T-A-A-C-T----3’ 3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A—A-T-T-G-A----5’
5’-----A-C-A-A-T G-C-A-U-A-C-T-T-A-A-C-T----3’ 3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’
5’-----A-C-A-A-T-A-G-C-A T-A-C-T-T-A-A-C-T----3’ 3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’
exo 5´-3´: eliminación de un nucleótido en 5´
pol 5´-3´: adición de dNTP en 3´
exonucleasa 5´-3´: eliminación de rNMP en 5´
polimerasa 5´-3´: adición de dNTP en 3´
5’-----A-C-A-A U-A-G-C-A-U-A-C-T-T-A-A-C-T----3’
3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’
nick Primer RNA Cadena retrasada
Cadena parental
Elongación 5’-3’
5´
P.
DNA ligasa: Cierra de manera covalente los cortes (nicks ) por que “sella” la unión de los fragmentos de
Okasaki ( unión de los fragmentos de Okazaki) en 4 etapas.
1. Adenilación de la ligasa.
2. Interacción ligasa con 5´-P del Okasaki 2
3. Ataque del 3’-OH del Okazaki 1 sobre el 5´-P del Okazaki 2
4. Enlace fosfodiester entre 3’-OH del Okasaki 1 y 5’-P del Okasaki. 2
5. Liberación AMP y ligasa
Okazaki 1
3’ 5´
5’ 3´
cadena
molde
Okazaki 2
Etapas de la replicación del ADN procariote.
A. Formación de la horquilla de replicación.
Relación entre el tiempo de início y el rango de crecimiento.
Las cadenas deben separarse para que actúen como molde.
1. Complejo de preiniciación
a.- Complejo Abierto: 45, pb, ATP y dos proteínas de unión a ADN: HU (tipo histona) y DnaA se unen a OriC
Locus OriC: 5 cajas DnaA (AT) , se une un multímero de 20 DnaA a expensas de ATP por HU
Proteínas de unión a DNA de una cadena: SSB recubren las cadenas separadas evitan reasociación
b.- Unión al DNA de Helicasa (DnaB): es transportada de un complejo DnaB : DnaC : ATP
Helicasa (DnaB): helicasa de la horquilla de replicación, rompe puentes de hidrogeno entre los pares de bases, es procesiva, se une a la
cadena rezagada, se mueve 5´- 3´, desplazando el molde lider. Usa ATP .
DnaB
Se sintetiza como monómero y actúa como dímero.
Se une a DNA de cadena sencilla.
Dependiente de la hidrólisis del ATP.
Polaridad 5´-3´
Helicasas
Catalizan el desenrrollamiento de las moléculas de nucleicos (DNA o
RNA) de doble cadena-
Facilitan varios procesos biologicos: replicación, transcripción,
recombinación, reparación….
2. Necesidad de la DNA girasa (topoisomerasa II) A medida que avanza la helicasa DnaB, se introducen fuerzas de tensión
a la molécula de ADN.
Sí DNA E.coli replica 1000 nucleotidos / seg y hay 10.5 pb por vuelta, se
introducirían 95 super enrrollamientos por segundo ¡
La girasa cambia los superenrrollamientos positivos a negativos a
expensas de ATP para liberar el estrés tensional
También se requiere para formar la horquilla de replicación
Proteínas de unión a monocadenas (SSB): mantenimiento
de la conformación optima del molde, impiden reasociación.
- Unión de un monómero
a la cadena sencilla de
DNA
- Estabilización de la
cadena previamente
desenrollada por la DnaB
(helicasa)
- Prevención de la
reformación de los
enlaces hidrógenos entre
ambas cadenas
- Unión
cooperativa de
varias SSB
potencializacion
del efecto
Prot. de unión a monocadenas (SSB)
- impiden reasociación de las cadenas
Burbuja de replicación
(2 horquillas)
Proteina DnaG (= Primasa)
RNA polimerasa dep de DNA
sintetiza iniciador de RNA
parte del primosoma con DnaB
CUERPO DE REPLICACIÓN REPLISOMA
B. REPLICACIÓN DEL DNA. FORMACIÓN DEL REPLISOMA. ¿ Como se usan las dos cadenas como moldes para ser copiadas en la horquilla durante la replicación.? Para el funcionamiento de las DNA polimerasas se requiere la participación de una RNA polimerasa o Primasa (DnaG). Sintetiza un iniciador (primer) de RNA corto 5- 60 nucleotidos. Las DNA polimerasas III, II y I, requieren 3 ÓH libre, dNTP´s, y la síntesis es de 5´ a 3´ ¿ Sí la horquilla de replicación es un complejo cerrado y las cadenas son antiparalelas, como puede moverse el replisoma en el mismo sentido?
Fragmentos de Okasaki. Síntesis discontinua del DNA DNA pol III no solo alarga ambas cadenas sino que permanece en la horquilla de replicación. Sintetiza el extremo 3´que quedaría más alejado en fragmentos cortos de 1000 nucleótidos La cadena copiada en fragmentos cortos se llama “retardada” (lagging)
La cadena copiada en fragmentos largos se llama “lider” (leading)
C. TERMINACIÓN. Región de terminación: locus con secuencias específicas Ter en seis
grupos Ter A,B,C,D,E y F.
Dos grupos A,D,E y C,B y F. Evitan la rotación de la horquilla de replicación
Proteina TUS (terminator utilization sustance) se une a grupos TER y desvia
la horquilla en un solo sentido
Se sugiere que inhibe a la helicasa
D. PARTICIÓN CROMOSÓMICA: Separación y segregación de los
cromosomas hijos.
en una ciencia como la Genética no debería emplearse la palabra "dogma" ya que como acabamos de ver en muy
poco tiempo el fundamento central de la Biología Molecular propuesto por Crick tuvo que ser modificado
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Transcripcion/Transcripcion.htm
Proteómica Genómica
Transcriptómica
Genómica, Transcriptómica y Proteómica
Genómica, Transcriptómica y Proteómica
Tres niveles básicos de información biológica:
Genoma: la información genética común a todas las células del organismo.
Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en una célula en una etapa específica de su desarrollo.
Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la célula su carácter individual.
Del GENOMA estático, único al PROTEOMA dinámico, múltiple.
http://www.unavarra.es/genmic/docbiomica/transcriptomica.pdf
http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/actabiol/article/view/19283/27971
Un gen es la unidad básica de la herencia, y porta la
información genética necesaria para la síntesis de una
proteína (genes codificantes) o de un ARN no
codificante (genes de ARN). Está formado por una
secuencia promotora, que regula su expresión, y una
secuencia que se transcribe, compuesta a su vez por:
secuencias UTR (regiones flanqueantes no
traducidas), necesarias para la traducción y la
estabilidad del ARNm, exones (codificantes) e
intrones, que son secuencias de ADN no traducidas
situadas entre dos exones que serán eliminadas en el
procesamiento del ARNm.
https://genmolecular.files.wordpress.com/2007/12/geneucaconproteinaovoalbc3baminaefnuncoredu.jpg
Los genes de las bacterias y de los organismos superiores se diferencian en su organización. El genoma bacteriano es muy pequeño y debe reducir la
información al mínimo posible. El genoma humano es tan amplio que se dice que solo el 10% posee genes, así que muchas regiones no codificantes
rodean a los genes e incluso estan dentro de ellos INTRONES) o sea son genes discontinuos poseen intrones y EXONES (regiones codificantes) que
luego se arreglan en el splicing.
Estructura génica eucariote
Los genes de las bacterias y de los organismos superiores se diferencian en su organización. El genoma bacteriano es
muy pequeño y debe reducir la información al mínimo posible
2. Transcriptoma. Transcripción de la información genética en procariotes
Mecanismo mediante el cual una cadena de DNA es
utilizada como molde por RNA polimerasas específicas
para generar los tres tipos de RNA conocidos:
1. RNA Mensajero (mRNAs): Es una copia de la información
contenida en el DNA y a su vez es usada por la maquinaria de
traducción para transformarla en una proteína.
2. RNA de Transferencia (tRNAs): forma enlaces covalentes entre
aminoácidos y reconoce las secuencias codificadas en los mRNAs y
permite la inserción correcta del aminoácido permitiendo el
alargamiento del péptido.
3.RNA Ribosomal (rRNAs): moléculas pequeñas que se ensamblan
con numerosas proteínas para dar lugar a los ribosomas. Reconocen el
mRNA forman los sitios de síntesis de proteínas. Las proteínas poseen
actividad catalítica.
http://www.unavarra.es/genmic/docbiomica/transcriptomica.pdf
Genes de ARN. Además de los genes codificantes de
proteínas, el genoma contiene varios miles de genes ARN,
cuya transcripción reproduce ARN de transferencia (ARNt),
ARN ribosómico (ARNr), microARN (miARN), u otros genes
ARN no codificantes. Los ARN ribosómico y de transferencia
son esenciales en la constitución de los ribosomas y en la
traducción de las proteínas. Por su parte, los microARN tienen
gran importancia en la regulación de la expresión génica,
estimándose que hasta un 20-30% de los genes del genoma
humano puede estar regulado por el mecanismo de
interferencia por miARN. Hasta el momento se han
identificado más de 300 genes de miARN y se estima que
pueden existir unos 500
Transcripción de la información genética en procariotes
RNA.
Compuesto por nucleótidos: gpo fosfato, ribosa y base nitrogenada.
Guanina (G), Citosina (C),Uracilo (U) y Adenina (A).
Existe complementaridad: U:T, G:C
Pueden presentarse estructuras secundarias.
BIOSÍNTESIS DE RNA: Se puede usar CUALQUIERA de las dos cadenas del DNA para
COPIAR SU INFORMACIÓN en una molécula de RNA mensajero.
La CADENA QUE SE COPIA se ha denominado de diversas maneras: CADENA MOLDE
(TEMPLATE), CADENA MENOS (-), SU SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS ES
COMPLEMENTARIA AL RNAm.
La cadena que NO SE COPIA se conoce como: CODIFICANTE, NO MOLDE, POSITIVA
(+). Su secuencia es idéntica a la del RNAm
El RNAm que se sintetiza y su secuencia de nucleótidos es ANTIPARALELA a la cadena
MOLDE.
El extremo 3´OH del RNAm es antiparalelo con el 5´OH de la cadena molde.
LA RNA POLIMERASA Y EL PROMOTOR Sintetiza los tres tipos de RNA en bacterias, los eucariotes tienen tres nucleares y una
mitocondrial.
GEN (CISTRON): Secuencia del DNA involucrada en la síntesis de una cadena
polipeptídica (región codificante), incluye las regiones que preceden (promotores) a la región
codificante y las posteriores (terminadores) (lider y atrasada; leader and trailer), así como que
las secuencias que separan (intrones) las secuencias codificantes (exones)
REGIONES PROMOTORAS DE LA TRANSCRIPCIÓN (SEÑALES PARA EL INICIO):
Secuencias de nucleótidos cortas similares rio arriba (upstream), indican el inicio de la región
codificante (downstream), -10 Pribnow box
Transcripción de la información genética en procariotes
Todas son dependientes de DNA
Procariotes: la síntesis de RNA depende de la actividad de una sola RNA polimerasa.
Eucariotes existen tres diferentes RNA polimerasas: RNA polimerasa (pol) I, II y III.
Cada polimerasa es responsable de la síntesis de tipo de RNA.
RNA pol I sintetiza rRNA synthesis (excluyendo 5S rRNA). 28S, 5S 5.8S.
RNA pol II sintetiza mRNAs y algunos RNAs nucleares (snRNAs) invoucrados en el
proceso de RNA splicing.
RNA pol III sintetiza tRNAs, the 5S rRNA y algunos snRNAs.
Subunidad Gen Masa
(daltons)
Número Localización Posibles
funciones
rpoA 40,000 2 Núcleo Ensamble del
complejo
rpoB 150,000 1 Núcleo Unión de nucleótidos
´ rpoC 160,000 1 Núcleo Unión DNA molde
rpoD 32 –
92,000
1 Holoenzima Unión al
promotor
RNA polimerasas de Eubacterias
Gen Masa Uso Secuencia -35 Separación Secuencia -10
rpoD 70,000 General TTGACA 16-18 pb TATAAT
rpoH 32,000 Choque Térmico CCCTTGAA 13-15 pb CCCGATNT
rpoN 54,000 Met. Nitrógeno CTGGNA 6 pb TTGCA
fliA 28,000 Flagelar CTAAA 15 pb GCCGATAA
E.coli posee varios factores sigma que reconocen promotores con diferentes secuencias consenso
El factor sigma reconoce las secuencias de nucleótidos en la región promotora.
Cuatro regiones conservadas en todos.
Regiones 2 y 4 reconocen las cajas –10 y –35 del promotor.
Otra parte de la región 2 tiene actividad desnaturalizante de DNA.
Regiones 361-390 necesarios para unirse a las otras subunidades.
El extremo N terminal evita que se una a DNA en ausencia del núcleo de la enzima.
Aminoacidos específicos en la alfa helice del factor sigma interactúan en las regiones promotoras.
I. INICIACIÓN.
a. Formación del Complejo Cerrado: (DNA duplex/RNA pol)
b. Formación del Complejo Abierto. No
requiere helicasa o una nucleotido
trifosfatasa. Superenrrolamiento
negativo lo favorece
c. Unión de los ribonucleótidos de
iniciación: En +1, con ATP o GTP
cuyo 3´OH ribosa libre, lo usa el
nucleótido siguiente.
El nuevo RNA sintetizado tiene un
trifosfato´en su´extremo 5´. Se
libera sigma ¡
ETAPAS DE LA TRANSCRIPCIÓN.
II. ALARGAMIENTO
Después de aprox 12 nucleotidos.
La polimerasa se mueve hacia delante formando la “burbuja de replicación” de 18 pb.
Se forma un hibrido transitorio RNA / DNA que favorece la unión de la enzima al DNA.
Rango de alargamiento en E.coli 40-.50 nucleotidos / seg.
Corresponde con el rango de síntesis de proteínas. El rango de aminoácidos adicionados
es 16 / seg.
El mensajero debe moverse en los ribosomas: 48 nucleotidos (16 codones) / seg
La posición de la Polimerasa determina cual cadena actúa como molde.
• RNA polimerasa adiciona 50 bases / seg
• no tiene actividad de nucleasa, si presenta errores no los corrige.
• 1/ 10000-100000, no heredables
II. ALARGAMIENTO
II. TERMINACIÓN. 1. Terminación dependiente de secuencias terminadoras. • Aprox 40 pb en el molde, segmento rico en G-C seguido por 6 ó mas A´s. • Las secuencias correspondientes en RNA son capaces de formar una estructura
secundaria consigo mismas. • Origina una sección tipo rizo o bucle. Hairpin loop. Seguido de un poli U´s • Esta estructura sirve como terminador y disocia RNApol-DNA.
2. Terminación dependiente de rho. • RNA sin señales de terminación • Actividad de ATPasa, hexámero • Se une a RNA naciente en sitio
específico rut . Rio arriba (5) del sitio de pausa de la polimerasa
• Hacia la burbuja de transcripción. • Disocia el complejo RNA
polimerasa-DNA.
Los mRNA policistrónicos presentan varias secuencias Shine-Dalgarno
Una secuencia en el rRNA 16S es complementario a la secuencia Shine-Dalgarno.
IV. PROCESAMIENTO DEL RNA DE TRANSFERENCIA Y RIBOSOMAL.
RNA RIBOSÓMICO.
E. coli 7 genes 30S: RNAr 16S, 23S, 5S y uno o más RNAt.
5´ 16S-tRNAIle-tRNAAla-23S-5S-tRNAAsp-tRNATrp 3´
Después de metilarse, se rompe en transcritos rRNA´s 17S,25S, y 5S y tRNA´s correspondientes.
RNA DE TRANSFERENCIA.
El transcrito primario es procesado removiendo los extremos 3´y 5´por actividad de RNasaP y una
endonucleasa.
Rnasa: ribonucleoproteína donde el RNA presenta ACTIVIDAD CATALITICA.
RIBOZIMA otro ejemplo: peptidil transferasa.
3´ una pieza es removida por una endonucleasa y después una RNAasa D que genera un extremo 3´maduro
17S tRNA17
S
25S
Metilación
5S
Hidrólisis
Nucleasa Nucleasa
16S 23S
V. FACTORES (EFECTORES) DE TRANSCRIPCIÓN.
INICIO : PROTEÍNAS DE UNIÓN A SECUENCIAS ESPECÍFICAS EN EL ADN. Ejemplos.
POSITIVOS. FAVORECEN O PROMUEVEN; NEGATIVOS: EVITAN LA TRANSCRIPCIÓN
PRESENTAN MOTIVOS HELICE-VUELTA HELICE
ALARGAMIENTO: ATENUACIÓN POR SECUENCIAS EN EL TRANSCRITO 1º. OPERON
TRIPTOFANO
La información ordenada en genes, contenida en el DNA como una secuencia de
desoxinucleotidos se transcribe a una molécula de RNA mensajero que también es una
secuencia de nucleótidos.
Si las proteínas son, en su estructura primaria, una secuencia de aminoácidos y se sintetizan a
partir de la expresión de la información genética.
¿ Cual es el mecanismo mediante el cual se lleva a cabo la traducción de un tipo de
información molecular en otra?
Búsqueda de un “código” en el cual se encontraran las “letras” que se traducirían en
“palabras” S. Ochoa, Khorana, M.Nirenberg: UUU= fenilalanina
Preparación de mRNA sintéticos de secuencia conocida.
La información contenida en el mRNA consta de “letras” en forma de un codón que equivale
a un triplete de nucleótidos.
Porqué tres y no dos o uno?: VR4,3= 43 = 64 codones, sí son 20 aminoacidos?
Traducción de la Información Genética. Código genético y Síntesis de Proteínas
• Esta compuesto de tripletes de nucleótidos que forman un codón en el mRNA y
especifican un aminoácido.
• No esta traslapado. Los codones se leen de manera sucesiva, cada nucleótido es parte
solo de un codón.
• No es ambiguo. Cada codón especifica para un aminoacido y solo para uno: ACG=
treonina y solo treonina.
• Es degenerado: en contraste cada aminoacido puede estar codificado por más de un
codón.
• Es universal: Casi todos los organismos (bacterias a humanos) usamn el mismo código
genético, excepciones DNA mitocondrial y algunos protozoarios.
El Código Genético
theredfoxatethehotdog
the red fox ate the hot dog
t her edf oxa tet heh otd og
th ere dfo xat eth eho tdo g
El Código Genético
TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS.
LA MAQUINARIA DE LA TRADUCCIÓN GENÉTICA. LOS RIBOSOMAS y tRNA´s
TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS.
LA MAQUINARIA DE LA TRADUCCIÓN GENÉTICA. LOS RIBOSOMAS y tRNA´s
Cargando el tRNA. Formación del aminoacil-tRNA
20 aminoacil tRNA sintetasas, el número de tRNA´s pueden ser más de 20.
Reconocen aminoácidos y tRNA´s (anticodón)
En dos etapas: aa / ATP= aminoacil AMP, ataque al OH de la ribosa 3´tRNA, también 2´OH
Dos tipos de sintetasas: I /2ÓH, II /3ÓH
Clase I requiere una reacción de transesterificación.
Formación de fMet-tRNA fMet iniciador.en procariotes es formil metionina.
Met + un iniciador especial tRNAfMet con la misma sintetasa que carga Met para secuencias internas.
tRNA metionil transformilasa transfiere un grupo formilo del N10 tetrahidrofolato
La transformilasa es capaz de distinguir ente tRNAfMet y tRNAMet
ETAPAS DE LA SÍNTESIS DE
PROTEÍNAS
1.INICIO: Complejo de
preiniciación. Unión de IF1, IF2, e IF3 a la
subunidad 30S Junto con fMet-tRNAMet
(anticodon)
Se unen al mRNA guiados por la
región Shine-Dalgarno. Se localiza el
codón AUG
Se agrega 50S por la hidrólisis de
GTP-IF2 y se libera IF-1, IF-3.
El iniciador fMet-tRNAMet se coloca
en el sitio P y queda libre el sitio A para
el siguiente aminoacil-tRNA.
Los largos mRNA´s de los operones
bacterianos presentan multiples
secuencias Shine-Dalgarno internas
cerca de cada del codón de inicio para
cada proteína
Ya que una subunidad ribosómica
puede unirse a cada región Shine-
Dalgarno, puede ocurrir la síntesis de
diferentes proteínas independiente y
simultaneamente de los multiples sìtios
de unión en los mRNAs policistrónicos.
Shine, J. and Dalgarno, L. (1974) The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA:
Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. US
2.- ALARGAMIENTO Y TERMINACIÓN.
Codón de iniciación.
Unión del aminoacil tRNA al sitio A: complejo EF-Tu-GTP . Hidrólisis GTP libera EF Tu de A.
Ts desplaza a Tu, libera GDP, GTP desplaza Ts e incorpora Tu.
b.- Formación del enlace peptídico. Ribozima: Peptidil transferasa = RNA 23 S en 50S catalíza el desplazamiento del tRNA al
sitio P vía grupo amino del aminoácido entrante. La cadena polipeptídica se desplaza de P a A
c. Translocación. El ribosoma se mueve un codón hacia 3´cuando tRNA se libera del sitio P y deja libre A para el
próximo a.a.
SE requiere EF-G y GTP.
d. Terminación
Un codón de terminación en sitio A.
Factor de liberación RF se une al codón de
terminación.
RF Estimula a la peptidil transferasa que
hidroliza la unión entre el péptido y el tRNA
en sitio P.
Se disocián los ribosomas, se libera el
péptido.
Unión de IF-3 para evitar reasociación.