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L’ingénierie des protéines : approche prometteuse pour le développement de nouveaux antimicrobiens
Ismail Fliss et Riadh Hammami
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Équipe à l’INAF: identification, caractérisation et étude de la relation structure/fonction des bactériocines de bactéries lactiques et des probiotiques.
Équipe du centre de recherche du CHUQ, laboratoire de chimie médicale: synthèse chimique de peptides à activité biologique.
Projet FQRNT-Équipe
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Synthétiser à grande échelle, à partir des séquences peptidiques des bactériocines, de nouvelles molécules antimicrobiennes biologiquement actives, plus stables et ayant un large spectre d’action.
Microcine J25
Objectif général
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Peptides ou polypeptides produits naturellement par plusieurs souches bactériennes d’origine alimentaire et environnementale.
Activité antimicrobienne (bactéricide ou bactériostatique) dirigée contre des microorganismes phylogénétiquement proches de la souche productrice.
Bactériocines?
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Phénomène très répandu (lactocoques et lactobacilles);
Large spectre d’activité antimicrobienne;
Résistance à l’acidité et aux traitements thermiques;
150 bactériocines de Gram (+) et 25 de Gram (-): BACTIBASE
Bactériocines
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Nisine est la seule bactériocine acceptée dans plus de 50 pays. Carinobacterium maltaromaticum CB1: agent de bioconservation des produits de charcuteries(Santé Canada, additif alimentaire) C. divergens M35: agent de bioconservation des produits marins fumés (Santé Canada, section des aliments nouveaux ) Pediococcus acidilactici: souche probiotique à usage vétérinaire (Santé Canada, section des produits de santé naturelle)
Statut légal des bactériocines
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Alimentaire: Agents de conservation des aliments( Nisine)
Pharmaceutique: infections de la peau, germes multirésistants
Vétérinaire: Traitement et prévention de la mammite bovine (WIPE OUT® Immucell)
Applications
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Avantages et limites
Limites Avantages
Substances de grade alimentaire
Complètement dégradées dans le
tractus digestif
Forte activité biologique: 103 à 106 fois
supérieure aux autres antimicrobiens
incluant les antibiotiques;
Grande stabilité thermique:
compatible avec divers traitements
thermiques
Spectre d’action étroit
l’instabilité dans les matrices biologiques
(protéases, de pHs extrêmes, de sel).
Faibles rendements de production (10%):
difficulté de les produire à grande
échelle, coûts élevés, etc
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Approche microbiologique: sélection de souches fortement productrice (L. lactis diacetylatis UL719, P. acidilactici UL5), optimisation de procédés de fermentation (système avec cellules immobilisées), et de purification (immunoaffinité). Approche de biologie moléculaire: clonage et production de bactériocines recombinantes
Approche d’ingénierie des protéines: synthèse peptidique (connaissance parfaite des caractéristiques structurales et les liens avec l’activité biologique)
Amélioration des rendements
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Élucider la relation entre les structures primaires et secondaires des bactériocines et leur fonction biologique.
Le but ultime étant d’exploiter les connaissances générées pour synthétiser à grande échelle, de nouvelles molécules antimicrobiennes biologiquement actives, plus stables et ayant un large spectre d’action.
Microcine J25
Objectif général
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
La microcine J25
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
La microcine J25
21 AA Structure unique en Lasso 3 feuillets β (5-7, 11-14 et 18-20)
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
La microcine J25
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Relation structure-fonction de la microcine J25
• Plusieurs études de biologie moléculaire et de synthèse chimique ont tenté de produire la microcine J25 ou de dérivés actifs mais sans succès.
• Manque de connaissances sur la relation entre la structure particulière en Lasso de la microcine et de son activité biologique:
- rôle de la boucle 1-8 en N-terminal, - rôle de la queue en C-terminal (avec
ces deux segments : 9-17 et 18-21), - la présence de certains ponts amides
(G1-E8 cyclisation), - La présence de certains AA particuliers.
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
GGAGH VPEYF VGIGT PISFYG
La conformation globale particulière en lasso de la microcine est-elle indispensable à l’activité biologique?
J25
C1
C2
C3 GGAGH VPCYF VGIGT PICFYG
CGAGH VPCYF VGIGT PISFYG
CGAGH VPEYF VGIGT PICFYG C8 C18
C1 G1
C8
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25
J25 C1 C2 C3
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
La séquence complète de la microcine est-elle essentielle à l’activité biologique?
GGAGH VPEYF VGIGT PISFY G
--YF VGIGT PISFY G
-CYF VGIGT PICFY G
KCYF VGIGT PICFY G
J25
9-21
8-21
7-21
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Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25
J25 7-21
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GGAGH VPEYF VGIGT PISFY G
GWKGK WKCYF VGIGT PICFY G
J25
WK_7-21
Est-ce que la charge globale nette influence l’activité biologique de la microcine?
-1
+3
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Structure tridimensionnelle des peptides dérivés de la microcine J25
J25 WK-7-21
Colloque STELA, 13-14 mai 2013
Liste des peptides synthétisés
Peptide Sequence lien Masse (Da) Charge nette
MccJ25* GGAGHVPEYFVGIGTPISFYG 1-8 2 145.0 -1 C1 CGAGHVPCYFVGIGTPISFYG 1-8 2 145.0 0 C2 CGAGHVPEYFVGIGTPICFYG 1-18 2 145.0 -1 C3 GGAGHVPCYFVGIGTPICFYG 8-18 2 145.0 0
1-8L GGAGHVPE------------- - 723.0 -1 1-10C GGAGHVPEYF----------- 1-8 1033.0 -1
NC1 GGAGHVPCYF-GKG---CFYG 8-18 1717.8 +1 NC2 GGAGHVPCYF-KKK---CFYG 8-18 1861.0 +3 NC3 GGAGHVPCYF-WKW---CFYG 8-18 1976.8 +1
9-21L --------YFVGIGTPISFYG-NH2 - 1420.0 0 9-21C --------YFVGIGTPISFYG 9-18 1420.0 0 8-21C -------CYFVGIGTPICFYG 8-18 1540.0 0 7-21C ------KCYFVGIGTPICFYG 8-18 1668.0 +1
WK_7-21 GWKGKWKCYFVGIGTPICFYG 8-18 2410.0 +3
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Concentrations minimales inhibitrices (CMI) des peptides
Souches CMI (µM)
MccJ25* NC1 NC2 NC3 C1 C3 8-21C 7-21C WK_7_21
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 14028 6.5 - - - 125-250 - - - -
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 8387 0.1 - - 31.3 1.0 15.6-31.3 1.0 7.8-15.6 7.8
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 29628 6.5 - 250 - - - - - -
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 8400 0.8 - - - 62.5-125 - - 125-250 62.5
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 9607 1.6 - - - 250 - - - -
Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 9700 0.4 - - - 250 - - - -
Escherichia coli ATCC 11229 0.2 - - - 62.5 - 125-250 - 250
Escherichia coli ATCC 25922 3.3 - - - 250.0 - - 250 - Escherichia coli ATCC 15144 - - - - - - - - -
Escherichia coli O157 H7 ATCC 35150 - - - - - - - - -
Escherichia coli MC4100 ATCC 35695 6.5 - - - 31.3-62.5 - - 125 -
Escherichia coli DH5a 6.5 - - - - - - - - Escherichia coli LR 05 - - - - >250 - - >250 >250
Listeria ivanovii HPB28 - - - - >250 - - >250 250
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0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
3.00 30.00 300.00
OD
595n
m
Concentration (µM)
7-21C-2S C1-2S C2-2S C3-2S-1 C3-2S-2 1-8L 8-21C-2S 9-21C-2S 9-21L 1-10C
Activité inhibitrice contre E. coli
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Activité inhibitrice contre S. enterica ATCC 8387
0
20
40
60
80
100
MccJ25 C1 C3 NC3 8-21C 7-21C WK_7_21
Inhi
bitio
n (%
)
0.5 µM 7.8 µM
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Activité inhibitrice contre Listeria ivanovii par les peptides actifs à250µM
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 4 8 12 16 20 24
Dens
ité o
ptiq
ue (5
95nm
)
Temps (Heures)
Control C1
7-21C WK_7-21
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Potentiel électrostatique (Face A)
Microcin J25 WK_7-21
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Potentiel électrostatique (Face B)
Microcin J25 WK_7-21
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Structure secondaire
expériences de dichroïsme circulaire :
La structure secondaire des peptides actifs est
très similaire à celle de la microcine J25
(structure en feuillet + coudes β)
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CONCLUSIONS
R1: oui, la structure en Lasso est importante mais non essentielle à l’activité biologique de la microcine.
R2: Non, la boucle joue un rôle important dans l’activité antimicrobienne de la microcine (C1) mais sa délétion n’abolit pas totalement l’activité inhibitrice (7-21)
R3: La substitution de certains acides aminés pour augmenter la charge globale semble améliorer l’activité de la microcine et étendre son spectre d’action pour le Gram+ (WK-7-21)
PERSPECTIVES
Les nouvelles molécules peuvent être synthétisées à grande échelle avec des rendement élevés
Ouvrent la porte à des applications de ces molécules dans plusieurs domaines (alimentaire, médical et vétérinaire) où la recherche de ces nouvelles molécules est de plus en plus urgente.
REMERCIEMENTS
François Bédard
Eric Biron
Pedro Alvares
Muriel Subirade
Fond québécois de recherche sur la nature et les technologies (FQRNT-Équipe)
Destruction of membrane potential
Nucleolytic and related activities
Inhibition of protein synthesis
Out
In
Leakage of cellular content
(ions, ATP)
insertion and pore formation
Nisin
Lipid II
Pediocin
Man-PTS
Electrostatic interactions
Translocation into the cytoplasm (e.g. colicins)
Bacteriocin
OR
Target recognition
Mem
bran
e
e.g. Sakacin
Receptor
or
+ + +
- - - -
-
Attraction électrostatique
Perturbation de la
membrane Insertion bioénergétique
et interaction
Peptides antimicrobiens: Mode d’action général
+ +
D’une manière générale le mode d’action se situe au niveau de la membrane :