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LEZIONE 8
Ingegneria cellulare:Metodi di manipolazione del genoma cellulare
Valeria Benedusi
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011-12
Titolare del corso: Adriana Maggi
Ingegneria Cellulare
Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma
stesso o
integrazione di DNA esogeno
Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla
farmacologia
• Identificazione di bersagli di farmaci
• Screening di farmaci
•Produzione di proteine terapeutiche
• Terapia cellulare
Metodo ideale:
alta efficienza di trasferimento del
materiale geneticobassa tossicità per le celluleriproducibilità in diversi
esperimenti
TRANSFEZIONE II
Applicazioni
• Studio di struttura e funzione di geni
• Studio dei meccanismi di regolazione dell'espressione genica
• Produzione di proteine su larga scala
• Produzione di modelli animali per ricerca
• Terapia genica
La scelta del sistema cellulare 1.
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Scelta del sistema cellulare 2.
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica
5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)
1. Facilità di coltura e stabilità
Scelta del vettore per ingegneria cellulare
La scelta del vettore
Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare:
1. iperespressione proteica
2. espressione regolata per lo studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo
3. studio della regolazione della espressione di un gene
VETTORE IDEALE
• Tropismo di espressione: per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore raggiunge cellule specifiche) che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule).
• Durata di espressione: per far sì che la terapia duri nel tempo.
• Livello di espressione: possibilmente regolabile.
• Efficacia clinica: test funzionali su modelli animali.
• Scarsa tossicità.
• Adenovirus• Retrovirus• Virus adeno-associati• Lentivirus (derivati da HIV)• Herpesvirus
• Plasmidi nudi• Elettroporazione in vivo• Liposomi• Ammine, proteine cariche
positivamente
VETTORI PER TERAPIA GENICA Vettori virali:
Vettori non virali:
Vettori per ingegneria cellulare
sequenze per la replicazione in procariote
Cassetta di espressione
Polylinker
Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.)
Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione;
poliadenilazione; segnali di splicing )
Marcatori di selezione
Vettori di espressione: il vettore pCI-neo Promotore
virale
Introne chimerico
Polylinker
Poliadenilazione
Promotore T7 pol
Promotore T3 pol
Origine di replicazione del fago f1
Neo resistenzaPromotore virale
Poliadenilazione
Amp resistenza
E.Coli ori
T-antigen e cellule COS.
L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di espressione di proteine
esogene senza l’utilizzo di promotori virali forti. Il gene è
clonato in un plasmide che include l’origine di
replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel
loro genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che riconosce l’origine di replicazione di
SV40 e stimola una massiccia replicazione del plasmide.
Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off
Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. coli è possibile regolare l’espressione di un transgene.
Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega il tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico)
Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE
E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il
transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina.
Il sistema Tet-on/Tet-off
pCMV
tetR VP16 Tet-OFF
pCMV
rtetR VP16 Tet-ON
TRE Pmin CV Gene of interest
Transcription
Plasmidi codificanti
per l’elemento
di regolazione
Plasmide contenente
il transgene
Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA
(tetracycline-controlled transactivator protein)è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
In presenza di tetraciclina tTA si stacca da TRE e il gene non è più trascritto
In presenza di tetraciclina rtTA si lega a TRE e il gene viene più trascritto
Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA
(reverse tetracycline-controlled transactivator protein)è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina
Metodi biochimiciCoprecipitazione con calcio fosfato
Adsorbimento mediante DEAE-destranoLipofezione
Metodi fisiciElettroporazioneMicroiniezione
Infezione con vettori virali
Scelta della tecnica di transfezione
Coprecipitazione con calcio fosfato
La coprecipitazione di aggregati calcio
fosfato-DNA sulla superficie cellulare favorisce
l’internalizzazione dell’acido nucleicoVantaggi: Molto semplice
Buona efficienza (5-40%)Piuttosto riproducibileEconomico
Svantaggi: Tossicità cellulare
Tecnicamente delicato, sono determinanti:Taglia e dimensioni del precipitatoVariazioni anche minime del pHNon funziona con alcuni tipi cellulari
DEAE-destranoPrimo metodo utilizzato per l’introduzione massiva di DNA
in un cellula eucariotica
Destrano: polisaccaride costituito da unità di D-glucosio che
associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile)
è in grado di legare i gruppi fosfato carichi negativamente del DNA e di mediarne l’ingresso
attraverso le membrane (endocitosi). Le cellule vengono preparate mediante shock osmotico con
glicerolo o DMSO Vantaggi: molto sempliceSvantaggi: poco efficiente
(elevata degradazione DNA, scarsa penetrazione nel nucleo)
solo trasfezioni transientiutilizzato in cellule ad elevata attività endocitotica
Lipofezione
Trasferimento di DNA mediato da liposomi
In particolari condizioni è possibile ottenere liposomi contenenti DNA
La struttura del doppio strato fosfolipidico facilita la fusione con la membrana cellulare ed il rilascio del DNA nel citosol
Buona efficienza
Scarsa citotossicità
Riproducibilità
DNADNA
Metodica vantaggiosa :• il DNA viene rilasciato efficientemente in diversi tipi cellulari• i liposomi sono semplici da utilizzare in quanto non richiedono
apparati o accorgimenti particolari
Lipofezione
Lipofezione con reagenti lipidici neutri
I liposomi sono delle sfere di membrane sintetiche che
possono essere riempite con DNA. Esse fondono
spontaneamente con le membrane cellulari
rilasciando il loro contenuto nel citoplasma. Sono
disponibile commercialmente dei kit per la semplice
preparazione dei liposomi.
Lipofezione con reagenti lipidici cationici
(LipofectamineTM, OligofectamineTM, CellfectinTM)Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli (100-400 nm) liposomi unilamellari. La superficie carica positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente “incapsulato” nel liposoma ma piuttosto legato alle sue superfici. Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi.
L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.
Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati
Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono un’architettura sferica, che si ramifica
radialmente da un core centrale e termina con gruppi amminici ionizzati.
Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando l’internalizzazione del DNA nella cellula.
Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex. Glicoproteine
sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente tampona il pH del lisosoma riducendo la degradazione
del vettore.
Transfezione con PEIMacromolecola organica con elevata capacità di cariche positive:ogni tre atomi c’è un gruppo amminico che può essere protonato
Il complesso PEI-DNA all’interno dell’endosoma si lega ai protoni stimolando l’ingresso degli ioni cloro, questo porta alla rottura dell’endosoma con conseguente rilascio del complesso nel citoplasma
Vantaggi: Favorisce il passaggio nucleo-citoplasmaEconomico
Svantaggi: Tossicità cellulareEfficienza non sempre elevata
ElettroporazioneLe cellule vengono concentrate,
miscelate con il DNA da transfettare e collocate in una
cella collegata a degli elettrodi. Un breve impulso elettrico apre in
maniera reversibile dei “buchi” nelle membrane cellulari. Il DNA entra nelle cellule che vengono
piastrate in terreno fresco.Vantaggi: Minore esposizione a endonucleasi
Svantaggi: Alta % di cellule che non sopravvi--vono al trattamentoAdatta a cellule con membrane particolarmente resistentiAdatta a cellule in sospensione
Microiniezione
Elevata efficienza (iniezione diretta nel nucleo)
Impossibile applicazione su larga scala
Grande manualità dell’operatoreApplicazioni particolari (topi transgenici, espressione di mRNA in cellule di Xenopus laevis)
Microiniezione
Esempio: generazione di topi transgenici mediante microiniezione di DNA nei pronuclei maschili
Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano sotto forma di concatameri a partire dai
primissimi stadi di sviluppo.
ATG *
Promotore Introne
1 2 3 4 5
Poly-ACDS
• Dopo la microiniezione gli embrioni vengono reimpiantati in femmine pseudogravide
• Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie.
• Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamente analizzati per valutare se il transgene si esprime in tutte le cellule, ed eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione