Les échantillons biologiques sont de taille variée

L'infiniment petit

1 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15

homme fourmi cellule moléculeprotéine

atome noyau de l'atome

Les outils d'observation

L'œil microscope rayonnement synchrotronrayons X

collisionneur de particulesCERN

Pus on veut voir petit, plus l'instrument est grand

Système à étudiere.g. solution aqueuse,

cristal

‘Sonde’e.g. faisceau de lumière

Signaux ‘émis’ parle système sous l’effet

de la ‘sonde’e.g. Transmission

Diffusion à ‘grands’ angles

Contiennent de l’informationsur les caractéristiques du

système

Principe :Soumettre le système à une excitation

et étudier ses réactions

Rayons IR : Spectro Infra rouge

Champ radiofréquence+ champ magnétique : RMN

Ionisation +champs E et B : spectro de masse

Lumière polarise: dichroïsme circulaire

Rayons X : diffraction XNeutrons, électrons

La lumière: onde électromagnétique

une oscillation couplée du champ électrique et du champ magnétique qui se propage

Le champs électrique E et le champs magnétique H sont perpendiculaires

Dans le vide la lumière se propage à la vitesse C= 300 000 km/s

Une onde est caractérisée par sa fréquence (période T=1/ )

L’énergieE=hh cste de Plank: 6.62 10-34 js)

Sa longueur d’onde=C.T=C/

L’amplitude et la direction (polarisation) du champs électrique

Absorption de la lumière

La matière n'absorbe la lumière que si la lumière a une énergie égale à une transition électronique.

Ei

EF

hEF-EI

E

Ei

EF

Cette transition est très rapide 10-15s

h

EI EF

hEF-EI

Extraction des électrons des couches électroniques de l'atome

Cela demande une grande énergie rayons X

Absorption des rayons X

L'absorption des rayons X est proportionnelle au nombre d'électron. Plus la longueur d'onde est petite, moins les rayons X sont absorbés (loin des seuils).C'est pour cella que les rayons X sont "transparent"

les éléments sont lourds (Z) sont plus absorbésEx Os (Ca, P), Pb

Les tissus (C,O,N) sont transparents

A=k Z3 3

En dehors des seuils

Application radiographie

L'absorption: la loi de Berr-Lambert

L'absorption de la lumière est dépendante de: -la longueur d'onde (transition électronique)- de la nature chromophore -la concentration (ou densité), C-la longueur du chemin optique parcouru dx

Io It

.C.L ε(λ)-IoeIt

Cste.C.L)()ln(

.C.dx)(I

dI

.C.dx.I ε(λ)- dI

I

L

La perte d'intensité pour un petit élément d'épaisseur dx

.C.L ε(λ)-IoeIt L'intensité transmise décroit de façon exponentiel en fonction de la largeur de la cuve et de la concentration. C'est la loi de Beer-Lambert

On intègre sur l'épaisseur L

On note le rapport .C.L ε(λ)-eIo

It la transmitance (souvent exprimée en %)

La Densité optique (D.O) ou l'aborsbance A est

.C.L ε(λ))It

Ilog()log( 0 TDOA

Plus la densité optique est forte plus la solution absorbe

Si une solution absorbe une couleur (longueur d'onde), la solution apparaitra avec sa couleur complémentaire.

Un solution qui absorbe le bleu apparaitra orange te vice versa

La couleur

Le spectrophotomètre UV-Visible

C'est un des appareil les plus utilisé en laboratoire

principe

Source polychromatique.Lampe à incandescence visible

Lampe à Xénon (UV)

MonochromateurPermet de

sélectionner la longueur d'onde

Cuve de référence

IO

Tampon +

échantillon

It

Le monochromateur est constitué soit d'un prisme soit d'un réseau

Le prisme permet de disperser la lumière selon sa longueur d'onde

La cuve est souvent standard avec une largeur de 1 cmLe coefficient d'extinction molaire []=mol-1. cm-1

Avec un réseau

On trouve des cuves de différent volume de 50l à 1ml.Elle peuvent être en plastique, en verre et en quartz.

Il faut utiliser les cuves en quartz pour les mesure dans l'UV

A la fin on représente A=log(IO/It) en fonction de la longueur d'onde

Ou bien l'absorption à une longueur d'onde (en fonction du temps)

Ex absorption à 340 nm pour suivre la formation du NADHA

t

- Méthode simple- Précise- sensible- Nécessite peu de matériel (50 l)- Non destructive

Spectrophotomètre Avantages:

L'absorption dans l'UV-Visible

l'absorption UV-Visible implique de transition de niveau électronique de valence

La liaisons chimique implique le partage d'électron à des niveaux énergétique plus bas

E=h

liaison

Ex H2

H

1S 1S

H

H2

liante

anti liante

Ex He21 liaison liante

1 liaison antiliantePas de liaison

Effectivement la gaz rare ne font pas liaisons

Les autres orbitales de valence

Orbital

Ex O2

8 électrons liants4 électrons antiliants=>2 liaisons(reste 2 doublets non liant sur chaque atome)

C'est à cause des électrons non appariés que le dioxygène est si réactif.Combustion, oxydation des aliments, respiration,…

2S

Px Py Pz

2S

Px Py Pz

x

n

Orbital Doublet non liant

n n n

O OS

n

n

nn

simplification

Résumé des transitions possible dans les couches de valence

La plupart du temps ces transitions seront responsables de l'absorption de la lumière dans la gamme de l'ultraviolet.

C'est la raison pour laquelle les UV sont capables de casser les liaisons chimiques, de former des radicaux libre

En biologie on s'intéresse principalement au transition * (Intense et UV-visible)

En pratique on s'intéresse à la gamme 200nm-800nm

Les systèmes conjugués

Lorsque les orbitales sont alignées, les électrons peuvent se déplacer d'une orbitale à l'autre. Les électrons sont délocalisés.

Ex benzene

Dans ce cas, il y a un effet stabilisateurs. L'énergie des orbitales baisse et le gape avec l'orbitale * non liante diminue. Plus le système est conjugué plus cette effet est marqué

d

d Plus le système est conjugué plus la longueur d'onde d'absorption sera grande.Grâce à cette propriété les chromophores peuvent absorber jusqu'au visible

d

d

Les indicateurs colorés de pH.

Les indicateurs colorés sont des systèmes conjugués qui absorbent dans le visible.Le changement de pH change la conjugaisons du système. Les longueurs d'onde absorbées ne sont plus les même, le système change de couleurs

Ex phénolphtaléine

Devient rose déprotonés à pH basique (>10)

certains pigments de fleurs: anthocyanidines

On retrouve ces pigments dans les fraise, le raisin, les mures,…

Ex de chromophore biologique

La liaison peptidique

C C

O

N

C

H

C C

O-

N

C

H

Absorption UV à 190nm

C C.

O.

N

C

H

C C.

O-

.N

C

Transition *

Certains acides aminés

Trp, Phe, tyr sont des systèmes conjuguès

L'absorption UV à 280 nM permet aussi de suivre les protéines (qui sont transparentes à l'œil) par exemple lors d'une purification

L'absorption UV à 280 nM permet de déterminer la concentration de protéine. L'absorption est proportionnel à la concentration

Loi de Beer Lambert : A= l CIl faut connaître son coefficient d'extinction molaire (expérimentale ou théorique à partir de la séquence).

Les bases d'ADN ou d'ARN

Adénine Guanine Thymine cytosine

A cause de leurs systèmes de conjugaisons, ces bases absorbe dans l'UV.L'ADN et L'ARN absorbe à 260nm (280 nM pour les protéine)

L'absorption UV à 260 nM permet aussi de suivre les l'ADN ou l'ARN

Dimère de thymine

Sous l'effet deradiations non-ionisantes (UV solaires ...), la thymine (tout comme la cytosine) peut former un dimère covalent. Un dimère consiste en deux bases adjacentes qui, sur le même brin d'ADN, font une double liaison. Une double liaison covalente empêche l'ADN polymérase d'effectuer la réplication de la cellule. Généralement la mort cellulaire ou le cancer s'en suivent lorsque non réparées par les enzymes. Le Xeroderma pigmentosum est notamment causée par ce dérèglement génétique. Cette liaison atypique entre les bases est réparé par le système NER (nucleotide excision repair).

Certain cofacteurs

Le carotène

Le système est fortement conjugué, le carotène absorbe le bleu. Par conséquent il apparait orange.

Astaxanthine 

La crustacyanine est une protéine qu'on retrouve dans la carapace des crustacés.2 monomères type tonneaux (Lipocaline). Elle fixe astaxanthine qui est responsable de la coloration des homards

La protéine fixe un pigment l'astaxanthineQui est très conjugué. il absorbe le bleu d’où la couleur rouge

Quand on chauffe le homard, il change de couleur

C'est à cause de la dénaturation de la crustacyanine.

Dans la protéine native, le pigment est courbé.L'environnent du pigment lié (liaisons hydrogène) sera différent du pigment libre.Il absorbe le rouge d’où la couleur bleu

Dans la protéine dénaturé, le pigment retrouvera une géométrie et un environnement similaire au pigment libre.Il absorbera dans le bleu, d’où la couleur rouge1GKA

Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est un coenzyme d'oxydoréduction

Le NAD est capable de fixer 2 électron et un proton, soit un ion hydrure H-

En fixant l'électron et le proton la résonance du cycle. On change donc les longueur d'absorption

En suivant l'absorbance à 340 nm, on pourra suivre l'évolution de la réaction enzymatique. Formation de NADH (réduction) ou disparition de NAD+ (Oxydation)

1 monomère d'alcool déshydrogénase.On voit le cofacteur fixe par le sandwich triple avec la topologie "Rossman fold"

Dans le foie cette enzyme catalyse l'oxydation de l'alcool en aldéhyde

CH3CH2

OH

CH3CH

O

+ NAD+ + NADH + H+

Le jeunes filles expriment moins d'alcool dehydrogenase que les jeunes hommes et sont par conséquent plus sensible à l'alcool

Les asiatiques ont une d'alcool dehydrogenase moins performante que les européen et sont par conséquent plus sensible à l'alcool

1HSO

CH3CH2

OH

CH3CH

O

+ NAD+ + NADH + H+

L'absorbation à 340 nm permet de suivre la réaction au cours du temps, cinétique enzymatique

Phase préstationnaire

[P]

Phase stationnaire

Effet du produit

équilibre

t

Vitesse initiale

Autres cofacteurs

NADP

Les cofacteurs flaviniques (FAD, FMN) dérivés de la vitamine B2 (riboflavine)

jaune rouge Sans couleurs

Coenzymes quinoniques

Ex ubiquinone (coenzyme Q10)

Production d'énergie dans la mitochondrieEt lutte contre le stress oxydant

Les cycles porphyrines: hème et chlorophylle

ChlorophylleHème

Le cycle porphyrine est très délocalisé, il absorbe donc dans le visible.La nature du métal ou son etat d'oxydation change les propriété d'absorbation.Sang oxygéné rouge, sang hypoxique bleu

Structure ?

Changement de couleur par clivage

La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse du para-nitrophénolphosphate :

Hydrolysé, ce substrat devient jaune et absorbe à 405 nM.

1ALK

Architecture sandwich triple ()2 Zn, 1 Mg

Cette propriété est très utilisé en biologie (ELISA)

La couleur par la diffusion Rayleigh

On peut avoir de la couleur sans pigment (sans absorption).

Le ciel est bleu est pourtant il n'y a pas de pigment bleu

Diffusion de RayleighDiffusion de mie

micro onde saut d'un niveau de rotation

Infrarouge saut d'un niveau de vibration

Visiblesaut d'un niveau électronique dans une  orbitale moléculaire délocalisée

Ultraviolet prochesaut d'un niveau électronique dans un orbitale moléculaire   ,  ou formation d'un radical libre si liaison   

Rayon X

   Extraction des électrons des couches électroniques de l'atome.

Les métaux de transitions

Radio X

Fluo BET, cristaux