Post on 20-Nov-2021
Kontrola ekspresji genów przez hipoksję
Wykład 3
21.10.2016
Biochemia stresu oksydacyjnego
Literatura:
Grzegorz Bartosz „Druga twarz tlenu”
Barry Halliwell & John Gutteridge „Free radicals in biology and medicine”
Hipoksja – fizjologiczne i biochemiczne mechanizmy reakcji na niedobór tlenu
Biochemiczne mechanizmy regulacji
aktywności czynnika transkrypcyjnego HIF-1: rola hydroksylacji i hydroksylaz prolinowych.
UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA
Funkcje układu oddechowego:
Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem
Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze
Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej
Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla
gó
rne
dro
gi
od
de
ch
ow
e
do
lne
dro
gi
od
de
ch
ow
e
UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA
Funkcje układu oddechowego:
Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem
Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze
Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej
Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla
gó
rne
dro
gi
od
de
ch
ow
e
do
lne
dro
gi
od
de
ch
ow
e
Wymianę gazową w płucach warunkuje sprawne współdziałanie układów wentylacyjnego i krążeniowego
Układ wentylacyjny płuc ma za zadanie usuwać dwutlenek węgla i dostarczać tlen do pęcherzyków płucnych
Krążenie płucne zapewnia ciągły przepływ krwi przez układ naczyń włosowatych płuc, dzięki temu nadmiar dwutlenku węgla przenoszony jest do pęcherzyków płucnych, a tlen przechodzi z pęcherzyków płucnych do krwi
Mechanika oddychania polega na cyklicznych ruchach oddechowych klatki piersiowej na zasadzie pracy pompy ssącej, które poprzez zmianę ciśnienia powodują przepływ powietrza do płuc i z płuc na zewnątrz, czyli powodują ich wentylację
WENTYLACJA PŁUC
WYMIANA GAZOWA
Wymiana gazowa w płucach odbywa się dzięki różnicy ciśnień tlenu i dwutlenku węgla we krwi tętniczej i żylnej
WYMIANA GAZOWA
CO2 + H2O <=> H+ + HCO3-
Anhydraza węglanowa (CA) katalizuje odwracalną reakcję powstawania jonu wodorowęglanowego HCO3
- z wody i dwutlenku węgla.
CA
Brahimi-Horn et al., 2007
Ciśnienie parcjalne tlenu w różnych tkankach i narządach jest różne
21%
~15-20%
~14 % ~5 %
~0.5-2.5 %
~0.1-1.5 %
Stan kliniczny, w którym utlenowanie tkanek jest niewystarczające
Może występować zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych
Może dotyczyć całego organizmu lub ograniczać się do jednego narządu
http://www.diffusionpharma.com/?page_id=15
HIPOKSJA
Uszkodzenie mięśnia sercowego Wrodzone wady serca
Choroby układu oddechowego
Choroby układu krążenia
Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach
2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w
tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla)
3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy
4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza
5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych
RODZAJE HIPOKSJI
HIPOKSJA HIPOKSYCZNA
Zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach spowodowane:
niskim ciśnieniem parcjalnym tlenu w powietrzu atmosferycznym zaburzeniami oddychania (choroby serca lub płuc) obecnością ciał obcych w drogach oddechowych obturacją oskrzeli
copyright 1999-2010 Getty Images, Inc.
Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach
2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w
tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla)
3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy
4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza
5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych
RODZAJE HIPOKSJI
HIPOKSJA HISTOTOKSYCZNA Zahamowanie czynności enzymów biorących udział w reakcjach wykorzystujących tlen (mimo dostępności tlenu tkanki nie są zdolne do jego wykorzystania, co wywołuje sytuację analogiczną do jego braku).
Działanie trujące polega na blokowaniu procesu oddychania na poziomie komórkowym poprzez nieodwracalną inhibicję oksydazy cytochromowej, będącej kluczowym enzymem łańcucha oddechowego (kompleks IV) i fosforylacji oksydacyjnej.
T. F. Cummings , Occupational Medicine 2004
cyjanek (CN-) siarkowodór (H2S)
azydek tlenek węgla (CO)
Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach
2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w
tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla)
3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy
4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza
5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych
RODZAJE HIPOKSJI
HIPOKSJA ZASTOINOWA
http://www.elements4health.com/oxygen-during-stroke-can-
reduce-damage-to-brain-tissue.html
Powstaje wskutek niedokrwienia
Może być przykładem hipoksji przewlekłej
Uwarunkowana spowolnionym przepływem krwi przez narządy, np. w następstwie niewydolności mięśnia sercowego, wstrząsu, zakażenia lub oderwanej blaszki miażdżycowej blokującej światło naczynia
Może prowadzić do uszkodzeń serca, wątroby, mózgu i nerek
ischemic stroke – udar niedokrwienny
Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach
2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w
tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla)
3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy
4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza
5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych
RODZAJE HIPOKSJI
HIPOKSJA WYSOKOŚCIOWA
Choroba wysokościowa (choroba d'Acosty, ang. acute mountain sickness, ASM) - Z reguły pojawia się na wysokościach powyżej 2500 m n.p.m., gdzie dostępność tlenu w powietrzu zaczyna być za mała na potrzeby organizmu człowieka
Image courtesy © Photographer: Jörg Jahn | Agency: Dreamstime.com
Początkowo dochodzi do wzrostu ciśnienia krwi i tętna, a w dalszej kolejności do spadku ciśnienia krwi, co skutkuje omdleniem
Zwiększa się ilość erytrocytów we krwi co powoduje jej zagęszczenie
Może dojść do obrzęku płuc i obrzęku mózgu, a w przypadku braku interwencji lekarskiej ASM może zakończyć się zgonem
Profilaktyka – stopniowa, powolna aklimatyzacja i adaptacja do warunków panujących na dużych wysokościach
Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach
2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w
tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla)
3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy
4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza
5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych
RODZAJE HIPOKSJI
Niewystarczające
stężenie hemoglobiny (Hb) w krwinkach czerwonych, co powoduje zmniejszoną zawartość tlenu we krwi
Odpowiedź
organizmu: Stymulacja produkcji
czerwonych krwinek
HIPOKSJA ANEMICZNA zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. przez zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych pod wpływem dużego krwotoku
Erytropoetyna (EPO) – glikoproteinowy hormon peptydowy, którego główną funkcją jest stymulacja różnych etapów erytropoezy, co prowadzi do zwiększenia produkcji erytrocytów przez szpik kostny.
HIPOKSJA ANEMICZNA
Odpowiedź organizmu: Stymulacja produkcji czerwonych krwinek
Niedotlenienie objawia się różnie w zależności od prędkości pojawiania się, stopnia obniżenia prężności tlenu oraz od możliwości rekompensowania niedoboru tlenu
Znaczne niedotlenienie pojawiające się nagle (np. dekompresja kabiny
samolotu) wywołuje utratę przytomności w ciągu 15-20 sekund, a po upływie ok. 5 minut prowadzi do nieodwracalnego zniszczenia tkanki mózgowej
Ostre niedotlenienie objawia się zaburzeniami koordynacji ruchowej, niewyraźną mową, może również prowadzić do utraty przytomności
Przy niedotlenieniu przewlekłym (choroba serca lub płuc, długotrwałe przebywanie na wysokości 3500-6000 m n.p.m.) pojawia się duszność, trudności w oddychaniu, występuje oddech typu Cheyne'a-Stokesa (cykle narastających a następnie zmniejszających się ruchów oddechowych powtarzane w nieregularnych odstępach)
Klinicznie objawy niedotlenienia: sinica (widoczna najlepiej na wargach, płatkach usznych i pod płytkami paznokciowymi), tachykardia oraz wzrost częstości i głębokości oddychania
OBJAWY NIEDOTLENIENIA
Bez względu na rodzaj występującej hipoksji każdy organizm posiada zdolności adaptacyjne
umożliwiające adaptację komórek i tkanek do stanu niskiej ilości tlenu.
Kluczowym elementem związanym z adaptacją
organizmu do niskiego stężenia tlenu jest czynnik indukowany hipoksją
HIF (ang. Hypoxia Inducible Factor)
Reakcja komórek na obniżone ciśnienie parcjalne tlenu
Lopez-Barneo , J Appl Physiol, 2004
1) Odpowiedź ostra – poprzez aktywację kanałów jonowych wrażliwych na tlen; w komórkach dochodzi do szeregu zmian związanych z pobudliwością, kurczliwością i funkcjami wydzielniczymi
2) Odpowiedź przewlekła – poprzez wzrost ekspresji czynników transkrypcyjnych indukowanych niedotlenieniem (HIFs – ang. hypoxia inducible factors), które z kolei zmieniają ekspresję genów kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiające adaptację komórek do hipoksji
Kłębek szyjny (łac. glomus caroticum; ang. carotid body) – chemoreceptor obwodowy, okrągły twór o średnicy około 4-6 milimetrów, leżący w rozwidleniu tętnicy szyjnej wspólnej. Jest unaczyniony przez gałązkę tętnicy szyjnej zewnętrznej a unerwiony jest przez gałązkę nerwu językowo-gardłowego. Ma właściwości chemorecepcyjne, jest wrażliwy na • zwiększone stężenie dwutlenku węgla
(hiperkapnia) • spadek ciśnienia tlenu (hipoksja) • kwasicę które pobudzając kłębek szyjny, doprowadzają do skurczu tętnic, zwolnienia akcji serca oraz hiperwentylacji.
ODPOWIEDŹ OSTRA
http://www.smkdds.com/cms/index.php?q=book/export/html/206
Kłębki szyjne, jako najważniejsze obwodowe chemoreceptory
W generowaniu reakcji na bodziec hipoksyjny biorą udział głównie kłębki szyjne oraz kłębki aortalne.
• kłębki szyjne odpowiadają za ok. 90% odpowiedzi na hipoksję, zaś ich udział w
procesie oddychania w warunkach normalnych wynosi ok. 10-20% • kłębki szyjne składają się z dwóch typów komórek: komórek typu I i typu II.
Komórki typu I są komórkami chemosensorycznymi, zaś komórki typu drugiego pełnią rolę podporową
• w komórkach typu I występują liczne ziarnistości zawierające neuroprzekaźniki, takie jak aminy katecholowe (w tym dopamina), acetylocholina, substancja P, czy co wskazuje zaangażowanie wielu neuroprzekaźników i neuromodulatorów w przekaźnictwo bodźca
• pobudzenie kłębków szyjnych przez bodziec hipoksyjny powoduje zmianę potencjału błonowego i wydzielenie z pęcherzyków presynaptycznych neuroprzekaźników, które, już na poziomie nerwu, w zależności od swojego charakteru odpowiednio modulują jego aktywność
Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - „model membranowy”
Lopez-Barneo et al., Eur Respir J, 2008
Reakcja komórek kłębka szyjnego na zmniejszone ciśnienie parcjalne tlenu
depolaryzacja
HIPOKSJA Zamknięcie
kanału K+O2
Depolaryzacja
komórek kłębka
typu I
Otwarcie
kanałów Ca2+
zależnych od
potencjału
Pobudzenie
zakończenia
nerwowego
EGZOCYTOZA
NEURO-
TRANSMITERA
Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - „model membranowy”
Prawdopodobnie
neurotransmiterem
pobudzającym zakończenia
nerwowe jest acetylocholina
Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006
Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - „model mitochondrialny”
Mo
de
l m
em
bra
no
wy
potencjał oksydoredukcyjny
Postuluje się różne mechanizmy łączące zmiany zachodzące w mitochondriach oraz depolaryzację błony komórkowej i/lub uwalnianie neurotransmitera. Uważa się, iż jednym z czynników łączących te dwa zjawiska może być czynnik transkrypcyjny HIF-1, który odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy tlenowej.
HIF-1 w roli łącznika?
Komórki hodowane w warunkach obniżonego stężenia tlenu i w obecności inhibitorów łańcucha oddechowego w mitochondriach wykazują obniżoną aktywność czynnika HIF-1α.
U myszy pozbawionych jednego allelu genu Hif1α (Hif1α+/-) dochodzi do upośledzenia depolaryzacji komórek kłębka w odpowiedzi na nagłą hipoksję i do braku poprawy wentylacji płuc.
HIF-1 w roli łącznika?
Baby, S.M. et al., communicated , 2005
Peng, YJ et al., J Physiol , 2006
CIH – ang. chronic intermittent hypoxia tzw. przerywana, przewlekła hipoksja, naśladująca epizody hipoksji obserwowane u chorych z zespołem bezdechu sennego
(HYPOXIA INDUCIBLE FACTORS – HIFs)
Badania poświęcone elementowi odpowiedzi na hipoksję (hypoxia response element - HRE) w genie erytropoetyny doprowadziły do odkrycia czynnika transkrypcyjnego HIF-1 (Semenza i Wang, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5447-5454)
HIF-1 reguluje ekspresję wielu genów, m. in. erytropoezy, angiogenezy, enzymów szlaku glikolitycznego
HIF-2 ma szczególne znaczenia dla stymulacji produkcji erytropoetyny w wątrobie
Rola biologiczna HIF-3 nie jest do końca poznana, przy czym wiadomo, że przynajmniej jeden wariant splicingowy negatywnie reguluje ekspresję HIF-1 i HIF-2
CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM
REGULACJA HIFα
HIF-1 HIF-1
2-KETOGLUTARAN
O2 CO2
HYDROKSYLAZY PROLINOWE
OH OH pVHL
Fe2+
BURSZTYNIAN
NORMOKSJA HIPOKSJA
zależna od ubikwityny
degradacja w proteasomach
stabilizacja
e.g. VEGF
CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM
HIFs to heterodimer zbudowany z podjednostek: HIF i HIF
p300
p300
bHLH
bHLH
PAS
PAS
TAD
TAD
HIF-1α
HIF-2α
P402 P564 N803
P405 P531 N847
ODD
ODD
N-TAD C-TAD
P402 P564 N803
O2 + 2-ketoglutaran CO2 + bursztynian
FIH-1
p300 PHDs
HYDROKSYLAZY PROLINOWE
PHD1 – hydroksylacja P402 & P564 PHD2 - hydroksylacja P402 & P564 PHD3 - hydroksylacja P564
kofaktory: tlen, żelazo, α-ketoglutaran, kwas askorbinowy
HIF-1
Utrzymanie optymalnej dostawy tlenu Erytropoeza • Erytropoetyna Transport żelaza • Transferyna • Receptor transferyny • Ceruloplazmina
Regulacja proliferacji i żywotności Zatrzymanie cyklu komórkowego • p21 Autofagia • BNIP3 Czynniki wzrostowe • IGF-1 • białka wiążące IGF-1 i 3 (IGFBP-1 i 3)
Metabolizm energetyczny komórki Glikoliza • LDH • kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) • aldolaza A i C Transport glukozy • transporter glukozy 1 i 3 (GLUT1 i 3) Inne białka • Dehydrogenaza fosfo-3-glicerolu
Kontrola układu naczyniowego Angiogeneza • VEGF • VEGFR-1 • PAI-1 Napięcie ściany naczyń • iNOS • endotelina-1 • oksygenaza hemowa -1 (HO-1)
O2
ODPOWIEDŹ PRZEWLEKŁA
Zmiany metaboliczne w komórce niedotlenionej
Cadenas et al., Cardiovasc Res, 2010
wzrost ekspresji transporterów glukozy GLUT1 oraz GLUT3;
wzrost ekspresji enzymów glikolitycznych;
wzrost ekspresji dehydrogenazy mleczanowej A (LDH-A);
wzrost ekspresji dehydrogenazy pirogronianowej (PDK);
zmiana w podjednostce COX (COX4-1 na COX4-2);
autofagia mitochondriów – proces adaptacyjny służący
ochronie komórki przed skutkami stresu i śmiercią
W odpowiedzi na niedotlenienie, wzrost aktywności HIF-1 prowadzi do • zwiększonego transportu glukozy do komórek, • nasilenia glikolizy, • konwersji pirogronianu do mleczanu,
HIF-1
Cell. 2007 Apr 6;129(1):111-22. HIF-1 regulates cytochrome oxidase subunits to optimize efficiency of respiration in hypoxic cells. Fukuda R, Zhang H, Kim JW, Shimoda L, Dang CV, Semenza GL. Abstract O(2) is the ultimate electron acceptor for mitochondrial respiration, a process catalyzed by cytochrome c oxidase (COX). In yeast, COX subunit composition is regulated by COX5a and COX5b gene transcription in response to high and low O(2), respectively. Here we demonstrate that in mammalian cells, expression of the COX4-1 and COX4-2 isoforms is O(2) regulated. Under conditions of reduced O(2) availability, hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) reciprocally regulates COX4 subunit expression by activating transcription of the genes encoding COX4-2 and LON, a mitochondrial protease that is required for COX4-1 degradation. The effects of manipulating COX4 subunit expression on COX activity, ATP production, O(2) consumption, and reactive oxygen species generation indicate that the COX4 subunit switch is a homeostatic response that optimizes the efficiency of respiration at different O(2) concentrations. Thus, mammalian cells respond to hypoxia by altering COX subunit composition, as previously observed in yeast, but by a completely different molecular mechanism.
HIF-1 REGULUJE EKSPRESJĘ PODJEDNOSTEK OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ
Element odpowiedzi na hipoksję (HRE) 5’-A/GCGTG-3’
HIF-1 HIF-2
kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
anhydraza węglanowa IX (CAIX) BNIP-3
erytropoetyna Oct-4 (Oct-3/4)
CYCLIN D1 TWIST1 TGF-
VEGF adrenomedullina
GLUT-1,-3
HIF-1 vs HIF-2
płuca
nerki
śródbłonek naczyniowy
serce
HIF-1 vs HIF-2
HIF-1 ulega ekspresji w wielu różnych tkankach i narządach, natomiast ekspresja HIF-2 jest ograniczona do następujących:
HIF-2α jest stabilizowany w wyższych stężeniach tlenu
akumulacja HIF-2α w niedokrwionych organach wskazuje, iż czynnik ten może odgrywać istotną rolę w procesie adaptacji do hipoksji
Patel and Simon, Cell Death and Differentiation 2008
w warunkach hipoksji (1% O2), HIF-1α ulega przejściowej stabilizacji i powoduje szybką odpowiedź tkanek na hipoksję, natomiast HIF-2α ulega stopniowej, powolnej akumulacji i powoduje późną odpowiedź tkanek na hipoksję
HIF-1 vs HIF-2
Lorenz Poellinger, communicated Smolenice 2010
INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs
HIF-1 HIF-1
2-KETOGLUTARAN
O2 CO2
HYDROKSYLAZY PROLINOWE
OH OH pVHL
Fe2+
BURSZTYNIAN
NORMOKSJA HIPOKSJA
zależna od ubikwityny
degradacja w proteasomach
stabilizacja
e.g. VEGF
DMOG
Deferoksamina
CoCl2
Inhibitor kompetycyjny wrażliwych na tlen hydroksylaz prolinowych (PHDs)
Stabilizuje ekspresję HIF w warunkach normalnego (fizjologicznego) ciśnienia parcjalnego tlenu
Powszechnie stosowany jako czynnik naśladujący hipoksję
DMOG (Dimethyloxaloylglycine)
DMOG 2-ketoglutaran
MODEL IN VITRO
Human Microvascular Endothelial Cells (HMEC-1) ważna funkcja w procesie angiogenezy unieśmiertelniona linia komórkowa produkują VEGF w ilościach możliwych do oznaczenia dostępnymi testami ELISA
AKTYWACJA HIFs W HMEC-1
Western blot
HIF-1α
α-tubulin
normoxia hypoxia
α-tubulin
HIF-1α
control DMOG
500 µM
HIF-2α
control DMOG
500 µM
α-tubulin
HIF-2α
α-tubulin
normoxia hypoxia
AdHIF-2α (MOI)
HIF-1α
α-tubulin
control AdGFP
100 MOI
10 50 100
HIF-2α
α-tubulin
control AdGFP
100 MOI AdHIF-1α (MOI)
10 50 100
AKTYWACJA HIFs W HMEC-1
0
1
2
3
lucif
era
se a
cti
vit
y
[rela
tive u
nit
s]
DMOG (M)
# #
control 250 1000
HRE – hypoxia response element element odpowiedzi na niedotlenienie
HRE luciferaza
HIFs
Badanie aktywności
genu reporterowego
# p<0,05 vs control, *p<0,05 vs cells treated with DMOG
AKTYWACJA HIFs W HMEC-1
HIF-1
DMOG 250 μM
0 30’ 1h 3h 6h 12h 24h
EMSA
0
200
400
600
800
control DMOG DMOG +
Mutated
competitor
DMOG +
Wild type
competitor
*
#
HIF
1α
acti
vit
y
[% o
f co
ntr
ol]
TransAm ELISA
VEGF promotor lucyferaza
Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF
*
AdGFP AdHIF-1α
0
1
2
3
VE
GF
mR
NA
[r
ela
tive
ex
pre
ss
ion
]
*
AdGFP AdHIF-2α 0
10
20
VE
GF
mR
NA
[r
ela
tive e
xp
ressio
n]
*
*
AdGFP AdHIF-1α AdHIF-2α 0
500
1000
1500
VE
GF
pro
mo
ter
acti
vit
y
[% o
f co
ntr
ol]
Badanie aktywności
genu reporterowego
Real-time PCR
*p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation
Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF
*
AdGFP AdHIF-2α 0
200
400
600
800
VE
GF
pro
tein
[% o
f co
ntr
ol]
*
AdHIF-1α
con
tro
l 3
h
DM
OG
3h
con
tro
l 6
h
DM
OG
6h
con
tro
l 1
2h
DM
OG
12
h
con
tro
l 2
4h
DM
OG
24
h
VEGF
Northern blot #
normoxia 0
100
200
300
400
hypoxia
500
VE
GF
p
rote
in
[% o
f c
on
tro
l]
ELISA
ELISA
# p<0,05 vs normoxia, *p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation
INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs
HIF-1 HIF-1
2-KETOGLUTARAN
O2 CO2
HYDROKSYLAZY PROLINOWE
OH OH pVHL
Fe2+
BURSZTYNIAN
NORMOKSJA HIPOKSJA
zależna od ubikwityny
degradacja w proteasomach
stabilizacja
e.g. VEGF
Deferoksamina
CoCl2
CoCl2 AKTYWUJE HIF
Zwiększenie poziomu białka HIF-1α pod wpływem CoCl2 w osteoblastach
Kim at al., Cytokine. 2002
CoCl2 zwiększa aktywność HRE oraz aktywację promotora VEGF
VEGF promotor lucyferaza
HRE
HRE lucyferaza
ak
tyw
no
ść l
ucy
fera
zy
[%
ko
ntr
oli
]
0
100
200
300
400
kontrola
*
CoCl2
250 M
*
Loboda A et al., 2006
REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1
Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010
Hipoteza redystrybucji tlenu Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT)
zakłada, iż mitochondrialna oksydaza cytochromowa mająca większe powinowactwo do tlenu niż PHDs i FIH-1 w warunkach hipoksji zmniejsza dostępność tlenu dla tych enzymów, hamując ich aktywność, co prowadzi do stabilizacji HIF-α.
zakłada, iż zwiększenie produkcji O2·–
przez mitochondrialny kompleks III podczas hipoksji prowadzi do zwiększenia poziomu RFT w cytoplaźmie, które bezpośrednio lub pośrednio hamują aktywność PHDs i FIH-1 zwiększając poziom HIF-α.
Hagen T, Taylor CT, Lam F, Moncada S (2003) Redistribution of intracellular oxygen in hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha. Science 302: 1975-1978
Chandel NS, Maltepe E, Goldwasser E, Mathieu CE, Simon MC, Schumacker PT, (1998) Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 11715-11720
Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT)
Komórki Rho(0), pozbawione mitochondrialnego DNA Brak mitochondrialnego DNA powoduje upośledzenie funkcjonowania mitochondriów i zmniejsza generację RFT w hipoksji. W komórkach Rho(0) w warunkach niedotlenienia nie występuje aktywacja ekspresji genów regulowanych przez HIF
Dodanie H2O2 do komórek typu dzikiego jak i do komórek Rho(0) stabilizuje HIF-1α zarówno w normoksji jak i w hipoksji.
Rola produkowanych przez mitochondria RFT w indukowanej przez niedotlenienie stabilizacji HIF-α została potwierdzona w komórkach nie posiadających kluczowych elementów łańcucha oddechowego (cytochrom c, żelazowo-siarkowe białka Rieske), po zastosowaniu inhibitorów kompleksu I (rotenon) i kompleksu III (jak myksotiazol i stigmatelina), lub genetycznej delecji kompleksów łancucha oddechowego
Klimova i wsp. zaproponowali hipotezę dotyczącą szczególnej roli kompleksu III w stabilizacji HIF-α podczas niedotlenienia
ROLA KOMPLEKSU III W STABILIZACJI HIF
Mimo, iż zarówno kompleks I i III mogą generować anionorodnik ponadtlenkowy tylko kompleks III może go uwalniać zarówno do przestrzeni międzybłonowej jak i do macierzy mitochondrialnej.
Wewnętrzna błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla drobnocząsteczkowych związków anionorodnik ponadtlenkowy uwalniany do macierzy mitochondrialnej nie jest przenoszony do cytozolu tylko przekształcany do H2O2 poprzez MnSOD Rodnik uwolniony do przestrzeni międzybłonowej, może przechodzić do do cytozolu
HIPOTEZA REAKTYWNYCH FORMY TLENU
Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010
ROS mogą hamować aktywność PHDs na kilka sposobów:
mogą wpływać na szlaki przekazywania sygnału prowadząc do potranslacyjnych modyfikacji PHDs
mogą modyfikować mostki disiarczkowe w PHDs mogą utleniać Fe2+ zmniejszając jego dostępność dla PHDs
α-KETOGLUTARAN
O2 CO2
HYDROKSYLAZY PROLINOWE
Fe2+
BURSZTYNIAN
ANTYOKSYDANTY OBNIŻAJĄ POZIOM HIF-1α
DPI (ang. diphenyleneiodonium chloride)
PDTC (ang. ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)
NAC (ang. N-acetyl-cysteine)
Mechanizm patogenezy H.pylori
Park HJ et al., Clin Cancer Res. 2003
ROS wytwarzane przez bakterie H. pylori przyczyniają się do stabilizacji HIF-1a, nawet w warunkach normoksji, co może tłumaczyć kancerogenny wpływ tego drobnoustroju na komórki błony śluzowej żołądka
Mitochondria mogą regulować aktywność HIF nie tylko przez RFT, ale również poprzez związki uczestniczące w cyklu kwasu cytrynowego, który ma miejsce w macierzy mitrochondrialnej.
PHDs
CYKL KWASU CYTRYNOWEGO vs HIF-1
bursztynian
fumaran HIF-1α
szczawiooctan
HIF-1α
Aktywacja HIF-1 niezależna od hipoksji
trombina Czynniki wzrostu: PDGF TGF-β HGF
angiotensyna II
CoCl2
Cytokiny: IL-1 TNF-α
Wiele z tych czynników może działać poprzez generację RFT
LPS
NO
CO
siarkowodór
Siarkowodór aktywuje HIF-1 in vivo
Caenorhabditis elegans
Wzrost ekspresji HIF-1 i translokacja do jądra komórkowego
Budde & Roth, Mol Biol Cell, 2010
0,5% 50ppm
(0,5%)
(50ppm)
Aktywacja HIF-1 przez tlenek węgla
Western blot
CORM – cząsteczka uwalniająca tlenek węgla, ang. carbon monoxide releasing molecule
EMSA
Aktywność genu reporterowego po transfekcji pHIF-1α-luc
Makrofagi RAW 264.7
Immunofluorescencja
CO indukuje także ekspresję HIF-1 in vivo Tu: makrofagi pęcherzykowe wyizolowane z myszy C57Bl/6 po ekspozycji na CO lub powietrze przez 2 h
po
wie
trz
e
CO
(2
50
pp
m)
Chin BY, PNAS, 2007
PODSUMOWANIE
Hipoksja to stan, w którym stopień utlenowania tkanek jest niewystarczający
Związanie czynnika HIF-1 ze specyficzną sekwencją DNA (5’-(A/GCGTG-3’), tzw. elementem odpowiedzi na niedotlenienie (HRE), oraz przyłączenie szeregu kofaktorów uruchamia transkrypcję wielu genów, których produkty białkowe są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiają adaptację komórek do hipoksji
Wiele czynników może aktywować HIF-1 niezależnie od hipoksji, np. poprzez RFT, zmniejszając tym samym skuteczność terapii antynowotworowych