The role of water in the d t ti f t i ddenaturation of proteins under

high pressurehigh pressure(Or how to cook an egg at room temperature)

J R úl G iJ. Raúl GrigeraIFLYSIBIFLYSIB

(University of La Plata and CONICET, Argentina)

Free energy of denaturation

ΔG.

P0

Heat denaturationCold denaturation

0

22 78

5/6/2010 Denaturation by pressure 2T/C‐100 ‐22 78

0 100

T / °C T / °CT /  C T /  C 

5/6/2010 Denaturation by pressure 3

T / ˚C

Free energy of denaturation

ΔG.

P0P1 < P0 P2 > P0

0

5/6/2010 Denaturation by pressure 4T/C‐100 0 100

From Clausius‐ Clapeyron equation

Integrating between T‐T0 y  P ‐P0

with

p

5/6/2010 Denaturation by pressure 55/6/2010Cold denaturation  

5

The previous expression for p pΔG assume that:

= Const

Which is not trueWhich is not true. Taking  the next term 

= Const

we get different shape

= Constshape

Accepting that condition we get:5/6/2010 Denaturation by pressure 65/6/2010

Cold denaturation  6

Accepting that condition we get:

5/6/2010 Denaturation by pressure 7

Under that conditions the PT diagram is elliptic. 

pPressure denaturation

Colddenaturation

T

denaturationNative

5/6/2010 Denaturation by pressure 85/6/2010Cold denaturation  

8

Heat denaturation

4000p/bar

3000

2000 Chymotrypsinogen (pH 2.07)

1000

0          10          20         30         40          500

5/6/2010 Denaturation by pressure 95/6/2010Cold denaturation  

9

0 0 0 30 40 50

T /°CHawley S.A. Biochemistry, 10, 2436 (1971).

4000

/b4000

3000

p/bar

3000

p/bar

2000

Ribonuclease (pH 2)3000

Ribonuclease (pH 2)20002000

10001000

00

5/6/2010 Denaturation by pressure 105/6/2010Cold denaturation  

10

0          10         20         30        40         50T /°C

5/6/2010Cold denaturation  

10

0        10      20    30     40      500

T /°C

We will focus on the hydrophobic i iinteraction

• The solubility of non‐polar solutes decreasesThe solubility of non polar solutes decreases with temperature, therefore: 

ΔΔ) solsolsolSTHTG Δ−Δ=Δ )(

)()( 12 TGTG Δ>Δfor T1 < T2

• Then we have 

0ΔS 0<Δ solS

5/6/2010 Denaturation by pressure 11

Ka t man propose that the decreasing inKautzman propose that the decreasing in entropy is due to the hydrophobic hydration

ΔS < 0Hydrationsphere ΔS < 0p

5/6/2010Desnaturalización en frío  

AFA ‐ Rosario 2009 12

Goldammer, Hertz.  J. Phys. Chem (1970)       NMRHallenga, Grigera JR, Berendsen. J. Phys. Chem (1980) Relaj. Dielect..Rezus, Bakker      Phys Rev, Letters (2007) IR 

5/6/2010Desnaturalización en frío  

AFA ‐ Rosario 2009 13

, y , ( )

Hydrophobic Interactionyd op ob c te act o

ΔSIh>0

ΔSHh<0

Approx 1kcal/mol (4 kJ/mol) 

5/6/2010Desnaturalización en frío  

AFA ‐ Rosario 2009 14

.

• The hydrophobic hydration, and consequently the hydrophobic interaction,  q y y pcan be produced due to the capacity of water to form hydrogen bond networkswater to form hydrogen bond networks.

• The HB network, remain under anythermodynamics condition?thermodynamics condition?

5/6/2010 Denaturation by pressure 15

η/η1barViscosity

20.36 oC1.00

6.24 oC

0.98

4.00 oC0.96

2 25 oC

0.96

0 94 2.25 C0.94

p / kbar

0.920.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

5/6/2010 Denaturation by pressure 16

p / kbar

Horne R.A, Johnson D.S. J. Phys Chem. 70, 2182‐2190  (1966)

Translational(D) and rotational (1/τ2) diffusion coefficientscoefficients

2.5

D 1/τ2 ar

)

-30 oC2.0

2

/ x(1

b 30 C

x(p)

/

0 oC

1.5

0 oC

90 oC1.0

0 1 2 3p / kbar

5/6/2010 Denaturation by pressure 17

p / kbar•Wolf. L.A. J. Chem. Soc. Faraday Trans. I. 71,784‐79 (1975)

.

E i t l id h th t th• Experimental evidences show that the pressure produce a weakening on the hydrogen bond networking of water phenomenon that start innetworking of water , phenomenon that start in the range of 1‐2 kbar. Around that range the distinctive characteristics of water change their gtrend.

• How can we define the crossover ?

5/6/2010 Denaturation by pressure 18

SPC/E 1bar

The radial distribution function(simulation by MD)

*

333Argon

( y )

SPCE  15 kbar

2

(r) 2

)

2

(r)

Tetrahedal structure

1

g( g(r)

1

g(

111HexagonalStructure

01 2 3

00

5/6/2010Desnaturalización en frío  

AFA ‐ Rosario 2009 19

1 2 3

r / σ

1 2 3

r / σ1 2 3

r / σ* Berendsen, Grigera. & Straatsma J. Phys Chem. 91, 6269‐6271. (1987)

G ‐ Decomposition4

Freundlich 1Gaussian 1 Tetrahedrical

3Hexagonal

Gaussian 2 Freundlich 2Gaussian 3

2

g Gaussian 5 Sigmoid Long distance

The sum = g(r)2 The sum = g(r)

1

0

5/6/2010 Denaturation by pressure 20

0 1 2 3 4 5 6r / σ

3

MD G-Decomposition

3

2

r)g(

r

1

1 2 3 40

5/6/2010 Denaturation by pressure 21

1 2 3 4

r / σ

2 5

3.0 g(r)

1 5

2.0

2.5

1.6 2 54

0 51.0

1.52.54

0.0

0.5

113

57 p / kbar

2 2

0 1 2 3 4

79

/

2.2

5/6/2010 Denaturation by pressure 22

r / σ

Order parameterpPr =1   Pure tetrahedralPr=‐1 Pure hexagonal. Pr= 1   Pure hexagonal

0.8

0.4

0.6

ussi

an

0.2

Ga

(Gaussian 1)A

5/6/2010 Denaturation by pressure 231 2

0.0

r / σ

0.2

0.1

0.2 water

argon

0.0

-0.1

Pr Crossover

0 3

-0.2P Crossover

-0.4

-0.3

0 2 4 6 8 10-0.5

5/6/2010 Denaturation by pressure 24

0 2 4 6 8 10

p / kbar

• The order parameter tell us the range in which water start to lose its characteristic properties.

• We will show our data on nonpolar solutes aqueous systems by Molecular Dynamics

• The question is: Can we reproduce the effects pressure and temperature on hydrophobic interaction?

5/6/2010 Denaturation by pressure 25

Lennard‐Jones particles in SPC/E water

0 8

1.0

e

0 6

0.8st

er S

ize

0.4

0.6

ed C

lus

DiameterConcentration

0.2

orm

aliz

e

0.0

No

2 3 4 5 6 7 8 9

Ratio Area LJ/SPCE*100

5/6/2010 Denaturation by pressure 26Ferrara, MacCarthy & Grigera  J.  Chem. Phys. 127, 104502 ‐1‐5 (2007). 

Lennard‐Jones particles in SPC/E water0 80.8

Size

0.6

lust

er

0.4

Mea

n C

0 2lized

M

0.2

Nor

mal

200 250 300 350 400 450 5000.0

N

5/6/2010 Denaturation by pressure 27

T / KFerrara., MacCarthy & Grigera J.  Chem. Phys. 127, 104502 ‐1‐5 (2007). 

Lennard‐Jones particles in SPC/E water

50 Ferrara C.G., MacCarthy A. N. & Grigera J.R. J.  Chem. Phys. 127, 104502 ‐1‐5 

40

r Siz

e (2007). 

30

Clu

ster

20

erag

e C

10Ave

0 1 2 3 4 50

5/6/2010 Denaturation by pressure 28

Pressure / kbar

1000Lennard‐Jones particles in SPC/E water

800

1000

0 4

0.6

0.8

an C

lust

er S

ize

800

ar 200 250 300 350 400 450 5000.0

0.2

0.4

Nor

mal

ized

Mea

600

P / b

a T / K

400P

200

300 400 5000

5/6/2010Cold denaturation  

29

300 400 500T / KFerrara C.G. & Grigera J.R.

(Unpublished)

.

This simple system in which the onlyThis simple system, in which  the only interaction present is the hydrophobic effect,  shows a  behaviour quite similar to what we can see in the proteins.can see in  the proteins. 

• Consequently, we consider that this q y,mechanism provided a coherent explanation f th d t ti b li dof the denaturation process by cooling and 

pressure .

5/6/2010 Denaturation by pressure 30

We have made MolecularWe have made Molecular Dynamics simulation underDynamics simulation under pressure of different proteins.pressure of different proteins.  We will show some results on apomyglobin

5/6/2010 Denaturation by pressure 31

RMSD = Root Mean Square of all α‐carbon atoms respect to  the initial conformation

J

Apomyoglobin

5/6/2010Cold denaturation  

32

Total Solvent Accessible SurfaceMD simulation of solvated apomyolgobin

1 b

MD simulation of solvated apomyolgobin(Chara , McCarthy , Ferrara , Caffarena & Grigera . Physica A 388, 2552, 2009).

‐‐‐‐‐ 1 bar‐‐‐‐‐ 3 kbar

3 kbar (extrapolated non‐linear regression)1 bar (average)1 bar (average)

5/6/2010Desnaturalización en frío  

AFA ‐ Rosario 2009 33

Solvent Accesible Surface

MacCarthy & Grigera. B. B. Acta‐ Proteins and Proteomics 1764 506–515(2006)and Proteomics.  1764 506 515(2006)

5/6/2010 Denaturation by pressure 345/6/2010Cold denaturation  

34

5/6/2010Cold denaturation  

35

l iConclusion

The disturbance of the hydrogen bond y gnetwork by pressure or temperature alter the hydrophobic interaction (thealter the hydrophobic interaction, (the main driving force to maintain the native folding of proteins) and, therefore induce the denaturationtherefore, induce the denaturation. 

5/6/2010 Denaturation by pressure 36

• MacCarthy A N & Grigera J R Effect of Pressure on the Conformation of

Recent related publication on the subject• MacCarthy A. N. & Grigera J.R. . Effect of Pressure on the Conformation of 

Proteins. A Molecular Dynamics Simulation of Lysozyme J. of Mol. Graph. and Mod.. 24, 254–261 (2005)M C h A N & G i J R P D i f A l bi A• MacCarthy A. N. & Grigera J.R. Pressure Denaturation of Aapomyoglobin. A Molecular Dynamics Simulation Study. Bioch. Bioph. Acta‐ Proteins and Proteomics. 1764, 506–515(2006) 

• Ferrara C.G., MacCarthy A. N. & Grigera J.R. Clustering of Lennard‐Jones particles in water: Temperature and pressure effects. J. Chem. Phys. 127, 104502 ‐1‐5 (2007) 

• Chara O., MacCarthy A.N., Grigera J.R. Water behavior in the neighborhood of hydrophilic and hydrophobic membranes: Lessons from molecular dynamics simulation. J. Biol. Phys.s 33, 523‐539 (2007) 

• Chara O., McCarthy A.N., Ferrara C.G., Caffarena E.R. &  Grigera J.R.  Water behavior in the neighborhood of hydrophilic and hydrophobic membranes: Lessons from molecular dynamics simulation Physica A 388, 2552‐2449 (2009). f y y , ( )

• Grigera J.R. & McCarthy A.N. The behavior of the hydrophobic effect under pressure and protein Denaturation. Biophys. J. 98; 8, : 1527; DOI: 10.1016/j.bpj.2009.12.4298 (in the press).

5/6/2010Cold denaturation  

37

10.1016/j.bpj.2009.12.4298 (in the press).• Chara O., McCarthy A.N. & Grigera J.R. Crossover between tetrahedral and 

hexagonal structures in liquid water (submitted).

ColaboradoresCollaboratorsIn the development of  this work have participated:

Dr Osvaldo Chara

work have participated:

Dr. Osvaldo Chara

Dr Andrés N McCarthyDr. Andrés N. McCarthy

Dr Ernesto R CaffarenaDr. Ernesto R. Caffarena

Lic Carlos G FerraraLic. Carlos G. Ferrara

5/6/2010Desnaturalización en frío  

AFA ‐ Rosario 2009 38IFLYSIB, La Plata, Argentina

The work was supported (but not 

l ) btoo generously) by

‐The University of La.‐The University of La Plata

The National Research Council of 

i (CO C )Argentina (CONICET)

‐ National Agency for‐ National Agency for Promotion of Science and Technology of Argentina (ANPCyT)

5/6/2010 Denaturation by pressure 39La Plata, Cathedral

5/6/2010Cold denaturation  

40