Post on 22-Mar-2022
VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ
ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ
FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
IZOLACE OBSAHOVÝCH LÁTEK CANNABIS SATIVA A JEJICH ANTIFLOGISTICKÝ ÚČINEK ISOLATION OF COMPOUNDS FROM CANNABIS SATIVA AND THEIR ANTI-INFLAMMATORY
EFFECT
DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER´S THESIS
AUTOR PRÁCE Bc. ZUZANA BARANOVÁ
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE PharmDr. Daniela VESELÁ
SUPERVISOR
BRNO 2015
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická
Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání diplomové práce
Číslo diplomové práce: FCH-DIP0892/2014 Akademický rok: 2014/2015
Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií
Student(ka): Bc. Zuzana Baranová
Studijní program: Chemie a technologie potravin (N2901)
Studijní obor: Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010)
Vedoucí práce PharmDr.Daniela Veselá
Konzultanti: doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc.
Název diplomové práce: Izolace obsahových látek Cannabis sativa a jejich antiflogistický účinek
Zadání diplomové práce: 1.Vypracujte literární přehled k dané problematice
2.Popište použité metody hodnocení 3.Zpracujte naměřené výsledky z experimentů
4.Zhodnoťte získané výsledky formou diskuse
Termín odevzdání diplomové práce: 11.5.2015 Diplomová práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v
elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Bc. Zuzana Baranová PharmDr.Daniela Veselá prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.
Student(ka) Vedoucí práce Ředitel ústavu
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - V Brně, dne 30.1.2015 prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. Děkan fakulty
3
ABSTRAKT
Predmetom záujmu tejto práce je tradičná a zároveň kontroverzná rastlina Cannabis sativa.
V teoretickej časti sú popísané ubikvitárne polyfenolické látky – flavonoidy, taktiež prítomné
v mnou študovanej rastline. Podrobnejšie sú popísané doposiaľ preskúmané a potvrdené rôzne
účinky na ľudský organizmus a taktiež synergia s inými látkami. Experimentálna časť práce sa
zaoberá izoláciou a identifikáciou látok chloroformového a hexánového podielu extraktu
získaného z tejto rastliny. Pre izoláciu boli použité chromatografické metódy – tenskovrstvová
a stĺpcová chromatografia a semipreparatívna HPLC. Získané látky boli identifikované
pomocou UV, IR spektrofotometrie a NMR. Následne bola skúmaná antiflogistická aktivita
získaných látok, ako aj celkového etanolického extraktu a jednotlivých podielov. Výsledkom
experimentu bola izolácia jednej čistej látky, ktorá bola identifikovaná ako kyselina
cannabidiolová. Experimentom na THP 1 bunkách bola demonštrovaná mierna antiflogistická
aktivita nepolárnych frakcií a z nich izolovanej CBDA.
ABSTRACT
The object of this thesis is a traditional and also controversial plant Cannabis sativa. The
theoretical part is focused on ubiquitous polyphenolic compounds – flavonoids, also present in
the studied plant. All previously researched and confirmed effects on human body are described
in detail. The experimental part of this thesis describes the isolation and identification of
substances of the chloroform and hexane yields of extract obtained from this plant.
Chromatographic methods were used for isolation – thin layer and column chromatography and
semipreparative HPLC. Obtained substances were characterized using UV, IR
spectrophotometry and NMR. Then the anti-inflammatory activity of obtained substances and
also of the ethanolic extract and its yields was observed. The result of the experimental part was
the isolation of one pure substance which was identified as the cannabidiolic acid. Using the
THP 1 assay, we demonstrated mild anti-inflammatory effect of the non-polar yields and
isolated CBDA.
KĽÚČOVÉ SLOVÁ
Cannabis sativa, flavonoidy, izolácia, identifikácia, antiflogistická aktivita
KEYWORDS
Cannabis sativa, flavonoids, isolation, identification, anti-inflammatory activity
4
BARANOVÁ, Z. Izolace obsahových látek Cannabis sativa a jejich antiflogistický
účinek. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2015. 73 s. Vedoucí
bakalářské práce PharmDr. Daniela Veselá.
PREHLÁSENIE
Prehlasujem, že som diplomovú prácu vypracovala samostatne a že všetky použité literárne
zdroje som citovala správne a úplne. Diplomová práca je z hľadiska obsahu majetkom Fakulty
chemickej VUT v Brne a môže byť využitá ku komerčným účelom len so súhlasom vedúceho
diplomovej práce a dekana FCH VUT.
….….………………………
podpis študenta
Poďakovanie:
Rada by som poďakovala PharmDr. Daniele Veselej za čas, ktorý mi
venovala, a rady, ktoré ma posúvali vo vypracovávaní mojej
diplomovej práce. Moje ďakujem patrí taktiež RNDr. Janovi
Hoškovi, Ph.D., ktorý ma sprevádzal pri meraní antiflogistickej
aktivity a oboznámil ma s danou problematikou.
5
OBSAH
1 Úvod ............................................................................................................................... 7
2 Teoretická časť – Flavonoidy, Antiflogistický účinok ................................................... 8
2.1 História flavonoidov ............................................................................................... 8
2.2 Výskyt flavonoidov ̶ distribúcia v prírode .............................................................. 8
2.3 Identifikácia flavonoidov ........................................................................................ 9
2.4 Chémia flavonoidov ................................................................................................ 9
2.4.1 Hlavné podskupiny flavonoidov ................................................................ 11
2.5 Biosyntéza flavonoidov ........................................................................................ 14
2.6 Absorpcia a metabolizmus .................................................................................... 15
2.7 Farmakológia flavonoidov v živočíchoch ............................................................. 15
2.7.1 Farmakodynamika ...................................................................................... 15
2.7.2 Akútna toxicita flavonoidov ....................................................................... 16
2.7.3 Flavonoidy ako antioxidanty ...................................................................... 16
2.7.4 Prooxidačná aktivita ................................................................................... 17
2.7.5 Antimikrobiálna aktivita ............................................................................ 18
2.7.6 Antiflogistická aktivita flavonoidov .......................................................... 19
2.7.7 Neurostimulačný účinok flavonoidov ....................................................... 21
2.7.8 Analgetický účinok .................................................................................... 21
2.8 Interakcie flavonoidov s inými liekmi .................................................................. 21
2.8.1 Flavonoidy izolované z rastliny Cannabis sativa ...................................... 22
3 Praktická časť ............................................................................................................... 30
3.1 Cieľ ....................................................................................................................... 30
3.2 Prvá časť: Izolácia a identifikácia obsahových látok C. sativa............................. 30
3.2.1 Použitý materiál a prístroje ........................................................................ 30
3.2.2 Metódy ...................................................................................................... 32
3.3 Druhá časť: Antiflogistický účinok celkového extraktu, jednotlivých
podielov a čistých izolovaných látok .............................................................. 35
3.3.1 Rozpúšťadlá, kultivačné médiá a iné použité chemikálie ................. 35
3.3.2 Prístroje ..................................................................................................... 35
3.3.3 Pomôcky.................................................................................................... 36
3.3.4 Komerčný kit použitý pre stanovenie antiflogistickej aktivity ........ 36
3.3.5 Charakteristika bunkovej línie a štruktúr sprostredkujúcich zápalovú
odpoveď ..................................................................................................... 37
3.3.6 Kolorimetrické stanovenie aktivity ............................................................ 38
3.3.7 Princíp stanovenia antiflogistickej aktivity ................................................ 38
4 Výsledky a diskusia ...................................................................................................... 40
4.1 Analýza a separácia extraktu ................................................................................ 40
4.1.1 Rozdelenie chloroformového podielu stĺpcovou chromatografiou ............ 43
4.1.2 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu ............................................................. 43
4.1.3 Rozdelenie hexánového podielu stĺpcovou chromatografiou .................... 44
4.1.4 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu ............................................................. 45
4.1.5 Rozdelenie frakcie CS-H 15–16 stĺpcovou chromatografiou ..................... 46
6
4.1.6 Separácia frakcií ......................................................................................... 47
4.2 Identifikácia .......................................................................................................... 52
4.2.1 Analýza UV spektier .................................................................................. 52
4.2.2 Analýza IR spektier .................................................................................... 53
4.2.3 Identifikácia pomocou NMR ...................................................................... 54
4.2.4 Výsledky identifikácie izolovaných látok .................................................. 55
4.3 Príprava THP1 buniek ........................................................................................... 56
4.3.1 Metódy ....................................................................................................... 56
5 Záver ............................................................................................................................. 60
6 Citovaná literatúra ........................................................................................................ 63
7 Zoznam skratiek ........................................................................................................... 71
7
1 ÚVOD
Flavonoidy sú ubikvitárne látky fotosyntetizujúcich buniek rastlín. Keďže sa vyskytujú
v zelených rastlinách v značnom množstve, reprezentujú bežnú zložku ľudskej potravy. Patria
do triedy polyfenolických látok tvorených v sekundárnom metabolizme. Ich prítomnosť
v rastline má niekoľko opodstatnení. Jednou z funkcií je poskytovať rastlinám farby atraktívne
pre ich opeľovateľov. Prítomnosť flavonoidov v listoch sa v čoraz väčšej miere pripisuje
schopnosti napomáhať fyziologickému prežitiu rastliny, jej uchránením pred fungálnymi
patogénmi a UV-B radiáciou. Flavonoidy sú taktiež zahrnuté v procese fotosenzibility, prenosu
energie, reguláciách rastlinných hormónov a rastových regulátorov, riadení respirácie
a fotosyntézy, morfogenézy a pohlavnej determinácii [1].
V posledných rokoch rapídne stúpol záujem o výskum tejto triedy prírodných produktov
ako predmetu skúmania aktimikrobiálnej aktivity [1]. Boli izolované a identifikované štruktúry
mnohých skupín flavonoidov vykazujúcich antifungálnu, antivirálnu a antibakteriálnu aktivitu.
Okrem toho niektoré skupiny demonštrovali synergiu medzi aktívnymi flavonoidmi, ako aj
medzi flavonoidmi s už existujúcimi chemoterapeutikami [2].
Rezistencia na antimikrobiálne činidlá sa stáva čoraz dôležitejším a naliehavým globálnym
problémom. Štruktúrna modifikácia antimikrobiálnych liečiv, na ktoré bola vyvinutá
rezistencia, sa preukázala ako efektívny prostriedok predlžovania životnosti antifungálnych,
antivirálnych a rôznych antibakteriálnych látok. Avšak vedci hľadajú aj iné spôsoby, respektíve
iné látky, ktoré by boli vhodnou náhradou [1,2].
Prírodné produkty boli zvlášť bohatým zdrojom antiinfektívnych látok; počínajúc
penicilínmi v roku 1940, tetracyklínmi v roku 1948 a glykopeptidmi v roku 1955. Práve vďaka
svojmu farmakologickému potenciálu sa aj flavonoidy dostali do pozornosti vedcov [1].
Vzrastajúca činnosť v oblasti biochémie flavonoidov je pretrvávajúce presvedčenie mnohých
alternatívnych medikov o priaznivých účinkoch liečenia prírodnými produktmi, ktoré sú bohaté
na tieto látky [3].
Z vyššie uvedených dôvodov som sa rozhodla spracovať práve problematiku flavonoidov
a ich využitia ako medicínskych prostriedkov. V prírodných látkach tkvie veľký potenciál,
ktorý je potrebné naďalej skúmať a rozvíjať pomocou dostupných technológií. Až v prípade
neúspechu dostupných prírodných zdrojov v liečebnom procese by sa malo siahať po
syntetických chemických liečivách.
8
2 TEORETICKÁ ČASŤ – FLAVONOIDY, ANTIFLOGISTICKÝ
ÚČINOK
2.1 História flavonoidov
Prvé štúdie zamerané na flavonoidné pigmenty, ktoré robila skupina Roberta Boyla v roku
1664, popisovali účinok zásad a kyselín na farbu extraktov z rastlinných kvetov. V roku 1936
obdržal Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu Dr. Albert Szent-Györgyi, významný
maďarský biochemik, a jeho spolupracovníci, ktorí prehlásili, že flavonoidný preparát z papriky
a citrusovej kôry môže kompletne navrátiť zdravie skorbutickým guinejským prascom.
Samotný vitamín C to totiž nedokázal, no flavonoidy jeho účinok podporili. Albert Szent-
Györgyi preukázal existenciu redukujúcich látok v rastlinných pletivách a živočíšnych
tkanivách [4].
Albert Szent-Györgyi a jeho spolupracovníci najskôr označili skupinu flavonoidov ako
vitamín P. Avšak chemická diverzita flavonoidov vylúčila možnosť ich klasifikácie ako jedinej
zlúčeniny. Neskôr bol preto vitamín P premenovaný na flavonoidy. Od tohto objavu vedci
izolovali viac ako 6000 flavonoidov [4].
Medzi prvé biologicky študované flavonoidy patria izoflavóny, pretože ich štruktúra
s hydroxylovou skupinou v pozícii 7 a 4' na základnom kruhu zabezpečuje ich afinitu
k estrogénnym receptorom. Ďalšia skupina, antokyaníny, bola v histórii ľudstva používaná
komerčne ako farbivá [4].
2.2 Výskyt flavonoidov ̶ distribúcia v prírode
Flavonoidy sú kvalitatívne aj kvantitatívne jednou z najväčších skupín známych prírodných
produktov. Biologický účinok v rastlinách je rôzny. Flavonoidy sa podieľajú na produkcii
pigmentácie, napríklad modrá farba je dôsledkom prítomnosti antokyanínu v okvetných
lístkoch. Antokyaníny sú tiež zodpovedné za jesenné farby mnohých druhov rastlín
a fotoprotekciu buniek listov. Ich schopnosť správať sa ako prirodzené UV filtre je daná
absorpciou v oblasti 280 ̶315 nm [1,5]. Rôzne rastlinné polyfenoly majú taktiež dôležitú úlohu
v ochrane pred mikróbmi a hmyzom. Niektoré z nich (izoflavóny, flavóny a flavanóny) sú
uznávané ako podstatné antifungálne rastlinné činidlá. Iné (flavonoidy, taníny) sú dôležitými
látkami pre ochranu rastlín pred hmyzom a bylinožravými cicavcami. Okrem toho majú mnohé
flavonoidy schopnosť pozmeňovať enzymatické a chemické reakcie a tým pozitívne alebo
negatívne zasahujú ľudské zdravie [1,5,6].
Flavonoidy hrajú dôležitú úlohu v metabolizme dusíka u rastlín viažucich dusík, pretože
indukujú noduláciu ich koreňov. Tieto noduly obsahujú baktérie fixujúce molekulu dusíka N2,
ako napríklad rod Rhizobium, ktorý žije v symbióze so strukovitými rastlinami. Rastlina
zabraňuje inhibícii transformácie molekuly dusíka na amoniak udržiavaním nízkej hladiny
kyslíka O2 a baktérie tvoria 3 proteíny, ktoré sú požadované pre fixáciu dusíka:
nitrogenázareduktáza, nitrogenáza a koenzým FeMo-co [1,3,5]. Hlavným účinkom flavonoidov
je pravdepodobne indukcia génovej expresie proteínov vyžadovaných bunkami nodúl, ale sú
tiež vhodné na to, aby sa podieľali na eliminácii kyslíka, keďže pôsobia antioxidatívne [5,6,7].
9
Táto trieda prírodných látok ohromuje svojou variabilitou a počtom členov. Na pozíciach
v charakteristickom flavonoidnom jadre sú deriváty tvorené najčastejšie hydroxyláciou,
metyláciou, acetyláciou, glykozyláciou alebo izoprenyláciou; je preto možné jednoduchou
permutáciou stanoviť počet flavonoidov, ktorých výskyt sa v prírode očakáva [3,5,7].
Flavonoidy sú často hydroxylované v pozíciách 3, 5, 7, 3', 4' a 5'. Niektoré z týchto
hydroxylových skupín sú mnohokrát metylované, acetylované alebo sulfátované. Keď sa tvoria
glykozidy, glykozidická väzba je za normálnych podmienok lokalizovaná v pozícii 3 alebo 7
a sacharidmi sú zvyčajne ramnóza, galaktóza, glukóza, glukoramnóza alebo arabinóza.
Prenylácia sa vyskytuje spravidla priamo na uhlíkovom atóme v aromatickom kruhu, ale už
bola objavená aj O-prenylácia [3,5,7].
Relatívne veľké množstvo zástupcov tejto skupiny je rozšírené chiralitou podjednotiek a ich
spojení. Z tohto hľadiska sa predpokladá výskyt až 6102 rôznych foriem flavonoidov.
Doposiaľ bolo identifikovaných viac ako 3102 a toto číslo veľmi rýchlo rastie. Vzhľadom na
relatívne vysokú molekulovú hmotnosť a komplikovanú štruktúru týchto zlúčenín ich
identifikácia a chemická syntéza predstavuje pre organických chemikov výzvu aj napriek
využitiu moderného vybavenia [1,6,7].
2.3 Identifikácia flavonoidov
Kompletná analýza štruktúry a absolútnej konfigurácie flavonoidov je zvyčajne zložitou
úlohou, ktorá vyžaduje aplikáciu progresívnych techník ako sú [1H]- a [13C]-NMR
spektroskopia, [1H-1H]-korelačná spektroskopia, kruhový dichroizmus, optická rotačná
disperzia, hmotnostná spektrometria a RTG difrakcia. Keďže je iba niekoľko laboratórií
vybavených týmito drahými prístrojmi, sú požadované iné prístupy k charakterizácii
flavonoidov. Štandardným vybavením biochemických laboratórií sa stala moderná
chromatografická technika HPLC. Menej finančne náročnou metódou je TLC v kombinácii
s fluorescenciou, pri ktorej sa dajú získať dobré výsledky. Ako referenčná vzorka sa používa
štandardný roztok známych flavonoidov. Pozície jednotlivých flavonoidov môžeme pozorovať
pod UV lampou. Charakteristické farby emitované jednotlivými flavonoidmi v roztoku, pri
použití UV žiarenia, slúžia a napomáhajú ich identifikácii. Presné postupy systematickej
identifikácie flavonoidov boli publikované niekoľkými autormi [1].
Príprava vzorky pre analýzu môže predstavovať problém, keďže flavonoidné glykozidy sú
prevažne polárne štruktúry, a teda vo vode rozpustné, zatiaľ čo aglykóny sú nepolárne. Tie preto
musia byť extrahované nepolárnymi rozpúšťadlami. Vhodným kompromisom je často metanol,
ktorý umožňuje extrakciu väčšiny flavonoidov. Čiastočne miernou a účinnou extrakčnou
technikou pre lipofilné flavonoidy je superkritická extrakcia pomocou CO2. Tento proces si
veľmi rýchlo získal uznanie [1].
2.4 Chémia flavonoidov
Flavonoidy ako sekundárne metabolity majú základnú štruktúru tvorenú 2-fenyl-
benzo[α]pyránovým alebo flavánovým jadrom, ktoré pozostáva z dvoch benzénových kruhov
(A, B) spojených pomocou heterocyklického pyránového kruhu (C) [1,6]. Skupina flavonoidov
10
je rozdelená na základe substituentov. Líšia sa v usporiadaní hydroxylovej, metoxy
a glykozidickej vedľajšej skupiny a v konjugácii medzi prvým a druhým benzénovým jadrom
[1,6,7]. Na obrázku (viď Obrázok č. 1) je zobrazená základná štruktúra, z ktorej vychádzajú
všetky flavonoidy.
O8
7
6
5 4
3
2
6'
5'
4'
3'
2'
B
A C
Obrázok č. 1: Základná štruktúra flavonoidu
V priebehu metabolizmu sú pridané hydroxylové skupiny, flavonoidy sú metylované,
sulfátované alebo glukuronidované. V potrave flavonoidy existujú primárne ako O-glykozidy
a polyméry. Najbežnejšou glykozidickou jednotkou je glukóza, inými príkladmi sú
glukoramnóza, galaktóza, arabinóza a ramnóza. Iba malá časť sa nachádza v podobe aglykónov
[1,6,7].
Flavonoidy môžu byť klasifikované podľa biosyntetického pôvodu. Niektoré triedy, ako
napríklad chalkóny (prekurzory vlastných flavonoidov), flavanóny, flavan-3-oly a flavan-3,4-
dioly, sú intermediátmi v biosyntéze a zároveň konečnými produktami a môžu sa hromadiť
v rastlinnom tkanive [1,7]. Iné triedy sú známe iba ako konečné produkty biosyntézy; príkladom
sú antokyanidíny, proantokyanidíny, flavóny a flavonoly. Dve ďalšie skupiny vznikajú
izomerizáciou flavanónu, kde 2-fenylový postranný reťazec sa presunie na pozíciu 3. Tým tvorí
skupinu izoflavónov a príbuzných izoflavonoidov. Neoflavonoidy sú vytvorené ďalšou
izomerizáciou na pozíciu 4 [1,7,9].
Jednotlivé flavonoidy môžu byť pomenované 3 rôznymi spôsobmi. V najväčšej miere sa
využíva triviálny názov, ktorý indikuje triedu alebo rastlinný zdroj. Taktiež sa využíva
semisystematický názov a zriedkavo systematický chemický názov. V nižšie uvedenej tabuľke
(viď Tabuľka č. 1) je základné rozdelenie flavonoidov a hlavní zástupcovia jednotlivých tried
s príslušnou substitučnou charakteristikou [7,8,9].
Tabuľka č. 1: Klasifikácia flavonoidov do základných skupín a ich hlavní zástupcovia
Trieda Flavonoid Substitučná charakteristika
Flavanol
epigallolkatechín
epigallolkatechín gallát
(-)-epikatechín
(+)-katechín
3,5,7,3',4',5'-OH
3,5,7,3',4',5'-OH; 3-R1
3,5,7,3',4'-OH
3,5,7,3',4'-OH
11
Flavón apigenín
luteolín
5,7,4'-OH
5,7,3',4'-OH
Flavonol
kaempferol
morín
quercetín
rutín
3,5,7,4'-OH
3,7,2',4',5'-OH
3,5,7,3',4'-OH
5,7, 3',4'-OH; 3- R2
Flavanón
(dihydroflavón)
hesperidín
naringenín
taxifolín
5,7,3',4'-OH
5,7,4'-OH
3,5,7,3',4'-OH
Izoflavón genistín 5,4'-OH; 7- R3
Antokyanidín apigenidín
kyanidín
5,7,4'-OH
3,5,7,4'-OH; 3,5-OCH3
*Chalkón trihydroxychalkón 2,4,2'-OH
R1: gallát; R2: ramnoglukóza; R3: glukóza
*Chalkóny sú prekurzormi flavonoidov, no niektorí autori ich zaraďujú do celkového
rozdelenia flavonoidov do skupín [10].
2.4.1 Hlavné podskupiny flavonoidov
2.4.1.1 Chalkóny
Chalkóny sú prekurzormi flavonoidov. Sú charakteristické absenciou C-kruhu v základnej
štruktúre flavonoidnej kostry. Preto sú tiež označované ako flavonoidy s otvoreným reťazcom.
Chalkóny zahŕňajú napríklad floridzín, floretín a chalkonaringenín. Vyskytujú sa v značných
množstvách v rajčinách, hruškách, jahodách a určitých vlákninových produktoch. Chalkóny
a ich deriváty si zasluhujú pozornosť vzhľadom na mnoho nutričných a biologických prínosov
[11,12]. Na obrázku pod odstavcom (viď Obrázok č. 2) je zobrazená základná štruktúra, od
ktorej sú odvodené všetky chalkóny.
Obrázok č. 2: Základná štruktúra chalkónu
Chalkón
O
12
2.4.1.2 Flavóny
Flavóny (viď Obrázok č. 3) sú jednou z najdôležitejších podskupín flavonoidov. Sú rozšírené
v listoch, kvetoch a ovocí ako glukozidy. Do tejto podskupiny patria napríklad luteolín,
apigenín a tangeritín. Tieto látky vykazujú rôzne biologické funkcie [12,14].
Obrázok č. 3: Základná štruktúra flavónu
2.4.1.3 Flavanóny
Flavanóny (viď Obrázok č. 4) sú ďalšou dôležitou skupinou flavonoidov, ktorá sa všeobecne
vyskytuje vo všetkých citrusoch. Hesperetín, naringenín a eriodiktoyl sú príklady tejto triedy.
Flavanóny sú spojené s mnohými benefitmi pre zdravie vďaka ich vlastnostiam očisťovať telo
od voľných radikálov. Hesperidín a naringín sú dva glykozidy flavanónov hesperetínu
a naringenínu, vyskytujúce sa vo vyššej miere. Tieto látky sú zodpovedné za trpkú príchuť
džúsov a šupiek citrusových plodov [12,13,14,15].
Obrázok č. 4: Príklady štruktúr niektorých flavanónov
2.4.1.4 Flavonoly
Flavonoly sú flavonoidy obsahujúce ketónovú skupinu a hydroxylovú skupinu v polohe 3
na C kruhu. Sú to stavebné častice proantokyanínov. Flavonoly sa vo veľkom množstve
nachádzajú v zelenine a ovocí. Najviac študovanými flavonolmi sú kaempferol, quercetín,
myricetín a fisetín. Bolo zistené, že príjem flavonolov je spojený so širokým spektrom
zdravotných benefitov, ktoré zahŕňajú antioxidačný potenciál a znížené riziko vaskulárnych
ochorení. Na obrázku (viď Obrázok č. 5) je zobrazená základná štruktúra flavonolu [13].
O
O
Flavón
O
O
Flavanón
13
Obrázok č. 5: Základná štruktúra flavonolu
2.4.1.5 Antokyaníny
Antokyaníny sú svetlé pigmenty zodpovedné za sfarbenie v rastlinách, kvetoch a ovocí.
Chemicky sú klasifikované ako vodorozpustné glykozidy, ktoré sú derivátmi
polyhydroxylových a polymetoxylových zložiek 2-fenylbenzopyrýlia. Najbežnejším
predmetom štúdií sú kyanidín, delfinidín, malvidín, pelargonidín a peonidín. Antokyaníny
vykazujú širokú škálu biologických aktivít zahŕňajúc antioxidačnú, antiflogistickú,
antimikróbnu a antikarcinogénnu aktivitu. Dokonca majú značný efekt na krvné cievy a krvné
doštičky a redukujú riziko koronárneho srdcového ochorenia [13,15]. Základná štruktúra je
zobrazená na obrázku pod odstavcom (viď Obrázok č. 6).
Obrázok č. 6: Základná štruktúra antokyanínu
2.4.1.6 Izoflavonoidy
Izoflavonoidy sú veľmi rozsiahlou osobitou podskupinou. Ich distribúcia v rastlinnej ríši je
veľmi obmedzená. Vyskytujú sa najmä v strukovitých rastlinách, no ich výskyt bol potvrdený
dokonca aj v miroorganizmoch. Vedci zistili, že majú významnú úlohu ako prekurzory pre
vznik fytoalexínov počas interakcie rastlina-mikróby. Izoflavonoidy vykazujú obrovský
potenciál pre porazenie množstva ochorení [13].
Izoflavonoidy sú druhom fytoestrogénov, s chemickou štruktúrou podobnou živočíšnemu
hormónu estrogénu. Izoflavóny ako genisteín a daidzeín sú spoločne považované za
fytoestrogény vďaka svojej estrogénnej aktivite v určitých živočíšnych modeloch. Aj keď boli
izoflavonoidy izolované už z mnohých rastlín, najväčšia pozornosť je venovaná sójovým
izoflavonoidom. Hrajú dôležitú úlohu napríklad v ochrane a zachovaní silných a zdravých kostí
zlepšením kostnej hmoty a znížením jej resorpcie. Taktiež sa správajú ako antioxidanty, ich
konzumáciou je možné znížiť tvorbu arteriálneho povlaku, čím sa ďalej znižuje riziko
O
O
OH
Flavonol
O
OH
Antokyanidín
14
koronárnych srdečných ochorení a s tým spojených kardiovaskulárnych komplikácií. Môžu
zabrániť rakovine pľúc a taktiež rakovine prostaty a zabrániť rastu buniek. Napomáhajú
uvoľňovať menopauzálne symptómy, znižujú krvný tlak a napomáhajú funkcii žíl [13,15].
Na obrázku uvedenom nižšie je zobrazená základná štruktúra izoflavónu (viď Obrázok č. 7).
Obrázok č. 7: Základná štruktúra izoflavónu
2.5 Biosyntéza flavonoidov
Hoci biosyntetická dráha flavonoidov bola značne študovaná a popísaná u mnohých rastlín,
doposiaľ neexistujú údaje o biosyntéze flavonoidov v konope. Mnohé štúdie iba predpokladajú
dráhu, podľa ktorej by mala syntéza prebiehať [1,7,16].
Prekurzormi biosyntézy sú fenylalanín zo šikimátovej dráhy a malonyl-CoA, ktorý je
syntetizovaný karboxyláciou acetyl-CoA, centrálneho intermediátu v Krebsovom cykle.
Fenylalanín je prevedený na p-cinnamovú kyselinu pomocou fenylalanín-amoniaklyázy (PAL),
táto kyselina je hydroxylovaná pomocou cinnamát 4-hydroxylázy (C4H) na kyselinu kumarovú
a CoA je pripojený pomocou 4-kumarát-CoA ligázy (4CL). Jedna molekula p-kumaryl-CoA
a 3 molekuly malonyl-CoA sú kondenzované pomocou chalkónsyntázy (CHS)
a polyketidsyntázy (PKS), za vzniku chalkónu naringenínu. Tento chalkón je izomerizovaný
chalkónizomerázou (CHI) na naringenín flavanón. Naringenín je spoločným substrátom pre
biosyntézu flavónov aj flavanolov. Pre biosyntézu luteolínu a cannflavínu A/B bola navrhnutá
dráha, ktorá začína reakciou feruloyl-CoA alebo caffeoyl-CoA s malonyl-CoA [16].
Ďalšie substitučné a modifikačné reakcie ako je hydroxylácia, metylácia, prenylácia či
glykozilácia prebiehajú pod dohľadom rôznych enzýmov, ktoré zabezpečujú syntézu ďalších
flavonoidov z daných intermediátov [16].
Metylácia hydroxylových skupín sa najpravdepodobnejšie vyskytuje s metanolom,
katalyzovaná špecifickou metylázou. Cukry, ktoré sú pripojené k hydroxylovej skupine, ktorá
sa preferenčne vyskytuje v pozícii C3, sú k dispozícii v podobe monosacharidu aktivovaného
pomocou UDP na anomérnom uhlíku a sú nastálo pripojené k aglykónu. Izoprenoidné
konjugáty flavonoidov sú tvorené pôsobením biologickej izoprénovej jednotky, izopentenyl
pyrofosfátu. Toto spojenie sa najčastejšie vyskytuje na pozícii C3 γ-chromónu [1,7].
Bolo zistené, že konope, ktoré neobsahuje kanabinoidy, neprodukuje prenylované
flavonoidy v kvetoch a listoch, čo idikuje, že biosyntéza flavonoidov v rastline Cannabis by
mohla byť spojená s kanabinoidnou, a preto tieto dve polyketidové biosyntetické dráhy môžu
byť kompetitívne [1,7,16].
O
O
Izoflavón
15
2.6 Absorpcia a metabolizmus
Okrem štruktúrnych a fyzikálno-chemických vlastností flavonoidov, absorpcia,
farmakokinetika, biotransformácia a príbuzné aktivity metabolitov sú kritickými determinantmi
biologického účinku v organizme. In vitro údaje dokazujú pozitívny antioxidačný účinok
štruktúrne odlišných flavonoidov za rôznych podmienok oxidačného stresu. Avšak, aktuálne
porozumenie absorpcie a metabolizmu u ľudí je obmedzené len na niekoľko dietárnych
flavonoidov [17].
Ako už bolo uvedené, väčšina flavonoidov v strave sa vyskytuje v podobe O-glykozidov.
Najbežnejšou glykozidickou jednotkou je glukóza, no vyskytujú sa v menšej miere aj iné
sacharidy. β-väzba týchto cukrov odoláva hydrolýze pankreatickými enzýmami, takže sa dlho
predpokladalo, že za β-hydrolýzu cukorných zvyškov bola zodpovedná intestinálna mikroflóra.
Odvtedy však boli charakterizované dve β-glukozidázy v tenkom čreve človeka schopné
hydrolýzy flavonoidných glykozidov, vrátane laktáza-florizínhydrolázy a nešpecifického
cytozolického enzýmu zodpovedného za deglykoziláciu flavonoidov a tým umožnenie
konjugácie. Výskumy ukázali, že luteolín-7-glukozid, kaempferol-3-glukozid a quercetín-3-
glukozid sú hydrolyzované a absorbované tenkým črevom za pomoci aktivity β-glukozidázy.
Iné štúdie ukázali, že extrakt z ľudského tenkého čreva rozštiepil 4'- a 7-monoglukozidy, no
nijak nezmenil radu ramnoglukozidov a diglukozidov, čim sa zistili rozdiely v biodisponzibilite
flavonoidov v závislosti na umiestnení a štruktúre cukorného zvyšku [2,17].
2.7 Farmakológia flavonoidov v živočíchoch
Doposiaľ boli snahy farmakológie zamerané na potenciálne rastlinné toxíny, ktoré boli
náhodne skonzumované, a lieky, ktoré boli určené na liečebné účely. Na druhú stranu, prírodné
produkty, ktoré sú pravidelne strávené vo veľkých množstvách ako komponenty bežnej ľudskej
stravy a sú iba jemne toxické, boli takmer úplne ignorované. Flavonoidy patria práve do tejto
kategórie [1].
Flavonoidy boli nedávno zahrnuté do výskumov, ktoré sa snažia preukázať dlhodobé účinky
na zdravie a zároveň môžnosť ovplyvnenia metabolizmu iných liečiv. Hlavnou príčinou nízkej
toxicity je nízka rozpustnosť aglykónu vo vode a rýchly rozklad pyrónového jadra v pečeni.
Nízka rozpustnosť flavonoidov vo vode často predstavuje problém pre medicínske aplikácie
týchto látok. Z tohto dôvodu je dôležitým pokrokom vývoj semi-syntetických, vo vode
rozpustných flavonoidov, napríklad na upravenie hypertenzie a mikrokrvácania. Príkladom
takýchto flavonoidov sú hydroxyetylrutozidy a inozitol-2-fosfátquercetín [1].
2.7.1 Farmakodynamika
Nutričné flavonoidy sú absorbované z gastrointestinálneho traktu, zatiaľ čo liečivé
flavonoidy sú riadené priamo do poškodeného tkaniva, ak je prístupné (napríklad pokožka,
sliznica) alebo pozdĺž dráhy vedúcej okamžite k cieľu (nazálny alebo vaskulárny systém). Po
uvoľnení glykozidov z aglykónu bakteriálnymi enzýmami v žalúdku je asi 15 % flavonoidných
aglykónov absorbovaných žlčovými micelami do epitelových buniek a prenesených do lymfy.
Dôležitým faktorom rozhodujúcim o účinnosti absorpcie flavonoidného glykozidu zo žalúdka
16
je podiel cukru. Niektoré štúdie ukazujú, že glykozidy sú absorbované lepšie ako čisté aglykóny
[1,2].
Pozostatky flavonoidov sú exkrétované stolicou a niektoré močom. Lymfa nesúca
flavonoidy vstupuje do krvi blízko pečene a väčšina (asi 80 %) je absorbovaná už pri prvom
prechode. Časť flavonoidov je pravdepodobne napojená na sérový albumín. Ďalšia časť sa
nachádza v konjugátoch, ktoré si zachovali svoje antioxidačné vlastnosti. Hepatocyty prenášajú
flavonoidy do Golgiho aparátu a tiež do peroxizómov, kde sú oxidačne degradované. Časť
oxidačnej degradácie flavonoidných aglykónov prebieha už v žalúdku, pretože niektoré
bakteriálne enzýmy sú schopné otvoriť C-kruh flavonoidnej kostry [1,2].
Produkty sú sekretované pomocou transportérov organických kyselín do krvi a následne
vylučované obličkami. Polčas života typického flavonoidu v tele bol stanovený na 1 ̶ 2 hodiny.
Flavonoidy nie sú akumulované v pečeni a ich dekompozičné produkty (kyselina kávová,
cinnamová, ako aj ich deriváty) sú kompletne vylučované močom s intenzitou podobnou
vylučovaniu kofeínu [1].
2.7.2 Akútna toxicita flavonoidov
Vzhľadom na nízku rozpustnosť flavonoidných aglykónov vo vode, krátky pobyt
flavonoidov v žalúdku a nízky absorpčný koeficient, u ľudí nie je možné, aby trpeli následkami
akútnej toxicity konzumovaním flavonoidov, s výnimkou vzácnych prípadov výskytu alergií
[1,9].
2.7.3 Flavonoidy ako antioxidanty
Antioxidanty sú látky, ktoré zabraňujú či predchádzajú oxidatívnemu poškodeniu cieľovej
molekuly alebo odstraňujú vzniknuté reaktívne molekuly. Hlavný mechanizmus účinku
antioxidantov zahŕňa potlačenie vzniku reaktívnych kyslíkatých foriem (ROS) chelatáciou
stopových prvkov, inhibíciou enzýmov podieľajúcich sa na tvorbe voľných radikálov,
odoberaním ROS a pozitívnou reguláciou ochranných antioxidačných enzýmov [2,9,18].
Protektívne účinky flavonoidov v biologických systémoch sú pripisované ich antioxidačnej
kapacite. Bolo zistené, že predchádzajú poškodeniam spôsobeným voľnými radikálmi
niekoľkými mechanizmami:
1) priame odstraňovanie ROS ‒ flavonoidy sú schopné vychytať voľné radikály priamo
donáciou atómu vodíka,
2) inhibícia oxidáz zodpovedných za tvorbu superoxidového aniónu ako xantínoxidáza,
cyklooxygenáza, lipoxygenáza, mikrozomálna monooxygenáza, glutatión S-transferáza,
mitochondriálna sukcínoxidáza a NADH oxidáza,
3) aktivácia antioxidačných enzýmov umocňujúcich indukciu detoxifikujúcich enzýmov
(NAD(P)H-quinón oxidoreduktáza, glutatión S-transferáza a UDP-glukuronozyltransferáza),
ktoré sú hlavnými obrannými enzýmami proti elektrofilným toxínom a oxidačnému stresu [2,9],
4) chelatácia stopových kovov,
17
5) zmiernenie oxidačného stresu zapríčineného oxidom dusným [2,18].
2.7.3.1 Faktory ovplyvňujúce antioxidačnú kapacitu
Doposiaľ bolo vedené značné množstvo in vivo a in vitro štúdií, ktoré využívali prírodné
flavonoidy, aby sa zistila súvislosť medzi štruktúrou flavonoidov a ich antioxidačnou aktivitou.
Možno popísať niekoľko špecifických štruktúrnych elementov flavonoidov, ktoré sú
kľúčovými determinantmi odstraňovania voľných radikálov, chelatácie a prooxidačnej aktivity
[12,18,19].
Celkový počet hydroxylových skupín a taktiež umiestnenie týchto substituentov podstatne
ovplyvňuje niekoľko mechanizmov antioxidačnej aktivity. Kapacita odstraňovania voľných
radikálov je primárne prisudzovaná vysokej reaktivite hydroxylových substituentov, ktoré sa
podieľajú na nasledujúcej reakcii [12,18]:
F-OH + R• → F-O• + RH
O-glykozylácia, ako aj O-metylácia flavonoidov, redukuje ich in vitro antioxidačnú aktivitu
v porovnaní s príslušnými aglykónmi. Tento jav je zapríčinený pravdepodobne vytvorením
stérickej zábrany. Okrem hydroxylových skupín naviac niektoré štúdie zdôrazňujú význam
nenasýtenosti v pozícii 2, 3 a substitúciu 4-karbonylovej skupiny. Tieto javy môžu taktiež
negatívne ovplyvniť antioxidačnú aktivitu flavonoidov. Posledným faktorom je polymerizácia.
Nárast stupňa polymerizácie zlepšuje účinnosť prokyanidínov proti rôznym radikálovým
formám [9,18,19,20].
V najnovších výskumoch bola demonštrovaná synergia antioxidačního efektu medzi α-
tokoferolom, epikatechínom a epikatechín-galátom v modeloch in vivo. Tieto štúdie ukázali,
že inklúzia quercetínu, katechínu alebo epikatechínu v strave potkanov zvýšila koncentráciu α-
tokoferolu prítomného v krvnej plazme a v pečeni [19,20,21].
V niektorých prípadoch sa predpokladajú možné synergické alebo antagonistické efekty
medzi rôznymi antioxidantmi prítomnými v rastline a odvodenými produktami, no len málo
štúdií sa sústredilo na určenie interakcií flavonoid-flavonoid vo vzťahu k antioxidačnej aktivite
[18,19,20,21].
2.7.4 Prooxidačná aktivita
Zatiaľ čo antioxidačné vlastnosti podporujú pozitívnu úlohu flavonoidov v ľudskej výžive
a prevencii pred rôznymi ochoreniami, určité štúdie sa zaoberali skúmaním možnej
prooxidačnej aktivity in vitro [1,2,18].
Prooxidačná aktivita je zodpovedná za cytotoxické a proapoptotické efekty flavonoidov
izolovaných z rôznych liečivých bylín [2]. V prítomnosti reaktívnych dusíkatých foriem (RNS)
flavonoidy s konfiguráciou obsahujúcou pyrogallol na A alebo B kruhu indukujú rozpad
jednovláknovej DNA. Je tiež dokázané, že nenasýtená väzba v polohe 2, 3 a usporiadanie 4-
oxo u flavónov môže podporovať tvorbu ROS indukovanú divalentnou meďou v prítomnosti
kyslíka [2,18].
18
2.7.5 Antimikrobiálna aktivita
2.7.5.1 Antifugálna aktivita flavonoidov
Z dôvodu rozsiahlej schopnosti flavonoidov inhibovať klíčenie spór rastlinných patogénov
boli navrhnuté na použitie proti fugálnym patogénom človeka. 5,7,4'-trihydroxy-8-metyl-6-(3-
metyl-[2-butenyl])-2S-flavanón vykazoval pozitívnu antifugálnu aktivitu proti
oportunistickému patogénu Candida albicans. Taktiež flavonoid 7-hydroxy-3',4'-
metylendioxyflaván inhiboval rast tohto mikroorganizmu [1,22]. Inhibičnú aktivitu proti
Aspergillus flavus, rodu mikroskopických húb, ktorý spôsobuje invazívne ochorenia
u imunosupresívnych pacientov, vykazovali flavonoidy 6,7,4'-trihydroxy-3',5'5-
dimetoxyflavón a 5,5'-dihydroxy-8,2',4'-trimetoxyflavón. Aktivita propolisu proti
dermatofytom a Candida spp. bola prisúdená aspoň z časti vysokému obsahu flavonoidov.
Galangín, flavonol bežne prítomný v propolise, vykazoval inhibičnú aktivitu proti Aspergillus
tamari, A. flavus, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium digitatum a P. italicum [1,8,22].
2.7.5.2 Antivirálna aktivita
Nedávne štúdie boli zamerané takmer výhradne na ľudský imunodeficienčný vírus HIV.
In vitro štúdie ukázali, že baikalín dokázal inhibovať HIV-1 infekciu a replikáciu. Baikaleín,
robustaflavón a hinokiflavón, ako aj niektoré katechíny, taktiež vykazovali inhibičnú aktivitu
proti HIV-1 reverznej transkriptáze. Katechíny ale inhibovali aj iné DNA polymerázy a ich
interakcia s HIV-1 enzýmom je preto považovaná za nešpecifickú. Navyše bolo
demonštrované, že niektoré flavonoidy inhibujú HIV-1 proteinázu (vrátane demetylovaného
gardenínu A a 3,2'-dihydroxyflavónu) [8,22,23].
Flavonoidy majú tiež inhibičnú aktivitu proti rôznym ďalším vírusom. Niektoré štúdie
ukazujú, že quercetín, morín, rutín, dihydrofisetín, pelargonidín chlorid a katechín disponujú
inhibičnou aktivitou proti niektorým typom vírusov ako herpes simplex (HSV), respiračný
syncytiálny vírus, poliovírus a Sindbis vírus. Daný mechanizmus antivirálneho účinku zahŕňa
inhibíciu virálnej polymerázy a väzby virálnej nukleovej kysleiny alebo proteínu virálneho
kapsidu [8,22,23]. Napriek tomu, že antivirálny účinok bol poprvýkrát zistený už v 40. rokoch
20. storočia, iba v posledných 25 rokoch boli použité na tieto pokusy synteticky modifikované
flavonoidy. Jednou z takýchto syntetizovaných látok bol 6,4'-dichloroflaván. Hoci v in vitro
podmienkach vykazoval silnú aktivitu, klinické pokusy boli neúspešné [8,23].
Synergizmus bol demonštrovaný medzi rôznymi kombináciami flavónov a flavonolov.
Napríklad kaempferol a luteolín vykazovali synergiu proti HSV. Synergizmus bol taktiež
preukázaný medzi flavonoidmi a inými antivirálnymi činidlami. Apigenín zlepšuje antivirálnu
aktivitu acykloviru proti HSV a besnote [23].
2.7.5.3 Baktericídna a bakteriostatická aktivita
Antibakteriálna aktivita bola skúmaná na jednotlivých izolovaných flavonoidoch, ako aj na
syntetických. Široká škála týchto látok disponuje antibakteriálnou aktivitou. Niektorí
výskumníci udávajú synergiu medzi prirodzene sa vyskytujúcimi flavonoidmi a inými
19
antibakteriálnymi látkami proti rezistentným rodom baktérií. Príkladom sú epikatechín gallát
a sophoraflavanón G. Niektorí skúmali synergiu medzi rôznymi flavonoidmi, iní synteticky
modifikovali prirodzené flavóny a analyzovali účinok proti baktériam. Skupina vedcov
potvrdila, že antibakteriálna aktivita 3-metylénflavanónov sa zvyšuje, ak sú v B kruhu prítomné
substituenty chlóru a brómu [1,22,23].
S narastajúcim počtom ľudí s oslabenou imunitou je pochopiteľný záujem o identifikáciu
látok, ktoré baktérie skôr zabíjajú, ako len inhibujú ich rast. Baktericídna aktivita v tomto
kontexte je definovaná ako aktivita majúca za následok 99,9 % redukciu počtu baktérií, a je
určovaná použitím metódy čas-úmrtie alebo metódy minimálnej baktericídnej koncentrácie
(MBC) [22]. Štúdie s modelovými membránami dokazujú, že flavonoidy spôsobujú agregáciu,
a v roku 2007 bolo potvrdené, že flavonol galangín vykazuje tento účinok na bakteriálne bunky.
Podobné účinky boli preukázané aj u flavan-3-olu a epikatechínu [8,22,23].
Prvé výskumy flavonoidov ukazujú, že priama atibakteriálna aktivita flavonoidov môže
prispievať až k trom rôznym mechanizmom. Týmito sú poškodenie cytoplazmatickej
membrány (spôsobené perforáciou alebo znížením membránovej fluidity), inhibícia syntézy
nukleových kyselín (spôsobené inhibíciou topoizomerázy) a inhibícia energetického
metabolizmu (spôsobené inhibíciou NADH-cytochróm c reduktázy). V rokoch 2005 ̶ 2010 boli
vedené ďalšie výskumy, ktoré podporili navrhnuté mechanizmy. Práca s triedou flavonolov,
flavan-3-olov a flavolanov preukázala, že spôsobujú poškodenie cytoplazmatickej membrány
(je možné, že kvoli tvorbe peroxidu vodíka). Trieda flavan-3-olov a izoflavónov vykazuje
inhibíciu syntézy nukleových kyselín (inhibíciou topoizomerázy a/alebo
dihydrofolátreduktázy) [8,22].
2.7.6 Antiflogistická aktivita flavonoidov
Ďalším dôležitým bodom terapeutickej aplikácie flavonoidov, ktorým sa táto práca zaoberá
v praktickej časti, je zápal (z gréckeho flogósis). Tento proces je integrovaná odozva mnohých
obranných systémov organizmu na inváziu cudzorodého telesa akéhokoľvek druhu, či už sa
jedná abiotickú časticu, bakteriálnu bunku alebo vírusy [1,24,25]. Okrem iného záhŕňa proces
zápalu pôsobenie doplnkového systému, koagulácie krvi, humorálnej a bunkovej imunity
cytokínov, tkanivových hormónov, angiogenézu (vývoj krvných a lymfatických tkanív)
a nápravné procesy [1,19,24,25].
Hlavným spúšťačom zápalu je rozpoznanie cudzorodej bunky (mikróbu) špecifickými
receptormi vrodeného imunitného systému, ktorý zohráva rozhodujúcu úlohu v indukcii
iniciácie prvotných signálov a vytvorení aparátu. Hlavnou funkciou zápalu je odstrániť infekciu
a napraviť poškodenia, ku ktorým došlo, za účelom opäť dosiahnuť homeostázu organizmu.
Ideálna zápalová odozva je preto rýchla a deštruktívna, špecifická a seba-limitujúca. Dôležitosť
tejto rovnováhy je demonštrovaná na nálezoch určitých chronických a infekčných a zápalových
poruchách, pri ktorých zápalová odozva spôsobí viac škody hostiteľovi ako mikróbu
[12,19,25,26].
Zápal je veľmi úzko spätý s imunitným systémom. Vskutku môže prehnaná aktivácia odozvy
vrodeného imunitného systému spôsobiť chronickú infekciu alebo chronický zápal v dôsledku
20
neefektívnej regulácie alebo rozpadu zápalovej odozvy. Z mnohých štúdií bolo preukázané, že
chronický zápal je čoraz viac zapojený v rozvoji niektorých patologických porúch ako je
ateroskleróza, obezita, diabetes, neurodegeneratívne ochorenia a tiež rakovina. Z nich
kardiovaskulárne ochorenia a rakovina sú hlavnými príčinami úmrtí v mnohých krajinách
[19,25]. Mnohé epidemiologické štúdie poukazujú na to, že vzrast konzumácie ovocia
a zeleniny bohatých na flavonoidy je spojený so znížením výskytu kardiovaskulárnych ochorení
rôznych typov rakoviny [19,25,26].
Hoci sa už dnes využívajú na liečenie akútneho zápalu steroidné protizápalové lieky, neboli
tieto lieky úplne úspešné v liečbe chronických zápalových porúch, pretože látky tohto druhu sú
doprevádzané nečakanými účinkami. Preto je potreba nájsť bezpečnejšie protizápalové zložky
[1,24,25,26].
2.7.6.1 Protizápalový mechanizmus flavonoidov
V nedávnych štúdiach bolo popísaných niekoľko mechanizmov vysvetľujúcich
protizápalovú aktivitu flavonoidov, vrátane antioxidačnej aktivity a odstraňovania voľných
radikálov, regulácií bunečnej aktivity buniek spojených so zápalom, modulácie aktivity
enzýmov metabolizmu arachidonovej kyseliny (fosfolipáza A2, cyklooxygenáza,
lipooxygenáza) a NO-syntázy, modulácie produkcie proinflamačných molekúl a modulácie
expresie proinflamačných génov [1,25,26].
2.7.6.2 Modulácia bunečných funkcií spojených so zápalom
Imunitný systém je integrovaný komplexne regulovanou skupinou buniek, ktoré možu
interagovať spôsobom bunka-bunka a taktiež môžu vytvoriť odozvu na intracelulárne signály
vrátane hormónov a cytokínov. Imunitná odpoveď môže byť modifikovaná stravou,
farmakologickými činidlami, environmentálnymi polutantmi a prirodzene sa vyskytujúcimi
potravinovými chemickými látkami ako sú vitamíny a flavonoidy. Niektoré flavonoidy
vykazujú pozoruhodný rad biochemických a farmakologických aktivít, ktoré ovplyvňujú
funkciu imunitných a zápalových buniek ako sú T- a B-lymfocyty, makrofágy, neutrofily, žírne
bunky alebo bazofily [24,25,26].
Niektoré flavonoidy špecificky ovplyvňujú enzýmový systém kriticky zapojený v generácii
protizápalového procesu, najmä tyrozín- a serín-treonín-proteínkinázu. Tieto enzýmy sú
zapojené v signálnej transdukcii a procesoch aktivujúcich bunky ako je proliferácia
T-lymfocytov, aktivácia B-lymfocytov alebo produkcia cytokínov stimulovaná monocytmi
[25,26]. Genisteín, izoflavón, bol preukázaný ako špecifický inhibítor tyrozín-proteínkinázy.
Táto aktivita sa môže podieľať na niektorých protizápalových účinkoch, keďže proliferácia T-
lymfocytov je spojená s fosforyláciou tyrozínu príslušných proteínov T-lymfocytov [1,25,26].
2.7.6.3 Modulácia aktivity proinflamačných enzýmov
Mnohé výskumy ukázali, že rôzne flavonoidné molekuly modulujú aktivitu enzýmov
metabolizujúcich kyselinu arachidonovú (AA) ako fosfolipáza A2 (PLA2), cyklooxygenáza
(COX) a lipooxygenáza (LOX) a enzými produkujúce oxid dusnatý (NOS). Inhibícia týchto
enzýmov redukuje produkciu AA, prostaglandínov, leukotriénov a NO, ktoré sú rozhodujúcimi
21
mediátormi zápalu. Preto inhibícia týchto enzýmov flavonoidmi môže byť jedným
z najdôležitejších mechanizmov ich protizápalovej aktivity [1,25,26].
2.7.7 Neurostimulačný účinok flavonoidov
Nielen periférny nervový systém, ale aj CNS je ovplyvňovaný flavonoidmi. Flavonoidy sú
antagonisti k adenozínovým receptorom v mozgu. Sú taktiež ligandmi benzodiazepínových
receptorov. Výsledkom je stimulácia príbuzná tej po požití kávy, čaju alebo tabaku. Keďže tieto
stimulanty obsahujú značné koncentrácie flavonoidov, pravdepodobne najviac prispievajú
k danému účinku [1,9].
Flavonoidy majú okamžitý účinok uvoľnovania bolesti pri kožných ranách spôsobených
hmyzom alebo po uhryznutí hadom, popálením alebo porezaním. Tento mechanizmus môže
byť veľmi jednoducho vysvetlený inhibíciou tvorby prostaglandínov (PG). Daný enzým
tvoriaci PG je inhibovaný mnohými flavonoidmi [1,9,17].
Lokálny anestetický efekt flavonoidov sa podobá na efekt acetylsalicylátu. Korešponduje
s účinkom kodeínu, čo je látka patriaca do skupiny opiátov. Ak by bolo možné nahradiť
novokaín a iné anestetiká založené na opiátoch, mohlo by sa predísť vedľajším neurologickým
účinkom ako sú dlhodobé závrate [1,9,17].
2.7.8 Analgetický účinok
Analgézia znamená uvoľnenie od bolesti. Dôležitou dráhou tohto druhu je zvýšená
biosyntéza proopiomelanokortínu, z ktorého sú proteázami uvoľnované endogénne opiáty
enkefalín, endorfín a dynorfín. Oprávnenie klasifikácie týchto látok ako opiátov nie je
opodstatnené len schopnosťou indukovať anestéziu, ale skladajú sa do rovnakej priestorovej
štruktúry ako členovia skupiny morfia. Okrem toho obe skupiny, endogénne opiáty aj tie
rastlinného pôvodu, obsadzujú rovnaké neuronálne receptory. Efekty flavonoidov
a endogénnych opiátov sú veľmi podobné, preto aj tu sa predpokladá priame spojenie. Obe
triedy látok zvyšujú koncentráciu cAMP, flavonoidy (quercetín, kaempferol) inhibujú cAMP
fosfodiesterázu. Flavonoidy sa môžu priamo viazať na opiátne receptory alebo môžu inhibovať
neurónové transmiterové receptory, aby aktivovali neuróny bolesti [1,6,22].
2.8 Interakcie flavonoidov s inými liekmi
Interakcie liečiv predstavujú narastajúci problém pri vytváraní a kontrole moderných
liečebných metód, keďže nové nahliadnutie na patogenézu vedie k predstavovaniu ešte
komplexnejších liečiv. Preto vzájomné interakcie medzi liekmi alebo liekmi a komponentmi
stravy, poprípade alkoholom, može drasticky vyradiť terapeutický účinok jedného alebo oboch
liečiv, čím sa stávajú zbytočnými alebo nebezpečnými. Hoci flavonoidy sú považované za
netoxické komponenty bežnej stravy, môžu podstatne ovplyvniť farmakologický potenciál
určitých liekov [2,27].
Jeden z prvých príkladov tejto komplikácie bol pozorovaný pri obličkovej dialýze, ktorej
pacienti so stabilnou transplantáciou obličiek dostávali lieky na zlepšenie krvnej cirkulácie.
22
Niektorí z týchto pacientov konzumovali so svojím jedlom grepový džús, no krátko na to trpeli
škodlivými efektmi zvýšenej potencie ich medikácie. Po tomto zistení sa začali touto témou
zaoberať aj iní vedci a tento výsledok bol opať potvrdený. Vedci zistili, že komponent džúsu,
pravdepodobne naringenín, ktorý je prítomný v značnej koncentrácii, aktivuje
fosfoglykoproteín v epitelových bunkách žalúdka a potláča expresiu génu cytochrómu P450
3A4. Uvedený proteín zlepšuje vstrebávanie mnohých liekov zo žalúdka, vrátane vinblastínu,
cyklosporínu, digoxínu, fexofenadínu a lozartánu, ten druhý naopak iniciuje oxidačnú
dekompozíciu liekov. Keďže sa jedná najmä o lieky často využívané v terapii rakoviny,
hypertenzie, HIV, imunitných ochorení a iných závažných porúch, interferencie týkajúce sa ich
funkčnosti musia byť lekármi brané v úvahu [2,27].
Mechanizmus zvýšenia aktivity liekov pre zlepšenie krvnej cirkulácie bol identifikovaný ako
inhibícia cytochróm P450-dependentnej monooxygenázy, ktorá iniciuje deštrukciu
vaskulárnych činidiel násobením hydroxylácií ich aromatického jadra [2,27].
2.8.1 Flavonoidy izolované z rastliny Cannabis sativa
Celkovo bolo doposiaľ izolovaných 26 flavonoidov z rastliny Cannabis sativa. Boli robené
štúdie bioaktivít týchto flavonoidov, no nie do takej miery ako štúdie kanabinoidov alebo
terpenoidov. Synergicky zlepšujú niektoré prospešné účinky alebo redukujú nechcené vedľajšie
účinky kanabinoidov, keď je Cannabis prijímaný v podobe hrubého extraktu. Je ešte mnoho
nepreštudovaných oblastí, nielen vo vzťahu ku konzumentom tejto rastliny, ale aj vo vzťahu
k ich úlohe v rastline [12,17,27].
Flavonoidy boli extrahované z listov, kvetov, peľu a stonky rastliny. Boli získané aglykóny
alebo konjugované O-glykozidy kaempferolu, quercetínu, apigenínu a luteolínu, ako aj C-
glykozidy vitexínu, izovitexínu, orientínu a ich O-glykozidy. Okrem toho sa vyskytujú rôzne
metylované, prenylované a geranylované deriváty týchto flavonoidov. Cannflavín
A a cannflavín B, dva metylované izoprenoidné flavóny, reprezentujú prvé aglykóny
flavonoidov unikátne izolované z rastliny Cannabis sativa [12,17,27].
2.8.1.1 6-prenylapigenín
U niektorých flavonoidov spolu s 6-prenylapigenínom (viď Obrázok č. 8), ktorý bol taktiež
izolovaný z Cannabis sativa, bolo dokázané, že inhibuje biosyntézu melanínu v B16
melanómových bunkách bez toho, aby inhiboval tyrozinázu. Výskumy zamerané na štruktúrnu
aktivitu indikovali, že prítomnosť izoprenoidom substituovaného zvyšku zvyšuje inhibičnú
aktivitu produkcie melanínu v týchto bunkách [29].
23
Obrázok č. 8: Štruktúra 6-prenylapigenínu
2.8.1.2 Apigenín
Apigenín (5,7,4’-trihydroxyflavón) je bežný flavonoid nájdený v mnohých rastlinách.
Apigenín (viď Obrázok č. 9) je popísaný ako nemutagénny flavonoid, ktorý má významný
chemopreventívny účinok proti UV žiareniu. Nedávne výskumy ukázali, že môže znížiť
oxidatívne poškodenie DNA, inhibuje rast abnormálnych bielych krviniek u leukemikov
a indukuje ich diferenciáciu. Navyše inhibuje transdukciu signálu rakovinových buniek
a indukuje apoptózu. Bol preukázaný antikarcinogénny účinok na rakovinových bunkách
prostaty a vaječníkov. Prejavuje protizápaľový, antispazmatický alebo spazmolytický účinok.
Je slabo estrogénnym flavonoidom. Ďalšie štúdie ukázali, že dokáže zlepšovať aterosklerózu
[30,31,32,33].
Obrázok č. 9: Štruktúra apigenínu
2.8.1.3 Cannflavín A a B
U cannflavínov A a B (viď Obrázok č. 10) bolo dokázané, že inhibujú prostaglandín E2
v ľudských reumatických synoviálnych bunkách. Cannflavín A tu má 30-násobne väčší
potenciál ako aspirín. Cannflavín A inhiboval cyklooxygenázu (COX) a lipooxygenázu, a preto
má protizápaľové účinky. Je zvláštne, že tieto zlúčeniny majú takú silnú biologickú aktivitu,
pretože substitúcia prenylovou skupinou zvyšuje lipofilnosť flavonoidov a tým dáva týmto
molekulám silnú afinitu k biologickým membránam. Prenylované flavonoidy priťahujú stále
väčšiu pozornosť vedeckých komunít, pretože majú potenciálny antioxidačný
a antikarcinogénny účinok a sú účinné v liečbe menopauzálnych problémov. Preto je možné,
že u cannflavínov budú v budúcnosti dokázané aj ďalšie biologické vlastnosti [34,35,36].
O
OH
OOH
HO
Apigenín
OH
O
OH
O
HO
CH3
H3C
6-prenylapigenín
24
V najnovších výskumoch a štúdiach bola prezentovaná ich antimikrobiálna a antiprotozoálna
aktivita, konkrétne antileishmanická aktivita (antileishmanický = pôsobiaci proti Leishmania
parazitom; Leishmania = taxonomický rod v rodine Trypanosomatidae – parazitárne prvoky,
trypanozómy; prenášané muškami, ktoré spôsobujú ochorenia u ľudí a iných stavovcov)
[34,35,36].
Obrázok č. 10: Štruktúra cannflavínu A a B
2.8.1.4 Chryzoeriol
Chryzoeriol (viď Obrázok č. 11) a jeho glykozid (chryzoeriol-6-O-acetyl-4’-β-D-glukozid)
vykazujú ako flavonoidy antioxidačnú aktivitu. Niekoľko rôznych metód bolo použitých na
zistenie efektu O-glykozilácie. Glykozilácia chryzoeriolu znižuje jeho schopnosť inhibovať
lipoperoxidáciu a reakciu s peroxylovými radikálmi. Naopak glykozid je efektívnejším
vychytávačom DPPH radikálov (stabilné radikály, ktoré strácajú charakter voľných radikálov
v prítomnosti molekúl, ktoré sú donorom vodíkového atómu) a lepším inhibítorom
xantínoxidázy ako aglykón [37].
Chryzoeriol pôsobí chemoprotektívne tým, že selektívne inhibuje aktivitu CYP1B1 (enzým,
ktorý sa zúčastňuje aktivácie prokarcinogénov na karcinogény). Ďalšie štúdie potvrdili, že
chryzoeriol je schopný zabrániť tvorbe aduktov DNA-benzo[a]pyrén v rakovinových bunkách
Canniflavón 2 = Cannflavín A
O
O OH
OH
HO
O
Canniflavón 1 = Cannflavín B
O
O OH
OH
HO
O
25
prsníka. Chryzoeriol sa teda môže podielať na chemoprevencii proti environmentálnym
prokarcinogénom ako je benzo[a]pyrén [37].
Obrázok č. 11: Štruktúra chryzoeriolu
2.8.1.5 Kaempferol
Niektoré epidemiologické štúdie zistili pozitívne spojenie medzi konzumáciou potravín
obsahujúcich kaempferol a zníženým rizikom vývoja niektorých porúch ako rakovina
a kardiovaskulárne ochorenia. Mnohé predklinické štúdie dokázali, že kaempferol a jeho
glykozidy majú širokú škálu farmakologických účinkov, vrátane antioxidačnej, protizápalovej,
antimikrobiálnej, antikarcinogénnej, kardioprotektívnej, neuroprotektívnej, antidiabetickej,
antiosteoporotickej, etrogénnej/antiestrogénnej, anxiolytickej, analgetickej a protialergickej
aktivity. Kaempferol (viď Obrázok č. 12) je silný antioxidant a pomáha predchádzať
oxidatívnemu poškodeniu buniek, lipidov a DNA. Pomáha predchádzať ateroskleróze
inhibíciou oxidácie LDL častíc a tvorby krvných doštičiek. Štúdie taktiež potvrdili, že sa správa
ako chemopreventívne činidlo, čo znamená, že inhibuje tvorbu rakovinových buniek.
Synergicky pôsobí s quercetínom v redukcii proliferácie rakovinových buniek. Z rastliny
Cannabis sativa bol izolovaný glykozylovaný kaempferol-3-O-soforozid (KPOS)
z metanolovej frakcie [38,39].
Obrázok č. 12: Štruktúra kaempferolu
Kaempferol-3-O-soforozid (viď Obrázok č. 13) má protinádorový, antioxidačný,
antialergický a antidiabetický účinok, ale mechanizmy dnes ešte nie sú známe. V nedávnych
štúdiach bol študovaný a potvrdený protektívny účinok proti zápalovým ochoreniam. Výsledky
OHO
OH O
OH
OH
Kaempferol
O
OH
OOH
HO
OCH3
Chryzoeriol
26
štúdií ukázali, že KPOS dokáže inhibovať lipopolysacharidom (LPS) indukovanú prozápalovú
odpoveď zvýšením bariérovej integrity, blokovaním adhézie neutrofilov a transepitelovou
migráciou cez epitelové bunky [40,41].
Obrázok č. 13: Štruktúra kaempferol-3-O-soforozidu
2.8.1.6 Luteolín
Luteolín (5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavón), klasifikovaný chemicky ako flavón, sa vyskytuje
v mnohých typoch rastlín vrátane ovocia, zeleniny a liečivých rastlín. Rastliny bohaté na
luteolín sa používali v tradičnej čínskej medicíne na liečenie rakoviny, zápalu a hypertenzie.
Svoju pozornosť si získal svojim širokým spektrom biologických a farmakologických
vlastností. Mnohé štúdie preukázali jeho protizápaľový, protialergický a antikarcinogénny
účinok. Tieto vlastnosti sú čiastočne zapríčenené antioxidačnou kapacitou a schopnosťou
vychytávať voľné radikály. Luteolín aktivuje antioxidačné enzýmy a potláča proinflamačné
zložky. Biologické účinky môžu byť funkčne prepojené. Napríklad protizápalový účinok môže
byť spojený s jeho vlastnosťou pôsobiť proti rakovinovým bunkám. Luteolín (viď Obrázok
č. 14) je najefekívnejším flavonoidom v inhibícii proliferácie nádorových buniek. Používa sa
na liečenie rakoviny kože. Okrem tohto vykazuje antimikrobiálne a imunomodulačné účinky
[42,43,44].
Mnohé štúdie ukázali pozitívny vplyv na centrálny nervový systém (CNS). Okrem iného
pomáha luteolín zamedziť hromadeniu plaku. Môže pomôcť zachovať zdravé kognitívne
funkcie ako učenie a pamäť v živočíšnych modeloch [42,43,44,45].
Kaempferol-3-O-soforozid
O
O
OH
HO
OH O
O
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
27
Obrázok č. 14: Štruktúra luteoliínu
2.8.1.7 Orientín a izoorientín
U orientínu je známa anxiolytická a antioxidačná aktivita, ktorá je silnejšia ako u vitexínu
(popísaný nižšie). Orientín ako aj izoorientín (viď Obrázok č. 15) inhibuje LPS-indukovanú
disrupciu bariéry, expresiu molekúl adherujúcich na povrch buniek (CAM)
a adhéziu/transendoteliálnu migráciu monocytov na/do ľudských endoteliálnych buniek.
Taktiež potláča hyperpermeabilitu a migráciu leukocytov in vivo indukovanú LPS. Ďalej bola
dokázaná jeho schopnosť potláčať tvorbu faktoru nádorovej nekrózy α (TNF-α) alebo
interleukínu (IL)-6. Dlhodobá liečba orientínom spôsobila redukciu LPS-indukovanej letálnej
endotoxémie. Tento výsledok potvrdil, že orientín chráni vaskulárnu bariérnu integritu a tým je
vhodný ako terapia pre vaskulárne zápalové ochorenia [46,47,48].
Popritom bola skúmaná aj vaskulárna aktivita a možné mechanizmy účinku orientínu.
Orietntín uvoľňuje fenylefrínom-indukované kontrakcie, ale tento vazorelaxačný efekt je
zoslabený oxidom dusnatým. Orientín inhibuje noradrenalínom, CaCl2- a KCl- indukovanú
vazorestrikciu. Orientín dokáže stimulovať produkciu NO endoteliálnymi bunkami. Zvyšuje
koncentráciu cyklického guanozínmonofosfátu (cGMP) bez toho, aby sa zmenila koncentrácia
cyklického adenozínmonofosfátu [46,47,48].
O
OH
OOH
HO
OH
Luteolín
O
OH
OOH
HO
OH
O
OH
OH
HO
HO
Orientín
28
Obrázok č. 15: Štruktúra orientínu a izoorientínu
2.8.1.8 Quercetín
Quercetín (viď Obrázok č. 16) je kategorizovaný ako flavonol. Je to aglykón, z ktorého
substitúciou hydroxylovej skupiny (väčšinou v polohe 3) cukrom (glukóza, ramnóza, rutinóza)
vznikajú glykozidy. Touto substitúciou sa môže zmeniť rozpustnosť, absorpcia ale aj účinky
in vivo. Quercetín sa javí ako veľmi prospešný pre ľudské zdravie v mnohých ohľadoch.
Antioxidačná aktivita quercetínu poskytuje ochranu mozgu, srdca a iných tkanív pred
ischemicko-reperfúznymi poškodeniami, toxickými látkami alebo inými faktormi, ktoré môžu
indukovať oxidatávny stres [49,50].
In vitro quercetín inhibuje histamín uvoľnený žírnymi bunkami a bazofilmi, čo naznačuje
antialergénny efekt. Taktiež pomáha čeliť aspektom spôsobujúcim anafylaktické reakcie tým,
že potláča imunologlobulín E [49,50,51].
Početné in vitro a in vivo experimenty pomohli vysvetliť antikarcinogénny účinok
quercetínu. In vitro dôkazy indikujú, že existuje rada antikarcinogénnych mechanizmov,
vrátane antioxidačného, antiproliferatívneho, pre-apoptotického, efekt signalízácie buniek
a potlačenie rastového faktora, ako aj potenciálny synergizmus s niektorými
chemoterapeutickými činidlami [49,50,51].
U ľudí bolo zistené, že príjem quercetínu inhibuje agregáciu krvných doštičiek a tvorbu
trombov. Z niektorých štúdií vyplýva, že pozitívne upravuje krvný tlak a môže mať efekt aj na
hladinu cholesterolu. Quercetín znižuje glukózu krvnej plazmy, zachováva integritu
pankreatických β-buniek a ich funkciu a pomáha chrániť proti úpadkom v rozpoznávaní, nálade
a vo funkcii ľadvín indukovaným diabetom v modelových potkanoch pre diabetes. Niektoré
štúdie robené na zvieratách dokazujú gastroprotektívne účinky. Quercetín slabo inhibuje rast
Helicobacter pyroli in vitro [50,51,52,53].
O
OH
OOH
HO
OH
O
OH
HO OH
OH
Izoorientín
29
Obrázok č. 16: Štruktúra quercetínu
2.8.1.9 Vitexín
Vitexín (viď Obrázok č. 17) kategorizovaný ako flavonoidný C-glukozid. In vivo
metabolizmus vitexínu bol zisťovaný na potkanoch. Vitexín indukuje apoptózu a potláča rast
nádorových buniek, má potenciálny antioxidačný účinok a môže byť efektívne využitý na
prevenciu pred nepriaznivými reakciami v koži indukovanými UV žiarením ako napríklad
produkcia voľných radikálov a poškodenie kožných buniek [54,55].
Vitexín má potenciálny hypotenzný efekt, ktorý vzniká blokáciou ganglií. Má značný
protektívny účinok proti myokardiálnym poraneniam. Protizápaľový účinok bol indikovaný na
základe jeho antihistaminických, antibradykinínových a antiserotonínových vlastností. Ďaľšie
klinické využitia zahŕňajú antivirálnu, antityroidnú, antisklerotickú a antihepatotoxickú
aktivitu. Schopnosť vitexínu inhibovať superoxidové radikály vedie k potenciálnej aplikácii
jeho anti-aging účinku v kozmetickom priemysle [54,55].
Vitexín spolu s izovitexínom podávané orálne značne znižujú postprandiálny krvný cukor.
Oba stimulujú sekréciu inzulínu a inhibujú α-glukozidázu, čím pomáhajú pacietom, ktorí trpia
na diabetes [54,55].
Obrázok č. 17: Štruktúra vitexínu
OHO
OH O
OH
OH
OH
Quercetín
O
OH
HO
HO
OH
O
OH
OOH
HO
Vitexín
30
3 PRAKTICKÁ ČASŤ
3.1 Cieľ
Cieľom mojej práce bolo izolovať rôzne látky obsiahnuté v rastline Cannabis sativa,
identifikovať ich a klasifikovať pomocou dostupných analytických metód. V druhej časti som
sa zaoberala skúmaním antiflogistickej aktivity látok, ktoré sa mi podarilo vyizolovať
v dostatočnom množstve, ako aj celkového rastlinného extraktu a podielov rozpustných
v jednotlivých organických rozpúšťadlách, respektíve vo vode.
Pri svojej práci som sa zamerala na flavonoidy – ubikvitárne biologicky aktívne látky
obsiahnuté v rastline C. sativa, a využila doposiaľ zistené informácie z výskumov o synergii
týchto látok.
3.2 Prvá časť: Izolácia a identifikácia obsahových látok C. sativa
3.2.1 Použitý materiál a prístroje
3.2.1.1 Rastlinný materiál
Rastlinný materiál, Cannabis sativa z čeľade Cannabaceae, bol zozbieraný začiatkom roku
2014 v Brne. Tento materiál bol ďalej spracovaný, aby mohla byť vykonaná jeho expertíza.
Z celej rastliny bol získaný etanolický extrakt, z ktorého sa odobrala časť na vlastnú analýzu
v množstve 18,591 g. Tento extrakt som spracovávala od začiatku až do získania jednotlivých
izolovaných látok.
Prvým krokom bola extrakcia kvapalina-kvapalina, ktorá bola realizovaná v oddeľovacej
kónickej nádobe. Pre prehľadnosť nižšie uvádzam schému celého postupu (viď Schéma č. 1).
Schéma č. 1: Spracovanie etanolického extraktu rastliny (čísla v zátvorkách označujú
objemové pomery rozpúšťadiel)
31
Vytrepávaním do rôznych rozpúšťadiel som dosiahla rozdelenie látok do 4 podielov.
Jednotlivé podiely boli odparené na odparke, respektíve lyofilizované v prípade vody, a získaná
sušina bola zvážená.
3.2.1.2 Chemikálie
Acetonitril gradient grade (Scharlau)
Benzén p.a. (Penta)
Chloroform p.a. (Penta)
Ethylacetát p.a. (Penta)
Kyselina octová p.a. (Penta)
Metanol p.a. (Penta)
Metanol gradient (Scharlau)
Voda pre HPLC – pripravení pomocou nižšie uvedeného prístroja
Recyklát – zmes zložená približne z 10 % vody, 10 % metanolu a 80 % acetonitrilu
3.2.1.3 Materiál pre chromatografiu
TLC
hliníková fólia Silikagel 60, F254 20 cm × 20 cm, tloušťka vrstvy 0,2 mm (Merck)
HPLC
analytická kolóna: Acentis ®Express C8, 15cm × 2,1 mm, veľkosť častíc 2,7 μm
preparatívna kolóna: Supelcosil TM LC-8 SEMI-PREP, 25 cm × 10 mm, veľkosť častíc
5 µm
LC-stĺpcová
náplň kolóny: silikagél Sigma-Aldrich 60 Å, veľkosť častíc 0,04–0,63 mm
3.2.1.4 Prístroje
Vákuová rotačná odparka
BŰCHI Waterbath B-480, Rotavapor R-114 (Bűchi, Switzerland)
BŰCHI Vacuum pump V-700, Vacuum controler V-850, Rotavapor R-3 (Bűchi,
Switzerland)
Lyofilizátor
CHRIST Alfa 1 – 2 LD (Christ, Germany)
32
HPLC a UV detekcia
analytická HPLC: Agilent 1100, detektor DAD UV/VIS (Agilent Technologies, USA)
preparatívna HPLC: YL9100 HPLC Systém Clarity – YL9101 Vacuum Degasser,
YL9110 Quarternary Pump, YL9130 Column Compartment, YL9160 PDA Detector,
YL9150 Autosampler (Young Lin Instrument, Korea)
IR spektrofotometer
Nicolet Impact 400D FT-IR (Thermo Nicolet Corporation, USA)
Prístroj na prípravu vody pre HPLC
Aqua MAX BASIC 360 series (Young Lin Instrument, Korea)
Analytické váhy
KERN EW 620-3NM (Kern, Germany)
3.2.2 Metódy
3.2.2.1 Separačné
Analytická tenkovrstvová chromatografia (TLC)
Stacionárna fáza: hliníková fólia Silikagel 60 F254, hrúbka vrstvy 0,2 mm (Merck)
Mobilná fáza: zložená z benzénu, chloroformu, etylacetátu a metanolu v rôznom
pomere
Detekcia: UV 254 nm a 356 nm
Postup: Po vyvinutí TLC som silikagel vysušila a pod UV svetlom s vlnovou
dĺžkou 254 nm vyznačila jednotlivé škvrny. Takto označené TLC slúžilo
pre zistenie čistoty frakcie a pre porovnanie podobnosti frakcií pri ich
spájaní.
Metódou TLC bolo taktiež zisťované vhodné zloženie mobilnej fázy pre
LC u jednotlivých podielov získaných z etanolického extraktu
vytrepávaním do organických rozpúšťadiel a vody.
Preparatívna tenkovrstvová chromatografia (TLC)
Stacionárna fáza: hliníková fólia Silikagel 60 F254, hrúbka vrstvy 0,2 mm (Merck)
Mobilná fáza: zložená z benzénu, chloroformu a metanolu v rôznom pomere
Detekcia: UV 254 nm a 356 nm
Postup: Po vyvinutí TLC som silikagel vysušila a pod UV svetlom s vlnovou
dĺžkou 254 nm vyznačila jednotlivé škvrny, potom ich zoškrabala do
vialiek a nasorbované látky eluovala metanolom. Získané eluáty som
následne analyzovala prostredníctvom HPLC.
33
Stĺpcová chromatografia
Stacionárna fáza: silikagel o veľkosti zŕn 0,040–0,063 mm
Mobilní fáze: chloroform, benzén, metanol v pomere 7 : 2 : 1 (v/v/v)
Postup: Frakcie z chloroformového podielu boli zbierané približne po 100–150
ml, frakcie z hexánového podielu asi po 40–50 ml, následne analyzované
pomocou TLC a HPLC. Na základe podobnosti zloženia boli pospájané
a potom odparené na vákuovej odparke.
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) ‒ analytická
Prístroj: Agilent 1100, detektor DAD UV
Stacionárna fáza: Acentis ®Express C8, 15 cm × 2,1 mm, veľkosť častíc 2,7 μm
Elúcia: gradientová
Mobilná fáza: Metóda 1: 0. minúta: 50 % MeCN, 50 % HCOOH (0,2 %)
24. minúta: 83 % MeCN, 17 % HCOOH (0,2 %)
24,1. minúta: 100 % MeCN
Prietok: 0,3 ml/min
Objem nástreku: 1 μl
Teplota kolóny: 40 °C
Detekcia: UV pri vlnových dĺžkach λ 254 a 280 nm
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) – semipreparatívna
Prístroj: YL9100 HPLC System
Stacionárna fáza: Acentis ®Express C8, 25 cm × 10 mm, veľkosť častíc 5 µm
Elúcia: gradientová
Mobilná fáza: Metóda 2: 0. minúta: 90 % recyklát, 10 % HCOOH (0,2 %)
15. minúta: 95 % recyklát, 5 % HCOOH (0,2 %)
15,01. minúta: 100 % ACN
25,01. minúta: 100 % MeOH
40,01. minúta: 90 % recyklát, 10 % HCOOH (0,2 %)
Prietok: 5 ml/min
Objem nástreku: 25 μl
Teplota kolóny: 40 °C
Detekcia: UV pri vlnovej dĺžke λ 254 a 280 nm
34
3.2.2.2 Identifikačné
UV spektrofotometria
UV spektrá vyizolovaných látok boli zmerané pomocou prístroja DAD UV/VIS Agilent
zároveň s HPLC analýzou. Tieto spektrá boli použité k odhadu štruktúry zlúčenín. Výsledky
boli porovnané s UV spektrami založenými v školskej databáze VFU v Brne.
IČ spektrofotometria
IČ spektrá boli namerané pomocou prístroja Nicolet Impact 400D FT-IR, a to ako závislosť
transmitancie na vlnočete žiarenia. Vzorky boli merané v pevnej forme metódou ATR. Na
zmeranie spektra bola aplikovaná ATR korekcia, korekcia na H2O a CO2 a automatické
vyhladenie spektra. Vyhodnotením spektier boli získané informácie o prítomnosti rôznych
funkčných skupín v štruktúre analyzovanej vzorky.
Nukleárna magnetická rezonancia
Analýza pomocou nukleárnej magnetickej rezonancie bola robená v zahraničí, na Univerzite
v Mississippi.
35
3.3 Druhá časť: Antiflogistický účinok celkového extraktu, jednotlivých
podielov a čistých izolovaných látok
Cieľom experimentu bolo stanoviť antiflogistický účinok jednotlivých izolovaných látok,
celkového extraktu a podielov rozpustných v roznych rozpúšťadlách. Pred samotným
experimentom som si vyhľadala a naštudovala publikované zahraničné štúdie, ktoré sa
zaoberali skúmaním protizápalového účinku látok prítomných u rastliny Cannabis sativa.
Antiflogistická aktivita bola stanovovaná pomocou komerčne dostupných kitov. Kľúčovými
boli špeciálne skonštruované ľudské reportérové monocyty – THP1 bunková línia. Táto metóda
bola vybraná na základe niekoľkých aspektov. Metóda je relatívne jednoduchá a časovo
nenáročná a je vhodná na skríning protizápalového účinku látok izolovaných z prírodných
materiálov. Vzhľadom k tomu, že pri izolácii sa mi podarilo získať malé množstvo čistej látky
(v rádoch μg), je výhodou taktiež malá náročnosť na množstvo použitej látky, ktorej
antiflogistickú aktivitu stanovujeme.
Stanovenie prebieha na mikrotitračnej doštičke paralelne so stanovením aktivity
referenčného antiflogistika.
3.3.1 Rozpúšťadlá, kultivačné médiá a iné použité chemikálie
Dimetylsulfoxid (DMSO)
Erytrozín B
Forbolester
Kultivačné médiá potrebné pre rast a úchovu buniek:
rastové médium ‒ zloženie: RPMI 1640 (2 mM L-glutamín, 1,5 g/l hydrogénuhličitan
sodný, 4,5 g/l glukóza, 10 mM HEPES a 1,0 mM pyruvát sodný) s 10 % teplom
inaktivovaným plodovým bovinným sérom (30 min pri 56 °C), 100 µg/ml
NormocínTM, Penicilín-Streptomycín (50 U/ml – 50 µg/ml)
mraziace médium ‒ zloženie: 90 % plodové bovinné sérum (FBS), 10 % DMSO alebo
75 % IMDM (Iscoveovo modifikované Dulbeccovo médium), 20 % FBS, 5 % DMSO
Lipopolysacharid (LPS)
PBS fosfátový pufor s 0,15 M NaCl
QUANTI-BlueTM
Selektívne antibiotiká: G418 (Geneticín®) a ZeocínTM
WST 1
3.3.2 Prístroje
Automatické pipety
Eppendorf (Nemecko)
36
Trepačka
VELP® SCIENTIFICA, Advanced Vortex Mixer (Taliansko)
Laminárny box
Merci SCS 1-6, Faster (Taliansko)
Inkubátor
ESCO CelCulture CO2 INCUBATOR (Singapur)
Centrifúga
NF 800 R, Nüve (Turecko)
Váhy
Kern 440 – Ecotech (Nemecko)
Spektrofotometer
FluoStar Omega – BMG LABTECH (Nemecko)
Inverzný mikroskop
OPTIKA® Microscopes Italy (Taliansko)
3.3.3 Pomôcky
Jednorázové rukavice
Jednorázové špičky na mikropipety
Kultivačná banka pre tkanivové kultúry
Mikrotitračná doštička s víčkom
boli použité jednorazové plastové doštičky s 96 jamkami s plochým dnom, ktoré mali
rady jamiek označené písmenami A až H a stĺpce číslami 1 až 12, takže každá jednotlivá
jamka bola označená kombináciou písmena a čísla
Vialky na riedenie jednotlivých komponentov
3.3.4 Komerčný kit použitý pre stanovenie antiflogistickej aktivity
K stanoveniu antiflogistickej aktivity bola použitá in vitro upravená bunková línia THP1,
komerčne dostupná od firmy InvivoGen (firma). THP1-XBlue™-MD2-CD14 bunky stabilne
exprimujú MD2 a CD14 gény, ktoré sú zodpovedné za TLR4 odpoveď indukovanú LPS.
Zároveň exprimujú enzým SEAP (sekretovaná embryonálna alkalická fosfatáza) indukovateľný
NF-κB/AP-1 (alkalická fosfatáza 1). Stimulácia TLR vedie k indukcii signálnej kaskády, ktorá
vedie k aktivácii NF-κB a následnej produkcii SEAP. Je to umelý konštrukt, ktorý obsahuje
reportérový gén pre SEAP, aby sme boli schopný monitorovať aktiváciu NF-κB stanovením
aktivity alkalickej fosfatázy exprimovanej extracelulárne do média. Pre lepší prehľad aktivácie
37
zápalovej dráhy, ktorá vedie cez NF-κB, je tento dej zobrazený v schéme uvedenej nižšie (viď
Schéma č. 2).
3.3.5 Charakteristika bunkovej línie a štruktúr sprostredkujúcich zápalovú
odpoveď
3.3.5.1 THP1 bunková línia
THP1 sú bunky odvodené od ľudskej monocytickej bunkovej línie získanej z periférnej krvi
jednoročného dieťaťa mužského pohlavia s akútnou monocytickou leukémiou. Používajú sa na
testovanie leukemických buniek v imunocytochemickej analýze interakciou proteín-proteín.
Vykazujú priestorovú, okrúhlu, jednobunkovú morfológiu. Narozdiel od iných leukemických
bunkových línií majú normálny diploidný karyotyp. THP 1 poskytujú kontinuálnu kultúru, rastú
v suspenzii. Priemerný čas zdvojenia je 35 až 50 hodín. Môžu byť diferencované na
makrofágoidné bunky použitím chemických činidiel [56].
3.3.5.2 Toll-like receptory
TLR4 (toll-like receptor) patrí do skupiny membránových receptorov (TLR 1−14). Hrá
zásadnú úlohu v rámci vrodeného imunitného systému - jeho monomérová štruktúra
prechádzajúca plazmatickou membránou rozoznáva cudzorodé molekuly a spúšťa príslušnú
signálnu kaskádu [57]. Rozpoznanie LPS pomocou TLR4 vyžaduje MD2 [57,58].
3.3.5.3 MD2
MD2 proteín (glykoproteín bohatý na cysteín) zjavne asociuje s TLR4 na povrchu bunky
a zabezpečuje odpovedavosť na LPS, čím poskytuje spojenie medzi receptorom a LPS
signalizáciou [58,59].
3.3.5.4 CD14
CD14 je ľudský gén, makrofágovo-špecifický diferenciačný antigén. Proteín kódovaný
týmto génom je komponentom vrodeného imunitného systému. CD14 plní úlohu koreceptora
(popri TLR4 a MD2) pre detekciu bakteriálneho LPS [58,59,60].
3.3.5.5 NF-κB
NF-κB je skupina transkripčných faktorov, ktoré sa viažu na promótory RNA polymerázy II
a ovplyvňujú tak expresiu génov dôležitých pre imunitu, zápalovú odpoveď, bunečný rast
a bunečnú smrť. Stimulácia receptorov spustí signalizačnú dráhu, ktorá spôsobí rozklad
komplexu I-κB/NF-κB a uvoľnenie inhibítora z komplexu, čo umožní transkripčným faktorom
NF-κB vstúpiť do jadra a regulovať prepis určitých génov.
38
Schéma č. 2: Aktivácia zápalovej dráhy v THP1 bunkovej línii bakteriálnym
lipopolysacharidom
3.3.6 Kolorimetrické stanovenie aktivity
K stanoveniu aktivity SEAP sa používa QUANTI-BlueTM, čo je kolorimetrický testovací
enzým vyvinutý k rozpoznaniu akejkoľvek aktivity AP v biologických vzorkách ako sú
supernatanty bunečných kultúr. Poskytuje jednoduchú a rýchlu cestu detekcie a kvantifikácie
embryonálnej alkalickej fosfatázy, ktorá je reportérom so širokým využitím pre in vivo a in vitro
analytické štúdie.
V prítomnosti AP sa zmení farba tohto enzýmu z ružovej na purpurovú. Intenzita tohto
odtieňa odráža aktivitu AP. Hladina alkalickej fosfatázy može byť určená kvalitatívne voľným
okom alebo kvantitatívne použitím spektrofotometra pri 620‒655 nm.
3.3.7 Princíp stanovenia antiflogistickej aktivity
Bunky inkubujeme v rastovom médiu a následne indukujeme ich diferenciáciu z monocytov
na makrofágy. Bunky sa potom inkubujú s látkami, ktorých aktivitu stanovujeme a in vitro
prídavkom LPS aktivujeme zápalovú dráhu, ktorá vedie cez TLR4
receptory. Spektrofotometricky stanovujeme kvantitatívne hladinu SEAP 3‒4 hodiny po
pridaní QUANTI-BlueTM. Látky s antiflogistickou aktivitou inhibujú zápalovú dráhu a tým
produkciu SEAP, čo sa prejaví znížením absorbancie. Ako referenčná látka je použitý
prednizón.
39
3.3.7.1 Prednizón ako referenčné antiflogistikum
Prednizón (viď Obrázok č. 18) je syntetické kortikosteroidné liečivo, ktoré má čiastočný
imunosupresívny účinok. Používa sa k liečbe niektorých zápalových ochorení (ako napríklad
reumatické poruchy, Crohnova choroba, laryngitída, astma, atď.) a niektorých typov rakoviny.
Pri stanovení antiflogistickej aktivity slúži ako referenčná vzorka k porovnaniu s testovanými
látkami/zmesami látok.
H
H H
O
O
OH
O
OH
Obrázok č. 18 : Štruktúra prednizónu
40
4 VÝSLEDKY A DISKUSIA
4.1 Analýza a separácia extraktu
Rastlinný materiál bol macerovaný v etanole a vytrepávaný s ďalšími rozpúšťadlami. Pre
ďalšie spracovanie bol použitý chloroformový a hexánový podiel. Vodný a etylacetátový podiel
sa ďalej nespracovávali, merala sa iba ich antiflogistická aktivita.
Na začiatku uvádzam chromatogram celkového etanolického extraktu, aby bolo zreteľné,
z čoho táto analýza vychádzala (viď Obrázok č. 19).
Obrázok č. 19: HPLC chromatogram etanolického extraktu CS-celkový (UV detekcia pri
280 nm)
Nižšie sú uvedené chromatogramy jednotlivých podielov získaných vytrepávaním do
organických rozpúšťadiel a vodného podielu, z čoho je viditeľná distribúcia látok z celkového
extraktu (viď Obrázok č. 20‒23).
min0 5 10 15 20 25 30
Norm.
0
50
100
150
200
250
41
min0 5 10 15 20 25 30
Norm.
0
50
100
150
200
250
300
350
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
min0 5 10 15 20 25 30
Norm.
0
50
100
150
200
250
300
350
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
Obrázok č. 20: HPLC chromatogram chloroformového podielu CS-CH (UV detekcia pri
280 nm) a UV spektrá
Obrázok č. 21: HPLC chromatogram hexánového podielu CS-H (UV detekcia pri 280 nm)
a UV spektrá
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
42
Obrázok č. 22: HPLC chromatogram etylacetátového podielu CS-etyalcetát (UV detekcia
pri 280 nm) a UV spektrá
Obrázok č. 23: HPLC chromatogram vodného podielu CS-voda (UV detekcia pri 280 nm)
a UV spektrá
min2 4 6 8 10 12 14 16 18
Norm.
0
500
1000
1500
2000
2500
min0 2 4 6 8 10 12 14
Norm.
0
100
200
300
400
1.0
51
1.2
24
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
7 0 0
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
7 0 0
8 0 0
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
43
4.1.1 Rozdelenie chloroformového podielu stĺpcovou chromatografiou
Kolónu s výškou stĺpca 62 cm a priemerom 4,5 cm som naplnila 400 g silikagélu, ktorý bol
vopred zmiešaný s mobilnou fázou, aby som eliminovala prípadné vzduchové bubliny, ktoré
by mohli znemožniť správne rozdelenie na kolóne. Mobilná fáza obsahovala chloroform,
benzén a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v). Silikagél bol prekrytý filtračným papierom, ktorý som
zaťažila malým množstvom morského piesku, aby priliehal k stacionárnej fáze. Nakoniec som
naniesla 3,683 g vzorky rozpustenej v minimálnom množstve mobilnej fázy. Pri neustálom
dopĺňaní mobilnej fázy som zbierala frakcie približne po 100–150 ml. Celkový počet frakcií
bol 37. Pri zbieraní posledných 7 frakcií bol ako mobilná fáza použitý čistý metanol, aby sa
z kolóny vymyli zvyšky vzorky.
Po rozdelení na kolóne som odparila rozpúšťadlá na vákuovej odparke, tuhé vzorky
rozpustila v metanole a uskutočnila som TLC analýzu. Ako mobilná fáza bola použitá zmes
chloroform, benzén a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v), na posledné frakcie 25–37 som zvýšila
pomer metanolu na 7:2:1,5 (v/v/v). Detekciu chromatogramov som previedla pod UV lampou
a vyznačila jednotlivé škvrny. Posúdila som ich čistotu a na základe podobnosti retenčných
faktorov som spojila jednotlivé frakcie. Frakcie získané z chloroformového podielu boli
označované CS-CH 1–37 (viď Tabuľka č. 2).
Tabuľka č. 2: Spojené chloroformové frakcie po rozdelení na kolóne a ich hmotnosti
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
1–6 17,49 15–16 80,80
7 295,33 17–18 67,54
8 859,92 19–20 53,54
9–10 451,87 21–23 107,04
11 166,47 24–32 251,93
12–13 202,46 33–36 52,06
14 48,90 37 816,00
Už po prvom rozdelení vzorky na kolóne bola získaná čistá látka, a to frakcia CS-CH 8, ktorá
mohla byť následne bez ďalších úprav či purifikačných krokov identifikovaná.
4.1.2 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu
Výber frakcie pre ďalšiu analýzu a separáciu som učinila na základe HPLC analýzy. Na
základe získaných chromatogramov jednotlivých frakcií som vybrala také, u ktorých boli
viditeľné vysoké píky čo najmenšieho počtu látok. Prvé frakcie obsahovali rôzne zmesi látok,
ktorých separácia by bola náročná, pretože píky neboli jednoznačne rozlíšiteľné a množstvo
týchto látok bolo príliš malé.
44
Posledná frakcia CS-CH 37 danou metódou nebola dobre rozdelená, no na základe relatívne
veľkého množstva danej frakcie (816 mg) som sa rozhodla ju ďalej analyzovať. Pomocou TLC
som skúšala rôzne zloženia mobilnej fázy, aby som zistila, v ktorej by sa daná frakcia dobre
rozdelila na jednotlivé látky. Nepodarilo sa mi však nájsť vhodné zloženie, v ktorom by došlo
k rozdeleniu do takej miery, že by som ich mohla od seba odseparovať. Nižšie je uvedený
chromatogram frakcie, ktorú som chcela spracovať (viď Obrázok č. 23).
Obrázok č. 24: HPLC chromatogram frakcie CS-CH 37 (UV detekcia pri 254 nm) a UV
spektrá
4.1.3 Rozdelenie hexánového podielu stĺpcovou chromatografiou
Kolónu s výškou stĺpca 62 cm a priemerom 4,5 cm som naplnila 402 g silikagélu, ktorý bol
vopred dobre premiešaný s mobilnou fázou, aby som eliminovala prípadné vzduchové bubliny,
ktoré by ovplyvnili správne rozdelenie na kolóne. Mobilná fáza obsahovala chloroform, benzén
a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v). Silikagél bol prekrytý filtračným papierom, ktorý bol
zaťažený malým množstvom morského piesku, aby dokonale priliehal k stacionárnej fáze.
Následne som naniesla 7,959 g vzorky rozpustenej v minimálnom množstve mobilnej fázy. Pri
neustálom dopĺňaní mobilnej fázy som zbierala frakcie približne po 40–50 ml. Celkový počet
frakcií bol 28. Pri zbieraní posledných 4 frakcií bol ako mobilná fáza použitý čistý metanol,
aby sa z kolóny vymyli zvyšky nanesenej vzorky.
m in0 5 10 15 20 25 30 35
N o rm .
0
10
20
30
40
50
45
Po rozdelení na kolóne som odparila rozpúšťadlá na vákuovej odparke, tuhé vzorky
rozpustila v metanole a uskutočnila som TLC analýzu. Ako mobilná fáza bola použitá zmes
chloroform, benzén a metanol v pomere 7:2:1 (v/v/v), na posledné frakcie 25–28 som zvýšila
pomer metanolu na 7:2:1,5 (v/v/v). Detekciu chromatogramov som previedla pod UV lampou
a vyznačila jednotlivé škvrny. Posúdila som ich čistotu a na základe podobnosti retenčných
faktorov som spojila jednotlivé frakcie. Frakcie získané z chloroformového podielu boli
označované CS-H 1–28 (viď Tabuľka č. 3).
Tabuľka č. 3: Spojené hexánové frakcie po rozdelení na kolóne a ich hmotnosti
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
1–6 86,94 17–21 2 718,73
7–9 1 368,04 22 93,40
10–12 1 398,78 23–25 102,02
13 587,47 26 17,86
14 631,60 27 11,85
15–16 1 576,25 28 58,36
4.1.4 Výber frakcií pre ďalšiu separáciu
Frakcie vhodné pre ďalšiu analýzu a separáciu som vyberala na základe HPLC analýzy.
Vyhodnotením a posúdením získaných chromatogramov jednotlivých frakcií som vybrala tie,
u ktorých boli viditeľné výrazné píky čo najmenšieho počtu látok. Ako v prípade
chloroformového podielu, aj v tomto prípade prvé a posledné frakcie obsahovali rôzne zmesi
látok, ktorých separácia by bola náročná, pretože jednotlivé píky sa prekrývali, neboli
jednoznačne oddeliteľné a množstvá týchto látok boli príliš malé.
Na základe HPLC analýzy som na ďalšie spracovanie vybrala frakciu CS-H 15–16, ktorá
bola v dostatočnom množstve a na chromatograme boli viditeľné relatívne vysoké píky
niekoľkých látok. Na Obrázku č. 25 je uvedený chromatogram tejto frakcie.
46
Obrázok č. 25: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16 (UV detekcia pri 280 nm) a UV
spektrá
4.1.5 Rozdelenie frakcie CS-H 15–16 stĺpcovou chromatografiou
Kolónu s výškou stĺpca 58 cm a priemerom 3,5 cm som naplnila 259 g silikagélu, ktorý bol
vopred zmiešaný s mobilnou fázou, aby v kolóne nezostali vzduchové bubliny, ktoré by mohli
negatívne ovplyvniť rozdelenie látok. Mobilná fáza obsahovala etylacetát, benzén a metanol
v pomere 3:2:1 (v/v/v). Silikagél bol prekrytý filtračným papierom, ktorý bol zaťažený
morksým pieskom. Následne som naniesla 1,576 g vzorky rozpustenej v minimálnom množstve
mobilnej fázy. Pri neustálom dopĺňaní mobilnej fázy som zbierala frakcie, prvých asi 7 priližne
po 50 ml, ďalšie približne po 10–20 ml. Celkový počet frakcií bol 26. Pri zbieraní posledných
3 frakcií bol ako mobilná fáza použitý čistý metanol, aby sa z kolóny vymyli zvyšky nanesenej
vzorky.
Po rozdelení na kolóne som odparila rozpúšťadlá na vákuovej odparke, tuhé vzorky
rozpustila v metanole a uskutočnila som TLC analýzu. Ako mobilná fáza bola použitá zmes
etylacetát, benzén a metanol v pomere 3:2:1 (v/v/v), na posledné frakcie 25–28 som zvýšila
pomer metanolu na 3:2:1,5 (v/v/v). Chromatogramy som podrobila UV analýze a vyznačila
som viditeľné škvrny. Posúdila som ich čistotu a na základe podobnosti retenčných faktorov
som spojila jednotlivé frakcie. Frakcie získané z frakcie CS-H 15–16 boli označované CS-H 15–
16/1–26 (viď Tabuľka č.4).
min0 5 10 15 20 25 30
Norm.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0
m A U
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
47
Tabuľka č.4: Spojené frakcie získané z CS-H 15–16 po rozdelení na kolóne a ich hmotnosti
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
1–8 28,90 15–17 294,07
9 104,10 18–20 171,29
10 19,11 21–23 220,42
11 23,69 24 134,97
12 74,93 25 30,98
13 108,33 26 11,01
14 214,61
4.1.6 Separácia frakcií
Po rozdelení na kolóne a vyhodnotení chromatogramov som vybrala frakciu vhodnú pre
rozdelenie pomocou preparatívnej HPLC. Chromatogram frakcie CS-H 15–16/24 (viď Obrázok
č. 26Obrázok č. 26) obsahoval diskrétne vysoké píky, ktoré mohli byť od seba oddelené bez
rizika kontaminácie. Metóda bola niekoľkokrát prispôsobená, aby boli výsledky čo
najpresnejšie, bolo zmenené zloženie mobilnej fázy. Z každého nástreku frakcie CS-H 15–
16/24 bolo získaných 5 frakcií. Po zozbieraní som odparila rozpúšťadlá a zvážila množstvo
získaných látok. Dostatočné množstvo, s ktorým by sa dalo ďalej pracovať, obsahovala iba
frakcia 2 označená ako CS-H 15–16/24/2. Nižšie uvádzam chromatogram z preparatívnej
HPLC, na ktorom sú vyznačené časové úseky, v ktorých boli zozbieravané frakcie (viď
Obrázok č. 27).
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
200
400
600
800
1000
48
Obrázok č. 26: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24 (UV detekcia pri 254 nm)
a UV spektrá
Obrázok č. 27: HPLC chromatogram separácie frakcie CS-H 15–16/24 (UV detekcia pri
280 nm, červenou sú vyznačené zbierané frakcie)
V tabuľke (viď Tabuľka č.5) je uvedené presné množstvo získaných frakcií, z čoho frakcie
2 a 4 sú relatívne čisté látky, no vzhľadom k ich malému množstvu nie je možná ďalšia analýza.
Príslušné chormatogramy sú uvedené nižšie (viď Obrázok č. 28).
Tabuľka č.5: Frakcie získané po rozdelení pomocou preparatívnej HPLC označené
CS-H 15–16/24/1–5 a ich hmotnosti
Spojené frakcie Hmotnosť [mg]
1 4,49
2 3,56
3 1,36
4 1,36
5 3,58
[min.]Time
0 5 10 15 20 25
[V]
Volt
age
0
1
2
3
4
CH15-16_24_11.4.2014 12_21_00_00404 - Channel 1
CH15-16_24_11.4.2014 12_21_00_00404 - Channel 2
6,2
0
6,8
0 V
ial 1 -
1
8,1
09,0
1 V
ial 2 -
2
10,1
0
10,9
1 V
ial 3 -
3
13,4
1
14,2
0 V
ial 4 -
4
15,5
016,5
0 V
ial 5 -
5
49
Obrázok č. 28: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/1 (UV detekcia pri 254 nm)
a UV spektrum
Obrázok č. 29: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/2 (UV detekcia pri 254 nm)
a UV spektrum
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
100
200
300
400
500
600
700
nm200 250 300 350 400 450
m AU
0
100
200
300
400
500
600
50
Obrázok č. 30: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/3 (UV detekcia pri 254 nm)
a UV spektrum
Obrázok č. 31: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/4 (UV detekcia pri 254 nm)
a UV spektrum
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
20
40
60
80
100
120
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
100
200
300
400
nm200 250 300 350 400 450
m AU
0
200
400
600
800
nm200 250 300 350 400 450
m AU
0
20
40
60
80
51
Obrázok č. 32: HPLC chromatogram frakcie CS-H 15–16/24/5 (UV detekcia pri 254 nm)
a UV spektrum
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
100
200
300
400
500
600
700
nm200 250 300 350 400 450
m AU
0
200
400
600
800
1000
52
4.2 Identifikácia
4.2.1 Analýza UV spektier
Orientačné UV spektrá boli zmerané pri analýze HPLC, chromatogramy boli
zaznamenávané pri 280 a 254 nm. Látka CS-CH 8 vykazovala tri pásy s absorpčnými
maximami okolo 220, 270 a 310 nm. Najkôr bola vyhľadávaná podobnosť spektier s niektorým
v databáze látok VFU. Keďže nebola nájdená zhoda, spektrum som porovnala so spektrom
látky, ktorú som izolovala v rámci svojej bakalárskej práce. Spektrum látky CS-CH 8
vykazovalo podobnosť s cannabinolom (viď Obrázok č. 34)
Obrázok č. 33: HPLC chromatogram a UV spektrum látky CS-CH 8 pri 254 nm (HPLC,
metóda 2)
Obrázok č. 34: UV spektrum látky CH 8–10/3–4/7 pri 254 nm (cannabinol)
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
n m2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0
m A U
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
7 0 0
n m200 250 300 350 400 450
m AU
0
200
400
600
800
53
m in0 5 10 15 20 25 30
N o rm .
0
100
200
300
400
500
600
700
UV spektrum kannabinolu vykazuje dve maximá v oblasti približne 230 a 280 nm a rameno
v oblasti okolo 310 nm.
Látka CS-H 15–16/24/2 vykazuje v UV spektre tri pásy s maximami okolo 230, 270
a 310 nm. Z podobnosti spektier sa dá predpokladať štruktúrna podobnosť s látkou CS-CH 8.
Obrázok č. 35: HPLC chromatogram a UV spektrum látky CS-H 15–16/24/2 pri 254 nm
(HPLC, metóda 2)
4.2.2 Analýza IR spektier
Široký absorpčný pás strednej intenzity v oblasti 3550‒3200 cm-1 odpovedá vibráciám –OH
skupín. Intenzívne absorpčné pásy v oblasti 2940‒2850 cm-1 sú spôsobené vibráciami
metylových (-CH3) a metylenových (-CH2-) skupín. V oblasti okolo 1614 a 1574 cm-1 sa
nachádza dublet odpovedajúci aromatickej C=C skupine. V oblasti s nižším vlnočetom okolo
1151 cm-1 môže vychádzať z C-O vibrácií alkoholovej skupiny.
nm200 250 300 350 400 450
m AU
0
100
200
300
400
500
600
54
82
88
86
10
26
10
51
11
72
12
35
13
75
14
28
15
74
16
14
28
54
29
22
33
93
CS_CH8
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100%
Tra
nsm
itta
nce
1000 2000 3000 4000
Wavenumbers (cm-1)
Obrázok č. 36: IR spektrum látky CS-CH 8
4.2.3 Identifikácia pomocou NMR
Meranie NMR spektier a ich následná interpretácia bola prevedená na partnerskej Univerzite
v Mississippi, pretože škola nemá k dispozícii tento prístroj. Na univerzitu bolo zaslaných 4,71
mg látky CS-CH 8 a 3,56 mg látky CS-H 15–16/24/2. U látky CS-H 15–16/24/2 bohužiaľ
nepostačovalo vyizolované množstvo na to, aby mohla prebehnúť jeho identifikácia. Nižšie
uvádzam spektrum, ktoré mi posyktla Univerzita v Mississippi k látke CS-CH 8 (viď Obrázok
č. 37). Kvalita spektra je veľmi nízka, pretože výsledky boli zaslané vo formáte PDF.
Obrázok č. 37: Proton-NMR spektrum látky CS-CH 8
55
Výsledky identifikácie poopisujúce štruktúru a názov látky sú uvedené v nasledujúcej
kapitole.
4.2.4 Výsledky identifikácie izolovaných látok
Izolované látky boli zaslané na identifikáciu do laboratória na Univerzite v Mississippi.
Štruktúra analyzovanej látky bola zisťovaná vyhľadávaním získaného spektra v databáze látok,
ktorú mali k dispozícii. Látka CS-CH 8 bola identifikovaná ako cannabidiolová kyselina (viď
Obrázok č. 38), z ktorej neenzymatickou dekarboxyláciou vzniká cannabinol, najviac
zastúpená biologicky aktívna látka obsiahnutá v rastline Cannabis sativa.
OH
HO
OH
O
H H
Obrázok č. 38: Štruktúra identifikovanej kyseliny cannabidiolovej
56
4.3 Príprava THP1 buniek
4.3.1 Metódy
4.3.1.1 Propagácia a uchovávanie kultúry
Zakúpené bunky sú uchovávané v pôvodnej vialke v kryoprotektívnom médiu pri teplote
-20 °C. Prvá propagácia buniek slúži k vytvoreniu zásob do budúcna. To nám zabezpečí
stabilitu a chovanie buniek v prípade potreby experiment opakovať.
Vialku s bunkami necháme roztopiť pri miernom miešaní vo vodnom kúpeli s teplotou
37 °C. Vytiahneme ju z kúpeľa a ošetríme 70% etanolom, aby sme ju dekontaminovali. Ďalšie
kroky prebiehajú v striktne aseptickom prostredí.
Bunky prenesieme do vialky obsahujúcej 15 ml predhriateho živného média. Vialku
centrifugujeme pri 1000‒1500 rpm asi 5 minút. Odstránime supernatant obsahujúci
kryoprotektívne činidlo a resuspendujeme bunky v 1 ml rastového média. Obsah vialky
prenesieme do 25 cm2 nádoby pre tkanivové kultúry obsahujúcej 5 ml rastového média. Kultúru
umiestnime do špeciálneho boxu s teplotou 37 °C a atmosférou 5 % CO2.
4.3.1.2 Stanovenie cytotoxicity
Pred samotným experimentom musíme určiť cytotoxicitu látok, ktorých antiflogistickú
aktivitu budeme stanovovať. Toto stanovenie prebieha ako 24-hodinová kultivácia buniek na
96-jamkovej mikrotitračnej doštičke v médiu bez séra (aby sme nedostali falošne pozitívne
výsledky z dôvodu prítomnosti látok, ktoré môžu podporiť rast buniek) v prítomnosti
testovaných látok. Použijeme niekoľko koncentrácií, aby sme zistili, aký je limit, v ktorom sa
môžeme pohybovať pri vlastnom experimente. V našom prípade boli použité tri koncentrácie:
25/5/1 μg/ml. Stanovenie prebehlo v tripletoch; ako blank bolo použité médium, ktoré bolo
taktiež nariedené na dané koncentrácie. Okrem toho bola pripravená kontrola, ktorou boli bunky
bez testovanej látky a vehikulum, ktoré neobsahovalo DMSO, čím sa odtestuje potenciálny
cytotoxický vplyv rozpúšťadla na bunky.
Po 24 hodinách inkubácie pridáme do každej jamky WST 1 od Roche. Je to tetrazoliová soľ,
ktorá je enzýmami živých buniek štiepená na formazán. Dochádza k zmene farby zo slabo
ružovej na oranžovo-žltú (viď Obrázok č. 39). Intenzita formazánu je priamo úmerná
koncentrácii živých buniek a stanovuje sa spektrofotometricky pri 440 nm (viď Obrázok č. 40).
Obrázok č. 39: Stanovenie cytotoxicity pomocou WST 1
57
Obrázok č. 40: Graf závislosti viability buniek na koncentrácii testovanej látky (chybové
úsečky sú vyjadrené ako štandardná chyba)
4.3.1.3 Príprava vzoriek
Všetky testované látky sú vo forme prášku. Presne navážené množstvo sa resuspenduje
v DMSO a uskladňuje pri -20 °C.
4.3.1.4 Príprava a inokulácia mikrotitračnej doštičky pre stanovenie antiflogistickej aktivity
THP1 bunky počítame pod mikroskopom s prídavkom erytrozínu, ktorý zafarbí mŕtve
bunky. Bunky scentrifugujeme pri 1000‒1500 rpm 5 minút. Odstránime supernatant,
premyjeme PBS a po scentrifugovaní resuspendujeme na hustotu 5 x 105 buniek/ml v čerstvom
rastovom médiu. Na stanovenie použijeme 96-jamkovú mikrotitračnú doštičku s plochým
dnom. Do každej jamky napipetujeme 100 μl suspenzie, to znamená asi 50 000 buniek/jamka.
K bunkám pridáme forbolester v koncentrácii podľa doporučenia výrobcu a kultivujeme
24 hodín pri teplote 37 °C v CO2 (viď Obrázok č. 41). V tomto kroku dochádza k diferenciácii
buniek z monocytov na makrofágy, suspenzná kultúra sa mení na prisadlé bunky [61]. Médium
odsajeme a vymeníme ho za komplexné médium so sérom; opäť kultivujeme 24 hodín pri
rovnakých podmienkach. Tretí deň odsajeme médium a bunky inkubujeme v médiu bez séra,
po 24 hodinách máme bunky pripravené na vlastný experiment.
58
Obrázok č. 41: Diferenciácia monocytov (vľavo) na makrofágy (vpravo)
Po predošlej príprave sa k bunkám pridajú testované frakcie s koncentráciou 1 μg/ml, iba
u látky CS-CH 8 bola použitá koncentrácia 0,1 μg/ml. Po 1-hodinovej inkubácii aktivujeme
zápalovú dráhu prídavkom LPS do každej jamky. LPS, ktorý bol dostupný ako lyofilizát, bol
vopred rozpustený v PBS. Doštička bola inkubovaná pri teplote 37 °C v CO2 inkubátore
20 hodín.
Na ďalší deň pristupujeme ku kolorimetrickému stanoveniu. Môžeme použiť buď úplne
novú doštičku alebo QUANTI-BlueTM pipetujeme do voľných jamiek. Do každej jamky
napipetujeme 175 μl činidla a následne pridáme 19,5 μl bunkového supernatantu, ktorý
odoberieme pipetou nad prisadnutými bunkami. Doštičku inkubujeme pri teplote 37 °C
30 minút až 6 hodín. Hladinu SEAP určujeme použitím spektrofotometra pri vlnovej dĺžke
655 nm a približne v hodinových intervalech sledujeme priebeh reakcie.
4.3.1.5 Spektrofotometrická detekcia aktivity SEAP
Po jednodennej inkubácii doštičky, ktorá bola pripravená vyššie uvedeným spôsobom, boli
vizuálne odčítané výsledky. Namerané hodnoty sú vynesené do grafu (viď Obrázok č. 42) ako
množstvo, respektíve aktivita NF-κB vo vzorke.
Výsledky získané pomocou spektrofotometra boli štatisticky spracované a vyhodnotené
pomocou softwéru metódou OneWay ANOVA (variačná analýza) a Tukeyovým porovnávacím
multiplicitným testom. Aktivity podielov a izolovanej látky sú porovnané s vehikulom,
u ktorého je indukovaný zápal pomocou LPS a nie je v ňom prídavok látok, ktoré by ho
zmierňovali alebo iným spôsobom interagovali s bunkovým metabolizmom. Kontrola obsahuje
bunky, u ktorých nie je aktivovaná zápalová dráha. Predstavuje tak bazálnu zápalovú aktivitu
buniek.
59
Obrázok č. 42: Graf aktivít NF-κB jednotlivých vzoriek (chybové úsečky sú vyjadrené ako
štandardná chyba)
60
5 ZÁVER
Vo svojej diplomovej práci som sa zaoberala izoláciou a identifikáciou obsahových látok
chloroformového a hexánového extraktu z rastliny Cannabis sativa. Teoretická časť je
zameraná na flavonoidy ako ubikvitárne látky, ich popis, charakteristiku a biologický účinok.
V praktickej časti je popísaný postup separácie a identifikácie látok. Vysušená frakcia
chloroformového extraktu, označená CS-CH, bola rozdelená pomocou kolónovej
chromatografie za použitia mobilnej fázy zloženej z chloroformu, benzénu a metanolu v pomere
7:2:1 (v/v/v). Celkovo bolo získaných 37 frakcií po približne 100–150 ml. Získané frakcie boli
analyzované pomocou TLC a HPLC a na základe výsledkov spojené podľa podobnosti. Frakcia
CS-CH 8 bola čistou látkou a preto som bez použitia ďalších purifikačních krokov mohla
pristúpiť k jej identifikácii. Táto látka bola zastúpená v relatívne vysokej miere. Podiel danej
látky v celkovom extrakte činil 4,6 %. Ďalšou frakciou, ktorú som sa rozhodla spracovávať na
základe veľkého množstva, bola frakcia CS-CH 37. Nepodarilo sa mi však nájsť vhodnú
mobilnú fázu, v ktorej by sa jednotlivé látky od seba oddelili. Preto som v analýze ďalej
nepokračovala.
Pri spracovaní vysušenej frakcie hexánového extraktu, označenej ako CS-H, som
postupovala rovnako ako pri spracovávaní chloroformovej frakcie. Pomocou kolónovej
chromatografie bola rozdelená za použitia mobilnej fázy zloženej z chloroformu, benzénu
a metanolu v pomere 7:2:1 (v/v/v). Celkovo som získala 28 frakcií po 40–50 ml. Na základe
TLC a HPLC analýzy som vybrala frakciu CS-H 15–16, ktorá bola v dostatočnom množstve
a na chromatograme boli viditeľné vysoké píky len niekoľkých látok. Túto frakciu som
rozdelila pomocou stĺpcovej LC za použitia mobilnej fázy zloženej z etylacetátu, benzénu
a metanolu v pomere 3:2:1 (v/v/v). Celkovo som získala 26 frakcií po 10–20 ml.
Frakcia CS-H 15–16/24, ktorá obsahovala vysoké diskrétne píky, bola vhodná k rozdeleniu
pomocou preparatívnej HPLC. Zozbierala som celkovo 5 frakcií, z čoho len jedna bola čistá
látka, a to frakcia CS-H 15–16/24/2. Kvôli malému množstvu, asi 3,56 g, však nemohla byť
identifikovaná, ani ďalej skúmaná na potenciálny antiflogistický účinok.
Bola teda získaná iba jedna látka v relevantnom množstve, s čistotou približne 95 %, čo bolo
dostatočné pre následnú identifikáciu prevedenú na základe UV, IR a NMR. UV a IR spektrá
boli porovnané s dostupnou databázou VFU, aby bola stanovená ich približná štruktúra. UV
spektrum CS-CH 8 bolo podobné kannabinolu, ktorý som vyizolovala pri vypracovávaní
bakalárskej práce, a teda bolo charakteristické pre kanabinoidy. Z IR spektra boli odhadnuté
funkčné skupiny obsiahnuté v štruktúre látky. K analýze pomocou NMR bola vzorka
vyizolovanej látky zaslaná na Univerzitu v Mississippi. Frakcia CS-CH 8 bola identifikovaná
ako cannabidiolová kyslina, z ktorej neenzymatickou dekarboxyláciou vzniká cannabidiol,
ktorý je hlavným biologicky aktívnym komponentom rastliny Cannabis sativa.
Po vyizolovaní a analýze obsahových látok som sa zaoberala zisťovaním antiflogistického
účinku ako čistých látok, tak aj jednotlivých podielov získaných vytrepávaním do rozpúšťadiel
a celkového extraktu. Pre nedostatočné množstvo látky CS-H 15–16/24/2 som skúmala iba
účinok jednej čistej látky, a to frakcie CS-CH 8.
61
Antiflogistická aktivita bola stanovená inkubáciou THP 1 buniek, u ktorých bola aktivovaná
zápalová dráha pomocou LPS, v prítomnosti testovaných látok. Celé stanovenie prebiehalo na
96-jamkovej mikrotitračnej doštičke v podmienkach 37 °C v atmosfére 5 % CO2. Bunky boli
kultivované v médiu RPMI 1640 s 10 % teplom inaktivovaným plodovým bovinným sérom.
Po rozmrazení sa kultúra revitalizovala niekoľkonásobným pasážovaním, kým sa obnovila
metabolická aktivita buniek. Ako kultivačné médium bolo použité RPMI 1640 s 10 % FBS. Po
docielení dostatočnej metabolickej aktivity bolo médium odstránené a vymenené za RPMI 1640
bez FBS. Všetky biologické testy prebiehali v médiu bez FBS, pretože sérum obsahuje mnoho
organických zlúčenín, rastových faktorov a iónov, ktoré by mohli negatívne ovplyvniť merania.
Dôležitým krokom po revitalizácii buniek bolo zistiť cytotoxicitu testovaných vzoriek, a to
tak, že bunky boli inkubované 24 hodín v prítomnosti 3 rôznych koncentrácií. Po danom čase
bola spektrofotometricky stanovená viabilita buniek, ktorých enzýmy sú schopné
metabolizovať tatrazoliovú soľ na formazánové farbivo a tým meniť absorpčné spektrum. Na
základe tohto experimentu som zistila vhodnú koncentráciu látok, ktorú som použila pri
samotnom stanovení antiflogistického účinku.
Vlastné stanovenie antiflogistickej aktivity prebiehalo v niekoľkých krokoch celkovo asi
5 dní. Kľúčovou bola diferenciácia monocytov THP 1 na makrofágy účinkom forbolesteru.
Bunky boli následne inkubované v prítomnosti testovaných látok a bakteriálnym LPS
izolovaným z E.coli bola aktivovaná zápalová dráha. Markerom tejto zápalovej odpovede bola
alkalická fosfatáza SEAP, ktorá bola bunkami exprimovaná do média. Po prídavku
kolorimetrického indikátora sa spektrofotometricky merala hladina SEAP, ktorá je
ekvivalentná množsvu produkovaného NF-κB. Za hornú hranicu, teda 100 %, bola považovaná
aktivita SEAP v jamkách, ktoré neobsahovali žiadne látky, ktoré by mohli zmierniť zápalovú
odpoveď. Táto kontrola bola označovaná ako vehikulum – pozitívna kontrola. Ako negatívna
kontrola slúžila bazálna zápalová aktivita buniek, u ktorých nebol zámerne indukovaný zápal.
Namerané hodnoty testovaných vzoriek boli vzťahované k vehikulu. Zníženie množstva SEAP
vo vzorke znamenalo antiflogistickú aktivitu vzorky.
U frakcií CS-H, CS-CH a čistej látky CS-CH 8 bol viditeľný mierny pokles a teda vykazovali
miernu antiflogistickú aktivitu. Celkový extrakt a etylacetátový podiel nevykazovali žiadnu
aktivitu. Keďže celkový extrakt obsahuje niekoľko stoviek rôznych látok a štruktúr, je celkom
zjavné, že môže dochádzať k antagonistickému účinku a teda sa navonok žiadna aktivita
neprejaví. Vodný podiel prekvapujúco hladinu NF-κB mierne zvyšoval a teda pôsobil
prozápalovo.
Ako referenčná vzorka bol použitý prednizón, liečivo, ktoré sa v dnešnej dobe používa
k potlačeniu zápalových prejavov rôzneho druhu. Pri použití danej metódy vykazoval dokonca
o niečo nižšiu antiflogistickú aktivitu v porovnaní s látkou CS-CH 8.
Z týchto výsledkov je zrejmé, že daná metóda umožňuje urobiť iba akýsi skríning aktivity.
Použitú metódu ovplyvňuje mnoho faktorov, a teda sa nedá jednoznačne určiť presná
protizápalová aktivita daných látok a zmesí. Dôležitým faktorom je použitá koncentrácia látok
a koncentrácia použitého LPS. Je možné. že bol v bunkách indukovaný tak silný zápal, že
koncentrácia testovaných látok nebola dostačujúca na to, aby zápalové prejavy znížila. Táto
62
metóda je veľmi citlivá, a práve to nám umožnilo uskutočniť experiment v mikromnožstvách.
Keďže sa jedná o živé bunkové systémy, je veľmi ťažké predpokladať, ako by experiment
prebehol vo väčšej mierke. V celej dráhe je veľmi veľa regulačných krokov, ktoré ovplyvňujú
jej celkový priebeh.
Týmto experimentom sa mi podarilo demonštrovať mierny antiflogistický účinok niektorých
obsahových látok rastliny Cannabis sativa. Ďalšie výskumy podobného zámeru by mohli
pomôcť presnejšie objasniť ich účinok a mohli by byť získané ďalšie výsledky, ktoré by
podporili moje závery. Výsledky taktiež naznačujú, že niektoré látky alebo ich zmesi môžu
pôsobiť prozápalovo, preto je potreba brať ohľad na zloženie zmesi, ktorá by mohla byť použitá
ako prírodné antiflogistikum.
Merania boli v mojom prípade negatívne ovplyvnené najmä množstvom extraktu, ktorý som
pre daný experiment spracovávala. Bolo totiž náročné vyizolovať čisté látky v dostatočnom
množstve a teda som nemohla realizovať paralelné stanovenie rôznych kombinácií čistých
látok, čim by som dokázala synergický, poprípade antagonistický účinok obsahových látok.
Aj napriek menšiemu množstvu výsledkov by som chcela demonštrovať potenciálny účinok
týchto látok ako antiflogistík, ktoré by mohli nahradiť syntetické látky používané k liečbe v
súčasnosti frekventovaných zápalových ochorení.
63
6 CITOVANÁ LITERATÚRA
1. HAVSTEEN, Bent H, B. STAVRIC, T. I. MATULA a Kenneth R. MARKHAM. The
biochemistry and medical significance of the flavonoids: Their Significance for Nutrition
and Health. ISBN http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4899-2913-6_12.
2. HEIM, Kelly E, Anthony R TAGLIAFERRO, Dennis J BOBILYA, Wolf BORS, Werner
HELLER, Christa MICHEL a Manfred SARAN. Flavonoid antioxidants: chemistry,
metabolism and structure-activity relationships. ISBN http://dx.doi.org/10.1007/978-1-
4684-5730-8_25.
3. HOLLMAN, Peter C.H. Absorption, Bioavailability, and Metabolism of
Flavonoids. Archives Of Physiology And Biochemistry. 2004, vol. 42, s1, s. 74-83. DOI:
10.1080/13880200490893492. Dostupné
z: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1080/13880200490893492
4. RUSZNYÁK, ST. a A. SZENT-GYÖRGYI. Vitamin P: Flavonols as Vitamins. Nature.
1936-7-4, vol. 138, issue 3479, s. 27-27. DOI: 10.1038/138027a0. Dostupné
z:http://www.nature.com/doifinder/10.1038/138027a0
5. CUSHNIE, T.P. Tim, Andrew J. LAMB, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG a Ping LI.
Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents.
2005, vol. 26, issue 5, s. 343-356. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2005.09.002. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857905002554
6. ANDERSEN, Øyvind M a Kenneth R MARKHAM. Flavonoids: chemistry,
biochemistry, and applications. Boca Raton, FL: CRC, Taylor, 2006, 1237 p. ISBN 08-
493-2021-6.
7. GROTEWOLD, Erich. The science of flavonoids. New York: Springer, c2006, vii, 273
p. ISBN 978-038-7288-215.
8. CUSHNIE, T.P. Tim, Andrew J. LAMB, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG a Ping LI.
Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents.
2005, vol. 26, issue 5, s. 343-356. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2005.09.002. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857905002554
9. BERNHOFT, Ed.: Aksel. Bioactive compounds in plants: benefits and risks for man and
animals : proceedings from a symposium held in Norwegian Academy of Science and
Letters, Oslo, 13 - 14 November 2008 00. Oslo: Novus Forlag, 2010. ISBN 978-827-
0995-837.
10. SELEPE, Mamoalosi a Fanie VAN HEERDEN. Application of the Suzuki-Miyaura
Reaction in the Synthesis of Flavonoids. Molecules. 2013, vol. 18, issue 4, s. 4739-4765.
DOI: 10.3390/molecules18044739. Dostupné z: http://www.mdpi.com/1420-
3049/18/4/4739/
64
11. DETSI, Anastasia, Maya MAJDALANI, Christos A. KONTOGIORGIS, Dimitra
HADJIPAVLOU-LITINA a Panagiotis KEFALAS. Natural and synthetic 2′-hydroxy-
chalcones and aurones: Synthesis, characterization and evaluation of the antioxidant and
soybean lipoxygenase inhibitory activity.Bioorganic. 2009, vol. 17, issue 23, s. 8073-
8085. DOI: 10.1016/j.bmc.2009.10.002. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968089609009171
12. ROSS, Julie A. a Christine M. KASUM. D IETARY F LAVONOIDS: Bioavailability,
Metabolic Effects, and Safety. Annual Review of Nutrition. 2002, vol. 22, issue 1, s. 19-
34. DOI: 10.1146/annurev.nutr.22.111401.144957. Dostupné
z:http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.nutr.22.111401.144957
13. TSAO, Rong. Chemistry and Biochemistry of Dietary Polyphenols. Nutrients. 2010, vol.
2, issue 12, s. 1231-1246. DOI: 10.3390/nu2121231. Dostupné
z: http://www.mdpi.com/2072-6643/2/12/1231/
14. YÁÑEZ, Jaime A., Connie M. REMSBERG, Nicole D. MIRANDA, Karina R. VEGA-
VILLA, Preston K. ANDREWS, Neal M. DAVIES a Joanne M. HOLDEN.
Pharmacokinetics of selected chiral flavonoids: hesperetin, naringenin and eriodictyol in
rats and their content in fruit juices.Biopharmaceutics. 2008, vol. 29, issue 2, s. 63-82.
DOI: 10.1002/bdd.588. Dostupné z:http://doi.wiley.com/10.1002/bdd.588
15. YANG, Hsin-Ling, Ssu-Ching CHEN, K. J. SENTHIL KUMAR, Kang-Ni YU, Pei-
Dawn LEE CHAO, Shang-Yuan TSAI, Yu-Chi HOU a You-Cheng HSEU. Antioxidant
and Anti-Inflammatory Potential of Hesperetin Metabolites Obtained from Hesperetin-
Administered Rat Serum: An Ex Vivo Approach. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 2012-01-11, vol. 60, issue 1, s. 522-532. DOI: 10.1021/jf2040675. Dostupné
z: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf2040675
16. SANCHEZ, Isvett Josefina Flores. Polyketide synthases in Cannabis sativa L. [S.l: s.n.],
2008. ISBN 978-909-0234-465.
17. CROZIER, Alan, M CLIFFORD a Hiroshi ASHIHARA. Plant secondary metabolites:
occurrence, structure and role in the human diet. Ames, Iowa: Blackwell Pub., 2006, xii,
372 p. ISBN 978-140-5125-093.
18. MLADĚNKA, Přemysl, Libuše ZATLOUKALOVÁ, Tomáš FILIPSKÝ a Radomír
HRDINA. Cardiovascular effects of flavonoids are not caused only by direct antioxidant
activity. Free Radical Biology and Medicine. 2010-09-15, vol. 49, issue 6, s. 963-975.
DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2010.06.010. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S089158491000362X
19. RAVISHANKAR, Divyashree, Amit Kumar RAJORA, Francesca GRECO a Helen. M.I.
OSBORN. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The
International Journal of Biochemistry. 2013, vol. 45, issue 12, s. 2821-2831. DOI:
65
10.1016/j.biocel.2013.10.004. Dostupné
z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S135727251300321X
20. HIDALGO, Maria, Concepción SÁNCHEZ-MORENO, Sonia DE PASCUAL-TERESA
a T.W. WONG. Flavonoid–flavonoid interaction and its effect on their antioxidant
activity. Food Chemistry. 2010, vol. 121, issue 3, s. 691-696. DOI:
10.1016/j.foodchem.2009.12.097. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814610000464
21. GONZÁLEZ, Evangelina A., Mónica A. NAZARENO, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG
a Ping LI. Antiradical action of flavonoid–ascorbate mixtures. LWT - Food Science and
Technology. 2011, vol. 44, issue 2, s. 558-564. DOI: 10.1016/j.lwt.2010.09.017.
Dostupné z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S002364381000335X
22. CUSHNIE, T.P. Tim a Andrew J. LAMB. Recent advances in understanding the
antibacterial properties of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents.
2011, vol. 38, issue 2, s. 99-107. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2011.02.014. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0924857911001300
23. WU, Ting, Mengying HE, Xixi ZANG, Ying ZHOU, Tianfu QIU, Siyi PAN, Xiaoyun
XU, M.M RICCIARDI, L RICCIARDI, M.L VUOTTO, Z. ZÍDEK, K. MAŠEK, M.
SVOBODOVÁ, K. ŠŮLA, K. NOUZA a J. MÜLLER. A structure–activity relationship
study of flavonoids as inhibitors of E. coli by membrane interaction effect. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 2013, vol. 1828, issue 11, s. 2751-2756. DOI:
10.1016/j.bbamem.2013.07.029. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0005273613002757
24. FU, Yu, Jun CHEN, Yan-Jing LI, Yun-Feng ZHENG a Ping LI. Antioxidant and anti-
inflammatory activities of six flavonoids separated from licorice. Food Chemistry. 2013,
vol. 141, issue 2, s. 1063-1071. DOI: 10.1016/j.foodchem.2013.03.089. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814613004342
25. GARCÍA-LAFUENTE, Ana, Eva GUILLAMÓN, Ana VILLARES, Mauricio A.
ROSTAGNO a José Alfredo MARTÍNEZ. Flavonoids as anti-inflammatory agents:
implications in cancer and cardiovascular disease. Inflammation Research. 2009, vol. 58,
issue 9, s. 537-552. DOI: 10.1007/s00011-009-0037-3. Dostupné
z: http://link.springer.com/10.1007/s00011-009-0037-3
26. IELPO, M.T.L, A BASILE, R MIRANDA, V MOSCATIELLO, C NAPPO, S SORBO,
E LAGHI, M.M RICCIARDI, L RICCIARDI, M.L VUOTTO, Z. ZÍDEK, K. MAŠEK,
M. SVOBODOVÁ, K. ŠŮLA, K. NOUZA a J. MÜLLER. Immunopharmacological
properties of flavonoids. Fitoterapia. 2000, vol. 71, s. 363-366. DOI:
http://dx.doi.org/10.1007/978-3-642-76120-1_48.
27. HEMAISWARYA, Shanmugam, Anil Kumar KRUTHIVENTI a Mukesh DOBLE.
Synergism between natural products and antibiotics against infectious
diseases. Phytomedicine. 2008, vol. 15, issue 8, s. 639-652. DOI
66
28. FLORES-SANCHEZ, Isvett Josefina a Robert VERPOORTE. Secondary metabolism in
cannabis.Phytochemistry Reviews. 2008, vol. 7, issue 3, s. 615-639. DOI:
10.1007/s11101-008-9094-4. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s11101-008-
9094-4
29. ARUNG, Enos, Kuniyoshi SHIMIZU, Ryuichiro KONDO, Ying ZHANG a Huai-Liang
WANG. Inhibitory Effect of Isoprenoid-Substituted Flavonoids Isolated from Artocarpus
heterophyllus on Melanin Biosynthesis. Planta Medica. 2006, vol. 72, issue 09, s. 847-
850. DOI: 10.1055/s-2006-931606. Dostupné z: http://www.thieme-
connect.de/DOI/DOI?10.1055/s-2006-931606
30. CHOI, Jae Sue, Md. NURUL ISLAM, Md. YOUSOF ALI, Eon Ji KIM, Young Myeong
KIM a Hyun Ah JUNG. Effects of C-glycosylation on anti-diabetic, anti-Alzheimer’s
disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food and Chemical Toxicology.
2014, vol. 64, issue 6, s. 27-33. DOI: 10.1016/j.fct.2013.11.020. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0278691513007825
31. JUNG, Woon-Won, G M FUHLER, N BLOM, C V FERREIRA, H AOYAMA, M P
PEPPELENBOSCH a Tetsuo ADACHI. Protective effect of apigenin against oxidative
stress-induced damage in osteoblastic cells: implications for prevention and
therapy. International Journal of Molecular Medicine. 2014-02-25, vol. 1, issue 1, s. -.
DOI: 10.3892/ijmm.2014.1666. Dostupné z:http://www.spandidos-
publications.com/10.3892/ijmm.2014.1666
32. RUELA-DE-SOUSA, R R, G M FUHLER, N BLOM, C V FERREIRA, H AOYAMA,
M P PEPPELENBOSCH a Tetsuo ADACHI. Cytotoxicity of apigenin on leukemia cell
lines: implications for prevention and therapy. Cell Death and Disease. 2010, vol. 1, issue
1, e19-. DOI: 10.1038/cddis.2009.18. Dostupné
z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/cddis.2009.18
33. WU, Ding-Guo, Peng YU, Jian-Wei LI, Peng JIANG, Jing SUN, Huai-Zhi WANG, Lei-
Da ZHANG, Ming-Bo WEN, Ping BIE a Ling ZHANG. Apigenin potentiates the growth
inhibitory effects by IKK-β-mediated NF-κB activation in pancreatic cancer
cells. Toxicology Letters. 2014, vol. 224, issue 1, s. 157-164. DOI:
10.1016/j.toxlet.2013.10.007. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378427413013507
34. IBRAHIM, Amany K., Mohamed M. RADWAN, Safwat A. AHMED, Desmond
SLADE, Samir A. ROSS, Mahmoud A. ELSOHLY, Ikhlas A. KHAN, M.M
RICCIARDI, L RICCIARDI, M.L VUOTTO, Z. ZÍDEK, K. MAŠEK, M.
SVOBODOVÁ, K. ŠŮLA, K. NOUZA a J. MÜLLER. Microbial metabolism of
cannflavin A and B isolated from Cannabis sativa. Phytochemistry. 2010, vol. 71, 8-9, s.
1014-1019. DOI: 10.1016/j.phytochem.2010.02.011. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0031942210000555
67
35. BARRETT, M.L., D. GORDON, F.J. EVANS, Desmond SLADE, Samir A. ROSS,
Mahmoud A. ELSOHLY a Ikhlas A. KHAN. Isolation from cannabis sativa L. of
cannflavin—a novel inhibitor of prostaglandin production. Biochemical Pharmacology.
1985, vol. 34, issue 11, s. 2019-2024. DOI: 10.1016/0006-2952(85)90325-9. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0006295285903259
36. BARRETT, M. L., A. M. SCUTT, F. J. EVANS, Desmond SLADE, Samir A. ROSS,
Mahmoud A. ELSOHLY a Ikhlas A. KHAN. Cannflavin A and B, prenylated flavones
fromCannabis sativa L.Experientia. 1986, vol. 42, issue 4, s. 452-453. DOI:
10.1007/BF02118655. Dostupné z:http://link.springer.com/10.1007/BF02118655
37. MISHRA, Beena, K.Indira PRIYADARSINI, M.Sudheer KUMAR, M.K.
UNNIKRISHNAN, Hari MOHAN, Jia-You FANG, Lei-Da ZHANG, Ming-Bo WEN,
Ping BIE a Ling ZHANG. Effect of O-glycosilation on the antioxidant activity and free
radical reactions of a plant flavonoid, chrysoeriol: The relationships to chemical
structures. Bioorganic. 2003, vol. 11, issue 13, s. 2677-2685. DOI: 10.1016/S0968-
0896(03)00232-3. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0968089603002323
38. VELLOSA, José Carlos Rebuglio, Luis O. REGASINI, Najeh Maissar KHALIL,
Vanderlan da Silva BOLZANI, Omar A. K. KHALIL, Francine Alessandra MANENTE,
Harli PASQUINI NETTO a Olga M. M. de Faria OLIVEIRA. Antioxidant and cytotoxic
studies for kaempferol, quercetin and isoquercitrin: implications for prevention and
therapy. Eclética Química. 2011, vol. 36, issue 2, s. 07-20. DOI: 10.1590/S0100-
46702011000200001. Dostupné z: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext
39. M. CALDERON-MONTANO, J., E. BURGOS-MORON, C. PEREZ-GUERRERO, M.
LOPEZ-LAZARO, Omar A. K. KHALIL, Francine Alessandra MANENTE, Harli
PASQUINI NETTO a Olga M. M. de Faria OLIVEIRA. A Review on the Dietary
Flavonoid Kaempferol: implications for prevention and therapy. Mini-Reviews in
Medicinal Chemistry. 2011-04-01, vol. 11, issue 4, s. 298-344. DOI:
10.2174/138955711795305335. Dostupné
z: http://www.eurekaselect.com/openurl/content.php?genre=article
40. KIM, Tae Hoon, Sae-Kwang KU, In-Chul LEE, Jong-Sup BAE, Omar A. K. KHALIL,
Francine Alessandra MANENTE, Harli PASQUINI NETTO a Olga M. M. de Faria
OLIVEIRA. Anti-inflammatory effects of kaempferol-3-O-sophoroside in human
endothelial cells: A combined experimental and DFT approach. Inflammation Research.
2012, vol. 61, issue 3, s. 217-224. DOI: 10.1007/s00011-011-0403-9. Dostupné
z: http://link.springer.com/10.1007/s00011-011-0403-9
41. KIM, Tae Hoon, Sae-Kwang KU, Jong-Sup BAE, Sai LI, Jingzheng ZHANG, Shuaishuai
WANG, Cheng LI, Yanguo SHANG, Tonghui HUANG a Ling ZHANG. Inhibitory
effects of kaempferol-3-O-sophoroside on HMGB1-mediated proinflammatory
responses. Food and Chemical Toxicology. 2012, vol. 50, 3-4, s. 1118-1123. DOI:
68
10.1016/j.fct.2011.12.004. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0278691511006697
42. COLETA, Miguel, Maria Graça CAMPOS, Maria Dulce COTRIM, Thereza Christina M.
de LIMA a António Proença da CUNHA. Assessment of luteolin (3′,4′,5,7-
tetrahydroxyflavone) neuropharmacological activity. Behavioural Brain Research. 2008,
vol. 189, issue 1, s. 75-82. DOI: 10.1016/j.bbr.2007.12.010. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S016643280700664X
43. JOHNSON, Jodee L., Sanjeewa G. RUPASINGHE, Felicia STEFANI, Mary A.
SCHULER, Elvira GONZALEZ DE MEJIA, Mamoru KOKETSU a Tetsuo ADACHI.
Citrus Flavonoids Luteolin, Apigenin, and Quercetin Inhibit Glycogen Synthase Kinase-
3β Enzymatic Activity by Lowering the Interaction Energy Within the Binding
Cavity. Journal of Medicinal Food. 2011, vol. 14, issue 4, s. 325-333. DOI:
10.1089/jmf.2010.0310. Dostupné
z:http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1089/jmf.2010.0310
44. THEOHARIDES, Theoharis C, Ji-Young JIN, Jeom-Il CHOI, In Soon CHOI, Sung-Jo
KIM, Mamoru KOKETSU a Tetsuo ADACHI. Luteolin as a therapeutic option for
multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 2009, vol. 6, issue 1, s. 29-. DOI:
10.1186/1742-2094-6-29. Dostupné
z:http://www.jneuroinflammation.com/content/6/1/29
45. LIU, Yi, Xiaobin FU, Nuo LAN, Sai LI, Jingzheng ZHANG, Shuaishuai WANG, Cheng
LI, Yanguo SHANG, Tonghui HUANG a Ling ZHANG. Luteolin protects against high
fat diet-induced cognitive deficits in obesity mice. Behavioural Brain Research. 2014,
vol. 267, s. 178-188. DOI: 10.1016/j.bbr.2014.02.040. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0166432814001259
46. LEE, Wonhwa, Sae-Kwang KU, Jong-Sup BAE, M.K. UNNIKRISHNAN, Hari
MOHAN, Jia-You FANG, Lei-Da ZHANG, Ming-Bo WEN, Ping BIE a Ling ZHANG.
Vascular barrier protective effects of orientin and isoorientin in LPS-induced
inflammation in vitro and in vivo: The relationships to chemical structures. Vascular
Pharmacology. 2014, vol. 62, issue 1, s. 3-14. DOI: 10.1016/j.vph.2014.04.006.
Dostupné z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1537189114000780
47. PRAVEENA, R., K. SADASIVAM, V. DEEPHA, Raman SIVAKUMAR, Omar A. K.
KHALIL, Francine Alessandra MANENTE, Harli PASQUINI NETTO a Olga M. M. de
Faria OLIVEIRA. Antioxidant potential of orientin: A combined experimental and DFT
approach. Journal of Molecular Structure. 2014, vol. 1061, issue 4, s. 114-123. DOI:
10.1016/j.molstruc.2014.01.002. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022286014000192
48. FU, Xiao-Chun, Min-Wei WANG, Shao-Peng LI, Ying ZHANG a Huai-Liang WANG.
Vasodilatation Produced by Orientin and Its Mechanism Study. Biological. 2005, vol. 28,
69
issue 1, s. 37-41. DOI: 10.1248/bpb.28.37. Dostupné
z: http://joi.jlc.jst.go.jp/JST.JSTAGE/bpb/28.37?from=CrossRef
49. DÁVALOS, Alberto, Patricia CASTILLA, Carmen GÓMEZ-CORDOVÉS a Begoña
BARTOLOMÉ.Quercetin is bioavailable from a single ingestion of grape juice. ISBN
http://dx.doi.org/10.1080/09637480600858662.
50. NEMETH, K., M. K. PISKULA, Carmen GÓMEZ-CORDOVÉS a Begoña
BARTOLOMÉ. Food Content, Processing, Absorption and Metabolism of Onion
Flavonoids. ISBN http://dx.doi.org/10.1080/10408390600846291.
51. SCHOLZ, S., G. WILLIAMSON, Stéphanie DÉPREZ, Augustin SCALBERT a
Angélique STALMACH. Interactions Affecting the Bioavailability of Dietary
Polyphenols in Vivo. International Journal for Vitamin and Nutrition Research. 2007,
vol. 77, issue 3, s. 561-576. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-398456-2.00042.
52. BORSKA, Sylwia, Malgorzata DRAG-ZALESINSKA, Teresa WYSOCKA, Miroslaw
SOPEL, Malgorzata DUMANSKA, Maciej ZABEL a Piotr DZIEGIEL. Antiproliferative
and pro-apoptotic effects of quercetin on human pancreatic carcinoma cell lines EPP85-
181P and EPP85-181RDB. Folia Histochemica et Cytobiologica. 2010, vol. 48, issue 2,
s. 561-576. DOI: http://dx.doi.org/10.2478/v10042-08-0109-1.
53. ROGERIO, Alexandre P., Cristiana L. DORA, Edinéia L. ANDRADE, Juliana S.
CHAVES, Luis F.C. SILVA, Elenara LEMOS-SENNA a João B. CALIXTO. Anti-
inflammatory effect of quercetin-loaded microemulsion in the airways allergic
inflammatory model in mice. Pharmacological Research. 2010, vol. 61, issue 4, s. 288-
297. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2009.10.005.
54. CHOO, C.Y., N.Y. SULONG, F. MAN a T.W. WONG. Vitexin and isovitexin from the
Leaves of Ficus deltoidea with in-vivo α-glucosidase inhibition. Journal of
Ethnopharmacology. 2012, vol. 142, issue 3, s. 776-781. DOI: 10.1016/j.jep.2012.05.062.
Dostupné z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378874112003844
55. DONG, Liuyi, Yifei FAN, Xu SHAO a Zhiwu CHEN. Vitexin protects against
myocardial ischemia/reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts by attenuating
inflammatory response and apoptosis. Food and Chemical Toxicology. 2011, vol. 49,
issue 12, s. 3211-3216. DOI: 10.1016/j.fct.2011.09.040. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0278691511004959
56. AUWERX, J. The human leukemia cell line, THP-1: A multifacetted model for the study
of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 1991, vol. 47, issue 1, s. 22-31.
DOI: 10.1007/bf02041244.
57. TAKEDA, Kiyoshi, Shizuo AKIRA, J. STENVIK, J. D. LAMBRIS, T. ESPEVIK a T.
E. MOLLNES. TLR signaling pathways. Seminars in Immunology. 2004, vol. 16, issue
1, s. 3-9. DOI: 10.1016/j.smim.2003.10.003. Dostupné
z:http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1044532303000964
70
58. SABROE, I, LC PARKER, SK DOWER, MKB WHYTE, T. ESPEVIK a T. E.
MOLLNES. The role of TLR activation in inflammation. The Journal of Pathology. 2008,
vol. 214, issue 2, s. 126-135. DOI: 10.1002/path.2264. Dostupné
z: http://doi.wiley.com/10.1002/path.2264
59. AKASHI, S., S.-i. SAITOH, Y. WAKABAYASHI, T. KIKUCHI, N. TAKAMURA, Y.
NAGAI, Y. KUSUMOTO, K. FUKASE, S. KUSUMOTO, Y. ADACHI, A. KOSUGI a
K. MIYAKE. Lipopolysaccharide Interaction with Cell Surface Toll-like Receptor 4-
MD-2: Higher Affinity than That with MD-2 or CD14. Journal of Experimental Medicine.
2003-10-06, vol. 198, issue 7, s. 1035-1042. DOI: 10.1084/jem.20031076. Dostupné
z:http://www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20031076
60. CHRISTIANSEN, D., O. L. BREKKE, J. STENVIK, J. D. LAMBRIS, T. ESPEVIK a T.
E. MOLLNES. Differential Effect of Inhibiting MD-2 and CD14 on LPS- Versus Whole
E. coli Bacteria-Induced Cytokine Responses in Human Blood. s. 237. DOI: 10.1007/978-
1-4614-0106-3_14. Dostupné z:http://link.springer.com/10.1007/978-1-4614-0106-3_14
61. GOEL, Gunjan, Harinder P. S. MAKKAR, George FRANCIS a Klaus BECKER. Phorbol
Esters: Structure, Biological Activity, and Toxicity in Animals. International Journal of
Toxicology. 2007, vol. 26, issue 4, s. 279-288. DOI: 10.1080/10915810701464641.
Dostupné z:http://ijt.sagepub.com/cgi/doi/10.1080/10915810701464641
71
7 ZOZNAM SKRATIEK
4CL 4-coumarate:CoA ligase – 4-kumarát:CoA ligáza
A. flavus Apergillus flavus
AA arachidonic acid (kyselina arachidonová)
ATP adenozíntrifosfát
cAMP cyklický adenozínmonofosfát
cGMP cyklický guanozínmonofosfát
C4H cinnamát 4-hydroxyláza
CAM molekuly adherujúce na povrch buniek
CBDA kyselina cannabidiolová
CHI chalkón izomeráza
CHS chalkón syntáza
CNS centrálna nervová sústava
COMT katechol-O-metyltransferáza
COX cyklooxygenáza
C. sativa Cannabis sativa
CYP1B1 cytochróm P4501B1 gén
DNA deoxyribonukleová kyselina
DPPH 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl
FAD flavín adenín dinukleotid
HIV ľudský imunodeficienčný vírus
HMG-CoA hydroxymetylglutaryl koenzýmA (reduktáza)
HPLC vysokoúčinná kvapalinová chromatografia
HSV vírus Herpes simplex
IL-6 interleukín 6
72
KPOS kaempferol-3-O-soforozid
LD50 letálna dávka, ktorá spôsobí úhyn 50 % jedincov
LDL nízkohustotný lipoproteín
LOX lipooxygenáza
LPS lipopolysacharid
NADH hydrogenovaný nikotín amid dinukleotid
NADPH hydrogenovaný nikotínamiddinukleotid fosfát
NMR nuclear magnetic resonance - nukleárna magnetická rezonancia
NO nitric oxide – oxid dusnatý
NOS NO-syntáza
PAL phenylalanine ammonia lyase – fenylalanín amonia klyáza
PG prostaglandín
PKS polyketide synthase – polyketid syntáza
PL fosfolipáza
RNS reactive nitrogen species - reaktívne dusíkaté formy
ROS reactive oxygen species - reaktívne kyslíkaté formy
RTG röntgen
THF tetrahydrofolát
TLC thin layer chromatography - tenkovrstvová chromatografia
TNF-α tumor necrosis factor – faktor nádorovej nekrózy
73
Tato práce vznikla za podpory projektu BiochemNet ‒ Vytvoření sítě pro podporu
spolupráce biomedicínských pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických
oborů v praxi (registrační číslo CZ.1.07/2.4.00/31.0133). Projekt je realizován v rámci
Operačního programu vzdělávání pro konkurenceschopnost, který je spolufinancovaný
z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu ČR.