Post on 20-Oct-2020
IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE PROTEINA
LIKVORA
Željka Vogrinc i Ljiljana ZaninovićKlinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku,
KBC Zagreb
Elektroforetska metoda kod koje se razdvajanje proteina provodi u gelu s uspostavljenim stabilnim pH gradijentom
Proteini se razdvajaju na osnovu razlika u izoelektričnim točkama (pI)
pI je fizikalno-kemijska konstanta
za svaki protein specifičnost metode
IEF – visoka rezolucija i velika osjetljivost
Izoelektrično fokusiranje
pH gradijent
Anoda
+ -
Katoda
amfoterične molekule
smjesa kiselina i baza
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Amfoliti: Ampholine®, Pharmalyte® , Servalyte®, BioLyte®
NOSAČ mora stabilizirati pH gradijent i spriječiti difuziju
razdvojenih vrpci
Pod utjecajem električnog polja amfoliti se gibaju prema anodi ili katodi i
uspostavljaju pH gradijent - predfokusiranje
Nosači : poliakrilamidni gel, agaroza
Stvaranje pH gradijenta u gelu:pomoću smjese sintetskih spojeva - amfolita
AMFOLITI
Proteini se tijekom elektroforeze gibaju u gelu s gradijentom pH prema anodi ili katodi ovisno o naboju
Prolaskom proteina kroz pH područje koje odgovara njegovoj pI, prestaje se dalje gibati jer gubi naboj i sabija se u uskoj vrpciProces razdvajanja proteina
metodom IEF je završen: velik broj vrpci na gelu koje treba identificirati
+ -
Princip razdvajanja IEF
Za dobro razdvajanje potreban je visoki napon (oko 2000V): - tanki gelovi- hlađenje tijekom IEF
Primjena IEF u likvorskoj dijagnostici
U kroničnim upalama aktivira se lokalni imunološki odgovor koji može biti poliklonskog ili oligoklonskog tipa ◦ imunokompetentne stanice ulaze u SŽS kroz oštećenu (aktiviranu) barijeru◦ dugotrajna stimulacija humoralnog odgovora unutar SŽSa◦ transformacija B limfocita u plazma stanice koje lokalno sintetiziraju
antitijela (IgG, A, M klase)
Mali broj B stanica u SŽSu stimuliranih prisutnim Ag stvara ograničen broj tipova pojedine klase imunoglobulina (jedan klon B-stanica stvara samo jednu klasu imunoglobulina određenog tipa lakih lanaca) oligoklonski Ig (OIgG)
u likvoru se prikazuju kao uske vrpce (oligoklonske vrpce) u području gama globulinske frakcije
Nalaz OIg u likvoru je najosjetljiviji test za potvrdu intratekalne sinteze antitijela.
Važnost ektroforetskih analiza proteina likvora u dijagnostici različitih kroničnih upalnih bolesti
središnjeg živčanog sustava
Povijest:
“PRODUŽENA” ELEKTROFOREZA I IMUNOFIKSACIJA
NEKADA
◦ Zonska elektroforeza ◦ Imunoelektroforeza◦ Imunofiksacija
IMUNOELEKTROFOREZA
ZONSKA ELEKTROFOREZA
S
L
L
Pre
alb
um
in
Beta
2
Beta
1
Alb
um
in
Alf
a 1
Alf
a 2
Gam
a
Elektroforetske tehnike za dokazivanje oligoklonskih imunoglobulina u likvoru
Metoda izbora za dokazivanje intratekalne sinteze IgIZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE + IMUNOFIKSACIJA
DANAS
• IEF – elektroforetska metoda visoke
rezolucije i velike osjetljivosti jer se dobro
razdvajaju proteinske molekule čija se pI
razlikuje za manje od 0,001 pH jedinica
• IEF – elektroforetska metoda velike
specifičnosti jer se proteini odvajaju prema pl
koja je identifikacijska kartica pojedinog
proteina
Ručna – In house - metoda IEF
na ultratankom poliakrilamidnom gelu debljine ≤0,5 mm
podnosi visoke napone struje - za dobro razdvajanje proteinskih frakcija
nedostatak - neurotoksičnost
puno „ručnog“ rada, -
- priprema i izlijevanje gela
- priprema i nanošenje uzoraka
- postupak sa visokim naponom
- pažljivo nanošenja antiseruma
- fiksacija i ispiranje
- bojenja srebrom
Za analizu je potrebno 5-7 µL nativnog uzorka likvora
(razrijeđenog na 0,4 g/l proteina)
donja granica detekcije IgG je 0,010 g/L
granica detekcije monoklonske vrpce IgG 0,00031g/L
Priprema otopina:
1. Otopina bis-akrilamida
2. Štok otopina riboflavin-5-fosfata (w = 0,1%),
3. Otopina amonij-persulfata (w = 40%)
4. Otopina glicerola (w=80%)
5. Anodni pufer: razrijeđena otopina orto-fosfatne
kiseline (f = 1%)
6. Katodni pufer: razrijeđena otopina etilen-diamina (f
= 2%)
7. Otopina AgNO3 (w=0,2 %)
8. Otopina octene kiseline za stopiranje boje (w=1%)
Priprema uzoraka :
Izmjeriti koncentraciju IgG u likvoru i serumu
Koncentraciju IgG u serumu i likvoru prilagoditi na
istu koncentraciju (oko 15 mg/L). Sva razrjeđenja se
rade s destiliranom vodom.
Analitička faza :
1. Postavljanje gela
2. Nanošenje uzoraka
3. Postavljanje sustava
4. Prefokusiranje i upijanje uzoraka (30 min)
5. Izoelektrično fokusiranje (75 min)
6. Imunofiksacija
7. Ispiranje
8. Bojanje srebrom
Sebia - automatizirana metode IEF
• na agaroznim gotovim gelovima
• manje su toksični
• smanjena osjetljivost metode
dosta „ručnog“ rada,
- priprema i nanošenje uzoraka
- pripreme analizatora
- pažljivog nanošenja antiseruma pomoću aplikatora
- bojenja i konačnog tumačenja rezultata
Za analizu je potrebno 20 µL nativnog uzorka likvora
donja granica detekcije IgG koju deklarira proizvođač je 0,020 g/L
granica detekcije monoklonske vrpce IgG 0,00031g/L
Međunarodni dogovor o klasifikaciji nalaza oligoklonskih IgG vrpci primjenom metode IEF: preporuča se 5 tipova rezultata paralelne analize likvora i seruma
IEF/PAGE + bojanje srebromRazličit izgled vrpci u likvoru i serumu ukazuje na lokalnu sintezu IgG
Tip 1(normalan)
Tip 2
Tip 3
Tip 4
Tip 5
CSF S
CSF S
(CSF S )
CSF S
CSF S
CSF S
CSF S
Tip 1 : Normalan nalaz ( difuzni “poliklonski” tip)Tip 2 : Oligoklonski IgG samo u likvoruTip 3: Oligoklonski IgG u likvoru, a manji broj (ili slabije izražene) i u serumuTip 4: Identične IgG vrpce u likvoru i serumuTip 5: Monoklonske IgG vrpce u likvoru i serumu
•••••
Učestalost nalaza oligoklonskih IgG u likvoru:
Bolest Učestalost OIg (%)
Subakutni sklerozirajući panencefalitis-SSPE 100
(uzrok: perzistirajuća infekcija virusom morbila)Multipla skleroza 95 Ostale kronične zarazne bolesti SŽS-a(neurosifilis, neuroborelioza i dr.) 50-80 Druge upalne bolesti SŽS-a 50
Važnost diferencijalne dijagnostike!
Likvoreja • stanje kod kojeg likvor nekontrolirano istječe iz SŽSa.
• Najčešće mjesto istjecanja je nosna šupljina, ali može biti i oko, uho...
• Stanje može biti vrlo opasno
Biološki uzorak koji se šalje u laboratorij kod sumnje na likvoreju najčešće nije čisti likvor već smjesa sekreta, krvi i likvora što otežava dijagnostiku.
Pouzdani biljega likvoreje je asijalotransferin (oblik transferina bez sijalinskih kiselina koji se stvara u SŽSu, a koji predstavlja oko 30%intratekalno stvorenog transferina)
U krvi - 82% transferina vezano sa 4-6 sijalinskih kiselina
- vrlo malo asijalo i monosijalo transferina
- u osoba s kroničnim alkoholizmom i u rijetkim slučajevima nasljednih metaboličkih bolesti – mogu se naći oblici transferina s manje sijalinskih kiselina (monosijalo- i disijalotransferin)
IEF na poliakrilamidnom gelu uz direktnu imunofiksaciju s antiserumom na humani transferin te bojenjem precipitata srebrom
pI asijalotransferina je u području pH 4-6
5-7 µL uzorka - razrijediti na koncentraciju ukupnih proteina od oko 0,4 g/L
pozitivna kontrola - slučajni uzorak likvora
negativna kontrola - uzorak seruma pacijenta
pozitivna kontrola
pozitivan nalaz
pozitivan nalaz
negativan nalaz
pozitivan nalaz
negativna konrola