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Isolierung, Identifizierung und funktionelle Charakterisierung der Metallo-Aminopeptidase CaApe2
—
Ein experimenteller Beitrag zur Beurteilung des kariogenen Potentials von Candida albicans
I N A U G U R A L D I S S E R T A T I O N
zur Erlangung des doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.)
der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden
vorgelegt von
Roman Pönisch
aus Dresden
Dresden 2008
1. Gutachter: Prof. Dr. med. habil. H. Wolfgang Klimm
2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas M. Kriegel
Tag der mündlichen Prüfung: 9. Dezember 2008
gez. Prof. Dr. med. H. Zwipp
Vorsitzender der Promotionskommission
Teile dieser Dissertationsschrift wurden in den beiden folgenden Arbeiten publiziert:
KLINKE, H. T.; PÖNISCH, R.; RUMP, A.; SCHELLENBERGER, W.; MÜLLER, E.-C.; OTTO, A.; KLIMM,
H. W.; KRIEGEL, T. M.: Identification and characterization of CaApe2 - a neutral arginine/
alanine/leucine-specific metallo-aminopeptidase from Candida albicans. FEMS Yeast Res. 8 (6), 858-869, 2008.
KLINKE, H. T.; PÖNISCH, R.; KRIEGEL, T. M.; KLIMM, H. W.: Immunohistochemical Detection of
the Collagenolytic Candida albicans Sap2 Proteinase in Caries Lesions. Caries Res. 37 (54th
ORCA Congress), 287, #53, 2007.
Doch Forschung strebt und ringt, ermüdend nie, Nach dem Gesetz, dem Grund, Warum und Wie.
Johann Wolfgang von Goethe
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................... 1
1.1 Gruppe der Pilze ............................................................................................ 1
1.2 Candida albicans: Einordnung und Morphologie ........................................... 2
1.3 Medizinische Bedeutung von Candida albicans ............................................ 3
1.3.1 Epidemiologie der Candida-Infektionen ......................................................... 4 1.3.2 Candida in der Mundhöhle ............................................................................. 5 1.3.3 Weitere klinisch relevante Candida-Spezies .................................................. 6 1.3.4 Klinik der Candida-Infektionen ....................................................................... 7 1.3.5 Diagnostik der Candida-Infektionen ............................................................... 9 1.3.6 Therapie der Candida-Infektionen ................................................................. 9
1.4 Virulenzfaktoren von Candida albicans ......................................................... 10
1.4.1 Zellwand und Adhäsion von Candida albicans .............................................. 11 1.4.2 Phänotypenwechsel ....................................................................................... 13 1.4.3 Dimorphismus ................................................................................................ 14 1.4.4 Thigmotropismus ........................................................................................... 15 1.4.5 Hydrolytische Enzyme von Candida albicans ................................................ 15
1.5 Peptidasen ..................................................................................................... 17
1.5.1 Funktionen von Peptidasen ........................................................................... 17 1.5.2 Klassifikation der Peptidasen ......................................................................... 17 1.5.3 Aminopeptidasen ........................................................................................... 19 1.5.4 Metallopeptidasen .......................................................................................... 19 1.5.5 Sezernierte Aspartylproteinasen (Saps) von Candida albicans ..................... 20
1.6 Kollagen-Struktur ........................................................................................... 24
1.7 Kollagenolyse ................................................................................................. 25
1.8 Zusammensetzung von Dentin ...................................................................... 26
1.9 Candida albicans und Dentinkariogenese ..................................................... 27
2 Zielsetzung der Arbeit ................................................................................. 30
3 Material und Methoden ................................................................................ 31
3.1 Geräte und Materialien .................................................................................. 31
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ................................................................ 31 3.1.2 Chemikalien ................................................................................................... 34 3.1.3 Kulturmedien-Bestandteile ............................................................................. 36 3.1.4 Enzyme und Antikörper .................................................................................. 36 3.1.5 Candida-albicans-Stämme ............................................................................. 37
3.2 Methoden ....................................................................................................... 37
3.2.1 Stammhaltung ................................................................................................ 37 3.2.2 Zellkultivierung von Candida albicans ............................................................ 37 3.2.3 Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung .................................................................. 40 3.2.4 Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ....................................... 41 3.2.5 Zellaufschluss ................................................................................................ 42 3.2.6 Enzymreinigung aus Zellwandlysat von Candida albicans ............................ 43 3.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ......................................................... 45 3.2.8 Proteinkonzentrationsbestimmung ................................................................. 47 3.2.9 Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie ........................................ 48 3.2.10 Datenbankrecherche ...................................................................................... 49 3.2.11 Charakterisierung der isolierten Peptidase .................................................... 49 3.2.12 Albuminabbau-Test ........................................................................................ 52 3.2.13 Kollagenabbau-Tests ..................................................................................... 53 3.2.14 Dentinscheibengewinnung und Dentinabbau-Test ........................................ 56
Inhaltsverzeichnis II
4 Ergebnisse .................................................................................................... 58
4.1 Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ........................................ 58
4.1.1 Vergleich von verschiedenen Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ............................................................................................ 58 4.1.2 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien .............. 59 4.1.3 Vergleich Zellaufschluss - Zellwandlyse ........................................................ 59
4.2 Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus Zellwandlysat ....................... 60
4.2.1 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP ..................................................................... 60 4.2.2 Mono Q HR 5/5 .............................................................................................. 61 4.2.3 Superdex 200 10/300 GL ............................................................................... 63 4.2.4 RESOURCE TM ETH ...................................................................................... 64 4.2.5 Zusammenfassung der Enzymreinigung ....................................................... 65
4.3 Charakterisierung des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans ..................................................................................... 68
4.3.1 Molekulare und funktionelle Identifizierung der Peptidase ............................. 68 4.3.2 Vergleichende Sequenzanalyse der isolierten Peptidase mit homologen Proteinen der Ascomycota .......................................................... 69 4.3.3 pH-Optimum der Enzymaktivität der isolierten Peptidase .............................. 70 4.3.4 Substratspezifität und Enzymkinetik der isolierten Peptidase ........................ 71 4.3.5 Wirkung von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen auf die L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin-Hydrolyse durch die Peptidase ............ 74 4.3.6 Temperaturoptimum der Enzymaktivität ........................................................ 77
4.4 Endopeptidase-Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans .......... 78
4.4.1 Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ................ 79 4.4.2 Kollagenhydrolytische Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans ..................................................................................... 79 4.4.3 Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ............. 82
5 Diskussion .................................................................................................... 83
5.1 Substrate zum Nachweis kollagenolytischer Aktivität .................................... 83
5.2 Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans ..................................................................................... 83
5.2.1 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien .............. 84 5.2.2 Vergleich der Methoden Zellwandlyse und Zellaufschluss ............................ 84 5.2.3 Fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats.......................................................... 86
5.3 Proteinidentifizierung und BLASTp-Suche ..................................................... 87
5.4 Diskussion der Eigenschaften der Metallo-Aminopeptidase .......................... 89
5.4.1 pH-Optimum der Enzymaktivität .................................................................... 89 5.4.2 Substratspezifität und Enzymkinetik .............................................................. 89 5.4.3 Inhibitionsprofil ............................................................................................... 90 5.4.4 Temperaturoptimum ....................................................................................... 91
5.5 Bedeutung der Metallo-Aminopeptidase ........................................................ 91
5.5.1 Wirkungsort und Aktivitätszustand der Metallo-Aminopeptidase ................... 91 5.5.2 Kollagenolytische Wirksamkeit der Metallo-Aminopeptidase ......................... 92 5.5.3 Funktionen der Metallo-Aminopeptidase ....................................................... 94
5.6 Kollagenolyse durch Candida albicans im neutralen Milieu ........................... 95
5.7 Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu ............................... 96
5.7.1 Kollagenolytische Aktivität des Kulturüberstandes ........................................ 96 5.7.2 Kollagenolytische Aktivität des Zellaufschlusses ........................................... 98 5.7.3 Hypothetische Rolle der sezernierten Aspartylproteinasen in der Dentinkariogenese ............................................................................... 99
Inhaltsverzeichnis III
6 Ausblick ........................................................................................................ 101
7 Zusammenfassung ...................................................................................... 102
8 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 103
9 Anhang .......................................................................................................... 121
9.1 Tabellenverzeichnis ....................................................................................... 121
9.2 Abbildungsverzeichnis ................................................................................... 122
9.3 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. 123
9.4 Danksagung ................................................................................................... 125
9.5 Tabellarischer Lebenslauf .............................................................................. 126
9.6 Erklärung ........................................................................................................ 127
1. Einleitung Die Demineralisation der Zahnhartsubstanz durch die säurebildenden Plaquemikro-
organismen wurde bereits umfangreich beschrieben. Hingegen ist die Proteolyse der
organischen Dentinmatrix noch weitgehend ungeklärt. An der Formation kariöser
Dentinläsionen könnten sezernierte mikrobielle Proteinasen beteiligt sein. Die vorliegende
Arbeit untersucht eine mögliche pathogene Funktion des Hefepilzes Candida albicans bei
der Entstehung der Dentinkaries. Zunächst wird in die Bedeutung des Hefepilzes als
Krankheitserreger eingeführt und ein Überblick zu seinen bekannten Virulenzfaktoren
gegeben. Für das Verständnis der zahlreichen Peptidasen des Mikroorganismus ist die
Kenntnis der Klassifikation der Peptidasen hilfreich, die hier ebenso dargestellt wird.
1.1 Gruppe der Pilze Die Gruppe der Pilze umfasst eine heterogene Gruppe von Eukaryoten, die nach
verschiedenen Gesichtspunkten klassifiziert werden können.
Die biologisch-mykologische Einteilung basiert auf der unter bestimmten Bedingungen
kurzzeitig auftretenden teleomorphen (geschlechtlichen) Entwicklungsform im Lebenszyklus
eines Pilzes. So unterteilt die Botanik die Gruppe der Pilze in Zygomycota („Jochpilze“),
Ascomycota („Schlauchpilze“) und Basidiomycota („Basidienpilze“) anhand der morpho-
logischen Charakteristik der Hauptfruchtform. Die entwicklungsgeschichtlich ältesten
Vertreter, die Zygomycota, werden aufgrund ihres unseptierten Myzels als niedere Pilze
bezeichnet.
Pilze, die nur nach ihrem anamorphen (asexuellen) Zustand beurteilt werden können, weil
nur diese Form bekannt ist oder diese Pilze noch nicht vollständig erforscht sind, werden als
Deuteromycota oder Fungi imperfecti bezeichnet. Aufgrund genetischer Verwandschafts-
analysen können die Deuteromycota nun den drei oben genannten Gruppen zugeordnet
werden. Dies berücksichtigt die aktuelle Nomenklatur der klinisch relevanten Pilze [DE HOOG
et al., 2000].
Morphologisch lassen sich die anamorphen Formen der Pilze in Sprosspilze (Blastomyzeten)
und Fadenpilze (Hyphomyzeten) differenzieren. Sprosspilze werden im englischen
Sprachraum als „yeasts“ (Hefen) bezeichnet. Die Gruppe der Sprosspilze setzt sich aus
Vertretern der biologischen Abteilungen Ascomycota und Basidiomycota zusammen.
Biochemische Eigenschaften ermöglichen die Unterscheidung. Basidiomycota bilden das
Enzym Urease und sind nicht zur Zuckerfermentation fähig. Ascomycota zeigen umgekehrte
Eigenschaften. Die Gruppe der Fadenpilze umfasst Pilze aus allen drei biologischen
Einleitung 2
Abteilungen. Einige Pilzarten kommen in Abhängigkeit von den äußeren Bedingungen
sowohl als Spross- als auch als Fadenpilz vor. Diese Eigenschaft wird als Dimorphismus
bezeichnet.
Die biologische Nomenklatur hat für die Medizin wenig Bedeutung, da von vielen medizinisch
relevanten Pilzen nur die asexuelle Entwicklungsform auftritt. Im deutschen klinischen
Sprachgebrauch ist die Einteilung in Dermatophyten, Hefen und Schimmelpilze (DHS-
System nach RIETH, Tabelle 1.1) viel gebräuchlicher, wobei die Gruppe der Schimmelpilze
hier alle Fadenpilze, außer den Dermatophyten, enthält. Die obligat pathogenen
Dermatophyten sind Fadenpilze, die eine Affinität zu Keratin aufweisen. Sie bilden daher
eine eigenständige Gruppe und besiedeln Haut, Haare und Nägel.
Tabelle 1.1: Das DHS-System mit einigen klinisch wichtigen Vertretern
Dermatophyten Hefen Schimmelpilze
Trichophyton mentagrophytes Candida albicans Aspergillus fumigatus
Microsporum canis Cryptococcus neoformans Penicillium marneffei
Epidermophyton floccosum Geotrichum capitatum Scopulariopsis brevicaulis
1.2 Candida albicans: Einordnung und Morphologie Domäne Eukaryota
Reich Fungi Abteilung Ascomycota Klasse Saccharomycetes Ordnung Saccharomycetales Gattung Candida Spezies albicans
Die Gattung Candida umfasst etwa 200 Arten [DE HOOG et al., 2000], von denen C. albicans
am besten untersucht ist. Genetische Verwandschaftsanalysen ermöglichten die Zuordnung
von Candida albicans in die Gruppe der Ascomycota („Schlauchpilze“). Eine teleomorphe
Entwicklungsform konnte bei Candida albicans bisher nicht kultiviert werden. Allerdings
lieferte die vergleichende Genanalyse mit Saccharomyces cerevisiae Hinweise auf einen
sexuellen Zyklus [TZUNG et al., 2001]. Der dimorphe Hefepilz Candida albicans tritt als
Sprosspilz und auch als Fadenpilz auf. Der Sprosspilz vermehrt sich vegetativ über
Knospung. An einer Stelle der Mutterzelle wölbt sich die Zellwand zu einer Ausstülpung, die
zu einer so genannten Tochterzelle heranwächst. Nachdem das Erbgut durch Mitose geteilt
Einleitung 3
wurde, schließt sich die Zellwand, und beide Zellen sind getrennt, haften aber meist noch
aneinander. Das Genom von Candida albicans ist immer diploid. Eine Sprosspilzzelle
(Synonyme: Blastokonidie, Blastospore) von C. albicans misst 2 bis 7 µm in der Breite und 3
bis 10 µm in der Länge und weist eine ellipsoide Form auf.
Auf nährstoffarmen Reisagarplatten zeigt sich die Formenvielfalt von Candida albicans im
Auftreten von Blastosporen, die als „ball like clusters“ an Pseudohyphen liegen, und
Chlamydosporen als Dauerorgane auf Mangelmedien. Die dickwandigen, runden
Chlamydosporen befinden sich an Hyphen und Pseudohyphen, die jeweils durch eine
dazwischen liegende pseudohyphale „Suspensor-Zelle“ getrennt sind. Chlamydosporen
kommen nur in vitro vor. Während bei echten Hyphen (Synonym Keimschläuche) die
Quersepten erst nachträglich entstehen, sind Pseudohyphen lang gestreckte Sprosszellen.
Hyphen zeigen keine sichtbaren Einschnürungen an den Septen. Die Bildung von Hyphen
kann künstlich durch Serum in einer Konzentration von 5 bis 20 % [GOW & GOODAY, 1982;
ODDS, 1988] induziert werden. Myzel bezeichnet ein Geflecht der Hyphen und entsteht bei
lateraler Ausstülpung von Hyphen. Die beiden filamentösen Formen sind in der Lage, durch
Knospung wieder Blastosporen zu bilden.
Candida albicans kann unter guten Bedingungen schnell wachsen, die Generationszeit von
Sprosszellen liegt dann bei 20 Minuten. Außerdem verkraftet der Hefepilz Milieu-
schwankungen gut und wächst innerhalb eines breiten Temperatur- und pH-Bereichs. Durch
die Aktivierung einer H+-ATPase in der Zellmembran bei Glukoseaufnahme und der Bildung
von organischen Säuren sorgt er für ein Absinken des pH-Wertes [MONK et al., 1993;
SAMARANAYAKE, 1983]. Candida bevorzugt ein dunkles, feuchtes und warmes Milieu,
welches in den schleimhautausgekleideten Körperhöhlen der Menschen zu finden ist.
Candida albicans baut über den aeroben Stoffwechsel ein breites Spektrum an
Kohlenhydraten ab. Eingeschränkt ist die Vergärung. Glukose und Maltose werden schnell
umgesetzt, während Galaktose nur sehr langsam und Laktose gar nicht anaerob
metabolisiert werden können [SCHAUER & HANSCHKE, 1999]. Diese Merkmale werden zur
biochemischen Differenzierung der Hefen herangezogen.
1.3 Medizinische Bedeutung von Candida albicans
Candida albicans ist ein ernstzunehmender fakultativ humanpathogener Keim, der
besonders bei immungeschwächten Patienten rezidivierende oberflächliche Candidosen,
aber auch schwere systemische Infektionen mit infauster Prognose verursacht. Prä-
disponierende Faktoren für eine Candida-Infektion sind in Tabelle 1.2 zusammengefasst.
Einleitung 4
Tabelle 1.2: Prädisponierende Faktoren für eine Mykose, modifiziert nach SANDERINK et al. [2004]
Erkrankungen Iatrogene Maßnahmen Gefährdete Bevölkerungsgruppen
Langzeitantibiose (Breitband-) Gravide Zytostatikamedikation Früh- und Neugeborene
Immundefekte (angeboren oder erworben, z.B. HIV-Infektion)
Immunsuppressiva-Einnahme Greise Strahlentherapie Leukopenie und andere
hämatologische Erkrankungen Glukokortikoidmedikation konsumierende Erkrankungen Organtransplantation Diabetes mellitus Dialyse
maschinelle Beatmung chronische gastroenterologische Erkrankungen
intensivmedizinische Behandlung
Alkoholabusus, Drogenabusus Ernährungssonden großflächige Verbrennungen Harnblasenkatheter Polytrauma Infusionskatheter Herzklappenprothesen
1.3.1 Epidemiologie der Candida-Infektionen
Candida albicans kommt nicht ubiquitär in der freien Natur vor, deshalb erfolgt eine
Übertragung als Kontakt- oder Schmierinfektion auf direktem oder indirektem Wege von
Mensch zu Mensch oder von Tier zu Mensch.
Candida spp. gehören nicht zur physiologischen Standortflora des Menschen [SANDERINK et
al., 2004]. Als kommensaler Keim kommt der Hefepilz in der Mikroflora der Schleimhäute im
Mund, Gastrointestinaltrakt und Urogenitalbereich vor. Candida wird hier durch die
Wirtsabwehr und auch von Vertretern der physiologischen Keimflora an der Ausbreitung
gehindert. Die Betroffenen tragen Candida als kommensalen Keim in sich, es kommt nicht
zur Ausbildung eines Krankheitsbildes. Befindet sich die Wirtsabwehr in einem defizitären
Zustand (Tabelle 1.2), kann es dem opportunistischen Keim C. albicans gelingen, sich rasant
zu verbreiten. Es wurde beobachtet, dass kleine Änderungen des Abwehrstatus genügen,
um das sensible Gleichgewicht zwischen virulenten und defensiven Faktoren zu stören, und
der harmlose Kommensale wird zu einem aggressiven Pathogen [FIDEL et al., 1999].
Die meisten symptomatischen Candida-albicans-Infektionen sind endogenen Ursprungs, die
aufgrund einer Schwächung des Immunsystems oder einer Gleichgewichtsstörung in der
Mikroflora des Wirts zum Ausbruch kommen [PFALLER, 1996]. Daneben wurden vereinzelt
auch exogene Schmierinfektionen beschrieben. Ein hoher Prozentsatz des Krankenpflege-
personals wurde als Träger von Candida-Spezies identifiziert.
In den USA ist die Candida-Sepsis die vierthäufigste Form aller Infektionen der Blutbahnen
[BECK-SAGUE & JARVIS, 1993].
Einleitung 5
Die Mykosehäufigkeit steigt weltweit an. Die Ursachen liegen in einem größeren Kreis an
prädisponierten Patienten und der intensiveren medizinischen Behandlung der
Grunderkrankungen der Patienten. Zwischen 1980 und 1990 ermittelten die Centers for
Disease Control and Prevention einen Anstieg der Pilzinfektionen um 90 % von 2,0 auf 3,8
pro 1000 Fälle in Krankenhäusern, die am US National Nosocomial Infection Surveillance
Program teilgenommen haben [BECK-SAGUE et al., 1993].
Candida albicans wird auch als problematischer Hospitalismus-Keim angesehen. Gefährdet
sind vor allem immunkomprimierte Intensivpatienten mit intravenösen Kathetern, die dann
eine systemische Candidose erleiden. Drei Viertel aller nosokomialen Pilzinfektionen werden
auf C. albicans zurückgeführt.
1.3.2 Candida in der Mundhöhle Bei 31 bis 55 % der gesunden Bevölkerung können Candida-Spezies in der Mundhöhle
nachgewiesen werden [ODDS, 1988]. Die orale Isolierungshäufigkeit von Candida-Spezies ist
bei Diabetes-mellitus-Patienten [ODDS et al., 1978; BELAZI et al., 2005] und AIDS-Patienten
[SÁNCHEZ-VARGAS et al., 2005] gegenüber einer gesunden Kontrollgruppe deutlich erhöht.
Bei 70 % der Patienten mit Prothesenstomatitis konnten Hefepilze aus Abstrichen von
prothesenbedeckter Schleimhaut isoliert werden, wovon in 75 % der Fälle Candida albicans
auftrat [McMullan-Vogel et al., 1999]. Candida albicans wurde auf der Mundschleimhaut, im
Speichel, in der Plaque, in kariösen Läsionen und auch im infizierten Wurzelkanal
nachgewiesen. Das Auftreten von C. albicans in der oralen Flora kann durch Mundspülung
mit einer Testlösung ermittelt werden. Die Keimzahlen, die meist in Koloniebildenden
Einheiten (KBE) Candida albicans pro Milliliter Mundspüllösung der Probanden angegeben
werden, variieren in den einzelnen Arbeiten sehr stark. Allerdings liegen die Keimzahlen von
C. albicans etwa vier Zehnerpotenzen unter denen von Streptococcus mutans [ALMSTÅHL &
WIKSTRÖM, 1999; HINTAO et al., 2007; KUMAR et al., 2005]. WETZEL et al. fanden 1993
C. albicans im Speichel bei 71,7 % der Kinder mit fortgeschrittener Karies und nur bei 17,5 %
der Probanden der kariesfreien Kontrollgruppe. Die quantitativen Angaben zur Belastung von
Speichel variieren ebenfalls sehr. Plaqueproben von Kindern mit aktiver Karies wiesen in
71,8 % der Fälle Candida spp. auf [SCHULZ-WEIDNER et al., 2005]. Die Frequenz von
Candida albicans in der Plaque bei Kindern mit frühkindlicher Karies war mit 50 % signifikant
höher als in den Plaqueproben der Kontrollgruppe (13,4 %). Bei Kindern mit geschädigten
Milchgebissen war kariöses Dentin in 81,5 % [SZIEGOLEIT et al., 1999] bzw. 96,8 % [SCHULZ-
WEIDNER et al., 2005] der Fälle mit Candida-Spezies besiedelt. In kariösem Dentin wurde
überwiegend ein massenhaftes Vorkommen von Candida albicans nachgewiesen
Einleitung 6
[WETZEL et al., 1993]. Auch die Angaben zur Isolierungshäufigkeit von Candida-Spezies in
infizierten Wurzelkanälen schwanken sehr stark zwischen 7 % [WALTIMO et al., 1997] und
55 % [NAJZAR-FLEGER et al., 1992]. Die Besiedelung von Kariesläsionen wird als Reservoir
für Candida-Spezies gesehen, rezidivierende orale Candidosen auszulösen. Außerdem
wurde gezeigt, dass die Besiedelung der Mundhöhle mit C. albicans nach umfangreicher
Gebisssanierung deutlich zurückgeht, nicht aber durch lokale Verabreichung von
Antimykotika [SZIEGOLEIT et al., 1999].
1.3.3 Weitere klinisch relevante Candida-Spezies Durch Candida spp. werden 80 % aller Mykosen hervorgerufen [PFALLER, 1996]. C. albicans
wurde in 70 bis 80 % der Candidosen isoliert. C. glabrata und C. tropicalis haben einen
Anteil von je 5 bis 8 % der Isolate, während andere Nicht-albicans-Candida-Arten spärlich
gefunden werden [BECK-SAGUE et al., 1993; ODDS, 1988].
In den letzten Jahren wird über eine Zunahme von Infektionen mit Nicht-albicans-Candida-
Arten berichtet. Da Nicht-albicans-Arten teilweise gegen die am häufigsten angewendete
Antimykotika-Gruppe der Azole resistent sind, kommt es zu dem Selektionsdruck unter der
antimykotischen Therapie und damit zu einer Veränderung der Besiedelung [FIDEL et al.,
1999; KULLBERG & OUDE-LASHOF, 2002].
Tabelle 1.3: Übersicht medizinisch relevanter Nicht-albicans-Candida-Arten
Candida spp. Medizinische Merkmale
Candida glabrata
urogenitale Infektionen, disseminierte Infektionen, oft Fluconazol-resistent
Candida krusei systemische Infektionen, intrinsisch Fluconazol-resistent
Candida tropicalis disseminierte Infektionen bei Krebspatienten
Candida parapsilosis häufig katheterassoziierte Infektionen
Candida dubliniensis
orale Candidiasis bei HIV-Patienten, Morphologie und Biochemie wie C. albicans, kein Wachstum bei 45 °C
Candida guilliermondii systemische Infektionen nach chirurgischen Eingriffen
Candida lusitaniae lokale und systemische Infektionen bei Karzinompatienten
Einleitung 7
1.3.4 Klinik der Candida-Infektionen Eine durch Candida spp. verursachte Erkrankung heißt Candidose (Synonym Candidiasis).
Unterschieden werden die mukokutane (superfizielle) von der systemischen Candidose.
Candida albicans besiedelt neben dem Oro-Intestinaltrakt auch den Respirationstrakt,
Genitaltrakt, Harntrakt und Körperoberflächen. Die Candidosen der Haut und Schleimhäute
werden auch als Soor bezeichnet. Nach einer Fungämie kann es zu multiplem Organbefall
mit Organabszessen kommen. Exemplarisch werden die orale Candidose, die Candida-
Ösophagitis und die systemische Candidose näher beschrieben.
Tabelle 1.4: Klinische Formen der Infektion mit Candida albicans
Oberflächliche Formen (kutane und mukokutane)
Tiefe Formen (isolierter Organbefall oder Dissemination)
Haut- und Nagelinfektionen Zystitis, Pyelitis, Nierenabszesse Windeldermatitis Pneumonie Vulvovaginitis Meningitis Balanitis Perikarditis, Endokarditis Stomatitis Peritonitis Ösophagitis Fungämie, Septikämie Gastritis, Enteritis Uveitis
Orale Candidose Der Nachweis von Candida albicans in der Mundhöhle zeigt lediglich eine Kolonisation mit
dem Hefepilz an. Erst wenn entsprechende klinische Symptome hinzukommen, wird von
einer Candida-Infektion mit Ausbildung einer oralen Candidose gesprochen. Oropharyngeale
Candidiasis ist die häufigste Erkrankung bei Patienten mit AIDS [VARGAS & JOLY, 2002].
Über 90 % aller HIV-Infizierten entwickeln einmal eine orale Candidose während der
Progression zur AIDS-Erkrankung [OLLERT et al., 1995].
Candidiasis mucoseae oris tritt akut oder chronisch auf. Akute Formen lassen sich
differenzieren in die pseudomembranöse Form und die seltener auftretende erythematöse
Form. Bei der akuten pseudomembranösen Form zeigen sich stippchenförmige, später
konfluierende, weißliche, abstreifbare Beläge, unter denen sich eine hochrote, leicht
blutende Schleimhaut befindet [SCHALLER, 2006]. Die typischen weißen Beläge fehlen bei
der erythematösen Form, hier ist nur eine diffuse Rötung erkennbar. Chronische orale
Candidose kann verschiedene klinische Bilder zeigen. Beschrieben werden hyperplastische,
noduläre, plaqueartige und pseudomembranöse Formen. Weiße Beläge sind in den meisten
Fällen zu finden.
Einleitung 8
Die weißen Auflagerungen sind mechanisch durch Abwischen entfernbar, was aber zu
Schleimhauterosionen und -blutungen führt. Der Mundsoor tritt oft am Gaumen und an der
Wangenschleimhaut auf, kann aber im Prinzip alle Mundschleimhautareale befallen.
Subjektiv bestehen leichte Missempfindungen oder auch Beschwerdefreiheit [SCHALLER,
2006]. Von Prothesenbasis bedeckte Gaumenschleimhaut zeigt häufig eine Prothesen-
stomatitis, die oft mit Candida albicans assoziiert ist. Eine weitere Sonderform stellt die
anguläre Candida-Cheilitis (Synonyme: Perlèche, Faulecken) dar, die typisch für ältere
Patienten mit abgenutzten Prothesen und damit einhergehender zu geringer vertikaler
Dimension ist. Eine Candida-Glossitis zeigt ein „lackzungenähnliches“ Bild mit
Papillenverlust. Die schwarze Haarzunge ist auch in vielen Fällen mit Candida assoziiert.
Candida-Ösophagitis Ein Befall der Speiseröhre ist meist die Folge von Mundsoor. Endoskopisch wurde bei 2,1 %
aller untersuchten Patienten eine ösophageale Candidose diagnostiziert. Dieser Wert hat
sich indessen auf 3,5 % erhöht [SANDERINK et al., 2004]. Bei einer Gruppe von HIV-positiven
Patienten wurde durch endoskopischen Abstrich in 42 % ein Candida-Nachweis erbracht.
Die Ösophagusschleimhaut zeigt die typischen Entzündungszeichen wie Rötung und
Schwellung sowie weiße Auflagerungen. Die Candida-Ösophagitis verläuft entweder
asymptomatisch oder mit Schluckbeschwerden und retrosternalen Schmerzen. Soor-
Ösophagitis ist häufig mit fortgeschrittener AIDS-Erkrankung und hämatologischen
Erkrankungen assoziiert. Eine Candida-Gastritis kann ebenso vergesellschaftet sein.
Candidämie und systemische Candidose Eine systemische Candidose entsteht entweder endogen durch Invasion einer
oberflächlichen Candidose oder exogen durch Katheterbesiedelung, parenterale
Ernährungssonden oder Infusionslösungen. Bei verstärkter Kolonisation oder Mukosa-
schäden infolge Radiatio oder Chemotherapie kann eine oberflächliche Candidose invasiv
werden und in die Blutbahn einbrechen. Die Mehrheit der systemischen Candidosen geht
endogen aus einer Candida-Besiedelung des Magen-Darm-Traktes hervor [NUCCI &
ANAISSIE, 2001]. Gastro-Intestinal-Chirurgie gilt als Risikofaktor für eine disseminierte
Candidiasis, weil die Integrität der Darmmukosa unterbrochen wurde. Candida-besiedelte
intravenöse Katheter stellen eine weitere häufige Ursache für eine Einschwemmung in die
Blutbahn dar. Die resultierende Fungämie wird von immunabwehrstarken Patienten limitiert.
Bei gestörter Immunabwehr, insbesondere bei Neutropenie, Verbrennungen,
intraabdominellen Operationen, können Keime in andere Organe streuen, und es entstehen
multiple Mikroabszesse. Man spricht auch von Candida-Sepsis. Systemische Candidosen
Einleitung 9
treten überwiegend stationär als Komplikation von laufenden Therapiemaßnahmen auf.
Nosokomiale Pilzinfektionen sind zu 72 % von Candida-Spezies ausgelöst [JARVIS, 1995].
Systemische Candidosen weisen eine Mortalitätsrate von etwa 35 % auf [WENZEL, 1995].
1.3.5 Diagnostik der Candida-Infektionen
Sprosspilze der Gattung Candida lassen sich oft schon mikroskopisch aus Abstrichen als
Nativpräparat oder als Gramfärbung nachweisen. Je nach Lokalisation der Infektion eignen
sich Abstriche, Punktate, Respirationssekrete, Urin, Blut und Liquor zum kulturellen
Nachweis. Die Anzucht erfolgt bei 37 °C auf Sabouraud-Glukose-Agar und nährstoffarmem
Reis- oder Kartoffelwasseragar, auf denen sich die für Candida charakteristischen
Pseudomyzelien und Clamydosporen ausbilden. Eine eindeutige Differenzierung kann auch
über die biochemische Charakterisierung erfolgen. Mannane der Zellwand werden als
Candida-Antigene über den indirekten Latexagglutinationstest mit Serum oder Bronchial-
lavage nachweisbar. Körpereigene Candida-Antikörper können im Serum mittels
Komplementbindungsreaktion (KBR), Enzymimmunoassay (EIA), Hämagglutinationshemm-
test, Immunofluoreszenztest sowie eines Candida-Präzipitationstests bestimmt werden.
Diese Tests haben klinisch einen geringen Stellenwert, da sich eine systemische nicht von
einer lokalen Infektion unterscheiden lässt. Der Nachweis von Candida-DNA ist mittels PCR
oder Gen-Chips möglich und gewinnt für die Diagnostik zunehmend an Bedeutung. Diese
Tests ermöglichen auch den Nachweis von Candida albicans in der Mundhöhle und können
somit zur Bestimmung des Kariesrisikos beitragen.
1.3.6 Therapie der Candida-Infektionen
Die Pilzzellwand, Zellmembran und die Proteinsynthese sind wichtige Angriffsorte der
Antimykotika. Die Wirkung der Antimykotica kann fungistatisch oder fungizid sein.
Eine oropharyngeale oder vulvovaginale Candidose wird lokal und oder systemisch durch
Polyene oder Azole therapiert. Antimykotika können oral als Suspensionen oder
Lutschtabletten angewendet werden [SCHALLER, 2006]. Zur Therapie der so genannten
Prothesenstomatitis hat sich auch Chlorhexidindiglukonat als Spüllösung bewährt. Bei
Formen der systemischen Candidose oder bei Versagen der topischen Therapie bei lokaler
Candidose kommen Polyene, Azole oder Echinocandine systemisch zum Einsatz.
Katheterassoziierte Infektionen erfordern die Entfernung des besiedelten Fremdmaterials.
Zu den Polyenen zählen unter anderem Amphotericin B, Nystatin und Natamycin. Sie
zeichnen sich durch eine hohe Affinität zum Ergosterin, dem dominierenden Membranlipid
Einleitung 10
der Pilze, aus. Früher wurde Amphotericin B als Goldstandard bei der Behandlung
verschiedener Formen der Candidose angesehen, aber wegen der hohen Oto- und Nephro-
toxizität von dieser Position durch Fluconazol verdrängt. Fluconazol, Itraconazol und
Voriconazol sind Triazole und gehören zur Gruppe der Azole. Die zweite Untergruppe der
Azole bilden die Imidazole mit den beispielhaft genannten Vertretern Clotrimazol und
Ketokonazol. Azole bewirken eine Hemmung der Ergosterinsynthese. Fluconazol weist gute
pharmakologische Eigenschaften auf. Es kann oral oder parenteral verabreicht werden, ist
gut verträglich, wasserlöslich und erreicht hohe Plasmaspiegel. Fluconazol wirkt allerdings
nicht gegen Candida krusei. Echinocandine hemmen die Synthese von Glukan, das ein
wichtiger Bestandteil der Pilzzellwand ist. Durch diesen selektiven Wirkungsmechanismus
zeigt das zurzeit einzige Präparat Caspofungin eine gute Verträglichkeit.
Alle Antimykotika sind wesentlich länger einzusetzen als Antibiotika. Eine mindestens
14-tägige bis monatelange Einnahme ist notwendig.
Resistenzentwicklung Die Resistenzentwicklung gegen Antimykotika bei Pilzen ist viel seltener als bei Bakterien
gegen Antibiotika. Pilze können den Zugang zum Angriffspunkt des Medikaments
einschränken oder die Zielstruktur verändern. Sie können die antimikrobielle Substanz nicht
enzymatisch attackieren, wie das bei Bakterien häufig geschieht. Außerdem verfügen Pilze
nicht über Plasmide oder Transposons, die zur genetischen Kodierung der Resistenzen
dienen könnten.
1.4 Virulenzfaktoren von Candida albicans
Candida albicans verfügt über ein interessantes Arsenal an Virulenzfaktoren, die zwar eine
intakte Wirtsabwehr nicht zu Fall bringen können, aber dem Pilz eine dauerhafte Einordnung
in die Wirtsstandortflora ermöglichen. Erfolgt eine Schwächung des Wirtsorganismus, kann
es zu einer progressiven Ausbreitung von Candida albicans kommen. Die Adhärenz von
Pilzzellen an Epithelzellrezeptoren und anderen Wirtsstrukturen geschieht über eine Vielzahl
von Proteinen. Durch Sekretion von lytischen Enzymen gelingt Candida albicans die
Zerstörung der Epithelintegrität. Der Dimorphismus trägt entscheidend zur Epithelpenetration
und Invasion in tiefer gelegene Schichten bei. Durch Änderung des Phänotyps, dem so
genannten „phenotypic switching“, gelingt es Candida albicans, das Immunsystem vor eine
neue Situation mit neuen Antigenen zu stellen.
Einleitung 11
1.4.1 Zellwand und Adhäsion von Candida albicans
Früher nahm man an, die Zellwand ist eine träge und inaktive Struktur, die dem Protoplasten
Stabilität und Schutz bietet. Heute ist bekannt, dass die Zellwand essentiell an vielen
Zellvorgängen beteiligt ist. Die Zellwand stellt das äußerste Kompartiment der Hefezelle dar
und fungiert als Kontaktorgan zwischen dem Mikroorganismus und seiner Umgebung,
insbesondere dem Wirt. Die Untersuchung der Zellwand liefert wichtige Erkenntnisse über
Pathomechanismen, die in innovative Diagnose- und Therapieverfahren münden können.
Die Zellwand ist die formgebende Struktur der Pilzzelle, stellt eine Permeabilitätsgrenze dar
und bietet osmotische Stabilität. Nach vollständiger Entfernung der Zellwand entstehen
Protoplasten, die in Medien ohne osmotische Stabilisatoren lysieren [WALKER, 1999]. Die
Zellwand ermöglicht die Zell-Zell-Adhäsion zwischen Hefezellen untereinander und zur
Wirtszelle. Die Candida-albicans-Zellwand bestimmt die wesentlichen Faktoren der
Interaktion zwischen Wirt und Parasit durch Ausprägung von Adhäsionsfaktoren und
Auslösen der Wirts-Immunantwort, die gezielt aktiviert oder unterdrückt werden kann
[MARTINEZ et al., 1998].
Die Candida-albicans-Zellwand besteht zu 75 bis 90 % aus Kohlenhydraten. Darunter fallen
β-Glukane, Chitin und Mannan, das nur in Verknüpfung mit Proteinen zu Mannoproteinen
(Glykoproteinen) vorkommt. Außerdem enthält die Zellwand 6 bis 25 % Proteine und 1 bis
7 % Lipide [CHAFFIN et al., 1998]. β-Glukane und Chitin bilden das feste Grundskelett der
Zellwand, in das die anderen Bestandteile eingelagert sind. Die verschiedenen
phänotypischen Formen der Candida-albicans-Zelle weisen jeweils spezielle
Zellwandstrukturen auf. Filamente enthalten die dreifache Menge an Chitin gegenüber der
Sprosspilzzelle. Inzwischen sind viele Morphologie-spezifische Proteine identifiziert worden
[CHAFFIN et al., 1998].
Durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie mit speziellen cytochemischen und
kontrastschaffenden Agenzien konnten verschiedene Schichten differenziert werden, die
aber von Stamm zu Stamm und in Abhängigkeit von Kulturbedingungen variieren.
Verschiedene Autoren beschrieben drei bis acht verschiedene Schichten. Zwischen
Zellmembran und Zellwand liegt der perizelluläre Raum („periplasm“). In diesem Raum
befinden sich zahlreiche sezernierte Proteine, die meist die Zellwand nicht durchdringen
können [WALKER, 1999]. Die inneren Zellwandschichten enthalten mehr Glukan und Chitin,
die für eine rigide Struktur sorgen. Die äußeren Schichten erscheinen als ein dichtes
fibrilläres oder globuläres Netzwerk von radial ausgerichteten Fimbrien und enthalten mehr
Proteine und Glykoproteine [MARTINEZ et al., 1998]. Zellwand und Zellmembran sind eng
verflochten, was durch zahlreiche Membran-Invaginationen offensichtlich wird. Das Auftreten
verschiedener Schichten der Pilz-Zellwand scheint mehr durch quantitative Unterschiede der
Einleitung 12
verschiedenen Zellwandbestandteile in der jeweiligen Schicht, als durch qualitative
Unterschiede geprägt zu sein [CHAFFIN et al., 1998]. Im Proteinanteil der Zellwand sind auch
zahlreiche hydrolytische Enzyme nachgewiesen worden. Darunter fallen auch alle
sezernierten Enzyme, weshalb eine Unterteilung dieser Enzyme nach Funktion sinnvoll
erscheint. Enzyme wie Exo-β-(1,3)-Glukanase oder Chitinase, die Bestandteile der Zellwand
spalten, sind von Enzymen wie sezernierte Aspartylproteinasen, Phospholipasen und
Hyaluronidase zu differenzieren, die extrazelluläre Substrate hydrolysieren. Viele Enzyme
mit extrazellulären Substraten stellen transiente Proteine der Zellwand dar, deren
Bestimmung der extrazelluläre Raum ist [CHAFFIN et al., 1998].
Die Adhäsion von Candida albicans an Epithel- oder Endothelzellen und Strukturen der
extrazellulären Matrix wird als wichtiger initialer Schritt in der Virulenz eingeschätzt. Die
„agglutinin like sequence“ (ALS)-Genfamilie mit acht Mitgliedern kodiert glykosylierte
Zelloberflächenproteine, von denen für Als1p, Als3p und Als5p eine adhäsive Funktion zu
humanen Wangenschleimhautzellen und Fibronektin nachgewiesen werden konnte [FU et
al., 1998; ZHAO et al., 2004].
Ein ebenso glykosylphosphatidylinositol-verankertes Adhäsin ist das „hyphal wall protein 1“
(Hwp1). Der Aminoterminus von Hwp1 ist ein Substrat für die Transglutaminasen der
Säugetiere. So gelingt es der Candida-Zelle, stabile Verbindungen mit Epithelzellen
einzugehen [SUNDSTROM, 2002]. Ein weiteres Oberflächenprotein von Candida albicans ist
das Int1p, das Sequenzähnlichkeiten zu Integrinen von humanen Leukozyten aufweist und
an die extrazelluläre Matrix binden kann. Die Unterbrechung des Genes INT1 senkt die
Adhäsionsfähigkeit an humane Epithelzellen um 40 % und reduziert die Virulenz im
Mausmodell für eine systemische Candidose erheblich [GALE et al., 1998].
Auch für die Mannosyltransferase 1 von C. albicans, die Protein-Mannosyltransferase 1 und 6
sowie für Sap-Proteine konnte eine Bedeutung bei der Adhärenz von Candida albicans
nachgewiesen werden.
Ein erst in den letzten Jahren beleuchtetes Thema ist die Fähigkeit von C. albicans, an
implantierte medizintechnische Materialien zu adhärieren und widerstandsfähige Biofilme zu
bilden [DOUGLAS, 2003]. In Biofilmen organisierte Candida-Kulturen sind deutlich
antimykotikaresistent [AL-FATTANI & DOUGLAS, 2006]. Es wurde eine Korrelation zwischen
dem Grad der Virulenz und der Fähigkeit zur Biofilmbildung gefunden [CHANDRA et al., 2001;
DOUGLAS, 2003].
Einleitung 13
1.4.2 Phänotypenwechsel
Ein reversibles Wechseln des sichtbaren Phänotyps der Zell- und Koloniemorphologie in
C. albicans bezeichnet man als „phenotypic switching“. Es erfolgt spontan bei Einzelzellen
mit einer Frequenz von 10-4 bis 10-1 Hz und geht mit Veränderungen von Stoffwechsel-
prozessen, in der Antigen-Expression, Adhäsion und Gewebeaffinität einher [SOLL, 1997].
Durch bestimmte Umweltreize kann der Phänotypenwechsel auch künstlich erzeugt und ein
Massenwechsel der Zellen einer Kultur erzielt werden. Am besten untersucht ist das so
genannte „white-opaque-switching“ des WO-1-Stammes [SOLL, 1997], der lediglich zwischen
zwei Phänotypen wechselt (Abbildung 1.1). Während die „white“-Form dieses Stammes
glatte und weiße Kolonien und runde bis ovale Zellen aufweist, zeigt die „opaque“-Form eine
flache gräuliche Kolonieform und elongierte stäbchenförmige Zellen mit einer großen
Vakuole und als „pimple“ bezeichnete Ausstülpungen [ANDERSON et al., 1990].
Abbildung 1.1: Unterschiede zwischen der „white“ und „opaque“ Form des Candida-albicans- Stamms WO-1 (aus SOLL [1997], mit Genehmigung des Verlages) Legende: w - „white“ Kolonie; op - „opaque“ Kolonie; p - Zellwandausstülpungen; Pfeilköpfe zeigen auf Knospungsstellen. Bei anderen Stämmen konnte aber eine deutlich größere Vielfalt an Phänotypen gefunden
werden. Stamm 3153A zeigt beispielsweise bis zu fünf verschiedene Kolonieformen („star“;
„stippled“; „hat“; „irregular wrinkle“; „fuzzy“) [SOLL, 1992]. Jeder Kolonietyp kann sich spontan
in einen anderen umwandeln und auch Mischformen werden beobachtet. Damit ist die
experimentelle Analyse dieses komplexen Phänotypenwechsels nahezu unmöglich. Der
Phänotypenwechsel ermöglicht eine Immunevasion der Candida-Zellen. Die Bedeutung des
Einleitung 14
Phasenwechsels für die Virulenz von C. albicans zeigt sich an einer erhöhten Wechselrate
von frischen klinischen Isolaten [SOLL, 1992].
1.4.3 Dimorphismus
Die Fähigkeit von Candida albicans, zwischen Sprosspilzzelle und Hyphenform zu wechseln,
wird als bedeutende Komponente der Virulenz angesehen (Abbildung 1.2). Der Hyphenform
wird bei Candidosen hinsichtlich der Adhäsion und der Invasion eine besondere Virulenz
zugesprochen [CUTLER, 1991]. Klinische Isolate enthalten in der Regel sowohl Blastosporen
als auch Filamente. Hyphale Elemente sind in der Lage, Epithelien zu durchwachsen. Die
Bildung von Hyphen ermöglicht es C. albicans, in vitro aus phagozytierenden Makrophagen
und Neutrophilen auszubrechen [VAZQUEZ-TORRES & BALISH, 1997].
Abbildung 1.2: Wechselmöglichkeiten zwischen den morphologischen Formen von Candida albicans (aus ERNST [2000], mit Genehmigung des Verlages) Die Hyphenbildung kann durch verschiedene Reize induziert werden. Eine Temperatur von
37 °C und ein neutraler pH-Wert begünstigen die Entwicklung echter Hyphen [BUFFO et al.,
1984]. Nährstoffmangel führt auch als Einzelfaktor zur Hyphenbildung. Als Standard in der
Diagnostik von C. albicans wird zur Induktion der Hyphenform Serum in einer Konzentration
von 5 bis 20 % eingesetzt [ERNST, 2000].
Candida albicans benutzt ein Netzwerk aus vielen Signal-Transduktionswegen, um die
Transformation von der Sprosspilzzelle zur Hyphenzelle zu kontrollieren. Durch
Einleitung 15
verschiedene Transkriptionsfaktoren wird die Expression eines typischen Musters von
hyphenspezifischen Genen kontrolliert, von denen viele als bekannte Virulenzfaktoren
agieren [LIU, 2001].
1.4.4 Thigmotropismus
Thigmotropismus, der im Englischen auch als „contact sensing“ bezeichnet wird, beschreibt
die Fähigkeit des Pilzes, sein Hyphenwachstum nach den Oberflächenstrukturen des Wirts
auszurichten. Neben dem Wachsen entlang von Zellgrenzen wurde beobachtet, dass die
Fadenstrukturen zielgerichtet mikroskopisch kleine Diskontinuitäten des Epithels finden und
so Schwachstellen im Gewebe für eine leichtere Penetration des Wirtsepithels nutzen
[SCHALLER, 2006].
1.4.5 Hydrolytische Enzyme von Candida albicans
Die drei bedeutendsten von Candida albicans produzierten extrazellulären Hydrolasen sind
sezernierte Aspartylproteinasen (Saps), Phospholipase B und Lipasen.
Peptidasen und Proteinasen von Candida albicans
Die bereits umfangreich untersuchten sezernierten Aspartylproteinasen werden gesondert im
Abschnitt 1.5.5 abgehandelt.
Die bekannten intrazellulären Peptidasen von Candida albicans sind oft unzureichend
charakterisiert. In mehreren Arbeiten wurde nicht erwähnt, ob die Enzyme auch extrazellulär
nachgewiesen werden können. Eine umfangreiche Analyse der Aminopeptidase-Aktivitäten
verschiedener Pilze beinhaltet eine 1975 veröffentlichte Arbeit von LEE und Mitarbeitern. Bei
C. albicans wurden hohe Aminopeptidase-Aktivitäten für L-alanyl-, L-leucyl-, L-methionyl- und
L-prolylhaltige Peptidsubstrate bestimmt. Geringere Aktivitäten wurden unter anderem für
L-Arginyl-, L-Lysyl- und L-Phenylalanyl-β-naphthylamid nachgewiesen.
PORTILLO und GANCEDO fanden 1986 bei der Untersuchung von Zellaufschluss eine
Aspartylproteinase mit einem pH-Optimum von etwa 5, eine Aminopeptidase und eine
Dipeptidase mit Aktivitätsmaxima im leicht basischen pH-Bereich. Da damals noch nicht die
Vielfalt der Saps bekannt war, kann die 1986 gefundene proteolytische Aktivität bei saurem
pH-Wert nach heutigem Erkenntnisstand als intrazelluläre Form einer Sap gedeutet werden.
Die Arbeitsgruppe um PORTILLO untersuchte nicht, ob die gefundene Aktivität auch im
Kulturüberstand einer Candida-albicans-Kultur nachweisbar ist.
Beschrieben wird auch die Proteinase B (ycaB). Diese Serinproteinase kommt sowohl in
C. albicans als auch in Saccharomyces cerevisiae vor [FARLEY et al., 1986]. BAUTISTA-
Einleitung 16
MUNOZ et al. [2005] zeigten, dass Candida albicans ein Gen zur Expression der Dipeptidyl-
Aminopeptidase A trägt. OROZCO et al. entdeckten 2002 das Gen PRB1, welches eine neue
Endoprotease B verschlüsselt. NISHIMURA et al. konnten 2002 eine zellassoziierte Spaltung
von 2-Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) bei physiologischem pH-Wert nachweisen.
Von der Arbeitgruppe um RODIER wurden mehrere gelatinolytische Serin-Proteinase-
aktivitäten durch Zymographie mit gelatinehaltigen Gelen gefunden [RODIER et al., 1994].
Weiterhin beschrieb diese Arbeitsgruppe die Entdeckung einer hauptsächlich in der Zellwand
lokalisierten Metallopeptidase. Bei neutralem pH-Wert konnte für dieses Enzym
elektrophoretisch die vollständige Spaltung von Typ-I-Kollagen und Fibronektin sowie der
partielle Abbau von Typ-IV-Kollagen und Laminin gezeigt werden [RODIER et al., 1999].
Mittels Zymogramms untersuchte eine weitere Arbeitsgruppe das gelatinolytische Potential
von konzentrierten Kulturüberständen aus BHI-Flüssigkultur von Candida-albicans-Isolaten
HIV-positiver Patienten [BRITO COSTA et al., 2003]. Durch Inhibitionsversuche wurden zwei
dieser Peptidase-Aktivitäten als Serinproteinasen und zwei als Metalloproteinasen
identifiziert. In einer neueren Arbeit dieser Gruppe wurde für eine Serinproteinaseaktivität
und eine Metalloproteinaseaktivität in BHI-Kulturüberstandkonzentraten durch
Elektrophorese der Abbau von RSA, Hämoglobin, Fibronektin und Laminin bei
physiologischem pH-Wert gezeigt [SANTOS et al., 2006].
Lipasen
Hierzu zählen Esterasen und Lipasen. Beide können Esterbindungen von Mono-, Di- oder
Triacylglycerolen oder Phospholipiden spalten. Lipasen arbeiten an der Grenze zwischen der
unlöslichen Triacylglycerol-Phase und Wasser, während Esterasen an löslichen Substraten
angreifen. Extrazelluläre Lipase-Aktivität wurde bereits 1966 entdeckt und eine sezernierte
Esterase von TSUBOI et al. [1996] beschrieben. Mittels Analyse der genomischen DNA
konnte eine Familie mit zehn lipolytischen Genen (LIP1-LIP10) gefunden werden, von denen
neun eine N-terminale Signalsequenz enthalten [HUBE et al., 2000]. Diese Vielfalt an
LIP-Genen zeigt möglicherweise die breite lipolytische Aktivität, die zur Virulenz und
Persistenz von Candida albicans beisteuert. Die Bedeutung und Funktion der Lipasen bleibt
aber noch aufzuklären.
Phospholipase B
Phospholipasen bilden eine Gruppe von Enzymen, die eine oder mehrere Esterbindungen in
Glycerophospholipiden in Zellmembranen spalten können. Es wurden verschiedene Gruppen
von Phospholipasen bei C. albicans entdeckt, eingeteilt in Phospholipasen A, B, C und D.
Heute sind zwei Gene für extrazelluläre Phospholipasen (Gruppe B) entdeckt: CaPLB1
[LEIDICH et al., 1998] und CaPLB2. Die Funktion der Phospholipasen in der Candida-Virulenz
Einleitung 17
ist noch nicht ausreichend untersucht. Es gibt Hinweise, dass Phospholipasen die
Wirtszellpenetration ermöglichen, die Adhäsion an Epithelzellen verbessern, eine Rolle bei
der Invasion von rekonstruierter humaner Mundschleimhaut spielen und mit der Wirts-
Signaltransduktion interferieren [SCHALLER et al., 2005].
1.5 Peptidasen
Im Folgenden werden wichtige Aspekte der Enzymgruppe der Peptidasen dargestellt. Im
Speziellen wird ausführlich auf die sezernierten Aspartylproteinasen (Saps) von C. albicans
eingegangen.
1.5.1 Funktionen von Peptidasen
Peptidasen gewährleisten verschiedene wichtige Funktionen der Zelle bzw. des Organismus.
Um adäquat auf verschiedenste Umweltbedingungen oder rezeptorvermittelte Informationen
reagieren zu können, muss die Zelle in der Lage sein, ihr Proteinmuster zeitnah zu
verändern. Der kontrollierte Proteinabbau ist ebenso wichtig wie deren Biosynthese. Der
Abbau von chemisch geschädigten, fehlerhaft translatierten oder missgefalteten Proteinen
liefert Bausteine für neue Polypeptide und wichtige Metabolite für diverse Stoffwechselwege.
Dadurch werden falsche Syntheseleistungen ausgeglichen und Ablagerungen von Proteinen
verhindert, die zu einer Störung des sensiblen intrazellulären Milieus führen könnten.
Sezernierte Peptidasen bauen extrazelluläre makromolekulare Substrate zu Aminosäuren
ab, die dann dem intrazellulären Aminosäurepool zugeführt werden können. Durch den
spezifischen Abbau von Enzymen kann die Zelle Stoffwechselprozesse regulieren. Viele
Enzyme werden durch limitierte Proteolyse der inaktiven Vorstufen (Zymogene) in die
katalytisch aktive Form überführt.
1.5.2 Klassifikation der Peptidasen
Nach der Nomenklatur der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-
IUBMB) [http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34] werden Enzyme, die hydrolytisch
Peptidbindungen spalten, als Peptidasen bezeichnet und in die Klasse der Hydrolasen EC 3
eingeordnet. Der Unterpunkt EC 3.4 enthält die Gruppe der Peptidasen, die abhängig von
ihrem Angriffspunkt im Substratmolekül in Endo- und Exopeptidasen unterteilt werden
(Abbildung 1.3).
Einleitung 18
Endopeptidasen, kurz auch als Proteinasen bezeichnet, spalten Peptidbindungen im Inneren
von Proteinketten. Nach dem Aufbau des katalytischen Zentrums werden die Serin-,
Threonin-, Cystein-, Aspartat-, Metalloproteinasen und Proteinasen unbekannten Typs
unterschieden.
Die Exopeptidasen werden am C- oder N-terminalen Ende der Peptidketten wirksam und
können durch Unterschiede in ihrem Spaltungsort, Substrat oder Reaktionsprodukt in
Untergruppen (EC 3.4.11.n bis EC 3.4.19.n) eingeteilt werden. Aminopeptidasen greifen an
der N-terminalen Aminosäure an und erhalten ihren Namen nach der bevorzugt
abgespaltenen Aminosäure. Di- und Tripeptidylpeptidasen trennen Peptide, die aus zwei
bzw. drei Aminosäuren bestehen, ab. Am C-Terminus eines Peptids angreifende
Exopeptidasen spalten einzelne Aminosäuren (Carboxypeptidasen) oder Dipeptide
(Peptidyl-Dipeptidasen) ab. Den Abbau von Dipeptiden realisieren spezifische Dipeptidasen.
Omegapeptidasen können Isopeptidbindungen auftrennen sowie terminal substituierte oder
zyklische Aminosäuren abspalten.
Abbildung 1.3: Einteilung der Peptidasen (aus MCDONALD [1986], mit Genehmigung des Verlages) Neben der Klassifikation der IUBMB für Peptidasen existieren noch weitere Einteilungen.
Hervorzuheben ist die von RAWLINGS und BARRETT [1993] angegebene Ordnung.
Entsprechend dem katalytischen Typ werden Peptidasen erst in die zuvor genannten
Einleitung 19
Gruppen eingeteilt und diese nach Verwandtschaft der Primärstruktur des aktiven Zentrums
in Familien unterteilt. Diese Einteilung wird aufgrund signifikanter Ähnlichkeit ihrer
Aminosäuresequenz im aktiven Zentrum oder ihrer cDNA-Sequenz vorgenommen. Die
Ergebnisse sind in der MEROPS-Datenbank [RAWLINGS & BARRETT, 1999 und 2000;
http://www.merops.co.uk/] zusammengetragen. Zeigen Familien eine ähnliche Tertiärstruktur
des katalytischen Zentrums, werden sie in so genannten Clans zusammengefasst. Die
Mitglieder eines Clans haben sich evolutionär so weit auseinander entwickelt, dass eine
Ähnlichkeit nicht mehr über die Primärstruktur, sondern nur noch über die Tertiärstruktur des
katalytischen Zentrums feststellbar ist. Für die Mitglieder eines Clans kann so ein
gemeinsames Vorläuferenzym bestimmt werden [BARRETT et al., 2004].
Die Spaltung einer Peptidbindung geht mit deren Polarisierung durch einen nukleophilen
Angriff auf den Carbonylkohlenstoff einher. Die einzelnen Proteinasegruppen unterscheiden
sich in der Ausbildung der nukleophilen Gruppe. Bei Serin-, Threonin- und
Cysteinproteinasen wirkt direkt der Hydroxylrest bzw. die Sulfhydrylgruppe der Aminosäure
im aktiven Zentrum als Nukleophil, während Aspartyl- und Metalloproteinasen über ein
aktiviertes Wassermolekül funktionieren, das im deprotonierten Zustand die Peptidbindung
spalten kann. Die letztgenannten Proteinasen gehen keine kovalente Bindung mit dem
Substrat ein.
1.5.3 Aminopeptidasen
Aminopeptidasen kommen sowohl in tierischen als auch bei pflanzlichen Organismen vor. In
zahlreichen humanen Geweben sind sie nachgewiesen worden, exprimiert auf der
Zelloberfläche, innerhalb von Zellorganellen, im Zytosol und, als sezernierte Form, in
Körperflüssigkeiten [BARRETT et al., 2004]. Die meisten Aminopeptidasen gehören nach
ihrem katalytischen Typ zu den Metallopeptidasen [TAYLOR, 1993].
1.5.4 Metallopeptidasen
Die Metallopeptidasen tragen in ihrem katalytischen Zentrum ein zweifach positiv geladenes
Metallion. Bei der Mehrheit der Enzyme handelt es sich um ein Zinkion oder seltener um
zwei Zinkionen [TAYLOR, 1993]. Kobalt- oder Mangan-enthaltende Enzyme benötigen immer
zwei dieser Ionen im katalytischen Zentrum [BARRETT et al., 2004]. Die positive Ladung der
Metallionen ermöglicht die Aktivierung eines Wassermoleküls, und dieses greift die zu
hydrolysierende Peptidbindung an. Eine weitere Unterteilung der Metallopeptidasen erfolgt
nach den an der Bindung des Metallions beteiligten Aminosäureresten. Die Funktion als
Einleitung 20
Metallligand können die Aminosäuren Histidin, Glutamat, Aspartat und Lysin übernehmen
[BARRETT et al., 2004].
Die Bindung des Zinkions der Monozinkenzyme im katalytischen Zentrum geschieht über
drei Aminosäuren. Die Zink-Bindungsdomäne enthält das typische Motiv
Histidin-Glutamat-X-X-Histidin (HEXXH), wobei die beiden mit X markierten Positionen durch
ungeladene Aminosäuren besetzt werden. Die beiden Histidin-Reste der Zinkbindungs-
domäne sowie ein weiter C-terminal gelegener Glutaminsäure-Rest fungieren als
Bindungsliganden und positionieren das Zinkion im Proteinmolekül. Metallopeptidasen mit
dieser Struktur sind zum Clan MA zusammengefasst. Insgesamt wurden acht Clans
innerhalb der Gruppe der Metallopeptidasen gefunden. Das zuerst entdeckte Enzym des
Clans MA war das Thermolysin vom Bakterium Bacillus thermoproteolyticus. Die
Tertiärstruktur konnte von COLMAN [1972] aufgeklärt werden. Seitdem gilt das Enzym als
Prototyp der MA-Enzyme.
Bei einer anderen wichtigen Gruppe des Clans MA der Metallopeptidasen, den Matrix-
Metalloproteinasen (MMPs) [NAGASE & WOESSNER, 1999], konnte durch Röntgenstruktur-
analyse gezeigt werden, dass der Glutamatrest im HEXXH-Motiv vermutlich als Base wirkt,
die bei der Aktivierung des Wassermoleküls ein Proton bindet.
Die Zink-Bindungsdomänen anderer Clans sind oft nur geringfügig gegenüber der von
Clan MA verändert. Clan MB trägt zum Beispiel auch das HEXXH-Motiv und unterscheidet
sich lediglich im dritten Liganden. Clan ME zeigt das leicht modifizierte Zink-Bindungsmotiv
HXXEH-Motiv. Hier ist aber wie bei MA das Glutamat der dritte Ligand.
1.5.5 Sezernierte Aspartylproteinasen (Saps) von Candida albicans
Eine proteolytische Aktivität wurde erstmals 1965 entdeckt, die es dem Pilz ermöglicht,
Protein abzubauen, wenn es die einzige Stickstoffquelle darstellt. Isoliert und charakterisiert
wurde sie erstmals 1968 von REMOLD und Mitarbeitern. Die Sap-Proteine nehmen eine
Schlüsselstellung in der Virulenz des Keimes ein [HUBE & NAGLIK, 2001].
Gruppe der sezernierten Aspartylproteinasen
Es konnten die in Abbildung 1.4 dargestellten zehn SAP-Gene identifiziert werden, deren
„open reading frames“ (ORF) eine Länge von 1173 bis 1764 bp aufweisen und auf fünf
verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind [NAGLIK et al., 2003; HUBE & NAGLIK, 2001].
Die Proteine Sap1 bis Sap3 tragen bis zu 67 % identische, die Untergruppe Sap4 bis Sap6
bis zu 89 % identische Aminosäuresequenzen, während Sap7 nur zu 20 bis 27 %
Übereinstimmung zu den anderen Sap-Aminosäuresequenzen aufweist [HUBE & NAGLIK,
2001].
Einleitung 21
Abbildung 1.4: Dendrogramm der Sap-Familie (aus STEHR et al. [2000], mit Genehmigung des Verlages) Alle zehn Sap-Proteine werden als Präproenzyme synthetisiert und über die zellulären
Membransysteme zur Sekretion gebracht.
Die zehn Saps zeigen zwei hochkonservierte Abschnitte mit Aspartylproteinase-Funktion, die
ein pepsinähnliches aktives Zentrum bilden, und eine dritte konservierte Region am
C-Terminus des Proteins. Am umfangreichsten wurde Sap2 charakterisiert. Von diesem
Enzym ist die dreidimensionale Struktur bereits aufgeklärt [ABAD-ZAPATERO et al., 1996].
Eigenschaften der Sap-Proteine
Sap-Proteine haben Molekülmassen von 35 bis 48 kDa. Der pH-Bereich der proteolytischen
Aktivität reicht von 2 bis 7, wobei Sap1 bis Sap3 die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von
3,5 und Sap4 bis Sap6 bei 5,0 aufweisen [SMOLENSKI et al., 1997; BORG-VON ZEPELIN et al.,
1998]. Sap2 und die Gruppe Sap4 bis Sap6 sind stabil und aktiv auch bei neutralem pH-Wert
[WAGNER et al., 1995; SCHALLER et al., 2005]. Die Wirksamkeit der Saps über diesen breiten
pH-Bereich ermöglicht der Candida-Zelle eine proteolytische Aktivität bei der Besiedelung
der vaginalen Schleimhaut mit ihrem sauren Milieu und der Mundhöhle bei neutralem pH-
Wert. Sap2 denaturiert bei pH-Werten oberhalb von etwa 8,4 irreversibel [WAGNER et al.,
1995]. Die Enzymaktivität der Saps kann in vitro sehr effizient mit dem Aspartylproteinase-
inhibitor Pepstatin A, einem Hexapeptid von Streptomyces, inhibiert werden [PICHOVA et al.,
2001].
Einleitung 22
Substrate der Saps - Wechselwirkungen mit dem Wirtsorganismus
Das Substratspektrum von Sap2 wurde umfangreich untersucht. Sap2 verfügt über ein
breites Substratspektrum, das viele humane Proteine beinhaltet. Hierzu zählen Bestandteile
der extrazellulären Matrix wie Kollagen, Keratin, Fibronektin, Laminin und Vimentin [HUBE,
1996; RAY & PAYNE, 1990]. Durch den Abbau der äußeren Schutzschichten des Körpers wird
es Candida albicans möglich, in tiefer gelegene Schichten vorzudringen, eventuell in das
Gefäßsystem einzubrechen und eine disseminierte Infektion zu verursachen. Der Abbau der
extrazellulären Bestandteile liefert nicht nur wichtige Nährstoffe für Candida albicans,
sondern ermöglicht auch die verbesserte Anheftung der Zellen an körpereigene Strukturen.
Selbst Zahnhartsubstanz ist von Sap abbaubar. KAMINISHI und Mitarbeiter zeigten 1986 den
Abbau von demineralisiertem Dentin im sauren Milieu durch ein sezerniertes Enzym, das
nach langer Inkubation von Candida mit Dentinpulver aus dem Kulturüberstand gewonnen
wurde [KAMINISHI et al., 1995]. Das beschriebene Enzym weist viele Merkmale einer
sezernierten Aspartylproteinase auf, was eine Gruppenzugehörigkeit nahe legt. Viele
körpereigene Abwehrfaktoren werden hydrolysiert wie Muzin, sekretorisches
Immunglobulin A und andere Immunglobuline, Laktoferrin des Speichels, Laktoperoxidase,
Cathepsin D (ein intrazelluläres lysosomales Enzym der Leukozyten), Complement-Faktoren
[KAMINISHI et al., 1995], der Proteinaseinhibitor α2-Makroglobulin des Plasmas und der
Cysteinproteinaseinhibitor Cystatin A der Epidermis. Sap2 sorgt auch für eine Verstärkung
der Entzündungsreaktion durch proteolytische Spaltung der Präcursoren von Interleukin-1β
und Hageman-Faktor, der als Serinproteinase des Kallikrein-Kinin-Systems fungiert. Durch
die Aktivierung der Faktoren X, XII (Hageman-Faktor) und Prothrombin interagiert Sap2 auch
mit der Gerinnungskaskade des Blutes [NAGLIK et al., 2003].
Saps sorgen vermutlich auch für ein Anfachen der Entzündungsreaktion in der Schleimhaut.
In einem In-vitro-Modell der vaginalen Candidose mit rekonstruiertem humanem
Vaginaepithel konnte ein Anstieg von proinflammatorischen Cytokinen nachgewiesen
werden [SCHALLER et al., 2005].
Diese Ergebnisse deuten auf eine eminente Bedeutung von Sap2 bei der Manipulation der
lokalen und systemischen Wirtsabwehr durch Candida albicans hin. Über das Substrat-
spektrum der anderen Sap-Proteine ist noch nicht viel bekannt. Es wird angenommen, dass
die anderen Mitglieder der Sap-Familie ein ähnliches Substratspektrum bei jeweils
bestimmten Umweltfaktoren hydrolysieren. Damit wird es Candida albicans ermöglicht, die
verschiedenen Körperregionen zu kolonisieren. Allerdings werden auch Unterschiede im
Substratspektrum vermutet, da die Sap-Familie nicht durchweg homogen ist. So sind Sap9
und Sap10 durch den GPI-Anker membrangebunden und haben deshalb eine andere
Funktion inne als die restlichen Sap-Proteine [NAGLIK et al., 2003].
Einleitung 23
Katalytischer Mechanismus der Saps
Den Kern des aktiven Zentrums bilden zwei Aspartatreste, die für die Spaltung der
Peptidbindung wichtig sind [ABAD-ZAPATERO et al., 1996]. Die Spaltung erfolgt durch den
nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls. Das deprotonierte Aspartat polarisiert das
Wassermolekül, während der andere Aspartatrest eine Wasserstoffbrücke zur Carbonyl-
gruppe der zu spaltenden Peptidbindung ausbildet.
Dadurch wird die C=O-Bindung des Peptids polarisiert und der nukleophile Angriff am
Kohlenstoff erleichtert. Im tetraedrischen Übergangszustand ist das Wassermolekül
intermediär an die Amidgruppe gebunden [BÖHM et al., 1996].
Expression in Abhängigkeit der Umgebung
In vitro wird SAP2 am häufigsten exprimiert [HUBE et al., 1994; SCHALLER et al., 2005]. Die
Expression von SAP9 und SAP10 scheint unabhängig von Umgebungsfaktoren zu sein.
Sap9 und Sap10 sind konstitutive Enzyme aller Wachstumsformen [SCHALLER et al. 2005].
Die Sekretion von Sap1 und Sap3 ist nur bei der opaken Form des WO-1-Stammes
nachweisbar. Einige Stämme exprimieren allerdings auch Sap3 in der „white“-Form
(Abbildung 1.5). Die Sap4- bis Sap6-Unterfamilie ist assoziiert mit der Hyphenform und
neutralem pH-Wert [HUBE et al., 1994]. Das zeigten auch Studien mit polyklonalen
Antikörpern. Während Sap4 bis Sap6 nur auf der Oberfläche von hyphalen Zellen zu finden
waren, konnten Sap1 bis Sap3 auf beiden morphologischen Formen nachgewiesen werden
[FELK et al., 2002; SCHALLER et al., 1998].
Abbildung 1.5: Expression der SAP-Gene der einzelnen phänotypischen Formen in vitro (aus HUBE et al. [1994], mit Genehmigung des Verlages) Unter der „yeast“-Form ist die „white“-Form zu verstehen.
Virulenzfaktor Sap
An rekonstruierter menschlicher Mukosa (reconstituted humane epithelium, RHE) wurde in
vitro gezeigt, dass die Anheftung und Epithelzerstörung durch Candida albicans mit
Einleitung 24
Pepstatin A gehemmt werden kann [RAY & PAYNE, 1988; SCHALLER et al., 2000]. Das
pathogene Potential der Sap-Enzyme wurde mittels Sap-defizitären Stämmen im Ratten-
Vaginal-Candidose-Modell untersucht. Defizitäre Stämme, die ein oder mehrere Saps nicht
bilden können, waren dennoch virulent. Es konnte nachgewiesen werden, dass stattdessen
alternative SAP-Gene oder andere Faktoren stärker exprimiert werden [SCHALLER et al.,
2005]. Sehr geringe Virulenz zeigte eine Sap2-defizitäre Singlemutante, geringere Sap1- und
Sap3-Singlemutanten und unveränderte Virulenz eine Sap4, 5, 6-Dreifach-Mutante [DE
BERNARDIS et al., 1999]. Am Maus-Modell wurde auch die Virulenz der Sap-Mutanten für die
disseminierte Candida-Infektion getestet. Sap1, 2, 3-Dreifach-Mutanten zeigten kaum
abgesenkte Virulenz, während Sap4, 5, 6-Dreifach-Mutanten deutlich herabgesetzt pathogen
waren [SANGLARD et al., 1997]. Diese Daten sprechen für die hohe Bedeutung von Sap4,
Sap5 und Sap6 bei invasiver Candidose.
Die Sap-Aktivität frischer Candida-Isolate oraler Candidose-Patienten war signifikant höher
als die der Isolate aus gesunden Mundhöhlen [OLLERT et al., 1995]. In vivo werden meist
hohe Titer von Sap2-IgG im Serum und Sap2-IgA in der Schleimhaut von Candidose-
Patienten nachgewiesen, wobei bei etwa 20 % der Patienten mit systemischer Candidiasis
nur geringe Antikörpertiter gemessen werden können, was vermutlich mit einer allgemeinen
Abwehrschwäche in Verbindung steht [NAGLIK et al., 2003]. Eine schützende Rolle von
Antikörpern gegen Sap2 wurde für das Vaginitis-Ratten-Modell festgestellt [DE BERNARDIS et
al., 1997].
Sezernierte Aspartylproteinasen anderer Candida-Arten
SAP-Aktivität konnte auch bei den Candida-Spezies Candida dubliniensis, Candida tropicalis
und Candida parapsilosis nachgewiesen werden.
1.6 Kollagen-Struktur
Beim Menschen wurden bisher 25 verschiedene Kollagen-Gene und 19 verschiedene
Kollagentypen gefunden [WATANABE, 2004]. Kollagen hat einen Anteil von 30 % am
Gesamtprotein des menschlichen Körpers. Kollagenmoleküle bestehen immer aus drei
Polypeptidketten, die identisch oder verschieden sein können und stabförmige (tripelhelikale)
und globuläre Abschnitte bilden. Drei linksgängige helikale Einzelketten bilden eine
rechtsgängige Superhelix mit einem Molekulargewicht von etwa 300 kDa. Diese Formation
basiert auf der Aminosäuresequenz (Gly-X-Y)n der Einzelstränge [GALLOP et al., 1972]. Jede
dritte Aminosäure liegt im Zentrum der Helix und muss aus sterischen Gründen Glycin sein,
da hier kein Raum für eine Seitenkette vorhanden ist [VAN-DER-REST & GARRONE, 1991]. An
Einleitung 25
X-Position steht meist Prolin, an Y-Position Hydroxyprolin oder seltener Hydroxylysin. Die
drei Einzelketten der Superhelix werden durch Wasserstoffbrückenbindungen und
hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten. An beiden Enden der Tripelhelix
befinden sich nichttripelhelikale Telopeptide bestehend aus etwa 20 Aminosäuren.
Typ-I-Kollagen besteht aus zwei α1(I)-Ketten und einer α2(I)-Kette. Die römische Zahl in
Klammern gibt die Zugehörigkeit zum Kollagen-Typ an. Typ-II- und Typ-III-Kollagen sind
Homotrimere der α1(II)- bzw. α1(III)-Kette. Typ-I- bis Typ-III-Kollagen zeigen quergestreifte
Mikrofibrillen im transmissionselektronenmikroskopischen Bild und gehören deshalb in die
Gruppe der fibrillären Kollagene. Diese Kollagene sind mechanisch auf Zugkräfte sehr
belastbar, da bei Zug die Einzelketten gegeneinander gepresst werden. Typ-IV-Kollagen
stellt ein flächiges Netzwerk dar. Es zählt zu den nichtfibrillären Kollagenen und besteht aus
den Einzelketten α1(IV) bis α6(IV). Die tripelhelikale Domäne ist hier durch zahlreiche
nichthelikale Domänen unterbrochen, die sich zu Tetrameren anordnen und das
Typ-IV-Kollagenmolekül um ein vielfaches flexibler werden lassen. Die globulären Domänen
des Typ-IV-Kollagens interagieren miteinander und können Kollagenplatten bilden [VAN-DER-
REST & GARRONE, 1991]. Typ-V-Kollagen wird aus den Einzelketten α1(V) bis α4(V)
zusammengesetzt und bildet mit Typ-I-Kollagen Fibrillen. Bei fibrillären Kollagenen sind
tripelhelikale Moleküle im Bereich der Telopeptide kovalent verbunden und bilden so
Mikrofibrillen. Mehrere Mikrofibrillen lagern sich wiederum zu Fibrillen zusammen. Die
Kollagen-Typen sind meist gewebespezifisch.
1.7 Kollagenolyse
Kollagenabbau findet unter verschiedenen physiologischen und pathologischen
Bedingungen statt wie bei fetaler Knochenentwicklung, Embryonalentwicklung, Invasion
maligner Tumoren, intestinalen Ulzerationen, Wundheilung, rheumatoider Arthritis, Invasion
pathogener Mikroorganismen und bei chronisch entzündlichen Prozessen [WATANABE,
2004]. Aufgrund der äußerst festen Struktur der Kollagene können diese nur von wenigen
Proteinasen gespalten werden. Auf der anderen Seite gibt es eine Vielzahl von Proteinasen,
die globuläre Kollagenstrukturen oder denaturierte Kollagenmoleküle spalten können und so
auch zum Kollagenabbau beitragen. Wegen der Vielfalt der Kollagenstrukturen ist es äußerst
schwierig, Proteinasen von echten Kollagenasen zu differenzieren [HARRINGTON, 1996].
Echte Kollagenasen sind definiert als Enzyme, die tripelhelikale Domänen von Kollagen bei
physiologischem pH-Wert und Körpertemperatur spalten können [HARPER, 1980;
HARRINGTON, 1996]. Sie kommen in Mikroorganismen und auch in humanen Geweben vor.
Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) stellen eine Gruppe von derzeit 26 Enzymen dar
[CHAUSSAIN-MILLER et al., 2006], die für den Kollagenabbau im Körper sorgen. Sie wurden
Einleitung 26
auch bei anderen Organismen nachgewiesen. Kollagenolytische Proteinasen von
Mikroorganismen sind oft nur unzureichend molekularbiologisch analysiert, was
hauptsächlich auf Schwierigkeiten in der Handhabung der Enzyme zurückzuführen ist
[WATANABE, 2004]. Kollagenolytische Enzyme sind meist Metalloproteinasen. Sehr gut
wurden die enzymatischen Eigenschaften der Kollagenasen ColH und ColG von Clostridium
histolyticum untersucht. Typisch für kollagenolytische Enzyme ist eine Kollagenbindungs-
domäne. Während MMPs Kollagen nur eines bestimmten Typs an einer spezifischen Stelle
binden können, kann von mikrobiellen Kollagenasen oft eine Vielzahl von Kollagenen an
variablen Stellen gespalten werden. Die Hydrolyse durch Kollagenasen findet meist an der
Peptidbindung zwischen der Aminosäure an X-Position und der darauf folgenden
Gly-Pro-Sequenz der Kollagen-Helix statt [VAN-WART & STEINBRINK, 1981].
Aufwendig gestaltet sich die Detektion von Kollagenasen. Als Testsubstrate zum
Kollagenasenachweis werden verschiedene Oligopeptide wie 4-Phenylazobenzyloxy-
carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (PZ-PLGPR) oder 2-Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala
(FALGPA) eingesetzt. Aber nicht alle kollagenolytischen Enzyme spalten diese
synthetischen Peptide. Außerdem gibt es Enzyme, die nur die Testsubstrate, aber kein
natives Kollagen spalten können. Diese Enzyme sind dennoch wichtig für die
Kollagendegradation. Sie spalten Kollagenfragmente und werden als Thimet-
Oligopeptidasen oder Metalloendopeptidasen (EC 3.4.24.15) bezeichnet [BARRETT &
BROWN, 1990].
1.8 Zusammensetzung von Dentin
Dentin ähnelt in seiner Zusammensetzung dem Wurzelzement und Knochen [KLIMM, 2003].
Es setzt sich zu 50 bis 70 % aus einer anorganischen Phase, zu 10 bis 20 % aus Wasser
und zu 20 bis 30 % aus einer organischen Matrix zusammen. Unter den Mineralien
überwiegen Kalzium und Phosphat, die in Form von Hydroxylapatitkristallen Ca10(PO4)6(OH)2
vorliegen. Im Dentin wurden viele Spurenelemente nachgewiesen: z.B. Fluor, Natrium,
Kalium, Barium, Eisen, Kupfer, Zinn und Zink [DERISE et al., 1974]. Die organische Matrix
wird mit 91 bis 92 % hauptsächlich von Kollagen gebildet, wobei Typ-I-Kollagen überwiegt
und weniger als 3 % Typ-V-Kollagen hinzukommt [BUTLER & RITCHI, 1995]. Kollagen bildet
ein dichtes Netzwerk, in das Hydroxylapatitkristalle eingebettet sind. Posttranslationell
werden im Kollagen einige Aminosäuren modifiziert, die dann zur Ausbildung von
Quervernetzungen (cross-links) dienen können. Hydroxylysylpyridinolin wird in vielen
Geweben gefunden, während Lysylpyridinolin spezifisch für Knochen und Dentin ist [AÇIL et
al., 2002]. Kontrovers wird die Zunahme der Quervernetzungen mit dem Alter diskutiert
[MARTIN-DE LAS HERAS et al., 1999; MIGUEZ et al., 2004].
Einleitung 27
Das noch nicht mineralisierte Prädentin ähnelt in der Zusammensetzung stark dem Osteoid,
das von Osteoblasten sezerniert wird [BUTLER & RITCHI, 1995]. Die nichtkollagene Grund-
substanz beinhaltet Proteoglykane, Phosphoproteine, Gla-Proteine (carboxyglutaminsäure-
haltige Proteine), Matrix-Gla-Proteine, Osteonektin, Glykoproteine, Plasmaproteine, Lipide,
Zitronen- und Milchsäure [LINDE, 1989; KLIMM, 2003]. Nur sehr wenige Dentinmatrixproteine
sind dentinspezifisch und können nicht im Knochen nachgewiesen werden [BUTLER et al.,
2003].
1.9 Candida albicans und Dentinkariogenese
Eine Beteiligung von C. albicans an der Entstehung der Karies wird schon viele Jahrzehnte
diskutiert. Candida albicans wurde regelmäßig in kariösen Dentinläsionen nachgewiesen
[ROSENSTENGEL et al., 1978; JACOB et al., 1998]. Insbesondere bei frühkindlicher Karies
zeigte sich eine hohe Isolierungshäufigkeit [WETZEL et al., 1993; DE CARVALHO et al., 2006].
Sprosspilzzellen und hyphale Filamente besiedeln die demineralisierte Dentinoberfläche und
Dentintubuli. Das konnte in vivo [JACOB et al., 1998] und in vitro [KLINKE & KLIMM, 2003]
gezeigt werden. Mehrere Publikationen konnten eine Korrelation zwischen dem Ausmaß des
Kariesbefalls und der Quantität der Besiedelung mit C. albicans nachweisen [GÁBRIS et al.,
1999; MOALIC et al., 2001]. Die potentielle Rolle der Candida albicans im Kariesgeschehen
als Resultat eines mikroökologischen Ungleichgewichtes in der Plaque (Dysbiose) bedarf
noch der endgültigen Klärung [KLIMM, 1999]. Ein direkter Nachweis der Beteiligung von
Candida albicans an der Dentinkariogenese ist bisher nicht erbracht.
Säurebildung durch Candida albicans Für die Entstehung von Dentinläsionen ist zunächst die Demineralisation des Dentins
erforderlich, die zur Exposition des Dentinkollagengeflechts führt und hauptsächlich durch
mikrobielle Säurefreisetzung geschieht. C. albicans kann der Gruppe der säurebildenden
Plaquemikroorganismen zugeordnet werden. Die Aufnahme von Kohlenhydraten ist an die
Freisetzung von Protonen gekoppelt. [MONK et al., 1993; VAN DEN BROEK et al., 1997].
C. albicans sezerniert des Weiteren zahlreiche organische Säuren. Bei Kultur in
kohlenhydratreichem Medium bildet C. albicans vor allem Acetat, aber auch Formiat, Pyruvat
und Propionat [SAMARANAYAKE, 1983 und 1986]. Wird die gebildete Säuremenge pro
Trockengewicht zum Vergleich herangezogen, bildet C. albicans eine vergleichbar große
Säuremenge wie Laktobazillen [KLINKE et al., 2006].
Während die Demineralisation von Zahnhartsubstanz schon recht ausführlich untersucht
wurde, lassen die Erkenntnisse über den Abbau der organischen Bestandteile noch viele
Fragen offen. Bisher ist nicht geklärt, welche Enzyme die Zerstörung der organischen
Einleitung 28
Dentinmatrix verursachen. Diskutiert werden mikrobielle Enzyme und auch körpereigene
Matrix-Metalloproteinasen [TJADERHANE et al., 1998; CHAUSSAIN-MILLER et al., 2006].
Candida albicans in der dentalen Plaque
Arbeiten über die Zusammensetzung der dentalen Plaque zeigen ein Vorkommen von
C. albicans gemeinsam mit anderen Mikroorganismen wie Streptokokken und Laktobazillen.
Plaqueproben von Kindern mit aktiver Karies wiesen zu 71,8 % Candida spp. auf und
kariöses Dentin solcher Kinder enthielt in 81,5 % bis 96,8 % der Fälle Candida spp.
[SZIEGOLEIT et al., 1999; SCHULZ-WEIDNER et al., 2005]. Die Rolle von C. albicans in der
dentalen Plaque ist noch unzureichend geklärt. In vitro konnte gezeigt werden, dass sich
C. albicans nur bei Glukoseüberschuss in die Gemeinschaft der Mundflora integrieren kann
[BASSON, 2000]. Die verschiedenen Mikroorganismen der Plaque kooperieren miteinander
und sind von einer Matrix aus extrazellulären Polysacchariden umgeben [DOUGLAS, 2003].
Im Biofilm existiert ein primitives Zirkulationssystem. Die Matrix schützt die Mikroorganismen
vor Faktoren der unspezifischen und spezifischen Immunabwehr und auch vor Pharmaka
wie Antibiotika. In der Plaque herrscht ein eigenes Mikroklima je nach Zusammensetzung
und Reifezustand der Plaque. Es existieren zahlreiche Arbeiten zur Biofilmbildung von
C. albicans in vitro. Die Untersuchung der Biofilmbildung auf künstlichen Materialien wie
Kathetern aus Kunststoff ergab, dass C. albicans als alleinige Spezies und auch mit anderen
Bakterien in der Lage ist, einen komplexen Biofilm zu formieren [DOUGLAS, 2003].
Milieu der Plaque und in kariösen Dentinläsionen Für das Verständnis der Vorgänge bei der Dentinkariogenese ist ein Blick auf die
Milieuverhältnisse in der Plaque und im kariösen Dentin hilfreich. In der Plaque auf der
Zahnoberfläche herrscht vorwiegend ein neutraler pH-Wert [STEPHAN, 1944]. Nach der
Zufuhr von kariogener Nahrung sinkt dieser für etwa eine halbe Stunde in den sauren
Bereich ab [STEPHAN, 1944; ENGLANDER et al., 1956]. Hauptsächlich durch die im Speichel
enthaltenen Puffersysteme (Hydrogenkarbonatpuffersystem, Phosphatpuffersystem, Protein-
puffersystem) kommt es zu einem Ausgleich des pH-Abfalls. Einfluss auf den pH-Verlauf
nimmt die Struktur der Plaque, die im reifen Zustand als Biofilm organisiert ist. In welcher
Weise die Biofilmmatrix die Säureeinwirkung auf die Zahnoberfläche beeinflusst, wird
kontrovers diskutiert. Mehrere aktuelle Arbeiten zeigen eine verzögerte Moleküldiffusion
durch in vitro gezüchtete dentale Plaque [THURNHEER et al., 2003; MARSH, 2003]. Die
verzögerte Diffusion wird auf die Interaktion der mikrobiellen Säuren mit extrazellulärer
Matrix zurückgeführt. Dies halten die Autoren für eine Grundbedingung der Entstehung von
kariösen Läsionen. Diese Ergebnisse widersprechen früheren Studien, die eine nahezu freie
Einleitung 29
Diffusion von organischen Säuren durch junge Plaque ermittelten [DIBDIN, 1981]. Die
Aufrechterhaltung des sauren pH-Werts in der Plaque wird auch durch das beachtliche
Puffervermögen der Plaque im pH-Bereich von 4,0 bis 5,5 realisiert [SHELLIS & DIBDIN, 1988].
Es ist bekannt, dass die Stärke des pH-Abfalls von der mikrobiellen und biochemischen
Zusammensetzung der Plaque abhängt. Patienten mit aktiver Karies zeigen einen stärkeren
und längeren pH-Abfall in der Plaque als kariesresistente Patienten [STEPHAN, 1944;
MARGOLIS et al., 1985].
Ein anderes Mikroklima herrscht in kariösen Dentinläsionen. Die pH-Kurve der Plaque in
Kavitäten ist wegen der schlechten Zugänglichkeit nicht direkt untersucht worden. Allerdings
gibt es Publikationen zum pH-Wert in kariösem Dentin. Der pH-Wert aktiver kariöser
Dentinläsionen liegt im Vergleich zu dem von chronifizierten Läsionen signifikant niedriger
[HOJO et al., 1994]. In Dentinkavitäten herrscht in der Tiefe des kariösen Dentins ein deutlich
niedrigerer pH-Wert als an der Oberfläche der Dentinläsion [DIRKSEN et al., 1962; DIRKSEN et
al., 1963]. Besonders niedrige pH-Werte wurden in Läsionen mit kleiner Eröffnung und dicker
Schicht kariösen Dentins gefunden. Der Speichel kann so nicht seine neutralisierende
Wirkung entfalten. Auch viele Stunden nach der Nahrungsaufnahme konnte ein niedriger
pH-Wert in der Tiefe der kariösen Dentinläsion gemessen werden.
Im Laufe weniger Tage organisiert sich die Plaque zu einem komplexen Biofilm, der einen
tieferen pH-Abfall und auch ein längeres Vorherrschen eines pH-Wertes unter der für das
Mineralisationsgleichgewicht kritischen Marke von 5,5 zu ermöglichen scheint. Auf der von
Plaque bedeckten Zahnhartsubstanz kommt es zu einem unregelmäßigen Wechsel von
sauren und neutralen Milieuverhältnissen, während in der Tiefe aktiver kariöser Dentin-
läsionen vorwiegend ein saurer pH-Wert vorherrscht. Bisher ist nicht geklärt, unter welchen
Bedingungen die enzymatische Degradation von exponiertem Dentinkollagen abläuft.
Neben sezernierten Aspartylproteinasen, die nur im sauren Milieu Aktivität zeigen, wurde
einer neutralen 95-kDa-Metallopeptidase aus Zellaufschluss ein erhebliches Virulenz-
potential zugeschrieben [RODIER et al., 1999]. Die Fähigkeit von C. albicans zur Hydrolyse
von Kollagen und der nachgewiesene Zusammenhang zwischen dem Kariesbefall und der
Besiedelung der Mundhöhle mit C. albicans [WETZEL et al., 1993; MOALIC et al., 2001] regte
die im Folgenden dargestellte Isolierung, Identifizierung und funktionelle Charakterisierung
eines peptidolytischen Enzyms von C. albicans an.
2. Zielsetzung der Arbeit
Die bisher verfügbare Literatur zeigt, dass Peptidasen von Candida albicans erheblich zur
Virulenz des Pilzes beitragen. Einige epidemiologische Studien wiesen eine Korrelation
zwischen Ausmaß des Kariesbefalls und der Quantität der Besiedelung mit Candida albicans
nach. Der Beitrag von Candida albicans an der Kariogenese wird vorwiegend in der
Fähigkeit zur Säurebildung gesehen, während eine Beteiligung an der Dentinhydrolyse
bisher unbeleuchtet blieb.
Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Isolierung, Identifizierung und funktionelle
Charakterisierung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans.
Um einen hohen Reinheitsgrad des Proteins zu erreichen, war die Entwicklung eines
speziellen Isolierungsverfahrens erforderlich. Die vermutete Lokalisation der Peptidase in der
Zellwand regte ein Herauslösen des Enzyms aus dieser an, um ein gutes Verhältnis von
Zielprotein zu Fremdprotein für die anschließende Chromatographie zu erhalten. Ziel der
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie war die Gewinnung eines hochgradig gereinigten
Enzyms, das anschließend für eine molekulare und funktionelle Identifizierung eingesetzt
werden konnte. Eine Funktion der Peptidase an der Dentinkariogenese sollte durch Versuche
zur kollagenolytischen Wirksamkeit geklärt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war weiterhin die Untersuchung von aufgeschlossenen Zellen
und Kulturüberstand aus Flüssigkultur von Candida albicans auf kollagen- und
dentinhydrolytische Aktivität. Die schon umfangreich beschriebene sezernierte Aspartyl-
proteinase 2 sollte als Referenz eingesetzt werden.
3. Material und Methoden Nachfolgend wird die Isolierung und Charakterisierung eines peptidolytischen Enzyms aus
der Zellwand von Candida albicans beschrieben. Der Begriff Peptidase soll als Synonym für
das zu isolierende peptidolytische Enzym verstanden werden.
3.1 Geräte und Materialien
In diesem Abschnitt sind tabellarisch alle eingesetzten Geräte, Materialien, Chemikalien,
Bestandteile der Kulturmedien, Enzyme, Antikörper und Candida-albicans-Stämme aufgeführt.
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Alle verwendeten Geräte und Materialen werden in Tabelle 3.1 aufgeführt.
Tabelle 3.1: Geräte und Verbrauchsmaterialien
Gerät / Material Typ Hersteller, Firmensitz Software Autoklav Varioklav 400 H+P Labortechnik GmbH,
München, Deutschland
Chromatographiesäulen HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
Mono Q HR 5/5 Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
PD-10 Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
Superdex 200 10/300 GL
Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
RESOURCE TM ETH Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
LC Packings 75 µm PepMap C18
Dionex, Idstein, Deutschland
Cryobank™ 291704 MAST Diagnostica GmbH, Reinfeld, Deutschland
Dialyseschlauch 12-14.000 Da Medicell International Ltd London, Großbritannien
Elektrophoresekammer Electrophorese Einheit SE 600
Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA
Feinwaagen MC1 Analytic AC 210 S
Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
MC1 Laboratory LC 2200 S
Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
Fluoreszenz-Plattenreader
Fluostar Optima BMG Labtech Offenburg, Deutschland
Fluostar Optima Version 1.32
Glasperlen 11079105 (d = 0,5 mm)
BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA
Material und Methoden 32
Gerät / Material Typ Hersteller, Firmensitz Software Heizmagnetrührer IKAMAG® RH Janke & Kunkel GmbH & Co.
KG - IKA-Labortechnik Staufen, Deutschland
RH basic 2 IKAMAG®
IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland
HPLC-System ÄKTA explorer Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden
Unicorn Version 3.10
Inkubationsbad F25-ED Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Deutschland
Inkubator für Flüssigkulturen
Thermoshake THL 500
C. Gerhardt GmbH & Co. KG, Königswinter, Deutschland
Inkubator für Reaktionsgefäße
Thermomixer comfort
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Küvetten 1,5 ml Plastbrand® Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
Massenspektrometer Q-Tof Premier™ Quadrupole Orthogonal Acceleration Time-Of-Flight Tandem-Massenspektrometer
Waters Corporation, Manchester, UK
Mikroskop Axioskop 20 Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland
Mikroplatte 96-Well, Nr. 655160 Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich
Mikroröhrchen 2 ml, Nr. 72.693 SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland
Mischer/Vortexer MS 2 Minishaker IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland
Reax 2000 Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kelheim, Deutschland
Multipipette 25-200 µl Bibby Dunn Labortechnik GmbH, Asbach, Deutschland
PC-Software Matrix Science, London, Großbritannien
Mascot-Software
Microsoft® Corporation Redmond, WA USA
Windows® XP Professional
Microsoft® Corporation Redmond, WA, USA
Microsoft® Office 2003
Systat Software, Inc. Point Richmond, CA, USA
SigmaPlot 9.0
pH-Messelektrode CTW 711 Thermo Electron, Auchtermuchty, Großbritannien
pH-Meter Portamess® 910 Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland
Pipetten Eppendorf Reference Variable Volumen
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Material und Methoden 33
Gerät / Material Typ Hersteller, Firmensitz Software Pipetman P2, P10,
P20, P100, P200, P1000, P5000, P10ml
Gilson, Middleton, WI, USA
Platteninkubator Wellwarm 1 Denley Instruments Ltd, Billingshurst, West Sussex, UK
Polypropylen-Röhrchen 15 ml - 188 261 50 ml - 210 270
Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich
Präzisionsküvetten SUPRASIL® (Quarzglas)
Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim, Deutschland
Präzisionstrennmaschine Accutom 50 Struers A/S, Ballerup, Dänemark Reaktionsgefäße 1,5 ml, 2 ml Eppendorf AG, Hamburg,
Deutschland
Scanner PowerLook 1000 UMAX Data Systems, Inc. Dallas, TX, USA
MagicScan32, Version V4.71
Spannungsversorgung Elektrophoresekammer
PowerPac 3000 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Spektralphotometer GeneQuant™ pro Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden
Specord 200 (UV/VIS)
Analytik Jena AG, Jena, Deutschland
Winaspekt Version 2.1
UV-Mini 1240 (UV/VIS)
Shimadzu Corporation, Analytical Instruments Division, Kyoto, Japan
Sterilarbeitsbank Hera safe Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland
Sterilfilter SCGPT01RE (d = 0,22 µm)
Millipore Corp., Billerica, MA, USA
Spritzenvorsatzfilter Qualilab 0,22 µm Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Vakuum-Konzentrator Concentrator 5301 Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Vakuumsauganlage PC 2004 VARIO VACUUBRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
Verschlussclips für Reaktionsgefäße
Rotilabo® Nr. 217.1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Wasseraufbereitungs-anlage
Purelab Plus ELGA LabWater, Siershahn, Deutschland
Zellhomogenisator Mini-Beadbeater™ - 1
BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA
Zentrifugen (mit Kühlung)
3K18 SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland
3K30 SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland
Avanti HP-25 Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA
Heraeus Biofuge fresco
Kendro Laboratory Products, Hanau, Deutschland
Material und Methoden 34
3.1.2 Chemikalien
In Tabelle 3.2 sind alle eingesetzten Chemikalien zusammengestellt. Sie wurden in Analyse-
qualität oder in reinerem Zustand eingesetzt.
Tabelle 3.2: Chemikalien
Chemikalie Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz
Acrylamid/Bisacrylamidstammlösung: Rotiphorese® Gel 30
3029.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Albumin Fraktion V (vom Rind) 8076.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
7-Amino-4-methylcoumarin (AMC) A-9891 Sigma, St. Louis, MO, USA
Ammoniumacetat 32301 Riedel-de Haën AG, Seelze-Hannover, Deutschland
Ammoniumperoxodisulfat (APS) 9592.3 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Ammoniumsulfat A-4418 Sigma, St. Louis, MO, USA
Bradford-Reagenz: Roti®-Nanoquant
K880.1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Bromphenolblau 18040 Fluka AG, Buchs, Schweiz
Calciumchlorid-Dihydrat C-5080 Sigma, St. Louis, MO, USA
Chloramin-T-Hydrat C-9887 Sigma, St. Louis, MO, USA
Coomassie Brilliant Blau R250 161-0400 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Dimethylsulfoxid (DMSO) D-2650 Sigma, St. Louis, MO, USA
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat
106580 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
EDTA-Entkalker Osteosoft 101728 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Essigsäure 100063 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Ethanol vergällt, min 96% 1641 M Berkel AHK, Ludwigshafen, Deutschland
Ethylendiamin-N,N,N’,N’,-tetraessigsäuredinatriumsalz-Dihydrat (EDTA)
E-5134 Sigma, St. Louis, MO, USA
Glycerol 104094 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Glycin 3908.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Kaliumdihydrogenphosphat P-5379 Sigma, St. Louis, MO, USA
Kollagen I (säureunlöslich) aus Achillessehne Rind
17439 SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland
Kollagen I (säurelöslich) aus humaner Plazenta
-- zur Verfügung gestellt von Prof. P. Grellier, Museum National d'Histoire Naturelle, Paris
Material und Methoden 35
Chemikalie Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz
Kollagen IV (säurelöslich) aus humaner Plazenta
C-7521 Sigma, St. Louis, MO, USA
L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin (L-Ala-AMC)
I-1410 Bachem AG, Bubendorf, Schweiz
L-Arginin-7-amido-4-methylcoumarin Hydrochlorid (L-Arg-AMC)
A-2027 Sigma, St. Louis, MO, USA
L-Leucin-7-amido-4-methylcoumarin-Hydrochlorid (L-Leu-AMC)
L-2145 Sigma, St. Louis, MO, USA
β-Mercaptoethanol M-7154 Sigma, St. Louis, MO, USA
Methanol 106009 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Natriumacetat-Trihydrat S-7670 Sigma, St. Louis, MO, USA
Natriumcarbonat 106392 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Natriumchlorid 106404 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Natriumdodecylsulfat (SDS) S-4509 Sigma, St. Louis, MO, USA
Natriumhydrogencarbonat 6329/106329 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat
106346 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Natriumhydroxid S-8045 Sigma, St. Louis, MO, USA
N,N,N’,N’-Tetraethylmethylendiamin (TEMED)
161-0800 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
p-Dimethylaminobenzaldehyd D-8904 Sigma, St. Louis, MO, USA
Pepstatin A P-5318 Sigma, St. Louis, MO, USA
Perchlorsäure 70% 31142-1 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
1,10-Phenanthrolin-Monohydrat P-9375 Sigma, St. Louis, MO, USA
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) P-7626 Sigma, St. Louis, MO, USA
Salzsäure, rauchend 37% 100317 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
SDS-PAGE-Standard Low Range ungefärbt
161-0304 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100)
X-100 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
trans-4-Hydroxy-L-prolin H5440-9 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA
Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan (TRIS)
5429.3 Carl Roth GmbH + CO KG, Karlsruhe, Deutschland
Trypsin (Sequenzierungsgrad) -- Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Deutschland
Zinkchlorid 108816 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Zitronensäure-Trinatriumsalz C-3674 Sigma, St. Louis, MO, USA
Material und Methoden 36
3.1.3 Kulturmedien-Bestandteile
Die Komponenten zur Herstellung der verschiedenen Kulturmedien enthält Tabelle 3.3.
Tabelle 3.3: Bestandteile der Kulturmedien
Bestandteil Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz
Agar Agar 101614 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Albumin Fraktion V 8076.2 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Brain-Heart-Infusion (BHI) 237400 BD, Franklin Lakes, NJ, USA
Chloramphenicol (Paraxin pro injekt.)
-- Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Deutschland
Glukose 108337 Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Hefeextrakt 212750 BD, Franklin Lakes, NJ, USA
Pepton 211677 BD, Franklin Lakes, NJ, USA
Sabouraud-Agar (Sabouraud-2%-Glukose-Agar)
TN 1252 Sifin Institut für Immunpräparate und Nährmedien GmbH, Berlin, Deutschland
Yeast Carbon Base (YCB) 239110 BD, Franklin Lakes, NJ, USA
Yeast Nitrogen Base (YNB) 239210 BD, Franklin Lakes, NJ, USA
3.1.4 Enzyme und Antikörper
Die angewendeten Enzyme und der verwendete Antikörper sind in der Tabelle 3.4 bzw. in
der Tabelle 3.5 aufgelistet.
Tabelle 3.4: Enzyme
Enzym Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz
Kollagenase A von Clostridium histolyticum
C-0773 Sigma, St. Louis, MO, USA
Lyticase von Arthrobacter luteus L-4025 Sigma, St. Louis, MO, USA
Sezernierte Aspartylproteinase 2 von Candida albicans
MG002 TaKaRa BIO INC., Otsu, Shiga, Japan
Tabelle 3.5: Antikörper
Antikörper Katalog - Nr. Hersteller, Firmensitz
Anti-Sap2 (monoklonal) M166 TaKaRa BIO INC., Otsu, Shiga, Japan
Material und Methoden 37
3.1.5 Candida-albicans-Stämme
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche Stämme von Candida albicans ver-
wendet (Tabelle 3.6). Tabelle 3.6: Stämme von Candida albicans
Bezeichnung Referenz
ATCC 2091 Pasteur-Institut Paris, Frankreich; freundlichst zur Verfügung gestellt von Marie-Hélène Rodier, Laboratoire de Parasitologie et Mycologie Medicales, Centre Hospitalier Universitaire La Milétrie, Poitiers Cedex, France.
OMZ 1066 Referenzstamm der Züricher Stammsammlung Ursprung: klinisches Isolat aus kariöser Dentinläsion, Dr. Thomas Klinke, Universitätsklinikum der TU-Dresden
3.2 Methoden
3.2.1 Stammhaltung
Die Candida-albicans-Stämme wurden mit dem CryobankTM-System nach Herstellerangaben
bei -80 °C gelagert.
3.2.2 Zellkultivierung von Candida albicans
Im Folgenden werden die Herstellung der Kulturmedien, die Kultivierung der Hefezellen, die
Zellernte sowie die Kulturüberstandsgewinnung beschrieben.
Yeast-Carbon-Base (YCB) YCB-Stammlösung: 11,7 % YCB (w/v) in destilliertem Wasser, sterilfiltriert (Porengröße 0,22 µm) Yeast-Nitrogen-Base (YNB) YNB-Stammlösung: 11,7 % YNB (w/v) in destilliertem Wasser, sterilfiltriert (Porengröße 0,22 µm) Rinder-Serum-Albumin (RSA) RSA-Stammlösung: 10 % Albumin Fraktion V (w/v) in destilliertem Wasser, sterilfiltriert (Porengröße 0,22 µm) Glukose-Stammlösung: 20 % Glukose (w/v) in deionisiertem Wasser, autoklaviert Flüssigmedien:
YCB-RSA-Medium: 10 % YCB-Stammlösung (v/v) 2 % RSA-Stammlösung (v/v) in sterilem destilliertem Wasser, RSA-Endkonzentration: 0,2 %
Material und Methoden 38
YNB-Glc-Medium: 10 % YNB-Stammlösung (v/v) 5,7 % Glukose-Stammlösung (v/v) mit sterilem destilliertem Wasser, Glukose-Endkonzentration: 3,5 % YPD-Medium: 2 % Glukose (w/v) 0,2 % Hefeextrakt (w/v) 0,2 % Pepton (w/v) in deionisiertem Wasser, pH 4,0 mit HCl eingestellt autoklaviert Brain-Heart-Infusion (BHI)-Medium: 3,7 % Brain-Heart-Infusion (w/v) in deionisiertem Wasser autoklaviert Festmedium:
Sabouraud-Glc-Agar: 42 % Sabouraud-2 %-Glukose-Agar (w/v) 5 % Agar Agar (w/v) in deionisiertem Wasser autoklaviert Zugabe von 0,5 % Chloramphenicol-Lösung (20 % Chloramphenicol (w/v) in sterilem Wasser), Abfüllen in Platten bei 50 °C, 18 ml je Platte PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, zur Herstellung der Hefezellsuspension): NaCl 150 mM NaH2PO4 × H2O 1,59 mM Na2HPO4 × 2 H2O 10,56 mM pH 7,0, autoklaviert
Kultivierung und Zellernte von Candida albicans
Je 100 ml YCB-RSA-Medium, YNB-Glc-Medium und BHI-Medium in 200 ml-Glaskolben
wurden mit Zellen des C.-albicans-Stammes ATCC 2091 beimpft und 24 h bei 37 °C und
180 rpm im Wärmeraum aerob kultiviert. Sabouraud-Glc-Agar-Platten wurden mit 0,8 ml
Candida-albicans-Zellsuspension (Absorption bei 600 nm (A600) von 0,6 bis 0,8) beimpft. Die
Verteilung der Zellsuspension erfolgte gleichmäßig mit einem Drigalski-Spatel. Die beimpften
Platten trockneten kurz an und wurden 24 h bei 37 °C im Wärmeraum inkubiert. Das
Beimpfen der Kulturmedien und Kulturplatten geschah an der Sterilarbeitsbank.
Material und Methoden 39
Für die Zellernte von Sabouraud-Glc-Agar-Platten wurden etwa 1,3 ml steriles destilliertes
Wasser auf die Agar-Platte gegeben und die Zellen mit einem Drigalski-Spatel vom Agar
gelöst. Die entstandene Zellsuspension wurde mit einer Pipette abgenommen und in ein
Polypropylen-Röhrchen gefüllt. Die Zellernte bei Flüssigkulturen erfolgte durch Zentri-
fugation. Die Flüssigkulturen wurden bei 1.000 × g für 8 min bei 5 °C zentrifugiert, und der
Kulturüberstand wurde verworfen. Die gewonnenen Hefezellen aus Fest- oder Flüssig-
kulturen wurden zweimal mit sterilem Aqua destillata gewaschen, das Waschwasser wurde
verworfen. Das Feuchtvolumen der Zellen wurde bestimmt und anschließend eine
Zellsuspension, die aus einem Teil Zellen und zwei Teilen PBS, 0,33 g Zellen/ml, bestand,
hergestellt. Diese Zellsuspension wurde umgehend in den Versuchen zur Enzymfreisetzung
aus der Zellwand (Abschnitt 3.2.4) verwendet.
Anzucht für die Präparation eines peptidolytischen Enzyms von Candida
albicans und Gewinnung eines Kulturüberstandes Um eine große Menge an peptidolytischem Enzym für die anschließende Präparation zu
gewinnen, wurde das im Folgenden beschriebene Kultivierungsschema entwickelt.
Eine Glasperle aus dem CryobankTM-System eines C.-albicans-Stammes wurde in 8 ml YPD-
Medium aerob bei 26 °C und 95 rpm inkubiert. Das Kulturwachstum wurde durch Messung
der Absorption bei 600 nm im Spektralphotometer bestimmt. Nach 60 h wurde eine
Zelldichte von 3,8 bis 4,8 × 107 Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) erreicht
(A600 1,3 bis 1,5). Für die frühe exponentielle Phase wurde eine Verdopplungszeit von 4,5 h
bestimmt. Die Bestimmung der Absorption wurde in Einweg-Küvetten mit 10 mm Schicht-
dicke und bei 600 nm im Spektralphotometer GeneQuant™ pro durchgeführt. 1 ml dieser
Startkultur wurde in 100 ml YPD-Medium als Vorkultur gegeben und 30 h, wie zuvor
beschrieben, bis zu einer Zelldichte von 3,0 bis 3,8 × 107 KBE/ml (A600 1,1 bis 1,3) inkubiert.
Danach wurden die Zellen bei 1.000 × g für 8 min zentrifugiert und zweimal mit sterilem
Aqua destillata gewaschen. Die Zellen wurden in 100 ml YCB-RSA-Medium (Mangel-
medium) resuspendiert und 20 h bei 26 °C und 95 rpm aerob inkubiert. Die resultierende
Zelldichte variierte je nach verwendetem C.-albicans-Stamm von 6 bis 11 × 107 KBE/ml
(A600 1,7 bis 2,2).
Für die im Abschnitt 3.2.6 dargestellte Präparation der Peptidase-Aktivität wurde eine 80 ml
Startkultur mit 12 Glasperlen angesetzt. 75 ml dieser Startkultur wurde in 5 l Vorkultur
gegeben. Das Volumen der Expressionskultur betrug ebenfalls 5 l. Die Expressionskultur
wurde bei 1.000 × g für 8 min bei 5 °C zentrifugiert und der Kulturüberstand abgegossen.
Aus den gewonnenen Zellen wurde eine Zellsuspension mit 0,33 g Zellen/ml hergestellt und
Material und Methoden 40
umgehend den Versuchen zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand zugeführt (Abschnitt
3.2.4). Der für die Albumin- und Kollagenabbau-Tests (Abschnitte 3.2.12 und 3.2.13)
vorgesehene Kulturüberstand von YCB-RSA-Medium wurde bei 5.000 × g für 8 min bei 5 °C
zentrifugiert, um eine klare Flüssigkeit zu erhalten. Für die Sicherung der Zellfreiheit des
Kulturüberstandes wurde 50 ml des Zentrifugats durch einen Spritzenvorsatzfilter mit
0,22 µm Porengröße filtriert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C tiefgefroren. Der
Kulturüberstand wird im Kapitel 4 bei der Darstellung der Ergebnisse mit CF (für culture fluid)
abgekürzt.
3.2.3 Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung
Das fluorogene Substrat L-Arginin-7-amido-4-methylcoumarin (L-Arg-AMC) wurde zur
Detektion und Bestimmung der Aktivität der Aminopeptidase verwendet, wie von RODIER et
al. 1999 beschrieben.
Fluorimetriepuffer (TBS-Puffer): 50 mM TRIS + 150 mM NaCl
pH-Wert mit HCl auf 7,4 eingestellt
Substrat-Stammlösung: Die hydrophobe Festsubstanz L-Arg-AMC wurde nach Herstellerangaben in Dimethylsulfoxid
(DMSO) gelöst. Es resultierte eine 4 mM Substrat-Stammlösung.
Substratlösung: Die Substrat-Stammlösung wurde mit Fluorimetriepuffer zur Einstellung unterschiedlicher
Konzentrationen verdünnt und der pH-Wert erneut mit HCl auf 7,4 eingestellt. Die Substrat-
lösung war bei 2 °C etwa vier Wochen verwendbar. Die Substratkonzentration im Reaktions-
ansatz betrug 20 µM zum Screening der Chromatographiefraktionen, 100 µM bei allen
Versuchen zur Enzymcharakterisierung, ausgenommen die Erstellung der Michaelis-Menten-
Kurve.
7-Amino-4-methylcoumarin (AMC)-Standard: AMC wurde als Standard verwendet. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mM AMC gelöst in
DMSO hergestellt. Die AMC-Standardreihe, die aus 5, 10, 20, 30 und 40 µM AMC besteht,
wurde aus der Stammlösung und Fluorimetriepuffer hergestellt.
Material und Methoden 41
Standardmessbedingungen: In einer 96-Well-Platte wurden 5 µl Probe mit 50 µl Substratlösung gemischt. Nach einer
Inkubationszeit von 15 min im Platteninkubator bei 37 °C erfolgte das Stoppen der Reaktion
durch Zugabe von 250 µl Ethanol 96 %. Für die Ermittlung des Leerwertes wurden 50 µl der
jeweiligen Substratlösung ohne Probe mit inkubiert. Die Probe wurde nach Zugabe des
Stoppreagenzes pipettiert. Die Fluoreszenz wurde bei Raumtemperatur im Fluoreszenz-
Plattenreader (Fluostar Optima) bei 538 nm mit einer Anregung bei 355 nm bestimmt. Als
Standard wurde die AMC-Verdünnungsreihe von 5 bis 40 µM AMC nach der Inkubation in
jede Platte pipettiert. Eine Enzymeinheit (Unit, U) wurde als die Freisetzung von 1 µmol AMC
aus dem jeweiligen Testsubstrat pro Minute bei 37 °C definiert.
3.2.4 Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand
Aufgrund der Lokalisation der von EL MOUDNI et al. [1997] beschriebenen Metallopeptidase
in der Zellwand wurde ein Herauslösen von Enzymen aus der Zellwand mit verschiedenen
Agenzien angestrebt. Dadurch sollte ein besseres Verhältnis von Enzym zu Gesamtprotein
erreicht werden.
Die Freisetzung von Enzymen aus der Zellwand kann durch chemische Agenzien oder durch
enzymatischen Verdau der Pilzzellwand unter Verwendung von Lyticase von Arthrobacter
luteus (Zellwandlyse) geschehen. Lyticase hydrolysiert Poly(β-1,3-Glukose), die in der
Zellwand von Hefen als Glukan vorkommt. Es entstehen Hefezellen mit teilweise abgebauter
Zellwand, so genannte Spheroplasten.
Vergleich verschiedener Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand
Die Zellen des C.-albicans-Stammes ATCC 2091, kultiviert auf Sabouraud-Glc-Agar-Platten,
wurden verschiedenen Agenzien ausgesetzt. Je 150 µl Zellsuspension mit 0,33 g Zellen/ml
wurde mit 3,4 mM Triton X-100, 46 mM β-Mercaptoethanol oder für die Zellwandlyse mit
20 U/ml Lyticase von Arthrobacter luteus inkubiert (angegeben sind Endkonzentrationen im
Reaktionsansatz). Als Kontrolle wurde Zellsuspension mit 3,3 % PBS versetzt. Die Ansätze
verweilten 24 h bei 25 °C im Inkubator für Reaktionsgefäße (Thermomixer comfort) bei
500 rpm. Danach wurden die Ansätze bei 100 × g für 10 min zentrifugiert und der Überstand
abgenommen. Der Überstand wurde bei 5.000 × g zentrifugiert, erneut abgenommen und der
Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung zugeführt.
Material und Methoden 42
Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien
Zellsuspensionen mit 0,33 g Zellen/ml des C.-albicans-Stammes ATCC 2091, gewonnen aus
den Flüssigkulturen in YCB-RSA-Medium, YNB-Glc-Medium, BHI-Medium und der Festkultur
von Sabouraud-Glc-Agar-Platten, wurden mit 80 U/ml Lyticase versetzt und 13 h bei 25 °C im
Inkubator für Reaktionsgefäße mit 500 rpm inkubiert. Die hohe Lyticase-Konzentration von
80 U/ml wurde aufgrund der kürzeren Inkubationszeit gewählt. Um eine Ruptur der entstan-
denen Spheroplasten zu vermeiden, wurden die Reaktionsansätze schonend bei 100 × g für
10 min zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der abgenommene Überstand wurde bei
5.000 × g zentrifugiert und anschließend eine Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung vorge-
nommen.
Zellwandlyseschema für Enzympräparation
Vorversuche zeigten, dass sich durch wiederholte Zellwandlyse ein größerer Anteil der
Aminopeptidase herauslösen lässt. Eine Hefezellsuspension mit einer Konzentration von
0,33 g Zellen pro ml PBS wurde viermal nacheinander bei einer Lyticase-Endkonzentration
von 15 U/ml im Reaktionsansatz für 20h bei 26 °C und 65 rpm inkubiert. Nach jeder
Lysestufe wurde der Ansatz mit 100 × g für 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen
und das Pellet für die nächste Lysestufe erneut suspendiert. Der gewonnene Überstand wies
mit steigender Lysestufe eine zunehmende Trübung durch Zellfragmente auf. Ein klarer
Überstand konnte durch Zentrifugation bei 600 × g, 3.500 × g und 5.000 × g für je 10 min bei
5 °C erzielt werden. Die Bodensätze wurden verworfen.
Die Zellsuspensionen wurden nach jeder Lysestufe der mikroskopischen Kontrolle unter-
zogen und der Anteil der freien Zellkerne bestimmt. Es erfolgte dann die Protein-
konzentrations- und Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung der vier Lysate mit dem Testsubstrat
L-Arg-AMC. Die Lysate der Lysestufen zwei, drei und vier wurden gepoolt und durch
Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 µm Porengröße filtriert. Das erste Lysat wurde aufgrund zu
geringer Enzymaktivität verworfen. Die Lysate und der Zellwandlysatepool wurden bis zur
kurz darauf folgenden Enzymaufreinigung (Abschnitt 3.2.6) auf Eis gelagert.
3.2.5 Zellaufschluss
Zellaufschluss und Zellextrakt wurde bei den Kollagenabbau-Tests eingesetzt. Der
Aufschluss der Hefezellen wurde in TRIS/HCl-Puffer vorgenommen.
TRIS/HCl-Puffer: 20 mM TRIS pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert
Material und Methoden 43
Das Feuchtvolumen der mit sterilem destillierten Wasser gewaschenen Hefezellen wurde
bestimmt und anschließend eine Zellsuspension mit 0,5 g Zellen/ml, die aus einem Teil
Zellen und einem Teil TRIS/HCl-Puffer besteht, hergestellt. Der Zellaufschluss erfolgte im
Zellhomogenisator Mini-Beadbeater™ mit Glasperlen (d=0,5 mm) dreimal 30 s unter
intermittierender Kühlung der Zellsuspension im Eisbad für jeweils 1 min.
Der gewonnene Zellaufschluss wurde mit und ohne weitere Aufbereitung mit Kollagen
inkubiert (Abschnitt 3.2.13). Der Zellaufschluss ohne weitere Aufbereitung wird fortan als
„Zellaufschluss“ bezeichnet und mit „CD“ (cells disrupted) abgekürzt. Die weitere
Aufbereitung bestand in der Zentrifugation bei 45.000 × g für 45 min bei 5 °C und
anschließender Sterilfiltration durch einen Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 µm Porengröße. Der
aufbereitete Zellaufschluss wird im Folgenden als „Zellextrakt“ bezeichnet und mit „CEx“
abgekürzt.
3.2.6 Enzymreinigung aus Zellwandlysat von Candida albicans
Chromatographiepuffer: TRIS/HCl-Puffer: 20 mM TRIS pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert TRIS/HCl-NaCl-Puffer: 20 mM TRIS + 1 M NaCl pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert Ammoniumacetat-Puffer: 0,1 M Ammoniumacetat pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert Kaliumphosphat-Puffer: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert Kaliumphosphat/AS-60S%-Puffer: 50 mM Kaliumphosphat Ammoniumsulfatsättigung 60 % (AS-60S%) pH 7,4 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert
Das dargestellte Chromatographie-Schema basiert auf der Veröffentlichung von RODIER et
al. [1999]. Es wurde aber erweitert und modifiziert. Alle Chromatographie-Schritte wurden mit
dem Chromatographie-System ÄKTA explorer durchgeführt.
Zum Pufferaustausch wurde das Zellwandlysat vor dem ersten Reinigungsschritt 12 h in
einem Dialyseschlauch mit der Porengröße von 12 bis 14 kDa zweimal gegen das 50fache
des Probenvolumens dialysiert. Hierzu wurde der Chromatographiepuffer TRIS/HCl-Puffer
verwendet, welcher zwischenzeitlich einmal gewechselt wurde.
Nach jedem Reinigungsschritt wurde eine Teilmenge des Poolvolumens zur Untersuchung
und Dokumentation des Reinigungsverlaufes abgenommen. Dazu erfolgten die Bestimmung
der Proteinkonzentration, L-Arg-AMC-Hydrolyse und SDS-Gelelektrophorese. Vor jedem
Chromatographieschritt wurde die Probe mit einem Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 µm Poren-
Material und Methoden 44
größe filtriert. TRIS/HCl-Puffer wurde für alle Ionenaustausch-Chromatographieschritte als
Puffer A verwendet.
HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
Mit der Ionenaustausch-Chromatographie können Proteine anhand ihrer unterschiedlichen
elektrischen Ladung getrennt werden. Im ersten Chromatographieschritt wurden 136,5 ml
Dialysat auf eine Ionenaustausch-Chromatographie-Säule HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
mit einem Säulenvolumen von 53 ml aufgetragen, die zuvor mit vier Säulenvolumina
TRIS/HCl-Puffer äquilibriert wurde. Das gebundene Protein wurde mit zwei Säulenvolumina
TRIS/HCl-Puffer gewaschen und dann mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M
(TRIS/HCl-NaCl-Puffer) über drei Säulenvolumina eluiert. Die Flussgeschwindigkeit betrug
2 ml/min und das Fraktionsvolumen 1,5 ml. Die Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes
wurde unter Standardmessbedingungen ermittelt. Anschließend wurden sieben Fraktionen
gepoolt und der resultierende Pool erneut mit TRIS/HCl-Puffer über zweimal 2 h dialysiert
gegen das 400fache des Probenvolumens.
Mono Q HR 5/5
Der zweite Reinigungsschritt bestand in einer Ionenaustausch-Chromatographie an einer
Mono Q HR 5/5-Säule mit einem Säulenvolumen von 1 ml. Das Dialysat wurde mit
TRIS/HCl-Puffer verdünnt und mit einem Gesamtvolumen von rund 19 ml aufgetragen. Die
Säule wurde mit drei Säulenvolumina TRIS/HCl-Puffer äquilibriert. Das gebundene Protein
wurde mit fünf Säulenvolumina TRIS/HCl-Puffer gewaschen und nachfolgend mit einem
NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M (TRIS/HCl-NaCl-Puffer) über 20 Säulenvolumina eluiert.
Die Flussgeschwindigkeit betrug 0,75 ml/min und das Fraktionsvolumen 150 µl. Die
Enzymaktivität von neun Fraktionen wurde gepoolt. Die Entsalzung des Pools wurde an
einer PD-10-Säule (Trennmedium Sephadex G-25M) mit TRIS/HCl-Puffer durchgeführt.
Es wurden 4,8 ml Eluat an einer Mono Q HR 5/5-Säule unter beibehaltenen Parametern
rechromatographiert. Die Elution erfolgte allerdings über 25 Säulenvolumina. Die Enzym-
aktivität von sieben Fraktionen wurde gepoolt.
Superdex 200 10/300 GL
Die Gelfiltration ermöglicht die Trennung eines Proteingemisches nach der Molekülgröße.
Um eine gute Trennung mit der Gelfiltration zu erzielen, sollten geringe Proteinmengen in
geringen Volumina aufgetragen werden. Die Trennung nach Molekülgröße erfolgte an einer
Material und Methoden 45
Superdex 200 10/300 GL-Säule mit einem Säulenvolumen von 23,65 ml. Als Chromato-
graphiepuffer diente Ammoniumacetat-Puffer. Aufgetragen wurden 4 × 200 µl Pool nach
Mono Q HR 5/5. Beim letzten Lauf betrug das Auftragsvolumen nur 135 µl Probe. Die
Flussgeschwindigkeit betrug 0,75 ml/min und das Fraktionsvolumen 200 µl. Die
Enzymaktivität von sechs Fraktionen wurde gepoolt. Der Pool wurde mit Ammoniumsulfat
versetzt, so dass eine 60%ige Ammoniumsulfatsättigung resultierte. Das Gesamtpool-
volumen betrug nun 15 ml.
RESOURCE TM ETH
Als letzter Reinigungsschritt wurde eine Hydrophobe-Wechselwirkungs-Chromatographie
durchgeführt. Die Trennung der Proteine basiert auf reversiblen Interaktionen zwischen
hydrophoben Proteinoberflächen und dem Trennmaterial. Als Matrix diente eine
RESOURCE TM ETH-Säule mit 1 ml Volumen. Die Säule wurde mit zehn Säulenvolumina
Kaliumphosphat/AS-60S%-Puffer äquilibriert. Bei drei Läufen wurden je 5 ml Probe
aufgetragen. Das gebundene Protein wurde mit zwei Säulenvolumina Kaliumphosphat/AS-
60S%-Puffer gewaschen und dann mit einem Ammoniumsulfat-Gradienten von 60 % bis 0 %
Ammoniumsulfatsättigung über 20 Säulenvolumina eluiert. Die Flussgeschwindigkeit betrug
1,0 ml/min und das Fraktionsvolumen 150 µl. Die wieder gefundene Enzymaktivität war über
sieben Fraktionen verteilt. Die drei Läufe ergaben ähnliche Chromatogramme und
Aktivitätsprofile. Die sich entsprechenden Einzelfraktionen der drei Läufe wurden separat
gepoolt, und jeder der sechs Einzelpools wurde separat dialysiert. Die Dialyse erfolgte über
zweimal 2 h in TRIS/HCl-Puffer gegen das 1000fache des Probenvolumens.
3.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zur Protein-Gelelektrophorese wurde das Verfahren nach HAMES und RICKWOOD [1990] in
der nachfolgend beschriebenen Weise angewendet.
Sammelgel (Endkonzentrationen):
Acrylamid 3,75 % (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid 0,1 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat 0,08 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) TEMED 0,2 % (v/v) TRIS-HCl 0,125 M (pH 6,8)
Material und Methoden 46
Trenngel (Endkonzentrationen):
Acrylamid 10,0 % (w/v) N,N'-Methylenbisacrylamid 0,27 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat 0,08 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) TEMED 0,05 % (v/v) TRIS-HCl 0,375 M (pH 8,8)
Laufpuffer/Elektrodenpuffer:
TRIS 0,025 M Glycin 0,192 M SDS 0,1 % (w/v) Probenpuffer pH 6,8 (5fach konzentriert):
TRIS-HCl 0,32 M SDS 5 % (w/v) Bromphenolblau 0,025 % (w/v) Glycerol 50 % (v/v) Proteinstandard für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
Der Proteinstandard „Low Range“ bestand aus:
Phosphorylase b 97,4 kDa Serum albumin 66,2 kDa Ovalbumin 45,0 kDa Carbonic anhydrase 31,0 kDa Trypsin inhibitor 21,5 kDa Lysozyme 14,4 kDa Der Proteinstandard wurde 1:20 verdünnt mit 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol und 95 % (v/v)
Probenpuffer und anschließend denaturiert bei 95 °C für 5 min.
Färbelösung:
0,1 % (w/v) Coomassie-Brilliantblau R250 in 50 % (v/v) Methanol und 8 % (v/v) Eisessig,
filtriert
Entfärberlösung:
10 % (v/v) Methanol, 15 % (v/v) Eisessig
Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) wurden 14 cm breite, 12 cm hohe und 0,75 mm dicke Trenngele in der
Material und Methoden 47
Gießvorrichtung einer Elektrophoreseeinheit gegossen. Nach dem Gießen des Sammelgels
konnte das Polyacrylamid mindestens 2 h polymerisieren.
Zur Einengung von Proben mit niedriger Proteinkonzentration diente ein Vakuum-
Konzentrator. Alle Proben wurden mit 20 % Probenpuffer und 4 % β-Mercaptoethanol
versetzt und anschließend bei 95 °C für 5 min denaturiert.
Nach Auftragen der Proben erfolgte das Sammeln der Proben mit 17 mA pro Gel für 45 min
und danach der Trennvorgang mit 35 mA. Die Elektrophoresekammer war an ein Kühl-
system angeschlossen. Der Lauf wurde beendet, wenn das Bromphenolblau am Gelende
angelangt war.
Die Gele wurden in die Färbelösung überführt und 45 min bei moderater Bewegung und bei
Raumtemperatur gefärbt. Nach dem Abgießen der Färbelösung wurden die Gele mit
deionisiertem Wasser gespült und anschließend mit Entfärberlösung für zweimal 20 min
entfärbt.
Das Digitalisieren erfolgte mit dem Scanner (PowerLook 1000) und der dazugehörigen
Computersoftware (MagicScan32, Version V4.71). Zur Bestimmung des Molekulargewichts
der Proteinbanden diente eine anhand der Markerproteine erstellte Eichgerade in halb-
logarithmischer Darstellung.
3.2.8 Proteinkonzentrationsbestimmung
Das Roti®-Nanoquant-Assay diente zur Bestimmung der Proteinkonzentration in Proben. Mit
Roti®-Nanoquant, einer modifizierten Form des Bradford-Protein-Assay, ist es möglich,
geringere Proteinkonzentrationen als beim konventionellen Bradford-Assay zu bestimmen
[BRADFORD, 1976; ZOR & SELINGER, 1996].
Roti®-Nanoquant-Arbeitslösung: 20 % Roti®-Nanoquant mit deionisiertem Wasser (v/v)
RSA-Standard: Ausgegangen wurde von einer Albumin-Stammlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml.
Als Lösungsmittel diente 0,9%ige NaCl-Lösung (w/v). Durch Verdünnen dieser Stammlösung
mit physiologischer Kochsalzlösung entstanden die Standard-Lösungen mit 0, 2, 5, 10, 20,
50 und 100 µg/ml RSA.
Vorbereitung der Proben: Die Proben wurden bei Bedarf mit 0,9%iger NaCl-Lösung (w/v) verdünnt, um den Proben-
Messbereich von 0-100 µg/ml Protein einzuhalten.
Material und Methoden 48
Reaktionsansätze: In 1,5 ml-Reaktionsgefäßen wurden 200 µl Standard oder Probe mit 800 µl Roti®-Nano-
quant-Arbeitslösung versetzt, gemischt und nach Herstellerangaben bei Raumtemperatur für
5 min inkubiert. Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde als Dreifachbestimmung für
Standards und Proben durchgeführt.
Photometrische Auswertung: Die Absorption wurde bei den Wellenlängen 590 und 450 nm sowie einer Schichtdicke von
10 mm mit dem Spektralphotometer Specord 200 bei Raumtemperatur gemessen. Als
Referenz diente deionisiertes Wasser. Mit der Software Winaspekt, Version 2.1, konnte der
Quotient A590 nm/A450 nm berechnet und graphisch dargestellt werden. Es ergab sich ein
linearer Zusammenhang zwischen den Proteinkonzentrationen der Standards und dem
Quotienten A590 nm/A450 nm.
Abbildung 3.1: Eichgerade für die Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Roti®-
Nanoquant-Kit (repräsentatives Beispiel) Angegeben ist die Proteinkonzentration in der Probe.
In Abbildung 3.1 ist die Linearität der Abhängigkeit des Quotienten A590 nm/A450 nm von der
Proteinkonzentration im Proteinkonzentrationsbereich von 0 bis 100 µg/ml in der einge-
setzten Probe (n = 3) dargestellt.
3.2.9 Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie
Die Proteinanalytik mittels Massenspektrometrie erfordert Spezialkenntnisse und aufwendige
Technik und wurde deshalb von der Abteilung Neuroproteomforschung des Max-Delbrück-
Centrums für Molekulare Medizin in Berlin durchgeführt (siehe Danksagung und Erklärung).
Die mittels SDS-PAGE erhaltene Enzymbande der D1-Fraktion nach RESOURCE TM ETH
Material und Methoden 49
(Spur 6 in Abbildung 4.8) wurde im SDS-Gel einer limitierten Proteolyse (In-Gel Digestion)
mit Trypsin zugeführt. Die erhaltenen tryptischen Peptide wurden auf einer LC Packings
75 µm PepMap C18–Reverse-Phase-Säule getrennt, die an ein Flüssigchromatographie-
System (capillary liquid chromatography system) angeschlossen war. Die Trennung der
Peptide erfolgte unter Anwendung eines Acetonitril-Gradienten von 5 bis 50 % (v/v). Die
eluierten Peptide wurden nach Elektrospray-Ionisation (ESI) in einem Q-TOF-Hybrid-
Massenspektrometer mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) analysiert. Die
erhaltenen Fragmentionen wurden unter Verwendung von Kollisionsenergie-Profilen unter
Berücksichtigung der Masse/Ladungs-Quotienten (m/z ratio) und des Ladungszustandes des
Mutterions charakterisiert. Fragmentionenmassen und Intensitäten wurden mithilfe der
Mascot-Software [PERKINS et al., 1999] mit der Protein-Datenbank NCBInr korreliert.
3.2.10 Datenbankrecherche
Die vergleichende Sequenzanalyse wurde am Institut für Klinische Genetik der
Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden mithilfe der
unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ zugänglichen BLASTp software (Basic Local
Alignment Search Tool for Proteins, ALTSCHUL et al., 1997) unter Benutzung voreingestellter
Standardparameter vorgenommen (siehe Danksagung und Erklärung). Durchsucht wurden
die Datenbank NCBInr sowie die Proteindatenbanken PDB (Protein Data Bank;
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), Swiss-Prot (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/), die
Datenbank PIR (Protein Information Resource; http://pir.georgetown.edu/) und die
Proteindatenbank PRF (Protein Research Foundation; http://www.prf.or.jp/en/index.html).
Der Begriff „signifikante Ähnlichkeit“ ist definiert als jede das Hintergrundniveau
übersteigende Ähnlichkeit, die durch Wiederholung der BLASTp-Suche mit einer
randomisierten Version der ursprünglichen Suchsequenz bestimmt wird.
Die Sequenzrandomisierung wurde mithilfe des „Random protein sequence generator“
(http://www.expasy.org/tools/randseq.html) vorgenommen. Zum Vergleich von multiplen
Sequenzen wurde das Programm CLUSTALW [THOMPSON et al., 1994;
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/] angewendet.
3.2.11 Charakterisierung der isolierten Peptidase
Alle Versuche zur Charakterisierung der gereinigten Aminpeptidase aus der Zellwand
wurden mit der nach RESOURCE TM ETH erhaltenen hochreinen Fraktion D1 durchgeführt
(Spur 6 in Abbildung 4.8).
Material und Methoden 50
Einfluss des pH-Wertes
Zur Ermittlung des pH-Optimums wurde die Aktivität der gereinigten Peptidase bei unter-
schiedlichen pH-Werten im Reaktionsansatz bestimmt. Um einen großen pH-Bereich optimal
abzudecken, kamen verschiedene Puffersysteme zum Einsatz (Tabelle 3.8).
Tabelle 3.7: Puffersysteme
pH-Bereich Reaktionspuffer (Puffersystem)
3 - 5,6 50 mM Na-Acetat-Puffer + 150 mM NaCl
5,9 - 9 50 mM TRIS-Puffer + 150 mM NaCl
9,5 - 11 50 mM Carbonat-Bicarbonat-Puffer + 150 mM NaCl
Es wurde für jeden pH-Messpunkt eine L-Arg-AMC-Substratlösung und eine Enzym-
verdünnung (2,2 µg/ml) mit Reaktionspuffer des entsprechenden pH-Wertes hergestellt.
Dazu wurde Substratstammlösung bzw. Enzymfraktion D1 mit dem entsprechenden
Puffersystem gemischt und der pH-Wert mit HCl und NaOH eingestellt. Im Reaktionsansatz
betrug die Substratkonzentration 100 µM und die Enzymkonzentration 0,2 µg/ml. Die
Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes wurde für Standardmessbedingungen ermittelt.
Der Mittelwert jedes Messpunktes wurde aus vier bis zehn Einzelmessungen berechnet.
Substratspektrum und enzymkinetische Untersuchungen
Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration wurde für die
synthetischen Substrate L-Arg-AMC und L-Ala-AMC ermittelt. Die Testsubstrate bestanden
aus einer Aminosäure gekoppelt an die potentiell fluoreszierende 7-Amido-4-
methylcoumarin-Gruppe, wobei die Aminosäuren N-terminal lokalisiert waren. Die
Festsubstanzen L-Arg-AMC und L-Ala-AMC wurden nach Herstellerangaben in DMSO
gelöst. Die Konzentrationen der so hergestellten Substrat-Stammlösungen betrugen 4 mM.
Außerdem wurde die Aktivität der Peptidase für L-Leu-AMC ermittelt. L-Leu-AMC wurde zur
Herstellung einer Substrat-Stammlösung von 20 mM in Methanol gelöst. Für jeden
Messpunkt wurde die Substratlösung durch Verdünnen der entsprechenden Substrat-
stammlösung mit Fluorimetriepuffer hergestellt und der pH-Wert mit HCl und NaOH auf 7,4
adjustiert.
Die Konzentration der gereinigten Peptidase der Fraktion D1 im L-Arg-AMC-Reaktionsansatz
und L-Leu-AMC-Reaktionsansatz betrug 0,2 µg/ml, im L-Ala-AMC-Reaktionsansatz 1,0 µg/ml.
Die Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes wurde unter Standardmessbedingungen
ermittelt.
Material und Methoden 51
Mithilfe des Datenanalyse-Programms SigmaPlot 9.0 wurden die Parameter , und
die Hemmkonstanten und aus den Messdaten durch nichtlineare Regression unter
Verwendung kinetischer Modellgleichungen berechnet. Das Programm verwendet den
Marquardt-Levenberg-Algorithmus [MARQUARDT, 1963] und liefert neben den berechneten
kinetischen Konstanten auch Grenzen für eine valide Schätzung dieser Größen sowie
verschiedene Maßzahlen für die Beurteilung der Qualität der erreichten Anpassung.
MaxV MK
IK IIK
Eine Enzymhemmung kann durch das Substratlösungsmittel, vom Substrat selbst
(Substrathemmung) oder durch eine Kombination beider Effekte verursacht sein. Bei der
Untersuchung der kinetischen Daten wurde zunächst ein Datenvergleich mit Modell-
gleichungen für eine gemischte Hemmung, eine kompetitive, eine nichtkompetitive und eine
unkompetitive Hemmung vorgenommen. Mit keiner der Modellgleichungen konnte eine
zufrieden stellende Beschreibung der experimentellen Daten erreicht werden. Eine
ausreichende Beschreibung konnte erst mit einer Verallgemeinerung der Gleichung für eine
nichtkompetitive Hemmung (1) erreicht werden.
( ) ( )Max
nII M
V [S]v1 ([I] K ) [S] K/
= ∗+ +
(1)
Die Güte der Anpassung des Regressionsmodells wurde mithilfe des AIC (Akaike’s
information criterion) eingeschätzt [AKAIKE, 1974]. Die Qualität der Ausgleichsrechnung
wurde durch die Konfidenzintervalle für die geschätzten Modellparameter mit einem
Signifikanzniveau von 95 % und durch das übliche Residuum (Quadratmittelabweichung)
charakterisiert.
Die korrigierten Messwerte und eine korrigierte Kurve erhält man durch Multiplikation der gemessenen oder der aus Gleichung (1) berechneten Geschwindigkeiten mit dem Faktor . ( )n
II1 ([I] K )/+
Durch weiterführende Versuche mit geringerem DMSO-Gehalt in den Reaktionsansätzen konnte der Einfluss von DMSO deutlich reduziert werden [KLINKE et al., 2008]. Die Beschreibung der v/S-Kinetik gelang hier durch Einfügen des Faktors ( )+ I1 1 [S] K// , der eine Substrathemmung beschreibt.
Einfluss von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen
Zum Test der Inhibitoren wurde der Reaktionsansatz modifiziert. Der Inhibitoren-
Reaktionsansatz bestand hier aus 25 µl Enzymverdünnung, 25 µl Inhibitor-Verdünnung und
5 µl L-Arg-AMC-Substratlösung, die hier eine Konzentration von 1,1 mM aufwies. Die
Substratkonzentration im Inhibitoren-Reaktionsansatz betrug 100 µM, die Konzentration der
gereinigten Peptidase 0,275 µg/ml. Es wurde zunächst Enzym mit Inhibitor für 15 min bei
Material und Methoden 52
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Inhibitoren-Reaktionsansatz wie der
Standard-Reaktionsansatz behandelt und die Peptidaseaktivität unter Standardmess-
bedingungen ermittelt. Kontrollproben mit Methanol bzw. Ethanol ermöglichten die Korrektur
der Werte. In Tabelle 3.9 sind die eingesetzten Inhibitoren mit ihren Lösungsmitteln
zusammengefasst.
Tabelle 3.8: Getestete Proteinaseinhibitoren und Metallkationen
Inhibitorkonzentration im Ansatz Lösungsmittel (Konzentration im Ansatz)
EDTA 0 – 1 mmol/l Fluorimetriepuffer
1,10-Phenanthrolin 0 – 1 mmol/l Methanol (0 – 55 mmol/l)
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) 1 mmol/l Ethanol (0 – 39 mmol/l)
Pepstatin 1 mmol/l Methanol (0 – 55 mmol/l)
Zinkchlorid 1 mmol/l Fluorimetriepuffer
Calciumchlorid 0,5 – 1 mmol/l Fluorimetriepuffer
Die Inhibitor-Stammlösungen wurden mit Fluoriemetriepuffer bis zur gewünschten Inhibitor-
Verdünnung gebracht. Wenn es erforderlich war, wurde der pH-Wert neu adjustiert.
Einfluss der Temperatur
Für die Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Inkubationsbad F25-ED mit
integrierter Temperaturregeltechnik verwendet. Hierfür wurde das Volumen des
Reaktionsansatzes verdoppelt. In 1,5 ml-Reaktionsgefäßen wurde 100 µl Substratlösung
vorgelegt, im Inkubationsbad 1 min temperiert, anschließend 10 µl Enzymverdünnung
zugegeben, gemischt und den Ansatz für 15 min inkubiert. Im Reaktionsansatz betrug die
Substratkonzentration 100 µM und die Enzymkonzentration 0,2 µg/ml. Zum Stoppen der
Reaktion diente 500 µl Ethanol 96 %. Die Ansätze wurden bei -20 °C aufbewahrt. In der
Folge wurden 305 µl des gestoppten Ansatzes in eine 96-Well-Platte gegeben. Die
Peptidaseaktivität des Reaktionsansatzes wurde unter Standardmessbedingungen ermittelt.
3.2.12 Albuminabbau-Test
Basierend auf der Vorschrift von SMOLENSKY et al. [1997] wurde die proteolytische Aktivität
der gereinigten Peptidase (Fraktion D2 nach RESOURCE TM ETH), von Kulturüberstand und
Zellextrakt mit Rinder-Serum-Albumin (RSA) als Substrat spektralphotometrisch bestimmt.
Der Albuminabbau-Test sollte zwei verschiedene pH-Bereiche umfassen. Die verwendeten
Material und Methoden 53
Lösungen hatten folgende Zusammensetzung:
Natrium-Citrat-Puffer: 50 mM Natrium-Citrat, pH-Wert 3,5 mit HCl eingestellt, sterilfiltriert
RSA-Lösung 1: RSA 2 % in Natrium-Citrat-Puffer, pH auf 3,5 mit HCl eingestellt
RSA-Lösung 2: RSA 2 % in TRIS-Puffer, pH auf 7,4 mit HCl eingestellt
Pro Ansatz wurden 600 µl RSA-Lösung mit 150 µl Probe gemischt. Die gereinigte Peptidase
aus der Zellwand und der Zellextrakt wurden mit der neutralen RSA-Lösung 2, die
Kulturüberstände mit der sauren RSA-Lösung 1 inkubiert. Die Konzentration der gereinigten
Peptidase im Reaktionsansatz betrug 4,4 µg/ml. Die Ansätze wurden 1 h bei 37 °C und
600 rpm inkubiert. Das Stoppen der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 200 µl
Perchlorsäure 2 M je Ansatz. Dadurch kommt es zum Denaturieren und Ausfällen der
großen Proteinmoleküle, während abgespaltene Peptide in Lösung bleiben. Für die
Leerwerte erfolgte die Zugabe von Probe und Perchlorsäure unmittelbar nacheinander am
Ende der Inkubationszeit. Nach einer Inkubation auf Eis für 10 min wurden die denaturierten
Proben 10 min bei 16.000 × g zentrifugiert. Der abgenommene Überstand wurde 5 min bei
25 °C temperiert. Die Bestimmung der Absorption erfolgte bei Raumtemperatur in
Quarzküvetten mit 10 mm Schichtdicke bei 280 nm im Spektralphotometer UV-Mini 1240.
Der Albuminabbau-Test wurde für alle Proben und Leerwerte als Doppelbestimmung durch-
geführt.
3.2.13 Kollagenabbau-Tests
Die kollagenolytische Aktivität der gereinigten Peptidase (Fraktion D2 nach
RESOURCE TM ETH), von Kulturüberstand, Zellaufschluss und Zellextrakt wurde mit
säureunlöslichem und säurelöslichem Kollagen als Substrat mithilfe der Hydroxyprolin-
Bestimmung und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht.
Nachweis mittels Hydroxyprolin-Bestimmung
Wie in der Vorschrift von KAMINISHI et al. [1988] angegeben, wurde säureunlösliches
Typ-I-Kollagen aus der Achilles-Sehne des Rindes für den Nachweis der Kollagenolyse bei
neutralem und saurem pH-Wert verwendet. Für die unterschiedlichen pH-Bereiche kamen
zwei verschiedene Puffersysteme zum Einsatz. Nach der Suspension von Kollagen in
TRIS/HCl-Puffer bzw. Natrium-Citrat-Puffer traten leichte pH-Verschiebungen auf, die ein
Adjustieren des pH-Wertes auf 7,4 bzw. 3,5 mit NaOH bzw. HCl erforderten. Der
Reaktionssnsatz enthielt je 1,2 mg Kollagen (Trockengewicht). Zugesetzt wurde eine der
folgenden enzymhaltigen Proben: gereinigte Peptidase (Fraktion D2 nach RESOURCE TM
ETH), Kulturüberstand (siehe Abschnitt 3.2.2), Zellaufschluss (Abschnitt 3.2.5), Zellextrakt
Material und Methoden 54
(Abschnitt 3.2.5) und Sap2 (Fa. TaKaRa). Als Negativkontrollen dienten Pufferlösungen oder
denaturierte Probe, Sap2 repräsentierte die Positivkontrolle. Die Denaturierung erfolgte bei
95 °C für 5 min. Vor der Zugabe zum Kollagen wurde der pH-Wert der enzymhaltigen Proben
überprüft und gegebenenfalls mit HCl oder NaOH auf 3,5 bzw. 7,4 adjustiert. Das
Probevolumen betrug 120 µl, bei Zellaufschluss 150 µl, um aufgrund des höheren
Pelletvolumens etwa gleiche Überstandsmengen zu erhalten. Die Reaktionsansätze wurden
24 h bei 37 °C und 600 rpm inkubiert. Der Kollagenabbau wurde mindestens als Doppel-
bestimmung durchgeführt.
Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
Kollagen 1,2 mg + Enzymlösung bzw. Kontrolllösung (1) – (12)
(1) gereinigte Peptidase (5 µg/ml) in TRIS/HCl-Puffer, pH 7,4 (2) TRIS-Puffer 20 mM, pH 7,4 (Kontrolle) (3) Zellextrakt, pH 7,4 (4) Zellextrakt denaturiert, pH 7,4 (Kontrolle) (5) Zellaufschluss, pH 7,4 (6) Zellaufschluss denaturiert, pH 7,4 (Kontrolle) (7) Zellaufschluss, pH 3,5 (8) Zellaufschluss denaturiert, pH 3,5 (Kontrolle) (9) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, pH 3,5 (10) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, denaturiert, pH 3,5 (Kontrolle) (11) Sap2 (5 µg/ml; Fa. TaKaRa) in Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (12) Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (Kontrolle)
Nach der Inkubation wurden die Reaktionsansätze bei 16.000 × g für 15 min zentrifugiert und
der Überstand abgenommen. Die Überstände der Proben mit Zellaufschluss wurden erneut
wie zuvor zentrifugiert. Die Überstände wurden der Hydroxyprolin-Bestimmung zugeführt.
Hydroxyprolin-Bestimmung
Mithilfe der Hydroxyprolin-Bestimmung kann Kollagenspaltung über den Hydroxyprolingehalt
von Kollagenfragmenten nachgewiesen werden. Angewendet wurde das Protokoll nach
REDDY und ENWEMEKA [1996]. Die verwendeten Lösungen hatten folgende Zusammen-
setzung:
Azetat-Citrat-Puffer:
0,88 M Natriumazetat-Trihydrat 0,24 M Citronensäure 0,21 M Essigsäure 0,85 M Natriumhydroxid in deionisiertem Wasser, pH-Wert auf 6,5 eingestellt.
Material und Methoden 55
Chloramin-T-Reagenz:
0,056 M Chloramin T und 1,33 M n-Propanol in Azetat-Citrat-Puffer
Ehrlichs Reagenz:
1 M p-Dimethylaminobenzaldehyd in n-Propanol/Perchlorsäure (2:1 v/v)
Für die Freisetzung des Hydroxyprolins aus den Kollagenfragmenten wurden 30 µl Probe mit
20 µl 5 M NaOH versetzt und durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min hydrolysiert. Dazu
wurden die 1,5 ml-Reaktionsgefäße mit Rotilabo® -Verschlussclips versehen, um einen
dichten Verschluss sicherzustellen. Durch Zugabe von 450 µl frisch hergestelltem Chloramin-
T-Reagenz und 25 min Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte eine Oxidation des
freigesetzten Hydroxyprolins. Die anschließende Zugabe von 500 µl frisch hergestelltem
Ehrlich-Reagenz und eine 20-minütige Inkubation bei 65 °C und 600 rpm bewirkten eine
Chromophorbildung. Die Absorption wurde bei den Wellenlängen 550 und 655 nm und einer
Schichtdicke von 10 mm mit dem Spektralphotometer Specord 200 bei Raumtemperatur
gemessen. Als Referenz diente bideionisiertes Wasser. Mit der Software Winaspekt,
Version 2.1, konnte die Differenz A550 nm - A655 nm berechnet und graphisch dargestellt werden.
Zur Kalibrierung wurde eine Hydroxyprolin-Verdünnungsreihe aus einer Hydroxyprolin-
Stammlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Es bestand eine lineare
Korrelation zwischen der Absorptionsdifferenz A550 nm - A655 nm und einem Hydroxyprolin-
Gehalt von 0 bis 4,5 µg im Standardansatz. Die Hydroxyprolin-Bestimmung wurde als
Doppelbestimmung für Standards und Proben durchgeführt. Die Berechnung der
gespaltenen Kollagenmenge beruht auf dem durchschnittlichen Hydroxyprolingehalt von
12,5 % in Kollagen [EDWARDS & O' BRIEN, 1980].
Abbildung 3.2: Eichgerade für die Hydroxyprolin-Bestimmung (repräsentatives Beispiel)
In Abbildung 3.2 ist die lineare Beziehung zwischen der Absorptionsdifferenz A550 nm - A655 nm
und dem Hydroxyprolin-Gehalt im Standardansatz von 0 bis 4,5 µg dargestellt.
Material und Methoden 56
Nachweis mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Für den Nachweis der Kollagenolyse mithilfe der SDS-PAGE bildete die Veröffentlichung von
RODIER et al. [1999] die Grundlage. Für die Ansätze wurden zwei verschiedene Kollagen-
Stammlösungen mit 1 mg/ml aus säurelöslichem Typ-I-Kollagen und Typ-IV-Kollagen
hergestellt. Während Typ-I-Kollagen in 1 % Essigsäure und Fluorimetriepuffer gelöst werden
konnte, wurde aufgrund der schlechteren Löslichkeit bei Typ-IV-Kollagen 5 % Essigsäure
und Fluorimetriepuffer eingesetzt. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
(1) 18 µl Typ-I- oder Typ-IV-Kollagen-Stammlösung + 26 µl gereinigte Peptidase + 76 µl TBS (Gesamtprotein: 18,6 µg)
(2) 18 µl Typ-I- oder Typ-IV-Kollagen-Stammlösung + 102 µl TBS (Gesamtprotein: 18 µg) (3) 26 µl gereinigte Peptidase + 94 µl TBS (Gesamtprotein: 0,6 µg) (4) 18 µl Typ-I- oder Typ-IV-Kollagen-Stammlösung + 30 µl Kollagenase A (20µg/ml) +
72 µl TBS (Gesamtprotein: 18,6 µg)
Das Volumen pro Reaktionsansatz betrug 120 µl, die Endkonzentration der Kollagene im
Ansatz 150 µg/ml.
Die Konzentration der gereinigten Peptidase und der Kollagenase A (Clostridium
histolyticum) im Reaktionsansatz war 5 µg/ml. Die Ansätze wurden 20 h bei 37 °C und
600 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit 20 % Probenpuffer und 4 %
β-Mercaptoethanol versetzt, bei 95 °C für 5 min denaturiert und auf eine SDS-PAGE
aufgetragen (siehe Abschnitt 3.2.7).
3.2.14 Dentinscheibengewinnung und Dentinabbau-Test
Zur Untersuchung der Fähigkeit von Candida albicans zur Dentinkollagenhydrolyse diente
humanes Dentin. Für die Gewinnung von Dentinkernen aus Weisheitszähnen, gelagert in
physiologischer Kochsalzlösung, wurden der gesamte Zahnschmelz, das Wurzelzement und
die Pulpakammerwände großzügig mittels diamantierter Schleifer hochtourig und unter
Wasserkühlung entfernt. Zum Einspannen in eine Schneidemaschine war das Einbetten der
Wurzelbereiche der Dentinkerne in einem PMMA-Kunststoff erforderlich. Anschließend
erfolgte das Scheibenschneiden mit der automatischen Präzisionstrennmaschine und
Präzisionsschleifmaschine Accutom 50. Die 0,4 mm dünnen Dentinscheiben aus dem
Kronenbereich der Zähne wurden gründlich mit destilliertem Wasser gespült, um
Schleifmittelrückstände zu entfernen. Eine optische Kontrolle stellte sicher, dass die
Scheiben keine an das Dentin angrenzenden Gewebe beinhalteten. Anschließend
inkubierten die Scheiben in EDTA-Entkalker Osteosoft nach Angaben des Herstellers für
Material und Methoden 57
eine Woche. Die demineralisierten Scheiben wurden mit sterilem Aqua destillata gewaschen
und in kleine Stücke von etwa 1,5 mg geteilt. Die Dentinscheibenstücke wurden mit
unterschiedlichen enzymhaltigen Proben von Candida albicans bzw. Kontrolllösungen 24 h
lang bei 37 °C und 600 rpm inkubiert. Als Kontrollen wurden Pufferlösungen oder
denaturierte Probe eingesetzt. Die Denaturierung erfolgte bei 95 °C für 5 min. Der pH-Wert
wurde überprüft und gegebenenfalls mit HCl oder NaOH auf 3,5 bzw. 7,4 adjustiert. Der
Dentinabbau-Test wurde mindestens als Doppelbestimmung durchgeführt. Nach der
Inkubation wurden die Proben vorsichtig bei 800 × g für 3 min zentrifugiert, der Überstand
abgenommen und der Hydroxyprolin-Bestimmung zugeführt.
Die Reaktionsansätze waren wie folgt zusammengesetzt:
3 Dentinscheibenstücke + Enzymlösung bzw. Kontrolllösung 100 µl (1) – (6)
(1) gereinigte Peptidase in TRIS-Puffer 20 mM, pH 7,4 (5 µg/ml und 22,02 µg/ml) (2) TRIS-Puffer 20 mM, pH 7,4 (Kontrolle) (3) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, pH 3,5 (4) Kulturüberstand von C. albicans ATCC 2091 oder OMZ 1066, denaturiert, pH 3,5 (Kontrolle) (5) Sap2 (5 µg/ml; Fa. TaKaRa) in 50 mM Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (6) 50 mM Natrium-Citrat-Puffer, pH 3,5 (Kontrolle)
4. Ergebnisse
4.1 Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand
Aufgrund des Nachweises einer Metallopeptidase von Candida albicans in der Zellwand [EL
MOUDNI et al., 1997] wurde ein Herauslösen des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand
angestrebt. Das Ziel war die Gewinnung eines Zellwandextraktes mit einem hohen Enzym-
anteil am Gesamtprotein.
4.1.1 Vergleich von verschiedenen Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand
Zellen des Candida-albicans-Stammes ATCC 2091 wurden zum Herauslösen des Enzyms
aus der Zellwand mit verschiedenen Agenzien nach im Abschnitt 3.2.4 beschriebener
Methode inkubiert. Mercaptoethanol, ein SH-Reagenz, spaltet Disulfidbrücken von Proteinen
reduktiv und löst so Proteingefüge. Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergenz (Tensid),
das nicht denaturierend wirkt und elektrostatische Bindungen verändern kann. Weiterhin
wurde versucht, die Pilzzellwand enzymatisch anzugreifen. Glukane bilden einen
Hauptbestandteil der Pilzzellwand und können durch Lyticase, die eine β-1,3-Glukanase
enthält, gespalten werden [CHAFFIN et al., 1998]. Dadurch werden in der Zellwand integrierte
Proteine freigesetzt. Jeder Ansatz enthielt gleichgroßes Hefezellfeuchtgewicht.
0
0,5
1
1,5
2
Kontrolle Triton X-100 2-ME Lyticase
Vol
umen
aktiv
ität [
mU
/ml]
Abbildung 4.1: Volumenaktivität verschiedener Zellwandextrakte und Zellwandlysat
Die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch die aus der Zellwand von Candida albicans gewonnenen Extrakte ist dargestellt. Die Hefezellen wurden in PBS-Puffer (Kontrolle), Triton X-100 3,4 mM, β-Mercaptoethanol (2-ME) 46 mM oder Lyticase 20 U/ml inkubiert. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt (n = 3).
Ergebnisse 59
4.1.2 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien
Candida-albicans-Zellen des Stammes ATCC 2091 wurden in verschiedenen Nährmedien
kultiviert und die gewonnenen Zellsuspensionen mit Lyticase inkubiert, wie im Abschnitt 3.2.4
beschrieben. Anschließend wurde die L-Arg-AMC-Aktivität der Zellwandlysate verglichen.
Wie in Abbildung 4.2 dargestellt ist, war die L-Arg-AMC-Aktivität der Zellwandlysate
gewonnen aus Flüssigkulturen höher als die vom Festmedium Sabouraud-Glukose-Agar.
0
1
2
3
4
5
Sabouraud BHI YNB-Glc YCB-RSA
Vol
umen
aktiv
ität [
mU
/ml]
Abbildung 4.2: Volumenaktivität der Zellwandlysate aus verschiedenen Kulturmedien
Dargestellt ist die Aktivität verschiedener Zellwandlysate von Candida albicans mit L-Arg-AMC als Substrat. Die Hefezellen wurden in Brain-Heart-Infusion (BHI), Yeast Carbon Base mit 0,2 % Rinder-Serum-Albumin (YCB-RSA), Yeast Nitrogen Base mit 3,5 % Glukose (YNB-Glc) oder auf Sabouraud-Glukose-Agar kultiviert. Pro Ansatz wurde gleiches Hefezellfeuchtgewicht eingesetzt. Die Zellsuspensionen mit einer Zell-dichte von 0,33 g Zellen/ml wurden mit 80 U/ml Lyticase versetzt und 13 h inkubiert. Es erfolgten Doppelbestimmungen (n = 2).
Die hohe Aktivität der in RSA-haltigem Medium gezüchteten Zellen war allerdings mit der
niedrigsten Hefezellausbeute assoziiert. Eine Ordnung der Zelldichte im Flüssigmedium vom
höchsten zum niedrigsten Wert ergibt folgende Reihenfolge: BHI > YNB-Glc > YCB-RSA.
4.1.3 Vergleich Zellaufschluss - Zellwandlyse
Ziel war eine Verbesserung der Aufarbeitung des biologischen Ausgangsmaterials (Hefe) zur
Enzymisolierung. Die Wirkung der Lyticase an der Zellwand konnte durch mikroskopische
Untersuchung der Hefezellen beobachtet werden. Mit andauernder Lyticaseeinwirkung
wurden eine dünner werdende Zellwand und eine Zunahme von freien Zellkernen
beobachtet. Nach der vierten Lysestufe des Zellwandlyseschemas der Enzympräparation
(Abschnitt 3.2.4) waren 10 bis 20 % der Zellen lysiert. Die spezifische Aktivität des Zell-
extraktes (zentrifugierter und sterilfiltrierter Zellaufschluss) und der gepoolten Zellwandlysate
Ergebnisse 60
wurde aus der Volumenaktivität mit L-Arg-AMC als Substrat und dem Proteingehalt
bestimmt. Der Zellwandlysatepool des Vorversuchs erreichte eine etwa 17fach höhere
spezifische Aktivität als Zellextrakt (Tabelle 4.1). Die spezifische Aktivität des Lysatepools für
die im Abschnitt 3.2.6 dargestellte Enzymreinigung lag allerdings nur knapp über der des
Zellextrakts. Der Lysatepool konnte bis zur weiteren Verwendung bei - 80 °C mit vernach-
lässigbaren Aktivitätsverlusten gelagert werden.
Tabelle 4.1: Vergleich von Zellextrakt und Zellwandlysat
Volumenaktivität[U/ml]
Proteinkonzentration [mg/ml]
spezifische Aktivität[U/mg]
Zellextrakt 0,427 8,487 0,050
Zellwandlysatepool Vorversuch 0,058 0,060 0,971
Zellwandlysatepool Enzympräparation 0,024 0,448 0,053
Der Zellextrakt wurde aus einer Zellsuspension mit 0,5 g Zellen/ml und Zellwandlysat aus
Zellsuspension mit 0,33 g Zellen/ml gewonnen.
4.2. Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus Zellwandlysat
Ziel war die Gewinnung eines hochgradig gereinigten Enzyms, das anschließend molekular
und funktionell charakterisiert werden sollte. Jeder Reinigungsschritt wurde einzeln bilanziert
(Tabelle 4.2). Der Reinigungsfortschritt wurde außerdem mittels SDS-Gelelektrophorese
optisch dargestellt (Abbildung 4.8).
4.2.1 HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
Nach Dialyse und Sterilfiltration des Zellwandlysatepools wurde ein Volumen von 138 ml
erhalten, von dem 136,5 ml auf eine HiLoad 26/10 Q Sepharose HP-Säule aufgetragen
wurden. Jede der 1,5 ml-Fraktionen wurde auf L-Arg-AMC-Hydrolyse untersucht und ein
Aktivitätsprofil erstellt. Das ungebundene Protein (gekennzeichnet in Abbildung 4.3) zeigte
keine Spaltung von L-Arg-AMC. Im Eluat konnte ein Aktivitätspeak, der sich über 12 Frak-
tionen erstreckte, gemessen werden. Etwa 90 % der in den Fraktionen gefundenen Aktivität
wurde gepoolt. Das Poolvolumen betrug 10,6 ml. Abbildung 4.3 zeigt das Chromatogramm
für den ersten Reinigungsschritt mit eingezeichneter Enzymaktivität und den Poolgrenzen.
Ergebnisse 61
Abbildung 4.3: Chromatographie des Zellwandlysats an HiLoad 26/10 Q Sepharose HP Dargestellt ist das Elutionsprofil der Zellwandlysat-Proteine nach Trennung anhand elektrischer Ladungsunterschiede. Die Elution erfolgte bei einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitätsprofil).
4.2.2 Mono Q HR 5/5
Das Volumen des entsalzten Pools nach Chromatographie-Schritt 1 wurde mit TRIS/HCl-
Puffer auf 20 ml ergänzt, von dem 18,8 ml auf eine Mono Q HR 5/5-Säule aufgetragen
wurden. In 16 der 150 µl-Fraktionen konnte L-Arg-AMC-Hydrolyse gemessen werden.
Gepoolt wurden neun Fraktionen, die 89 % der wieder gefundenen Enzymaktivität
beinhalteten und ein Poolvolumen von 1,34 ml ergaben. Abbildung 4.4 zeigt das
Chromatogramm für den zweiten Reinigungsschritt mit eingezeichneter Enzymaktivität und
den Poolgrenzen. Zur Entsalzung des erhaltenen Pools wurde das Volumen mit TRIS/HCl-
Puffer auf 2,5 ml ergänzt und auf eine PD-10-Säule aufgetragen. Das Elutionsvolumen
betrug 3,5 ml und wurde mit TRIS/HCl-Puffer zu 5 ml aufgefüllt. Durch die Entsalzung kam
es zu einem geringen Verlust an totaler Aktivität von maximal 5%.
Ergebnisse 62
Abbildung 4.4: Chromatographie an Mono Q HR 5/5 Dargestellt ist das Elutionsprofil einer Mono Q HR 5/5-Säule nach Auftragen des HiLoad 26/10 Q Sepharose HP-Pools. Die Elution erfolgte bei einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitäts- profil). Für die Rechromatographie an einer Mono Q HR 5/5-Säule wurden 4,8 ml aufgetragen. Der
Anstieg des NaCl-Gradienten von 0 auf 0,5 M wurde gestreckt. Die Aktivität war über elf
Fraktionen verteilt, von denen sieben gepoolt wurden (Abbildung 4.5). Das Poolvolumen
betrug 1,03 ml und beinhaltete 86 % der wieder gefundenen Enzymaktivität. Das
Chromatogramm der Rechromatographie mit eingezeichneter Enzymaktivität und den
Poolgrenzen ist in Abbildung 4.5 gezeigt. Durch den niedrigeren Anstieg des NaCl-
Gradienten konnte eine geringfügig bessere Trennung erreicht werden. Die Poolgrenzen
wurden bewusst eng gewählt, um das Probevolumen für die nachfolgende Gelfiltration gering
zu halten.
Ergebnisse 63
Abbildung 4.5: Chromatogramm nach Rechromatographie an Mono Q HR 5/5 Dargestellt ist das Elutionsprofil nach Rechromatographie an einer Mono Q HR 5/5- Säule. Die Elution erfolgte bei einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,5 M. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitätsprofil).
4.2.3 Superdex 200 10/300 GL
Die Gelfiltration an einer Superdex 200 10/300 GL-Säule ergab eine Verteilung der
Peptidase-Aktivität über 12 Fraktionen (Abbildung 4.6). Die ersten vier Läufe zeigten ein
nahezu deckungsgleiches Chromatogramm, das exemplarisch für den ersten Lauf in
Abbildung 4.6 dargestellt ist. Der fünfte Lauf wich quantitativ etwas von den vorhergehenden
ab, da hier ein geringeres Probenvolumen und damit eine geringere Proteinmenge
eingesetzt wurde. Gepoolt wurden pro Lauf sechs Fraktionen und die Pools der einzelnen
Läufe anschließend vereinigt. Der 6 ml große Pool beinhaltete 82,6 % der wieder
gefundenen Enzymaktivität.
Ergebnisse 64
Abbildung 4.6: Chromatographie an Superdex 200 10/300 GL Dargestellt ist das Elutionsprofil einer Superdex 200 10/300 GL-Säule nach Auf- tragen des Mono Q HR 5/5-Pools. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3). Die unterbrochenen vertikalen Linien im Chromatogramm begrenzen die zur weiteren Reinigung vereinigten Fraktionen (blau gefüllte Balken im Aktivitätsprofil).
4.2.4 RESOURCE TM ETH
Der Gelfiltrations-Pool wurde mit Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine 60%ige
Ammoniumsulfatsättigung resultierte und das Volumen auf 15 ml anstieg. Die drei Läufe auf
einer RESOURCE TM ETH-Säule mit je 5 ml Probe zeigten ein qualitativ und quantitativ
vergleichbares Aktivitätsprofil und Chromatogramm (Abbildung 4.7). Die Abbildung stellt den
repräsentativen ersten Lauf dar. Der Aktivitätspeak war über sieben Fraktionen verteilt. Die
sich entsprechenden Einzelfraktionen der drei Läufe wurden separat gepoolt und jeder der
Einzelpools separat dialysiert. Die Enzymcharakterisierung wurde mit den Fraktionen D1 und
D2 nach RESOURCE TM ETH durchgeführt, wobei D2 zur Untersuchung der Endopeptidase-
Aktivität diente.
Ergebnisse 65
Abbildung 4.7: Chromatographie an RESOURCE TM ETH
Dargestellt ist das Elutionsprofil einer RESOURCE TM ETH-Säule nach Auftragen des
Superdex 200 10/300 GL-Pools. Die Elution erfolgte bei einem Ammoniumsulfat- Gradienten von 60 bis 0 % Ammoniumsulfatsättigung. Zum Nachweis der Peptidase diente das Substrat L-Arg-AMC (siehe Abschnitt 3.2.3).
4.2.5 Zusammenfassung der Enzymreinigung
Tabelle 4.2: Bilanz der Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand 1 U entspricht der Menge an Enzym, die 1 µmol AMC pro Minute durch Hydrolyse von L-Arg-AMC unter Standardmessbedingungen freisetzt.
Reinigungs-schritt
Volumen [ml]
Protein-gehalt [mg/l]
Gesamt-protein
[mg]
Volumen-aktivität
[U/ml]
Totale Aktivität
[U]
Spezif. Aktivität [U/mg]
Reini-gungs-faktor
Aus-beute
[%]
Zellwandlysat 138,00 425,35 58,698 0,022 3,034 0,05 1,00 100,0
HiLoad 26/10 Q Sepharose HP * 19,60 348,94 6,839 0,121 2,369 0,35 6,70 78,1
Mono Q HR 5/5 * 5,00 309,85 1,549 0,356 1,779 1,15 22,2 58,6
Mono Q HR 5/5 * 1,03 571,89 0,589 1,173 1,208 2,05 39,7 39,8
Superdex 200 10/300 GL * 6,00 39,46 0,237 0,091 0,547 2,31 44,7 18,0
RESOURCE TM
ETH * 0,98 22,02 0,022 0,056 0,055 2,56 49,5 1,8
Ergebnisse 66
Die mit (*)-gekennzeichneten Daten beziehen sich auf das Protein bzw. Enzym in den
gepoolten Fraktionen nach dem jeweiligen Reinigungsschritt und gegebenenfalls Entsalzung.
In Tabelle 4.2 ist der Reinigungsverlauf des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand
zusammengefasst und bilanziert. Abbildung 4.8 zeigt den Fortschritt der Enzymreinigung
durch die Darstellung des Proteinmusters der verschiedenen Reinigungsstufen in der SDS-
PAGE. Abbildung 4.9 stellt die Fraktionen nach RESOURCE TM ETH mit dem höchsten
Peptidase-Gehalt dar.
Abbildung 4.8: Proteinmuster der Reinigungsschritte in der SDS-PAGE Spur 1: Zellwandlysatepool nach Dialyse (26 µg) Spur 2: Pool nach HiLoad 26/10 Q Sepharose HP-Chromatographie, dialysiert (19 µg) Spur 3: Pool nach Mono Q HR 5/5-Chromatographie, entsalzt mittels PD-10 (9,6 µg) Spur 4: Pool nach Mono Q HR 5/5-Rechromatographie, dialysiert (14 µg) Spur 5: Pool nach Superdex 200 10/300 GL-Chromatographie (7,9 µg) + Spur 6: Fraktion D1 nach RESOURCE
TM ETH-Chromatographie (4,4 µg) + Rechte Spur: Molekularmassenstandard (Low Range, 9 µg) Die mit (+)-gekennzeichneten Proben wurden von 200 µl mittels Vakuum- Konzentrators eingeengt. Zur Färbung des Gels diente Coomassie-Blau. In Klammern ist die aufgetragene Proteinmenge pro Spur angegeben.
Ergebnisse 67
Abbildung 4.9: Proteinmuster der RESOURCE
TM ETH-Fraktionen C15 bis D3 Spur 1: Fraktion C15 (4,6 µg) Spur 2: Fraktion D1 (4,4 µg) Spur 3: Fraktion D2 (6,3 µg■) Spur 4: Fraktion D3 (6,0 µg■) Rechte Spur: Molekularmassenstandard (Low Range, 9 µg) Die mit (■)-gekennzeichneten Angaben wurden aus dem Flächenintegral des RESOURCE
TM ETH-Chromatogramms geschätzt. Zur Färbung des Gels diente Coomassie-Blau. In Klammern ist die aufgetragene Proteinmenge pro Spur angegeben. Die Isolation eines L-Arg-AMC-hydrolysierenden Enzyms aus Zellwandlysat des Candida-
albicans-Stammes ATCC 2091 ergab ein Präparat mit einer Reinheit von etwa 95 %. Die
spezifische katalytische Aktivität des isolierten Enzyms von 2,56 U/mg für L-Arg-AMC
(Tabelle 4.2) stellt nicht das Maximum der katalytischen Aktivität dar, da die verwendete
Substratkonzentration von 100 µM unter Standardmessbedingungen keine Substratsättigung
gewährleistete. Detaillierte Angaben zu kinetischen Eigenschaften beinhaltet Abschnitt 4.3.4.
Ergebnisse 68
4.3. Charakterisierung des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans Nachfolgend werden die Ergebnisse der Identifizierung sowie molekularen und funktionellen
Charakterisierung der in Fraktion D1 nach RESOURCE TM ETH enthaltenen Peptidase aus
der Zellwand von Candida albicans dargestellt. Diese Fraktion zeigte den höchsten
Proteingehalt und die größte Reinheit in der SDS-PAGE.
4.3.1 Molekulare und funktionelle Identifizierung der Peptidase
Die Identifizierung des isolierten Enzyms erfolgte durch vollständigen tryptischen Verdau
einer aus einem SDS-Polyacrylamidgel ausgeschnittenen Proteinbande (In-gel digestion)
und nachfolgender Peptididentifizierung mithilfe der Massenspektrometrie (Einzelheiten
enthält Abschnitt 3.2.9). Die durch Peptididentifizierung erhaltenen Aminosäuresequenzen
passen zur Aminosäuresequenz des hypothetischen Proteins mit dem ORF CaO19.12664
(GenBank RefSeq XM 705313, Candida albicans SC5314). Das Resultat ist in der
Abbildung 4.10 gezeigt. Die rot und fett gedruckten identifizierten tryptischen Peptide
entsprechen einer Sequenzabdeckung (sequence coverage) von 63 %. Gemäß
entsprechendem NCBI-Eintrag EAK91143 ist das Enzym als Aminopeptidase ausgewiesen
und wird als Candida-albicans-Aminopeptidase 2 (CaApe2) bezeichnet. Die Übersetzung
des ermittelten ORF ergibt ein aus 954 Aminosäuren zusammengesetztes Protein mit einer
berechneten nominellen Molekularmasse von 107,361 kDa. Der größte Teil des Proteins,
bestehend aus den Aminosäuren 88 bis 954, wird von identifizierten Peptidsequenzen
abgedeckt und entspricht einer berechneten Molekularmasse von 97,607 kDa. Die Differenz
zum Wert von rund 90 kDa, der über die elektrophoretische Mobilität des CaApe2-Proteins in
der SDS-PAGE bestimmt wurde, wird im Abschnitt 5.3 ausführlich diskutiert.
Ergebnisse 69
1 MFSTARKGVI SSTGKYRPKL YHGITILNIN KSFFSKIALT HDMVGKTPNS 51 VNKNTNRHIF PFHKISNSGF SSGGQKLSYS KMCHHSRSSD NSASVVNQER 101 EVLPTNVKPL HYDLTIEPIF DNFTFKGEET IDFQVNEKTN FITLNSLEIE 151 VQEAKIDGKS VTDISFDAGK QTVTFKFDDD LSTGSIAKLY IKFTGELNDK 201 MAGFYRASYQ EDGKTKYMAT TQMEPTDCRR AFPSYDEPAA KSKFTISLIA 251 DKELVCLSNS SEKETVSLDG NKKKVTFQTT PLMSTYLVAF IVGDLRYISN 301 DNYRVPIRVY STPGTEHLGE YSANIAAQTL KFFDQQFGID YPYDKLDMVA 351 VPSFSAGAME NCGLVTFRTV DLLIDADNAN VNTKQRVTEV VMHELAHQWF 401 GDLVTMEFWD GLWLNEGFAT WMSWYACNSL YPDWKVWESY VSDSLQHALT 451 LDALRASHPI EVPVKRADEI NQIFDAISYS KGSSLLRMIS KWLGEDVFVK 501 GVSNYLKKHK WGNTKTSDLW EALSEASGED VVKVMDIWTK NIGFPIVKVE 551 EIGNGEIKVT QNRFLATGDV KESEDKTLYP VFLGLKTSEG VDESSVLETR 601 SKTIKLPTSD DFFKINGDQS GIYRTAYEPA RWTKLGKAGV EGKLSVEDRV 651 GLVADAGSLA SSGFIKTSSL LDLVKSWSKE SNYVVWNEIL TRIGSIKAAL 701 MFEDEATKKA LEIFTRDLIS EKLKETGWEF SADDSFADQQ LKSSLFASAA 751 NAEDPEAVAF AKEAFAKFIA GDKKAIHPNL RASIFNTNAK YGDEKTFDEL 801 YNIYRNPSSV EEKIAALRSF GRFTKPEILD KVTGLLLQTD IVKQQDIYIP 851 MQGLRAHKLG VEKLWTWLSE NWDQIYILLP PGLSMLGSVV TLGTSGFTKE 901 EQKKKVEEFF AQKDNKGYDQ SLAQSLDIIT AKSKWTDRDA KSIYEWLEAN 951 EYTK Abbildung 4.10: Identifizierung der isolierten Peptidase von Candida albicans Die Korrelation der Fragmente (rot und fett gedruckt) mit der Protein-Datenbank NCBInr unter Verwendung der Mascot-Software [PERKINS et al. 1999] ergab das hypothetische Protein CaO19.12664 (Candida albicans SC5314) mit einer Sequenz- abdeckung von 63 %. Das Protein weist eine nominelle Molekularmasse von 107,361 kDa auf, wird als Aminopeptidase ausgewiesen und erhält in dieser Arbeit die Bezeichnung Candida-albicans-Aminopeptidase 2 (CaApe2).
4.3.2 Vergleichende Sequenzanalyse der isolierten Peptidase mit homologen Proteinen der Ascomycota
Die vergleichende Sequenzanalyse wurde mithilfe des Programms CLUSTALW [THOMPSON
et al., 1994; http://www.ebi.ac.uk/clustalw/] vorgenommen. Die BLAST-Suche mit der
Sequenz von Ca_hp EAK91143 gegen alle verfügbaren Proteinsequenzen der Ascomycota
identifizierte 53 homologe Proteine. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die den höchsten
Übereinstimmungsgrad aufweisenden ersten sechs Sequenzen dargestellt (Abbildung 4.11).
Bindestriche wurden von CLUSTALW eingefügt, um Aminosäuren an der jeweils homologen
Position zu platzieren. Sternchen zeigen identische Aminosäuren an, Doppelpunkte
markieren konservierte Substitutionen und Punkte symbolisieren semi-konservierte
Substitutionen.
Ergebnisse 70
Ca_hp MFSTARKGVISSTGKYRPK--LYHGITILNINKSFFSKIALTHDMVGKTPNSVNKNTNRH 58 Ps_Aap ------------------------------------------------------------ Dh_hp --KMSRYLLVNCKNRLTPLRASFNKASPNTRNHIYQQNRRISFSHAPHKFKSYLPSVNGL 58 Af_Ape --------MRRFSSARLPLVLNSARPPLSSPSTKPLLLLSRSASLFSSSPSTSVNRIAPR 52 An_hp ------------------------------------------------------------ Nc_hp ------------------------------------------------------------ Ca_hp IFPFHKISNSGFSSGGQKLSYSK-MCHHSRSSDNSASVVNQ-EREVLPTNVKPLHYDLTI 116 Ps_Aap ------------------------MCRHS-SSD-SSLVVPA-DREVLPTNVKPLHYDLTL 33 Dh_hp TSLFKSIALRFKRNHHSQLSLIKSMCRNNTESS-SSQVVPQ-DREVLPTNVKPLHYDLTL 116 Af_Ape RFPLSQVAKRYCSYRR--------MCMSRRTDVPSGSTNVTHGREVLPTNVKPVHYDLTL 104 An_hp ------------------------MCGTRRAEA-AGSTNVP-GREVLPTNVKPTHYDLTL 34 Nc_hp ------------------------MCRTQAQADVASGVNIQ-GRELLPTNVIPKHYHITL 35 ** :. . **:***** * **.:*: Ca_hp EPIFDNFTFKGEETIDFQVNEKTNFITLNSLEIEVQEAKIDG-----KSVTDISFDAGKQ 171 Ps_Aap EPIFSTFKFNGQETIDFHVNEDTDYITLNSLEIEIQEAIING-----SAVSDISFNVDKQ 88 Dh_hp EPNFETFKFDGQVIIDLHVNEYSDYVTLNCLEIDIHEAKIND-----VETKKIEFNEDQQ 171 Af_Ape EPNFEKFTYDGTVIIDLEVAEDTTSISLNTNEIDIHEAVVSSQGSVVTSSPDISINKDNQ 164 An_hp EPNFETFKYDGTVIIDLQVAEDTTSISLNSTEIDIHTATVSAQGSVVSSSPEILLNKDKQ 94 Nc_hp EPDFQKLTFDGTVVIDLDVEEDSKSISLHTLEIDIHNAKITSGGQTVSSSPKVSYNETTQ 95 ** *..:.:.* **:.* * : ::*: **::: * : .: : * Ca_hp TVTFKFDDDLSTGSIAKLYIKFTGELNDK 200 Ps_Aap TVTFKLPQPLAQGSNAKLALKFTGDLNNK 117 Dh_hp SVTFKFADHLVSGADARLSIKFTGELNDK 200 Af_Ape TATIKFAKTIPAGSSAQLKLTFSGILNDN 193 An_hp EATIKFSETISAGSSAQLKLTFTGTLNDN 123
Abbildung 4.11: Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenzen der Aminopeptidase CaApe2 aus Candida albicans mit homologen Proteinen anderer Ascomycota
Die Suchsequenz Ca_hp ist blau dargestellt. Aminosäuren, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden, sind in roter Farbe gezeigt. Nähere Erläuterungen sind dem Text zu entnehmen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen bedeuten: Ca_hp = hypothetisches Protein EAK91143 aus Candida albicans; Ps_Aap = Alanin/Arginin-Aminopeptidase XP_001385797 aus Pichia stipitis; Dh_hp = hypothetisches Protein XP_459061 aus Debaryomyces hansenii; Af_ap = Aminopeptidase XP_751922 aus Aspergillus fumigatus; An_hp = hypothetisches Protein EAA64758 aus Aspergillus nidulans; Nc_hp = hypothetisches Protein EAA29936 aus Neurospora crassa.
4.3.3 pH-Optimum der Enzymaktivität der isolierten Peptidase
Die spezifische katalytische Aktivität der isolierten Peptidase für das Substrat L-Arg-AMC bei
einer Konzentration von 100 µM wurde für den pH-Bereich von 3 bis 11 untersucht. Drei
verschiedene Puffersysteme dienten zur Abdeckung dieses breiten pH-Bereichs. Die pH-
Aktivitäts-Kurve ist in Abbildung 4.12 dargestellt. Die maximale Aktivität des gereinigten
Enzyms für das Testsubstrat L-Arg-AMC wurde bei einem pH-Wert von 7,2 bestimmt.
CaApe2 wird somit der Gruppe der neutralen Aminopeptidasen zugeordnet.
Ergebnisse 71
Abbildung 4.12: pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 Der pH-Bereich von 3 bis 11 wurde mit 3 verschiedenen Puffersystemen abgedeckt. Es wurde je pH-Wert mindestens eine Vierfachbestimmung durchgeführt (n ≥ 4).
4.3.4 Substratspezifität und Enzymkinetik der isolierten Peptidase
Die Zuordnung von CaApe2 zur Unterklasse der Alanin/Arginin-spezifischen Amino-
peptidasen legte den Einsatz von Peptidsubstraten zur Analyse der Enzymkinetik nahe. Die
verwendeten Substrate verfügten über einen N-terminalen Aminosäurerest. Untersucht
wurde die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration bei der
enzymatischen Hydrolyse von L-Arg-AMC und L-Ala-AMC durch die gereinigte Peptidase.
Das isolierte Enzym akzeptierte noch ein drittes Substrat, L-Leu-AMC. Die Hydrolyse von
makromolekularen Substraten wird in Abschnitt 4.4 beschrieben.
Enzymkinetik für das Substrat L-Arginin-7-amido-4-methylcoumarin
Der Zusammenhang von Hydrolysegeschwindigkeit des L-Arg-AMC-Substrates und der
L-Arg-AMC-Konzentration ist in Abbildung 4.13 dargestellt. Der Kurvenverlauf zeigt zunächst
die Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substratkonzentration, fällt aber
bei hohen Substratkonzentrationen unerwartet wieder ab (grüne Linie in der Abbildung 4.13).
Die letztgenannte Beobachtung konnte unter Berücksichtigung der Tatsache, dass
L-Arg-AMC in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst wurde, experimentell untersucht werden.
Dazu wurde eine Substratlösungsreihe mit gleichbleibender Substratkonzentration von
100 µM und ansteigender DMSO-Konzentration hergestellt. Die Messreihe ergab ein
Ergebnisse 72
Abfallen der Enzymaktivität mit steigender DMSO-Konzentration (Daten nicht gezeigt).
Mithilfe dieser Daten konnte die beobachtete biphasische v/S-Kinetik des Enzyms korrigiert
werden. Die Korrektur wurde mit dem Programm Sigma Plot durchgeführt und ist als
schwarze fettgedruckte Linie in Abbildung 4.13 dargestellt. Das zur Berücksichtigung des
DMSO-Hemmeffektes zugrunde gelegte Inhibitions-Modell ist im Abschnitt 3.2.11 ausführlich
beschrieben.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 100 200 300 400 500 600Konzentration von L-Arg-AMC [µM]
Spe
zifis
che
Akt
ivitä
t [U
/mg]
Abbildung 4.13: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Arg-AMC-Konzentration
Die grüne Linie zeigt die biphasische v/S-Kinetik, die schwarze Linie die den DMSO-Hemmeffekt berücksichtigende v/S-Kinetik. Für jede Substratkonzentration erfolgte mindestens eine Dreifachbestimmung (n ≥ 3).
Die Daten nach der Korrektur des DMSO-Einflusses ermöglichten eine Berechnung der
charakteristischen kinetischen Parameter und für das Substrat L-Arg-AMC
(Tabelle 4.3).
MaxV MK
Tabelle 4.3: Zusammenstellung kinetischer Parameter von CaApe2 Legende: = maximale Reaktionsgeschwindigkeit MaxV = Michaelis-Menten-Konstante MK = Hemmkonstante für DMSO IIK
Kennwert L-Arg-AMC L-Ala-AMC
MaxV [U/mg] 2,92 ± 0,063 4,25 ± 0,576
MK [µM] 1,48 ± 0,077 32,40 ± 4,520
IIK [M] 0,07 ± 0,001 0,04 ± 0,003
Ergebnisse 73
Enzymkinetik für das Substrat L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin
Der Zusammenhang von Hydrolysegeschwindigkeit des Substrates L-Ala-AMC und der
L-Ala-AMC-Konzentration ist in Abbildung 4.14 dargestellt. Auch für das synthetische Sub-
strat L-Ala-AMC zeigt sich der schon für L-Arg-AMC gefundene Abfall der Reaktionsge-
schwindigkeit bei hohen Substratkonzentrationen. Für die Korrektur der Substrat-
abhängigkeitskurve für L-Ala-AMC wurde ebenfalls der DMSO-Hemmeffekt auf das Enzym
untersucht. Zwei Messreihen bei 100 µM und 300 µM L-Ala-AMC und steigender DMSO-
Konzentration ergaben jeweils ein Abfallen der Enzymaktivität (Daten nicht gezeigt). Die
Korrektur der Substratabhängigkeitskurve durch die DMSO-Hemmkurven wurde ebenfalls
mit dem Programm Sigma Plot vorgenommen. Die um den DMSO-Hemmeffekt korrigierte
v/S-Kinetik zeigt die schwarze fettgedruckte Linie in Abbildung 4.14.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 200 400 600 800 1000 1200
Konzentration von L-Ala-AMC [µM]
Spez
ifisc
he A
ktiv
ität [
U/m
g]
Abbildung 4.14: Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Ala-AMC-Konzentration
Die grüne Linie zeigt die biphasische v/S-Kinetik, die schwarze Linie die den DMSO-Hemmeffekt berücksichtigende v/S-Kinetik. Es wurde für jede Substratkonzentration mindestens eine Vierfachbestimmung durchgeführt (n ≥ 4).
Die Daten nach Korrektur des DMSO-Einflusses ermöglichten eine Berechnung der
charakteristischen kinetischen Parameter VMAX und KM für das Substrat L-Ala-AMC
(Tabelle 4.3). Darüber hinaus ist die Hemmkonstante für DMSO aufgeführt. Der Einfluss des
Substratlösungsmittels auf die Enzymaktivität wird in Abschnitt 5.4.2 diskutiert.
Ergebnisse 74
Hydrolyse von L-Leu-AMC
Die Aktivität der Peptidase wurde auch für das Substrat L-Leu-AMC bestimmt. Die Ab-
bildung 4.15 zeigt die Enzymaktivität für zwei verschiedene L-Leu-AMC-Konzentrationen. Der
niedrigere Wert für die höhere Substratkonzentration lässt sich vermutlich durch die
Hemmung der Peptidase durch Methanol, in dem das Substrat L-Leu-AMC gelöst war,
erklären. Eine Substrathemmung könnte ebenfalls beteiligt sein. In weiterführenden
Versuchen wurde für das Substrat L-Leu-AMC die Abhängigkeit der Reaktions-
geschwindigkeit von der L-Leu-AMC-Konzentration genauer untersucht und die Kennwerte
der Michaelis-Menten-Kinetik bestimmt [KLINKE et al., 2008].
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
100 300Konzentration von L-Leu-AMC [µM]
Spe
zifis
che
Akt
ivitä
t [U
/mg]
Abbildung 4.15: Spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase mit L-Leu-AMC als Substrat Es wurden Vierfachbestimmungen durchgeführt (n = 4).
4.3.5 Wirkung von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen auf die L-Alanin-7-amido-4-methylcoumarin-Hydrolyse durch die Peptidase
Die hydrolytische Aktivität von Peptidasen kann durch gruppenspezifische Inhibitoren
gehemmt werden. Die spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase für das Substrat
L-Arg-AMC in der Konzentration von 100 µM wurde im Inhibitoren-Reaktionsansatz bei
Anwesenheit von Phenanthrolin, EDTA, Pepstatin und PMSF bestimmt (siehe Abschnitt
3.2.11). Die Bestimmung der Peptidaseaktivität des Inhibitoren-Reaktionsansatz erfolgte wie
für den Standard-Reaktionsansatz bei Standardmessbedingungen. Der Einfluss von Metall-
kationen auf die Enzymaktivität wurde mit Kalziumchlorid und Zinkchlorid untersucht.
Ergebnisse 75
Einfluss von Phenanthrolin auf die Enzymaktivität
Die Wirkung von Phenanthrolin auf die L-Arg-AMC-Hydrolyse durch das isolierte peptido-
lytische Enzym ist in Abbildung 4.16 dargestellt. Phenanthrolin bildet speziell mit Zink
Chelate. Eine Hemmung der Enzymaktivität um 50 % trat bei einer Phenanthrolin-
Konzentration von 83 µM auf. Bei einer Phenanthrolin-Konzentration von 1 mM betrug die
prozentuale Hemmung unter Standardmessbedingungen 96 %. Das Phenanthrolin-
Lösungsmittel Methanol bewirkte ebenfalls eine Hemmung der Enzymaktivität. Methanol-
Kontrollproben dienten zur Korrektur der Werte.
Abbildung 4.16: Phenanthrolin-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 Die Abszissenachse wurde logarithmisch eingeteilt. Für jede Phenanthrolin-Konzentration wurde mindestens eine Vierfachbestimmung durchgeführt (n ≥ 4).
Einfluss von EDTA auf die Enzymaktivität
EDTA inhibiert Metalloenzyme mit zweiwertigen Metallionen durch Chelatbildung. Für EDTA
konnte ebenfalls eine Hemmung der L-Arg-AMC-Hydrolyse festgestellt werden (Ab-
bildung 4.17). EDTA zeigt schon bei sehr geringen Konzentrationen eine deutliche Wirkung.
Eine Hemmung der Enzymaktivität um 50 % trat bei einer EDTA-Konzentration von 2,2 µM
auf. Bei 0,5 mM wurde die Enzymaktivität um 75 % gehemmt. Bei steigender EDTA-
Konzentration wurde keine vollständige Hemmung der Enzymaktivität erreicht.
Ergebnisse 76
Abbildung 4.17: EDTA-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2
Die Abszissenachse wurde logarithmisch eingeteilt. Für jede EDTA-Konzentration wurde mindestens eine Fünffachbestimmung durchgeführt (n ≥ 5).
Einfluss von Pepstatin A auf die Enzymaktivität
Pepstatin A ist ein spezifischer Inhibitor der Aspartylproteinasen. Die spezifische Aktivität der
gereinigten Peptidase für das Substrat L-Arg-AMC in der Konzentration von 100 µM wurde in
Anwesenheit von Pepstatin A unter Standardmessbedingungen bestimmt. Die Enzymaktivität
wurde durch Pepstatin A bei einer Konzentration von 1 mM nicht beeinträchtigt. Aus einer
Dreifachbestimmung (n = 3) ergab sich das Konfidenzintervall zum empirischen Mittelwert für
die spezifische Aktivität der Peptidase von 2,154 U/mg mit der unteren Konfidenzgrenze von
2,107 und der oberen Konfidenzgrenze von 2,201 bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 %.
Einfluss von Phenylmethylsulfonylfluorid auf die Enzymaktivität
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gilt als Inhibitor von Serinproteinasen und einigen
Cysteinproteinasen. Die spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase für das Substrat
L-Arg-AMC in der Konzentration von 100 µM wurde in Anwesenheit von PMSF unter
Standardmessbedingungen bestimmt. Die Enzymaktivität wurde durch PMSF bei einer
Konzentration von 1 mM nicht beeinträchtigt. Aus einer Sechsfachbestimmung (n = 6) ergab
sich das Konfidenzintervall zum empirischen Mittelwert für die spezifische Aktivität der
Peptidase von 2,129 U/mg mit der unteren Konfidenzgrenze von 2,061 und der oberen
Konfidenzgrenze von 2,197 bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 %.
Ergebnisse 77
Einfluss von Metallkationen auf die Enzymaktivität
Die nach der Dissoziation von Metallsalzen entstehenden Ionen können die Enzymaktivität
beeinflussen. Während der Enzymreinigung wurde eine starke Abnahme der Volumen-
aktivität nach Ionenaustausch-Chromatographie festgestellt, die nach Dialyse gegen
TRIS/HCl-Puffer reversibel war. Die Abnahme der Enzymaktivität bei 400 mM Natriumchlorid
betrug 65 %. Beim Erstellen des Aktivitätsprofils nach Ionenaustausch-Chromatographie
konnte somit nur eine verringerte L-Arg-AMC-Hydrolyse gemessen werden.
Die Aminosäure-Sequenz des hypothetischen Proteins enthält eine mögliche Zink-
Bindungsdomäne. Dies legte die Untersuchung der Wirkung von zweiwertigen Metallionen,
insbesondere von Zink auf die Peptidase-Aktivität nahe. Exemplarisch wurde Kalziumchlorid
und Zinkchlorid eingesetzt (Abbildung 4.18). Für Kalziumchlorid in der Konzentration von
1 mM konnte eine minimale Abnahme der Enzymaktivität unter Standardmessbedingungen
festgestellt werden. Entgegen den Erwartungen bewirkte Zinkchlorid eine starke Abnahme
der Enzymaktivität, die in Abschnitt 5.4.3 diskutiert wird. Die prozentuale Hemmung bei
1 mM Zinkchlorid betrug 96 %.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Kontrolle 1 mM 1 mMCaCl2 ZnCl2
spez
ifisc
he A
ktiv
ität [
U/m
g]
Abbildung 4.18: Einfluss von Metallkationen auf die Enzymaktivität
Dargestellt wurden der Kalziumchlorid-Einfluss und der Zinkchlorid-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch die gereinigte Peptidase. Es wurde je eine Fünffachbestimmung durchgeführt (n = 5).
4.3.6 Temperaturoptimum der Enzymaktivität
Die spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase für das Substrat L-Arg-AMC in der
Konzentration von 100 µM wurde über den Temperaturbereich von 10 °C bis 60 °C unter
Standardmessbedingungen untersucht (Abbildung 4.19). Die maximale Aktivität der
gereinigten Peptidase wurde bei einer Temperatur von 30 °C gemessen. Bei physiologischer
Ergebnisse 78
Körpertemperatur von 37 °C zeigt das Enzym etwa 85 % seiner maximalen katalytischen
Aktivität.
Abbildung 4.19: Temperaturabhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 Der Temperaturbereich von 10 bis 60 °C wurde bei Standardmessbedingungen untersucht. Für jeden Temperaturwert wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt (n = 3).
4.4 Endopeptidase-Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans
Im Folgenden werden die Ergebnisse der Untersuchungen zur Einwirkung der gereinigten
Peptidase, des Kulturüberstandes, des Zellextraktes und des Zellaufschlusses (zusammen
als enzymhaltige Proben bezeichnet) auf verschiedene physiologische Substrate dargestellt.
Die enzymhaltigen Proben wurden aus C.-albicans-Zellen der Stämme ATCC 2091 und
OMZ 1066, kultiviert in YCB-RSA-Medium, gewonnen, wie in den Abschnitten 3.2.2, 3.2.5
und 3.2.6 beschrieben. Zellextrakt ist zentrifugierter und sterilfiltrierter Zellaufschluss.
Eingesetzt wurden Albumin, das von vielen Proteinasen hydrolysiert wird, und verschiedene
Kollagene, die aufgrund ihrer rigiden Struktur nur von wenigen Proteinasen gespalten
werden können. In den Versuchen wurden Typ-I-Kollagen, Typ-IV-Kollagen und
demineralisiertes humanes Dentin, das vorwiegend aus Typ-I-Kollagen besteht, verwendet.
Ergebnisse 79
4.4.1 Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans
Die proteolytische Aktivität der gereinigten Peptidase, des Kulturüberstandes und des
Zellextraktes mit Rinder-Serum-Albumin (RSA) als Substrat wurde spektralphotometrisch
bestimmt (Abbildung 4.20). Die Kulturüberstände wurden aufgrund der erwarteten Sap-
Aktivität bei einem pH-Wert von 3,5 inkubiert. Die gereinigte Peptidase und der Zellextrakt
wurden bei neutralem pH-Wert untersucht. Die Spaltung von Albumin konnte für die
Kulturüberstände und für Zellextrakt gezeigt werden, nicht aber für die gereinigte Peptidase.
Abbildung 4.20: Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans
Eingesetzte Proben mit entsprechendem pH-Wert im Reaktionsansatz: CF (2091) = Kulturüberstand des Stammes ATCC 2091, pH 3,5 CF (1066) = Kulturüberstand des Stammes OMZ 1066, pH 3,5 CWP = Zellwand-Peptidase (gereinigt), 4,4 µg/ml im Ansatz, pH 7,4 CEx (2091) = Zellextrakt des Stammes ATCC 2091, pH 7,4 Pro Reaktionsansatz wurden 600 µl RSA-Lösung mit 150 µl Probe 1 h bei 37 °C inkubiert (siehe Abschnitt 3.2.12). Nach Denaturieren durch Perchlorsäure und Zentrifugation des Reaktionsansatzes wurde die Absorption bei 280 nm der im Überstand enthaltenen freigesetzten Peptide bestimmt. Die aufgetragenen Absorptionen stellen die um Kontrollwerte verminderten Mittelwerte einer Doppel-bestimmung dar (n = 2).
4.4.2 Kollagenhydrolytische Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans Nur wenige Mikroorganismen können die stabilen tripelhelikalen Domänen der Kollagene
hydrolysieren. Die proteolytische Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans
gegenüber säurelöslichem und unlöslichem Typ-I-Kollagen wurde im Folgenden untersucht.
Der Nachweis der Degradation von unlöslichem Kollagen erfolgte durch die Bestimmung von
freigesetztem Hydroxyprolin, für säurelösliches Kollagen durch Darstellung mithilfe der SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Ergebnisse 80
Nachweis mithilfe der Hydroxyprolin-Bestimmung
Die proteolytische Aktivität der enzymhaltigen Proben gegenüber unlöslichem Kollagen ist in
Abbildung 4.21 dargestellt. Die Hydrolyse von unlöslichem Typ-I-Kollagen aus der Achilles-
Sehne des Rindes wurde bei neutralem und saurem pH-Wert untersucht, wie im Abschnitt
3.2.13 beschrieben. Bei saurem pH-Wert wurde eine Aktivität der Saps erwartet, wobei diese
auch bei neutralem pH-Wert noch gering wirksam sind. Bei neutralem pH-Wert wurde eine
neutrale kollagenolytische Aktivität der enzymhaltigen Proben erwartet. Als Positivkontrollen
wurden für pH-Wert 3,5 das kommerziell gereinigte Sap2 (Fa. TaKaRa) und für pH-Wert 7,4
Collagenase A von Clostridium histolyticum, die zum Zellextrakt gegeben wurde, eingesetzt.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
CF (1066) CF (2091) Sap 2 CD (2091) CF (2091) CWP CEx (2091) CD (2091) CD + CC
freig
eset
ztes
Kol
lage
n [µ
g]
pH 3,5 7,4
Abbildung 4.21: Kollagenhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans Eingesetzte Proben mit entsprechendem pH-Wert im Reaktionsansatz: CF (1066) = Kulturüberstand des Stammes OMZ 1066, pH 3,5 CF (2091) = Kulturüberstand des Stammes ATCC 2091, pH 3,5 Sap2 = Sap2-Enzym (Fa. TaKaRa), 5 µg/ml, pH 3,5 CWP = Zellwand-Peptidase (gereinigt), 5 µg/ml, pH 7,4 CD (2091) = Zellaufschluss (Stamm ATCC 2091), pH 7,4 CEx (2091) = Zellextrakt (Stamm ATCC 2091), pH 7,4 CD + CC = Zellaufschluss (Stamm ATCC 2091) mit Collagenase A von Clostridium histolyticum, pH 7,4 1,2 mg unlösliches Typ-I-Kollagen (Trockengewicht) wurde mit enzymhaltiger Probe 24 h bei 37 °C inkubiert (siehe Abschnitt 3.2.13). Die Menge des freigesetzten Kollagens im Überstand wurde mittels Hydroxyprolin-Bestimmung nach REDDY und ENWEMEKA [1996] ermittelt. Die aufgetragenen Kollagenmengen stellen die um Kontrollwerte verminderten Mittelwerte einer Vierfachbestimmung dar (n = 4).
Eine Kollagendegradation im sauren Milieu konnte für die Kulturüberstände, Sap2 (Fa.
TaKaRa) und Zellaufschluss gezeigt werden. Kollagen wurde stark im Überschuss
eingesetzt. Es wurde maximal 7 % des Gesamtkollagens abgebaut. Bei neutralem pH-Wert
zeigte der Kulturüberstand geringe Kollagenspaltung, die gereinigte Peptidase, der
Zellextrakt und der Zellaufschluss keine Kollagenolyse.
Ergebnisse 81
Abbildung 4.22: Analyse des Kollagenabbaus durch die gereinigte Peptidase mittels SDS-PAGE
Die gereinigte Peptidase (5 µg/ml im Ansatz) wurde mit Typ-I- und Typ-IV-Kollagen (150 µg/ml im Ansatz) 24 h bei pH 7,4 und 37 °C inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend mithilfe der SDS-PAGE nach HAMES und RICKWOOD [1990] analysiert (siehe Abschnitt 3.2.7 und 3.2.13). Zur Färbung des Gels diente Coomassie-Blau.
Spur 1: Typ-I-Kollagen ohne weitere Zusätze (18 µg) Spur 2: gereinigte Peptidase ohne weitere Zusätze (0,6 µg) Spur 3: Typ-I-Kollagen mit gereinigter Peptidase (18,6 µg) Spur 4: Typ-IV-Kollagen ohne weitere Zusätze (18 µg) Spur 5: Typ-IV-Kollagen mit gereinigter Peptidase (18,6 µg) Spur 6: Typ-IV-Kollagen mit Collagenase A von Clostridium histolyticum (18,6 µg) Rechte Spur: Molekularmassenstandard (Low Range, 9 µg) In Klammern ist die aufgetragene Gesamtproteinmenge angegeben.
Bestimmung des Kollagenabbaus durch die gereinigte Peptidase mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Mit der SDS-PAA-Gelelektrophorese kann der Abbau von säurelöslichen Kollagenen
dargestellt werden. Zum Einsatz kam hier auch Typ-IV-Kollagen als Vertreter der
nichtfibrillären Kollagene. Die gereinigte Peptidase wurde mit säurelöslichem Kollagen vom
Typ I und Typ IV inkubiert und das Gemisch anschließend auf das Gel aufgetragen (siehe
Ergebnisse 82
Abschnitt 3.2.13). Als Positivkontrolle wurde auch hier Collagenase A von Clostridium
histolyticum mit Kollagen angesetzt. Für die gereinigte Peptidase konnte keine
kollagenolytische Aktivität abgelesen werden (Abbildung 4.22). Clostridium-Collagenase
verdaute Typ-I-Kollagen vollständig (nicht dargestellt) und Typ-IV-Kollagen weitgehend.
4.4.3 Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von
Candida albicans Der Abbau von demineralisiertem Dentin durch enzymhaltige Proben von Candida albicans
wurde mithilfe der Hydroxyprolin-Bestimmung untersucht. Auch hier wurde bei saurem pH-
Wert eine Aktivität der Saps erwartet. Bei neutralem pH-Wert wurde die gereinigte Peptidase
auf eine neutrale dentinhydrolytische Aktivität untersucht. Als Positivkontrolle wurde für pH-
Wert 3,5 die kommerziell gereinigte Sap2 eingesetzt.
0
5
10
15
20
25
30
CF (2091) CF (1066) Sap 2 CWP
freig
eset
ztes
Kol
lage
n [µ
g]
pH 3,5 3,5 3,5 7,4
Abbildung 4.23: Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans Eingesetzte Proben mit entsprechendem pH-Wert im Reaktionsansatz: CF (2091) = Kulturüberstand des Stammes ATCC 2091, pH 3,5 CF (1066) = Kulturüberstand des Stammes OMZ 1066, pH 3,5 Sap2 = Sap2-Enzym (Fa. TaKaRa), 5 µg/ml, pH 3,5 CWP = Zellwand-Peptidase (gereinigt), 5 µg/ml und 22 µg/ml, pH 7,4 4,5 mg demineralisierte Dentinscheibenstücke wurden mit enzymhaltiger Probe 24 h bei 37 °C inkubiert (siehe Abschnitt 3.2.14). Die Menge des freigesetzten Kollagens im Überstand wurde mittels Hydroxyprolin-Bestimmung nach REDDY und ENWEMEKA [1996] ermittelt. Die aufgetragenen Kollagenmengen stellen die um Kontrollwerte verminderten Mittelwerte dar. Es wurde mindestens eine Doppelbestimmung je Probe durchgeführt (n ≥ 2).
Ein Abbau des demineralisierten Dentins wurde für die Kulturüberstände und das kommer-
ziell gereinigte Sap2 gezeigt (Abbildung 4.23). Demineralisiertes Dentin wurde stark im
Überschuss eingesetzt, wobei maximal 0,5 % des Gesamtdentinkollagens abgebaut wurden.
Die gereinigte Peptidase aus der Zellwand wies keine dentinhydrolytische Aktivität auf.
5. Diskussion In der vorliegenden Arbeit sollte die Beteiligung von Candida albicans an der
Dentinkariogenese beleuchtet werden. Die Entstehung einer Dentinkavität geht mit der
Degradation der organischen Dentinmatrix einher. In welchem Milieu die Hydrolyse des
Dentinkollagens abläuft, ist eine bisher ungeklärte Frage. Es galt, die Fähigkeit von
C. albicans zum Abbau der organischen Dentinmatrix bei neutralem und auch bei saurem
pH-Wert zu untersuchen. Im Speziellen sollte ein peptidolytisches Enzym auf
kollagenolytische Wirksamkeit geprüft werden. Bestandteile der vorliegenden Arbeit, ergänzt
um die Reinigung des Enzyms aus Zellextrakt und weiterführende Untersuchungen, wurden
in der Publikation KLINKE et al. [2008] zusammengefasst.
5.1 Substrate zum Nachweis kollagenolytischer Aktivität
Zur Detektion von enzymatischer Aktivität im Eluat nach Chromatographie bedarf es
einfacher und schneller Testverfahren. Der komplexe Vorgang der Kollagenolyse ist schwer
in Schnelltests umsetzbar. Die verfügbaren künstlichen Substrate werden meist nicht nur von
Kollagenasen gespalten, es mangelt an Spezifität. Oft verwendete Peptidsubstrate sind
PZ-PLGPA und FALGPA. Candida albicans verfügt über eine zytosolische FALGPA-Aktivität
[NISHIMURA et al., 2001; KLINKE & KLIMM, 2003]. Das mithilfe von FALGPA isolierte Enzym
wies aber in eigenen Versuchen keine kollagenolytische Aktivität auf (Daten nicht gezeigt).
Auch die in Zellaufschluss von Gruppe-B-Streptokokken gefundene FALGPA-Aktivität konnte
einer Oligopeptidase zugeordnet werden [LIN et al., 1996].
In Anlehnung an die von RODIER et al. [1999] erschienene Publikation wurde in der
vorliegenden Arbeit L-Arg-AMC als Testsubstrat verwendet.
5.2 Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von Candida albicans
Es wird angenommen, dass proteolytische Enzyme eine Schlüsselfunktion bei der Invasion
von C. albicans in menschliche Gewebe innehaben [NAGLIK et al., 2003]. Die von Rodier et
al. 1999 beschriebene Metallopeptidase, welche das bisher einzige Enzym von C. albicans
mit nachgewiesener kollagenolytischer Wirksamkeit ist, regte zur Untersuchung des
Einflusses von C. albicans an der Dentinkariogenese an. In der vorliegenden Arbeit wurde
ein peptidolytisches Enzym aus der Zellwand von C. albicans mithilfe des von Rodier et al.
Diskussion 84
[1999] angegebenen L-Arg-AMC-Tests gereinigt, identifiziert und funktionell charakterisiert.
Tests zur kollagenolytischen Wirksamkeit sollten eine Einschätzung der Funktion der
isolierten Peptidase in der Dentinkariogenese ermöglichen.
5.2.1 Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien
Bei dem Vergleich der Candida-albicans-Kultur in verschiedenen Nährmedien wurden große
Unterschiede in der freigesetzten L-Arg-AMC-Volumenaktivität deutlich (Abschnitt 4.1.1). Es
zeigte sich, dass die Zellwandlysate der Zellen aus Flüssigkulturen eine deutlich höhere
L-Arg-AMC-Aktivität aufwiesen als die Zellwandlysate der Kultur auf dem Festmedium
Sabouraud-Glukose-Agar. Diese Beobachtung lässt sich mit der besseren Verfügbarkeit von
Nährstoffen in Flüssigmedien erklären. Bei Plattenkulturen ist immer mit Substratlimitation
der oberen Zellschichten zu rechnen. Die Anzucht in YCB-RSA-Flüssigmedium ergab eine
90 % höhere L-Arg-AMC-Volumenaktivität des Zellwandlysats als die des Lysats aus
YNB-Glc-Medium. Allerdings war die Zellausbeute der YCB-RSA-Kultur von allen
Flüssigkulturen am geringsten. Um diesen Nachteil auszugleichen, wurde ein
Anzuchtschema entwickelt, das zuerst die Kultivierung in einem Vollmedium (YPD) und
anschließend die Fortführung der Kultur in dem Mangelmedium YCB-RSA vorsah (Abschnitt
3.2.2). Mit der Kultur der Zellen im YCB-RSA-Medium konnte der Kulturüberstand für den
Nachweis der proteolytischen Aktivität und die Hefezellen für die Gewinnung der Peptidase
eingesetzt werden.
5.2.2 Vergleich der Methoden Zellwandlyse und Zellaufschluss
Im Folgenden werden Methoden zur Freisetzung der L-Arg-AMC-Aktivität diskutiert. Der
hohe Proteingehalt im Zellextrakt erschwert die Reinigung eines mengenmäßig gering
vertretenen Proteins erheblich. Um das Verhältnis von Enzym zu Gesamtprotein zu
verbessern, wurden Versuche zum Herauslösen des Zielproteins aus der Zellwand
unternommen.
Unterschieden werden muss die Enzymfreisetzung mittels chemischer Substanzen von dem
enzymatischen Verdau der Zellwand, der Zellwandlyse. Die Agenzien Triton X-100 und
β-Mercaptoethanol lösen Proteine aus der Zellwand heraus, während Enzyme wie Lyticase
die Zellwandstruktur auflösen und so die Zellwandproteine freisetzen. Triton X-100 verändert
elektrostatische Bindungen in der Zellwand und wurde von einigen Autoren erfolgreich zur
Proteinfreisetzung verwendet [REISER & GASPERIK, 1995; LODDER et al., 1999]. Das zur
Zellwandfraktionierung eingesetzte β-Mercaptoethanol spaltet Disulfidbrücken von Proteinen
reduktiv [CHAFFIN et al., 1998].
Diskussion 85
Die Substanzen SDS und DTT werden auch von einigen Autoren mit Erfolg zum
Herauslösen von Zellwandbestandteilen angewendet [PITARCH et al., 2002; PONTON &
JONES, 1986]. Für die Freisetzung des L-Arg-AMC-spaltenden Enzyms aus der Zellwand
konnten die letztgenannten Substanzen nicht eingesetzt werden, da sie die Enzymaktivität
inhibieren (Daten nicht gezeigt).
Zur Gewinnung von Spheroplasten aus Hefezellen wird oft das Enzymgemisch Zymolyase
verwendet [MCCOURTIE & DOUGLAS, 1984; OVALLE et al., 1998]. Für das Herauslösen der
gesuchten L-Arg-AMC-Aktivität aus der Zellwand konnte Zymolyase nicht eingesetzt werden,
da vermutet wurde, dass die enthaltene Protease mit Affinität zu Mannoproteinen das
Zielprotein modifizieren könnte.
Ende der 70er Jahre wurde ein Enzymsystem von Arthrobacter spp. entdeckt, dass die Lyse
der Hefezellwand bewirkt [SCOTT & SCHEKMAN, 1980]. Lyticase wird zur Gewinnung von
Spheroplasten [HAZEN & LEMELLE, 1990; CAVALHEIRO et al., 2004] oder zur Zelllyse
eingesetzt. Einige Autoren verwenden die Kombination Lyticase und DTT [PONTON & JONES,
1986] oder Lyticase mit β-Mercaptoethanol [BLASI et al., 1995]. Aufgrund der Empfindlichkeit
des zu isolierenden L-Arg-AMC-spaltenden Enzyms gegen die sonst erfolgreich zur
Zellwandlyse eingesetzten Substanzen wurde ein mehrstufiges Lyse-Verfahren auf alleiniger
Basis von Lyticase entwickelt (siehe Abschnitt 3.2.4). Die Konzentration der Lyticase von 15
bis 20 U/ml wurde bewusst niedrig gewählt, da höhere Konzentrationen zu verstärkter
Zelllyse des verwendeten C.-albicans-Stammes ATCC 2091 führten. Das enzymatische
Herauslösen des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand von C. albicans sollte eine
Proteinlösung gewährleisten, die nur einen geringen Anteil an intrazellulären Proteinen
beinhaltet. Durch das zur Zellwandlyse verwendete Proteingemisch Lyticase wurde
allerdings eine Beimischung von Fremdproteinen in Kauf genommen. Die mikroskopische
Verlaufskontrolle der Zellwandlyse zeigte die Unversehrtheit von etwa 90 % der Hefezellen
nach Lyticase-Behandlung. In den Vorversuchen wurde eine etwa 17fach höhere spezifische
Aktivität des Zellwandlysatepools als des Zellextraktes erreicht. Bei der Adaptation der
Lyticase-Behandlung auf die Gewinnung eines großen Volumens des Zellwandlysats zeigte
sich ein Absinken der spezifischen Aktivität auf das Niveau des durch Zellaufschluss
gewonnenen Zellextraktes. Während der Zellwandlyse für die in dieser Arbeit dargestellten
Präparation rupturierten mehr Hefezellen, was zu einer höheren Proteinkonzentration des
Zellwandlysats führte. Die Gewinnung eines großen Volumens an Zellwandlysat bedarf der
weiteren methodischen Verbesserung, da die Maßstabsveränderung bei biologischen
Materialen oft zu unerwarteten Problemen führt. In weiterführenden Versuchen konnte
gezeigt werden, dass die Enzymreinigung mit Zellextrakt als Ausgangsmaterial einen
geringeren Reinigungsgrad erreicht, vergleicht man die Reinheit nach Gelfiltration [KLINKE et
al., 2008].
Diskussion 86
5.2.3 Fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats
Das von RODIER et al. 1999 vorgestellte dreistufige Reinigungsschema wurde als Grundlage
für die in dieser Arbeit vorgestellte Enzymreinigung übernommen. Um ein hochgradig
aufgereinigtes Enzym zu erhalten, war es erforderlich, die Reinigungsschritte nach dem
etablierten Schema „capture“, „intermediate purification“ und „polishing“ [JANSON, 1998] zu
ordnen. Mit drei Trennschritten auf zwei verschiedenen Ionenaustausch-Materialien konnte
ein Höchstmaß an Auftrennung nach elektrischen Ladungsunterschieden der Proteine erzielt
werden. Aufgrund einer verbleibenden Verunreinigung nach Gelfiltration wurde das Schema
um die Trennung nach hydrophoben Wechselwirkungen erweitert.
Durch die fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats wurde ein Enzym mit einer Reinheit von
etwa 95 % erhalten (siehe Abbildung 4.8). Das RESOURCE TM ETH-Chromatogramm zeigte
einen großen Peak des Zellwandenzyms, der in der absteigenden Schulter einige
Fremdproteine enthält (Abbildung 4.7). Diese Verunreinigungen stellten sich im SDS-Gel als
wenige vernachlässigbare Banden dar (Abbildung 4.9). Die Fraktionen C15, D1 und D2
wiesen im SDS-Gel nahezu keine Verunreinigungen auf. In den nachfolgenden Fraktionen
stieg der Anteil an Verunreinigung an. Aufgrund des Überlappens des Zellwandenzyms mit
den Verunreinigungen wurde kein Aktivitätspool erstellt. Die Fraktionen kamen einzeln für die
Charakterisierung des Enzyms zum Einsatz. Die Summe der verunreinigungsarmen
Fraktionen C15, D1 und D2 ergab eine Ausbeute an totaler Aktivität von 4,7 %.
Nach Gelfiltration und auch nach Hydrophober-Wechselwirkungs-Chromatographie war ein
überdurchschnittlicher Verlust an totaler Enzymaktivität zu verzeichnen, was sich negativ auf
die Ausbeute auswirkte. Obwohl die Gesamtproteinmenge durch die letzten beiden
Reinigungsschritte deutlich verringert wurde, stieg die spezifische Enzymaktivität nur sehr
moderat. Möglicherweise wirkte sich der Verzicht auf NaCl in den Chromatographiepuffern
negativ auf die Enzymaktivität aus.
Anhand des Proteinmusters des Zellwandlysats im SDS-Gel wird offensichtlich, dass der
Anteil des zu reinigenden Enzyms am Gesamtprotein sehr gering war (Abbildung 4.8). Die
Priorität der Enzymreinigung wurde auf Reinheit des Zielproteins gelegt, um eine sichere
Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie zu gewährleisten. Die erzielte Ausbeute
ist angesichts der aufwendigen Reinigung, die fünf Teilschritte beinhaltete, durchaus
zufrieden stellend.
Diskussion 87
5.3 Proteinidentifizierung und BLASTp-Suche
Die Korrelation der Peptidsequenzen mit der Protein-Datenbank NCBInr unter Verwendung
der Mascot-Software [PERKINS et al., 1999] identifizierte das hypothetische Protein
CaO19.12664 (GenBank RefSeq XM 705313, Candida albicans SC5314) mit einer Sequenz-
abdeckung von 63 % [KLINKE et al., 2008]. Die ermittelte Primärstruktur (siehe Abbildung
4.10) und die funktionelle Charakterisierung zeigten, dass es sich bei dem isolierten Enzym
um eine Metallo-Aminopeptidase handelt. Aufgrund der Orthologie zum APE2-Gen von
S. cerevisiae (siehe Abbildung 4.11) und der funktionellen Ähnlichkeit beider Enzyme erhält
die isolierte Metallo-Aminopeptidase den Namen C.-albicans-Aminopeptidase 2 (CaApe2).
Beachtet werden muss, dass das Protein aus dem C.-albicans-Stamm ATCC 2091 isoliert
wurde, von dem das Genom noch nicht bekannt ist. In weiteren Versuchen sollte untersucht
werden, ob das Protein auch aus C. albicans SC5314 isoliert werden kann und ähnliche
funktionelle Eigenschaften aufweist. EL MOUDNI und Mitarbeiter konnten die Hydrolyse von
L-Arg-AMC auch bei anderen Candida-albicans-Isolaten und weiteren Candida-Spezies
nachweisen [EL MOUDNI et al. 1995].
Die identifizierte Aminosäuresequenz beinhaltet von Position 393 bis 416 das
HEXXH(X)18E-Motiv, das als Zink-Bindungsstelle fungieren kann und die Zuordnung zur
Gruppe der Metallopeptidasen auf primärstruktureller Ebene ermöglicht. Die Sequenz
HEXXH ist in einem identifizierten Fragment des gereinigten Proteins enthalten. Die beiden
mit X gekennzeichneten variablen Stellen sind mit den ungeladenen Aminosäuren Alanin
und Leucin besetzt.
Das dem ORF CaO19.12664 entsprechende hypothetische CaApe2-Protein besteht aus 954
Aminosäuren und weist eine berechnete Molekularmasse von 107,4 kDa auf [KLINKE et al.,
2008]. Diese Molekularmasse ist signifikant größer als der anhand der elektrophoretischen
Mobilität des Enzyms in der SDS-PAGE ermittelte Wert von ca. 90 kDa. Trotz des
Vorhandenseins von Schnittstellen für Trypsin konnte den ersten 87 Aminosäuren des
vorausgesagten N-Terminus des hypothetischen CaApe2-Proteins keines der massen-
spektrometrisch identifizierten tryptischen Peptide zugeordnet werden (Abbildung 4.10). Über
die vorliegende Arbeit hinausgehende Untersuchungen lieferten Erkenntnisse zur Aufklärung
der Diskrepanzen. Eine Analyse der DNA-Region, die dem ORF CaO19.12664 vorgelagert
ist, legt eine 2-Exon-Struktur des CaAPE2-Gens nahe. Zusammengesetzt kodieren beide
Exons ein hypothetisches Präproprotein mit einem N-terminalen Signalpeptid, das auf eine
Sekretion des CaApe2-Enzyms hinweist. Exon 2 beginnt mit dem Codon für Serin-88 gemäß
ORF CaO19.12664. Diese Aminosäure stellt vermutlich den N-Terminus der katalytisch
aktiven Aminopeptidase dar. Die durch die Analyse der DNA-Sequenz der Protein-
primärstruktur des ORF CaO19.12664 bzw. des hypothetischen CaApe2-Proteins erhaltenen
Diskussion 88
Resultate werden durch die Ergebnisse der Proteinanalytik bestätigt. Das mittels Tandem-
Massenspektrometrie ermittelte N-terminale Peptid von CaApe2 beginnt mit Serin-88. Auch
mithilfe des Edman-Abbaus der nicht acetylierten Form des CaApe2-Proteins wurde Serin-88
als die N-terminale Aminosäure identifiziert [KLINKE et al., 2008]. Die korrespondierende
Molekularmasse von 97,607 kDa (Aminosäuren 88-954) stimmt in ausreichendem Maße mit
dem mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmten Wert von etwa 90 kDa
überein.
Hinweise auf die genetische Verwandtschaft dieses Proteins mit Proteinen anderer Spezies
konnten durch BLASTp-Suche [ALTSCHUL et al., 1997] erzielt werden. Die Suche ergab viele
Treffer mit Aminopeptidasen verschiedener Organismen. BLASTp-Suche erzielte in allen
verfügbaren Genomen der Gruppe der Saccharomycotina (z.B. Candida albicans, Candida
glabrata, Debaryomyces hansenii, Eremothecium gossypii, Kluyveromyces lactis,
Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica) einen Treffer mit signifikanter
Sequenzähnlichkeit pro Spezies. Entsprechend dem NCBI-Datenbank-Eintrag EAK91143, ist
das CaO19.5197 kodierende Gen als APE2 klassifiziert [KLINKE et al., 2008]. Dies deutet
darauf hin, dass das Candida-albicans-Gen mit dem ORF CaO19.5197 das orthologe Gen
zum S. cerevisiae-APE2-Gen (Synonym: Leucin-Aminopeptidase 1, LAP1) darstellt. Die
wahre Situation ist aber komplexer. Das CaO19.5197-Protein zeigt 54 % Übereinstimmung
mit dem Ape2-Protein von S. cerevisiae, besitzt aber eine ebenso hohe Übereinstimmung
mit einer als Aap1 bezeichneten Aminopeptidase von S. cerevisiae [KLINKE et al., 2008]. Auf
der anderen Seite ergibt die separate BLASTp-Suche mit jedem einzelnen der beiden
Aminopeptidasen von S. cerevisiae gegen das gesamte Candida-albicans-Proteom ein und
denselben Treffer: das CaO19.5197-Protein. Deshalb ist anzunehmen, dass das
phylogenetische Vorläuferprotein von CaO19.5197 in S. cerevisiae dupliziert [WOLFE &
SHIELDS, 1997; SEOIGHE & WOLFE, 1999] und beide einzelnen Kopien subfunktionalisiert
wurden [KLINKE et al., 2008]. ScApe2 spaltet spezifisch N-terminales Leucin [HIRSCH et al.,
1988], während die Alanin/Arginin-spezifische Aminopeptidase ScAap1 L-Leu-AMC nicht
akzeptiert [CAPRIOGLIO et al., 1993]. Die Beobachtung, dass CaApe2 fähig zur Spaltung von
L-Ala-, L-Arg- und L-Leu-AMC ist, stützt diese Hypothese. Weil das Genom von C. albicans
vermutlich keine Duplikation erfuhr [LANGKJAER et al., 2003], kombiniert CaApe2 die unter-
schiedlichen Aktivitäten der beiden Aminopeptidasen von S. cerevisiae [KLINKE et al., 2008].
In Proteomen von Aspergillus spp. wurden auch Sequenzen gefunden, die eine hohe
Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz der isolierten Aminopeptidase aufweisen.
Eine Lysin-Aminopeptidase (AspA) aus Aspergillus niger wurde von BASTEN et al. [2001]
überexprimiert und charakterisiert. Sie wurde in die Gruppe der Metallopeptidasen
eingeordnet und zeigt Aktivität gegen Arg-, Met- und Ala-p-Nitroanilid. Sie weist außerdem
Diskussion 89
hohe Aminosäuresequenzähnlichkeiten mit dem LAP1-Protein von S. cerevisiae auf [BASTEN
et al., 2001]. Diese Publikation weist nach, dass auch Schimmelpilze ähnliche
Aminopeptidasen ausbilden.
5.4 Diskussion der Eigenschaften der Metallo-Aminopeptidase
Im Folgenden sollen die grundlegenden Eigenschaften der identifizierten
Arginin/Alanin/Leucin-spaltenden Metallo-Aminopeptidase diskutiert werden.
5.4.1 pH-Optimum der Enzymaktivität
Die Bestimmung der Enzymaktivität über den pH-Bereich von 3 bis 11 wurde in drei
verschiedenen Puffersystemen durchgeführt. CaApe2 hydrolysierte L-Arg-AMC in einem
pH-Intervall von 6 bis 9 mit einem pH-Optimum von 7,2 (Abbildung 4.12). Die Enzymaktivität
bei dem physiologischen pH-Wert von 7,4 betrug 97 %, während das Enzym bei pH 4,0
nahezu keine Aktivität zeigte. Die maximale Aktivität bei neutralem pH-Wert deutet auf eine
Funktion in Umgebungen mit physiologischem pH-Wert hin. Bei Absenkung des pH-Wertes
durch Säureproduktion von Candida albicans, die bei In-vitro-Kultur auftritt, liegt das
sezernierte Enzym inaktiv vor. Die Funktion der Aminopeptidase wird in Abschnitt 5.5.3
diskutiert.
Kritisch anzumerken ist, dass der pH-Bereich des TRIS/HCl-Puffer deutlich ins saure Milieu
bis pH 5,9 ausgedehnt wurde. Üblicherweise wird TRIS/HCl-Puffer in einem Pufferbereich
von 7,2 bis 9,0 verwendet. Es wurde versucht, den pH-Bereich von 6 bis 7 durch
Inositol/HCl-Puffer abzudecken. Allerdings kam es durch Inositol zu einer nahezu
vollständigen Enzyminhibition (Daten nicht gezeigt). Das weitere Absenken des pH-Wertes
des TRIS/HCl-Puffers und der damit verbundenen geringeren Pufferkapazität führte zu
keiner Veränderung der pH-Kurve. Die Hydrolyse von L-Arg-AMC weist eine neutrale
Protonenbilanz auf.
5.4.2 Substratspezifität und Enzymkinetik
Die gereinigte Aminopeptidase zeigte Exopeptidase-Aktivität gegenüber den synthetischen
Peptiden L-Ala-AMC, L-Arg-AMC und L-Leu-AMC. L-Ala-AMC wurde mit einer höheren
maximalen Reaktionsgeschwindigkeit gespalten als L-Arg-AMC (Tabelle 4.3). Der KM-Wert
für L-Ala-AMC lag signifikant über dem für L-Arg-AMC. Die Affinität des Enzyms zu
L-Arg-AMC war deshalb deutlich größer als zu L-Ala-AMC.
Diskussion 90
Der hemmende Einfluss des Substratlösungsmittels DMSO auf die Enzymaktivität zeigte sich
in einer biphasischen Enzymkinetik für L-Ala-AMC und L-Arg-AMC. Durch rechnerische
Elimination des DMSO-Effektes mittels Verallgemeinerung der Gleichung für eine
nichtkompetitive Hemmung wurden typische Verläufe einer Michaelis-Menten-Kinetik
ermittelt. Mit steigenden Substratkonzentrationen erreichte auch die DMSO-Konzentration im
Reaktionsansatz hohe Werte von bis zu 25 % (bei 1000 µM L-Ala-AMC). Diese hohe
DMSO-Konzentration resultierte aus dem Lösen des hydrophoben Substratpulvers nach
Herstellerangaben. Gleichung (1) im Abschnitt 3.2.11 beschreibt eine kooperative Hemmung
des Enzyms durch den Inhibitor und geht von der mechanistischen Vorstellung aus, dass für
die nichtkompetitive Hemmung des Enzyms DMSO-Komplexe verantwortlich sein könnten.
Hinweise auf eine Substrathemmung gab es in der vorliegenden Arbeit nicht. In weiter-
führenden Versuchen wurden konzentriertere Substratstammlösungen hergestellt, die den
Einfluss von DMSO im Reaktionsansatz in den Hintergrund treten ließen [KLINKE et al., 2008].
Die Abnahme der Aktivität der Aminopeptidase bei einer Konzentration von 300 µM im
Vergleich zu 100 µM L-Leu-AMC ist vermutlich auf eine Hemmung durch das Substrat-
lösungsmittel Methanol zurückzuführen (Abbildung 4.15), was sich aus den Methanol-
Kontrollproben ableiten ließ (Daten nicht gezeigt). Eine Substrathemmung könnte für
L-Leu-AMC ebenfalls vorliegen.
Es wurde keine Endopeptidase-Aktivität für CaApe2 gefunden. Die Tests auf Hydrolyse von
Albumin, Typ-I-Kollagen und Typ-IV-Kollagen waren negativ. Im Abschnitt 5.5.3 wird
ausführlich auf die möglichen Funktionen von CaApe2 eingegangen.
5.4.3 Inhibitionsprofil
Das gereinigte Zellwandenzym wurde von den Proteinaseinhibitoren Phenanthrolin und
EDTA wirkungsvoll gehemmt. Weiterführende Versuche ermittelten eine fast vollständige
Hemmung für den Aminopeptidaseinhibitor Bestatin in mikromolaren Konzentrationen
[KLINKE et al., 2008]. Zusammengenommen lassen die Inhibitionsergebnisse auf eine Zuge-
hörigkeit von CaApe2 zur Untergruppe der Metallo-Aminopeptidasen schließen, in die auch
die orthologen Aminopeptidasen ScAap1 und ScApe1 eingeordnet werden. Metallo-Amino-
peptidasen sind der Familie M1 der MEROPS-Datenbank zugeordnet [BARRETT et al., 2004].
Das Zinkion zählt zu den Schwermetallionen und hemmte die Enzymaktivität des gereinigten
Zellwandenzyms bei einer Konzentration von 1 mM vollständig. Möglicherweise kann die
hemmende Wirkung auf die metallkatalysierte Oxidation der freien SH-Gruppen sowie auf
die Bildung von stabilen Komplexen mit der Beteiligung von SH-Gruppen zurückgeführt
werden [JOCELYN 1972].
Diskussion 91
5.4.4 Temperaturoptimum
Das gereinigte Zellwandenzym zeigte die maximale Aktivität bei einer Temperatur von 30 °C
(Abbildung 4.19). Damit liegt das Temperaturoptimum von CaApe2 in der Nähe der
optimalen Kulturtemperatur für die Sprosszellform. Im Temperaturbereich von 25 bis 30 °C
zeigt C. albicans die kürzeste Verdopplungszeit [BUFFO et al., 1984]. Die einzelnen Enzyme
von C. albicans haben verschiedene Temperaturoptima. Der Bereich der Temperaturoptima
der Enzymaktivitäten von Candida albicans erstreckt sich von 28 °C bei Adenosin-
Monophosphat-Deaminase, über 40 °C bei N-Acetyltransferase, 45 °C bei Chitinase und bis
zu 55 °C bei Phosphatidylinositol-Synthase.
5.5 Bedeutung der Metallo-Aminopeptidase
CaApe2 wurde als neutrale Arginin/Alanin/Leucin-spaltende Metallo-Aminopeptidase
identifiziert. Im Folgenden wird die Rolle der Aminopeptidase im Zusammenhang mit ihrer
Lokalisation und ihren Eigenschaften diskutiert; im Speziellen wird auf eine mögliche
humanpathogene Bedeutung eingegangen.
5.5.1 Wirkungsort und Aktivitätszustand der Metallo-Aminopeptidase
Eine L-Arg-AMC-Hydrolyse durch Kulturüberstand konnte in der vorliegenden Arbeit nicht
nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Dagegen zeigte Zellextrakt und Zellwandlysat
eine hohe L-Arg-AMC-Aktivität. Die Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand ließen
die Vermutung zu, dass das gesuchte Enzym in der Zellwand lokalisiert ist. Dies steht nicht
in Widerspruch zum Nachweis der Aminopeptidase in Zellextrakt. Es kann davon
ausgegangen werden, dass durch die Gewinnung des Zellaufschlusses mittels Mini-
Beadbeater™ eine ausreichende Enzymfreisetzung aus der Zellwand stattfindet.
Zellaufschluss und Zellextrakt (zentrifugierter und sterilfiltrierter Zellaufschluss) enthalten
somit neben intrazellulären Proteinen auch Zellwandproteine. Die Analyse der DNA-Sequenz
ermittelte eine dem ORF CaO19.5197 vorgelagerte Signalpeptidsequenz, die auf eine
Sekretion und damit verbundene extrazelluläre Funktion von CaApe2 hinweist [KLINKE et al.,
2008]. In der Literatur wurde das Vorkommen einer L-Arg-AMC-Aktivität von C. albicans in
konzentriertem Kulturüberstand beschrieben [IMBERT et al., 2006]. In dieser Veröffentlichung
wurde allerdings die von RODIER et al. [1999] angegebene Messvorschrift abgeändert.
Besiedelt C. albicans Wirtsregionen mit physiologischem pH-Wert, könnte CaApe2 ihre
Aktivität im Extrazellularraum, zu dem die Zellwand hinzugezählt werden kann, entfalten.
Besonders hohe L-Arg-AMC-Aktivität konnte bei Zellen aus YCB-RSA-Kultur gemessen
werden. Im Kulturmedium selbst herrscht durch die Freisetzung von Säuren durch
Diskussion 92
Candida albicans ein saures Milieu, in diesem liegt das Enzym inaktiv vor. Es bleibt nun zu
diskutieren, wie das Enzym dennoch wirksam werden könnte. Sollte das Enzym in der
Zellwand und insbesondere im Perizellularraum nahe der Zellwand lokalisiert sein, muss dort
ein neutraler pH-Wert vorherrschen, damit das Enzym arbeiten kann. Es existieren keine
Untersuchungen über den pH des Perizellularraums. Vorstellbar ist ein Schutzsystem der
Candida-albicans-Zelle ähnlich Helicobacter pylori, das ein Überleben in einer sauren
Umgebung möglich macht. Zentrale Bedeutung in der Säureresistenz von H. pylori hat das
Urease-System, das hauptsächlich für die Aufrechterhaltung des zytoplasmatischen und
perizellulären neutralen Milieus verantwortlich ist [PFLOCK et al., 2006]. Zusätzlich verfügt
dieses Pathogen über ein Amidase-System, das an Bedeutung gewinnt, wenn Harnstoff
kaum verfügbar ist. Einige andere Mikroorganismen verfügen über Mechanismen, die eine
Adaptation an saures Milieu ermöglichen, dazu zählen Yersinia enterocolitica, Vibrio cholera,
Escherichia coli und Salmonella typhimurium [VALENZUELA et al., 2003]. Bei C. albicans wird
seit mehr als 20 Jahren der transmembranöse Protonentransport untersucht. Beschrieben
wurde ein Na+/H+-Antiporter, der an der Regulation des intrazellulären pH-Wertes beteiligt
sein soll [SOONG et al., 2000]. Bei der zellulären Aufnahme von Kohlenhydraten, wie z.B.
Glukose, kommt es zur Protonenfreisetzung durch die Plasmamembran-ATPase [MONK et
al., 1993]. Für Candida utilis konnte ein stöchiometrisches Verhältnis bei Protonen zu
Zuckermolekülen von 1:1 ermittelt werden [VAN DEN BROEK et al., 1997]. Speziellere
Säuretoleranz-Mechanismen wurden noch nicht beschrieben.
5.5.2 Kollagenolytische Wirksamkeit der Metallo-Aminopeptidase
Die Anpassung des Reinigungsschemas einer zytosolischen 95-kDa-Metallopeptidase von
Candida albicans aus Zellaufschluss [RODIER et al., 1999] auf die Isolation der Peptidase aus
Zellwandlysat führte zur Reinigung eines Enzyms, das funktionell charakterisiert und als
neutrale Ala/Arg/Leu-spaltende-Aminopeptidase (CaApe2) identifiziert wurde. Diese
Einordnung erfolgte auf Basis der identifizierten Primärstruktur und der funktionellen
Eigenschaften. CaApe2 zeigte im Gegensatz zur Metallopeptidase der französischen
Arbeitsgruppe keine kollagenolytische Aktivität.
Es ist zu diskutieren, ob die Zellwandlyse oder das verwendete Reinigungsschema zu dem
Verlust der kollagenolytischen Aktivität des Enzyms geführt haben könnte. Die zur
Zellwandlyse eingesetzte Lyticase besteht nach Herstellerangaben aus einem Gemisch von
Proteinen des Bakteriums Arthrobacter luteus. Die Literatur beschreibt eine in der Lyticase
enthaltene alkalische Proteinase, die die Wirkung der β-1,3-Glukanase ermöglicht [SCOTT &
SCHEKMAN, 1980]. In weiterführenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass CaApe2 auch
aus Zellextrakt unter Anwendung der für Zellwandlysat angegebenen Reinigungsprozedur
Diskussion 93
gewonnen werden kann. Die aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien gewonnenen
Enzyme zeigten sich in der Proteinanalytik identisch [KLINKE et al., 2008]. Somit erscheint
eine Veränderung der Proteinstruktur während der Zellwandlyse mit Lyticase
unwahrscheinlich.
Während der Enzymreinigung kann es theoretisch zu einem Verlust der
Endopeptidase-Aktivität von CaApe2 kommen. Durch Abspaltung eines Proteinbestandteils
könnte die Molekülstruktur und damit auch Substratbindungsdomänen oder aktive Zentren
modifiziert worden sein. Die Reinigung kann zur Abtrennung eines Co-Substrates führen,
das für die Endopeptidase-Aktivität unbedingt erforderlich ist. Durch die Modifizierung einer
funktionellen Gruppe des Enzyms könnte das aktive Zentrum ebenfalls in seiner
Bindungsfähigkeit von Substraten beeinträchtigt worden sein. Im Zuge der Alterungs-
prozesse der Moleküle kommt es zu verschiedensten Modifikationen an Proteinen, die zu
einer Inaktivität oder einer veränderten Enzymaktivität führen können. Um zu prüfen, ob die
Kollagenase-Aktivität bei der Enzymreinigung verloren ging, wurde Zellaufschluss in den
Kollagenabbau-Test einbezogen. Auch frisch gewonnener Zellaufschluss zeigte keine
kollagenolytische Wirksamkeit bei einem pH-Wert von 7,4. Dabei wurde nativer
Zellaufschluss, gewonnen aus Zellsuspension mit einer Zelldichte von 0,5 g/ml, in direkten
Kontakt mit säureunlöslichem Kollagen gebracht und über einen langen Zeitraum inkubiert,
siehe Abschnitt 3.2.13. Eine Positivkontrolle zeigte an, dass der Test an sich funktionierte.
Wurde dem Aufschluss Kollagenase A zugesetzt, konnte eine deutliche Kollagenspaltung
beobachtet werden (Abbildung 4.21).
Das hier isolierte Enzym wurde als neutrale Metallo-Aminopeptidase identifiziert. Eine
Endopeptidase-Akivität einer Aminopeptidase ist ungewöhnlich, wurde aber für Kathepsin K
nachgewiesen [Garnero et al., 1998].
Die Reinigung von CaApe2 aus Zellwandlysat wurde initial an die von RODIER et al. [1999]
verwendeten Methoden angelehnt. Die französische Arbeitsgruppe isolierte eine 95-kDa-
Metallopeptidase aus Zellextrakt desselben Candida-albicans-Stammes. Ein Vergleich von
CaApe2 mit der 95-kDa-Metallopeptidase ist aufgrund spärlicher Datenlage von Seiten der
französischen Arbeitsgruppe schwer durchführbar. So können nur die offensichtlichen
Unterschiede hinsichtlich der fehlenden Kollagendegradation und des Mangels an
experimentellen Beweisen für eine limitierte Proteolyse von CaApe2 betont werden. Eine
52-kDa-Form von CaApe2 war weder bei den zahlreichen Chromatographieläufen noch auf
einem SDS-Gel nachweisbar. Weiterhin spricht für die Vermutung der Verschiedenheit
beider Enzyme, dass das Genom von Candida albicans noch eine dritte hypothetische
Metallopeptidase codiert, die eine zu den beiden jetzt bekannten Enzymen ähnliche
Molekularmasse zeigt [KLINKE et al., 2008]. Die Untersuchungen der Arbeitsgruppe um
RODIER werden im Abschnitt 5.6 genauer dargestellt. Die angeführten Ergebnisse sprechen
Diskussion 94
dafür, dass die Metallopeptidase der französischen Arbeitsgruppe und CaApe2 vermutlich
verschiedene Enzyme sind.
5.5.3 Funktionen der Metallo-Aminopeptidase
Die Exopeptidase-Aktivität von CaApe2 bewirkt die Spaltung von synthetischen Substraten
mit N-terminaler Aminosäure. Es ist anzunehmen, dass die Aminopeptidase in vivo
spezifisch endständige Aminosäuren von Proteinen oder Peptiden abspaltet und damit zum
Abbau von ganzen Proteinen oder Proteinfragmenten beiträgt. Der Abbau von Proteinen ist
notwendig für die Beseitigung von schadhaften Proteinmolekülen, für die Regulierung von
Protein- und Enzymkonzentrationen in einem bestimmten Kompartiment und den Erhalt
eines Aminosäurepools. Die durch CaApe2 freigesetzten Aminosäuren können der
Hefepilzzelle zur Synthese neuer Proteine oder zur Energiegewinnung dienen. Es liegen
wenige Erkenntnisse über die Funktionen der Aminopeptidasen Ape2 und Aap1 von
S. cerevisiae vor. Ein Zusammenhang zwischen dem AAP1-Gen und dem Glykogen-
Haushalt der Hefezelle wurde beschrieben [CAPRIOGLIO et al., 1993]. Die Inaktivierung des
AAP1-Gens bewirkte eine Abnahme der Glykogen-Speicherung der Zelle, während die
Überexpression des AAP1-Gens zu einer erheblichen Zunahme der Glykogen-Akkumulation
führte. Möglicherweise besitzt CaApe2 auch eine regulatorische Funktion.
Neben einer das Wachstum und die Vermehrung des Hefepilzes unterstützenden Funktion
ist auch eine humanpathogene Wirkung nicht auszuschließen. Vorstellbar ist, dass es durch
die Abspaltung N-terminaler Arginin-, Alanin- oder Leucinreste von humanen Proteinen zu
Strukturveränderungen kommt und Antikörper oder andere Abwehrfaktoren funktionsunfähig
gemacht werden. Im Zusammenspiel mit anderen Proteinasen könnte CaApe2 zum Abbau
von humanen Proteinen wie Extrazellularsubstanz beitragen. Auch an eine Beteiligung bei
der Aktivierung von Proenzymen durch Abspaltung von Peptiden muss gedacht werden.
Inaktive körpereigene Matrix-Metalloproteinasen, die konstitutionell im Dentin vorkommen,
werden möglicherweise durch bakterielle Proteinasen aktiviert [CHAUSSAIN-MILLER et al.,
2006]. Ob CaApe2 eine aktivierende Wirkung auf MMPs ausübt, sollte in weiteren Versuchen
geklärt werden.
Das Vorkommen von zum identifizierten Aminopeptidase-Gen ähnlichen Gensequenzen bei
allen Saccharomycotina mit aufgeklärtem Genom deutet auf die Expression einer ähnlichen
Aminopeptidase in dieser Gruppe hin. Die Funktion der Aminopeptidase in vivo, die
möglicherweise essentiell für die Pilzzelle ist, sollte mit APE2-defizitären Candida-albicans-
Mutanten untersucht werden.
Diskussion 95
5.6 Kollagenolyse durch Candida albicans im neutralen Milieu
Im Folgenden soll die Expression von Kollagenasen durch C. albicans diskutiert werden. Der
Nachweis eines neutralen kollagenolytischen Enzyms von C. albicans wäre von enormer
Bedeutung für die Aufklärung der Virulenz des Keimes. Die Gewebeinvasion durch
Candida-Zellen wäre nachvollziehbar. Auch bei der Entstehung der Dentinkaries könnte eine
neutrale kollagenolytische Aktivität von C. albicans beteiligt sein.
Proteolyse und Kollagenolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans
Wurde Kollagen in Kulturüberstand bei neutralem pH-Wert inkubiert, konnte ein geringer
Kollagenabbau nachgewiesen werden (Abschnitt 4.4.2). Diese geringe Aktivität ist vermutlich
auf die Wirkung von Sap2 bei neutralem pH-Wert zurückzuführen [WAGNER et al., 1995;
SCHALLER et al., 2005]. Da die höchste Aktivität der im Kulturüberstand enthaltenen
Aspartylproteinasen im sauren pH-Bereich liegt, werden die Saps in Abschnitt 5.7 diskutiert.
Kollagenasen sind definiert als Enzyme, die tripelhelikale Domänen von Kollagen bei
physiologischem pH-Wert und Körpertemperatur spalten können [HARPER, 1980;
HARRINGTON, 1996]. Nach dieser Definition handelt es sich bei Enzymen wie z.B. den Saps,
die im sauren Milieu kollagenolytisch wirken, nicht um echte Kollagenasen.
Frisch hergestellter Zellaufschluss und auch Zellextrakt zeigten keinerlei neutrale
kollagenolytische Aktivität (Abbildung 4.21). Dies spricht dafür, dass die im Kulturüberstand
nachgewiesene Aktivität von sezernierten Proteinasen stammt. Die proteolytische Aktivität
der intrazellulären Saps bei neutralem pH, die überwiegend in sekretorischen Vesikeln
lokalisiert sind [NAGLIK et al., 2003], lag somit unterhalb der Nachweisgrenze.
Es existieren nur sehr wenige Arbeiten, die sich mit proteolytischen Enzymen von
C. albicans, wirksam in neutraler Umgebung, beschäftigen. PORTILLO und GANCEDO
untersuchten 1986 Zellaufschluss auf proteolytische Aktivität und fanden die im
Abschnitt 1.4.5 beschriebene Aspartylproteinase mit saurem pH-Optimum. Die französische
Arbeitsgruppe um RODIER beschreibt in mehreren Arbeiten das Vorkommen intrazellulärer
Peptidaseaktivitäten. In einer 1994 veröffentlichten Arbeit wurden mehrere gelatinolytische
Serinproteinase-Aktivitäten durch Zymographie mit gelatinehaltigen Gelen gefunden. Ein
Jahr später isolierte diese Arbeitsgruppe eine 52-kDa-Metallopeptidase aus Zellextrakt, die
zur Katalyse des synthetischen Substrates L-Arg-AMC fähig war, aber keine gelatinolytische
Aktivität zeigte. In einem 1997 erschienenen Artikel wies diese Arbeitsgruppe die
Lokalisation der Metallopeptidase durch indirekte Immunofluoreszenz und Immun-
Elektronenmikroskopie in der Zellwand nach [EL MOUDNI et al., 1997]. Aufgrund einer
Diskussion 96
Kreuzreaktion des polyklonalen Antikörpers mit einem 95-kDa-Protein schlussfolgerte
El Moudni, dass die 52-kDa-Metallopeptidase ein Fragment des größeren Proteins ist.
Mithilfe der SDS-PAA-Gelelektrophorese zeigten RODIER et al. [1999} eine neutrale
kollagenolytische Aktivität der 95-kDa-Metallopeptidase. Bisher liegen keine weiteren
Erkenntnisse zu Enzymen von Candida albicans, die im neutralen Milieu kollagenolytisch
wirken, vor.
5.7 Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu
Kollagenolytisch wirksame Enzyme können entweder in den Extrazellularraum sezerniert
werden oder zellassoziiert vorliegen. Um beide Enzymlokalisationen in die Versuche
einzuschließen, wurde zum einen Kulturflüssigkeit und zum anderen Zellaufschluss und
Zellextrakt eingesetzt.
5.7.1 Kollagenolytische Aktivität des Kulturüberstandes
In der vorliegenden Arbeit konnte die Hydrolyse von Albumin für den zellfreien Überstand der
YCB-RSA-Kultur im sauren Milieu nachgewiesen werden. Weiterhin wurde Kulturüberstand
bei den Kollagenabbau-Tests eingesetzt (Abschnitte 3.2.13 und 4.4.2). Säureunlösliches
Kollagen und demineralisiertes Dentin wurden direkt mit Kulturüberstand über einen langen
Zeitraum inkubiert. Es zeigte sich eine deutliche Hydrolyse von Typ-I-Kollagen und von
humanem Dentinkollagen in saurem Milieu. Die Kulturüberstände des klinischen Isolates von
Candida albicans aus kariöser Dentinläsion und des Referenzstammes Candida albicans
ATCC 2091 prägten einen Kollagenabbau in vergleichbarer Höhe aus. Die Hydrolyse von
säureunlöslichem Kollagen und demineralisiertem humanen Dentin wurde auch für
kommerziell gereinigte Sap2 gezeigt, die als Positivkontrolle eingesetzt wurde.
Die nachgewiesene kollagenolytische Proteinaseaktivität des Kulturüberstands bei saurem
pH-Wert ist mit hoher Wahrscheinlichkeit auf sezernierte Aspartylproteinasen (Saps)
zurückzuführen, die in den Extrazellularraum sezerniert werden. Die Expression der Saps ist
essentiell für das Wachstum des Hefepilzes Candida albicans, wenn Protein die einzige
Stickstoffquelle darstellt [HUBE et al., 1994]. Auf andere kollagenolytische Proteinasen finden
sich in der Literatur keine Hinweise. Die Saps stellen einen wichtigen Virulenzfaktor von
C. albicans dar und wurden in der Literatur umfangreich charakterisiert [NAGLIK et al., 2003].
Saps werden in der deutschsprachigen Literatur auch als saure Aspartylproteinasen
bezeichnet, weil sie vorwiegend im unteren pH-Bereich wirken.
Diskussion 97
Es bleibt zu klären, welche von Candida albicans sezernierte Aspartylproteinase im Kultur-
überstand die Hydrolyse der eingesetzten Kollagene verursacht hat. Die Hypothese, dass
Sap2 die wesentliche proteolytische Aktivität im Kulturüberstand repräsentiert, wird gestützt
durch den Fakt, dass in vitro am häufigsten Sap2 exprimiert wird [HUBE et al., 1994;
SCHALLER et al., 2005]. Der Abbau von Typ-I-Kollagen durch Sap2 im sauren Milieu wurde
zuvor beschrieben von RAY und PAYNE [1990] und HUBE [1996]. Die eigenen Versuche mit
kommerziell gereinigtem Sap2 (Abschnitte 4.4.2 und 4.4.3) bestätigen diese Beobachtung.
Die zuvor aufgestellte Hypothese wird durch Ergebnisse des Einsatzes eines kommerziellen
Sap2-Antikörpers gestützt. Im Kulturüberstand konnte Sap2 durch immunohistochemische
Färbung mit einem monoklonalen Sap2-Antikörper nachgewiesen werden. Abbildung 5.1
zeigt gewaschene eosingefärbte Zellen des Stammes C. albicans ATCC 2091, die mit einem
monoklonalen Antikörper gegen Sap2 inkubiert wurden. Die Zellen links stammen aus
YCB-RSA-Kultur (Mangelmedium zur Sap-Expression), die Zellen rechts wurden in
YPD-Medium (Vollmedium) kultiviert, das nicht zur Bildung von Sap2 führt.
Abbildung 5.1: Candida albicans ATCC 2091 mit monoklonalem Antikörper gegen Sap2 Eosinfärbung links: YCB-RSA-Kultur Sap2-Antikörper erkennbar an dunkelblauem Saum um die Zellen rechts: YPD-Kultur (Präparate freundlichst überlassen von Dr. Klinke)
Das Substratspektrum der anderen Saps ist noch nicht ausreichend charakterisiert.
Möglicherweise sind weitere Sap-Isoenzyme zur Kollagenolyse im sauren Milieu fähig.
Bislang ist keine kollagenolytische Aktivität der anderen Saps bekannt.
KAMINISHI und Mitarbeiter zeigten 1986 den Abbau von demineralisiertem Dentin im sauren
Milieu durch ein sezerniertes Enzym, das nach langer Inkubation von Candida albicans mit
Diskussion 98
Dentinpulver aus dem Kulturüberstand gewonnen wurde. Zum Nachweis der Hydrolyse von
säurelöslichem Kollagen und humanem Dentinkollagen diente die Hydroxyprolin-
Bestimmung. Diese Arbeitsgruppe belegte die Degradation von Dentinkollagen mit
elektronenmikroskopischen Aufnahmen in einer weiteren Publikation [HAGIHARA et al., 1988].
Nach dem heutigen Kenntnisstand über die Familie der sezernierten Aspartylproteinasen von
Candida albicans kann nur vermutet werden, dass KAMINISHI und Mitarbeiter [1986] entweder
Sap2 oder ein anderes Enzym der Sap-Familie beschrieben haben. Das von KAMINISHI et al.
angegebene pH-Optimum von 3,5 bis 4,0 entspricht nicht ganz dem für Sap2 ermittelten von
3,2 bis 3,5. In der Literatur differieren die Angaben zum Molekulargewicht für Sap2 von 40
bis 49 kDa [NAGLIK et al., 2003], die von KAMINISHI et al. beschriebene Proteinase besitzt ein
Molekulargewicht von 46 kDa. Beide Proteine weisen ihren isoelektrischen Punkt bei einem
pH-Wert von 4,2 auf. Diese Arbeitsgruppe zeigte auch den Abbau von bovinem Kollagen
durch ein Enzym, das aus dem Überstand einer Candida-albicans-Kultur mit 2 %
Rinderachillessehnenkollagen gewonnen wurde [KAMINISHI et al., 1988]. Diese Proteinase
wurde nicht weiter charakterisiert und es bleibt offen, ob es sich um dasselbe Enzym handelt
wie in den Arbeiten mit Dentinkollagen. Unbeleuchtet blieben auch das Substratspektrum der
Aspartylproteinase und die Frage, ob die Bildung des Enzyms auch durch RSA als alleinige
Stickstoffquelle im Kulturmedium induziert wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Degradation von humanem Dentinkollagen
durch Überstand aus YCB-RSA-Kultur von Candida albicans sowie durch gereinigte Sap2
(Fa. TaKaRa) gezeigt. Außerdem wurde unlösliches Typ-I-Kollagen aus der Rinder-
achillessehne durch Kulturüberstand und Sap2 gespalten, siehe auch KLINKE et al., [2007].
Die hydrolytische Aktivität im Kulturüberstand war sowohl bei Candida albicans, isoliert aus
kariöser Dentinläsion, als auch bei dem Referenzstamm Candida albicans ATCC 2091
nachweisbar. Die vorliegende Arbeit liefert somit einen Beitrag zur Aufklärung des
Substratspektrums von Sap2.
5.7.2 Kollagenolytische Aktivität des Zellaufschlusses
Wurde Zellaufschluss mit Kollagen bei saurem pH inkubiert, konnte ebenfalls eine deutliche
Kollagendegradation gemessen werden. Allerdings betrug die Kollagenhydrolyse durch
Zellaufschluss etwa 50 % der von Kulturüberstand. Das deutet auf eine deutlich geringere
zellassoziierte kollagenolytische Aktivität hin. Es kann geschlussfolgert werden, dass diese
kollagenolytische Wirkung wahrscheinlich von zytoplasmatischen Saps, die intrazellulär
bereits aktiv vorliegen, und von perizellulären Saps der Zellwand verursacht wurde. Die
zytoplasmatischen Saps wurden von HOMMA et al. [1992] beschrieben. Sie sind Vorstufen
Diskussion 99
der sezernierten Form. Die Saps erhalten im Golgi-Apparat durch die Abspaltung eines
Propeptids ihre reife und aktive Form und werden anschließend in Vesikeln zur Zellmembran
transportiert [NAGLIK et al., 2003]. PORTILLO und GANCEDO fanden 1986 bei der Unter-
suchung von Zellaufschluss eine Aspartylproteinase mit einem pH-Optimum von etwa 5. Da
damals noch nicht die Vielfalt der Saps bekannt war, kann die 1986 gefundene
proteolytische Aktivität heute als intrazelluläre Form einer Sap gedeutet werden. Die
Arbeitsgruppe um PORTILLO untersuchte nicht, ob die gefundene Aktivität auch im
Kulturüberstand nachweisbar war. Nichtsezernierte Enzyme mit kollagenolytischer Aktivität
wurden bei Candida albicans bisher nicht gefunden.
5.7.3 Hypothetische Rolle der sezernierten Aspartylproteinasen in der Dentinkariogenese Im Folgenden soll diskutiert werden, ob die gezeigte sezernierte proteolytische Aktivität von
Candida albicans eine Funktion in der Pathogenese der Dentinkaries ausübt. Zunächst muss
geklärt werden, ob C. albicans in der Nähe des Substrates Dentin nachgewiesen werden
kann.
Zahlreiche Arbeiten, die sich mit der Plaqueflora beschäftigen, zeigen ein gemeinsames
Auftreten von Candida albicans mit anderen Plaquemikroorganismen. In mehreren Studien
konnte C. albicans aus Kavitäten kariöser Zähne isoliert werden [ROSENSTENGEL et al., 1978;
JACOB et al., 1998]. Die Fähigkeit von C. albicans, Dentintubuli zu besiedeln, konnte in vivo
[JACOB et al., 1998] und in vitro [KLINKE & KLIMM, 2003; Sen et al., 1997] gezeigt werden.
Für die Entstehung von Dentinläsionen ist zunächst die Demineralisation des Dentins
erforderlich, die zur Exposition des Dentinkollagengeflechts führt und durch die säure-
bildenden Plaquemikroorganismen herbeigeführt wird [ARENDS et al., 1989; VAN-STRIJP et
al., 1997]. Auch Candida albicans kann den pH-Wert des umgebenden Milieus durch eine
H+-ATPase der Zellmembran und die Sekretion zahlreicher organischer Säuren erheblich
absenken [MONK et al., 1993; SAMARANAYAKE, 1983 und 1986; KLINKE et al., 2006].
Während die Demineralisation von Zahnhartsubstanz schon recht ausführlich untersucht
wurde, ist bisher nicht geklärt, welche Enzyme die Zerstörung der organischen Dentinmatrix
verursachen. Diskutiert werden mikrobielle Enzyme und auch körpereigene Matrix-
Metalloproteinasen [TJADERHANE et al., 1998; CHAUSSAIN-MILLER et al., 2006].
Seit langer Zeit wird ein Einfluss von C. albicans an der Entstehung der Karies diskutiert.
Bereits 1940 isolierten FOSSDICK und WESSINGER Hefepilze aus der Mundhöhle und zeigten
ihre Fähigkeit zur Dekalzifikation. Mehrere Publikationen konnten eine Korrelation zwischen
Ausmaß des Kariesbefalls und Quantität der Besiedelung mit Candida albicans nachweisen
Diskussion 100
[GÁBRIS et al., 1999; MOALIC et al., 2001]. Diese Ergebnisse und die hohe Isolierungs-
häufigkeit von C. albicans aus kariösen Kavitäten weisen auf eine mögliche Bedeutung von
C. albicans in der Pathogenese der Dentinkaries hin.
Ein direkter Nachweis der Beteiligung von C. albicans an der Dentinkaries wurde bisher nicht
erbracht. C. albicans ist sowohl in der Lage, Säuren zu produzieren, als auch Saps zu
sezernieren. Die in dieser Arbeit durchgeführten Kollagenabbau-Tests zeigten, dass die
kollagenolytische Aktivität von C. albicans ihre Wirkung insbesondere im sauren pH-Bereich
entfaltete, während bei physiologischem pH-Wert nur 20 % der Hydrolyse bei pH 3,5 erreicht
wurde. Für Sap2 wurde die höchste proteolytische Aktivität bei einem pH-Wert von 3,5
[SMOLENSKI et al., 1997], aber auch noch geringe Aktivität bei neutralem pH nachgewiesen
[WAGNER et al., 1995; SCHALLER et al., 2005].
Wie im Abschnitt 1.9 ausgeführt, kommt es auf der von Plaque bedeckten Zahnhartsubstanz
zu einem unregelmäßigen Wechsel von sauren und neutralen Milieuverhältnissen
[STEPHAN, 1944; MARGOLIS et al., 1985], während in der Tiefe aktiver kariöser Dentinläsionen
vorwiegend ein saurer pH-Wert vorherrscht [HOJO et al., 1994; DIRKSEN et al., 1963].
Überwiegen neutrale oder nur leicht saure Verhältnisse im Dentin der Kavität, wäre nur eine
sehr langsame Sap-bedingte Dentindegradation möglich. Im Zeitfenster des sauren Milieus
findet zum einen die Demineralisation der Zahnhartsubstanz statt, zum anderen könnten an
exponiertem Dentinkollagen die Saps von C. albicans ihre Wirkung zeigen. Es ist vorstellbar,
dass durch die Ansäuerung des Dentins in unmittelbarer Nähe der Hefezelle die Saps
besonders wirksam werden.
Wie hier unter In-vitro-Bedingungen gezeigt wurde, ist eine Hydrolyse von Dentinkollagen
durch Candida albicans in vivo unter den genannten Gegebenheiten denkbar.
6. Ausblick Zur vollständigen Erforschung der proteolytischen und insbesondere der kollagenolytischen
Enzyme des Hefepilzes Candida albicans und dessen Beteiligung am Kariesgeschehen sind
noch einige Forschungsanstrengungen zu unternehmen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Reinigung, Identifizierung und funktionelle
Charakterisierung einer sezernierten Metallo-Aminopeptidase namens CaApe2 mit bisher
unbekannter extrazellulärer Funktion beschrieben. Das Klonen und Überexprimieren von
CaApe2 in Candida albicans würde eine leichtere Enzymreinigung und die Bereitstellung
größerer Mengen an CaApe2 für eine noch ausführlichere Enzymcharakteristik gewähr-
leisten. Es sollte geklärt werden, ob CaApe2 eine aktivierende Wirkung auf im Dentin
enthaltene Matrix-Metalloproteinasen entfalten kann.
In weiteren Versuchen sollten die Expressionsbedingungen der in dieser Arbeit isolierten
Aminopeptidase in vivo untersucht werden. Versuche mit CaApe2-defizitären oder
CaApe2-überexprimierenden Mutanten könnten Hinweise auf die Funktionen der CaApe2
geben. Mithilfe von Antikörpern gegen CaApe2 oder mittels RT-PCR könnte die Expression
von CaApe2 in Gewebeproben, und speziell in kariöser Zahnhartsubstanz, auf Proteinebene
bzw. auf mRNA-Ebene untersucht werden.
Um den Umfang der Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu zu erfassen, ist
es notwendig, alle Sap-Isoenzyme auf kollagenolytische Aktivität zu untersuchen. Die pH-
Abhängigkeit der Kollagendegradation durch Aspartylproteinasen von Candida albicans
könnte mittels biochemischer Nachweisverfahren umfangreich analysiert werden.
Offen ist, ob die Virulenzfaktoren Säure und Sap2 von Candida albicans im besiedelten
Dentin der Kariesläsion synergistisch wirken und hohe Konzentrationen erreichen können,
geschützt vor dem neutralisierenden und verdünnenden Einfluss des Speichels.
Weitere Forschung ist auch auf dem Gebiet der Säuretoleranz-Mechanismen von C. albicans
erforderlich. Untersucht werden sollte, über welche speziellen Mechanismen der Hefepilz
zum Schutz vor dem sauren Milieu des Extrazellularraums verfügt.
Welche mikroökologischen Bedingungen der Hefepilz in vivo benötigt, um sich in der Plaque
zu etablieren und wie Candida albicans an der kariesfördernden Dysbiose [KLIMM, 1999]
beteiligt ist, sollte zukünftig aufgeklärt werden.
7. Zusammenfassung Die Hefe Candida albicans ist ein fakultativ humanpathogener Mikroorganismus, der insbe-
sondere bei immungeschwächten Patienten schwere Erkrankungen der Haut und Schleim-
häute sowie der inneren Organe hervorrufen kann. Seit langer Zeit wird eine Beteiligung des
Hefepilzes an der Ätiopathogenese der Zahnkaries diskutiert, vor allem aufgrund der Säure-
bildung, die zur Demineralisation der Zahnhartsubstanz beitragen kann. Hydrolytische
Enzyme ermöglichen vermutlich die Gewebeinvasion von Candida albicans.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein sezerniertes peptidolytisches Enzym aus der Zellwand
des Mikroorganismus isoliert, identifiziert und funktionell charakterisiert. Die mittels massen-
spektrometrischer Analyse der tryptischen Peptide und Datenbankrecherche ermittelte
Primärstruktur und die Ergebnisse der funktionellen Charakterisierung ließen eine Identifi-
zierung des peptidolytischen Enzyms als neutrale Arginin/Alanin/Leucin-spaltende Metallo-
Aminopeptidase (CaApe2) zu, die durch den ORF CaO19.5197 (GenBank RefSeq XM
705313) kodiert wird. Mithilfe der Proteinanalytik wurde Serin-88 als N-terminale Aminosäure
ermittelt. Die Aminosäuren 88 bis 954 des hypothetischen Genprodukts ergeben eine
nominale Molekularmasse von 97,607 kDa. CaApe2 weist gleich hohe Ähnlichkeit mit den
paralogen Genprodukten ScAap1 und ScApe2 auf, was eine Duplikation und
Subfunktionalisierung des phylogenetischen Vorläufergens in Saccharomyces cerevisiae
nahe legt. Die fehlende kollagenolytische Wirksamkeit von CaApe2 spricht gegen eine
direkte Rolle des Enzyms in der Pathogenese der Dentinkaries von Candida albicans,
schließt aber eine unterstützende Funktion nicht aus.
Die Kollagendegradation durch aufgeschlossene Zellen und Kulturüberstand einer
Flüssigkultur von Candida albicans wurde im sauren und neutralen Milieu mithilfe der
Hydroxyprolin-Bestimmung untersucht. Dabei war keine Kollagenolyse mit Aktivitäts-
maximum im neutralen Bereich nachweisbar. Im sauren pH-Bereich konnte eine deutliche
Hydrolyse von säureunlöslichem Typ-I-Kollagen und auch von demineralisierter Dentinmatrix
durch Kulturmedium gezeigt werden. Diese Kollagenolyse kann auf die bereits umfangreich
charakterisierten sezernierten Aspartylproteinasen zurückgeführt werden. Die in der Literatur
beschriebene Korrelation zwischen dem Ausmaß des Kariesbefalls und der Quantität der
Besiedelung mit Candida albicans legt eine Beteiligung des Hefepilzes an der Kariogenese
nahe. Auch die in der vorliegenden Arbeit gezeigte Fähigkeit von Candida albicans zur
Dentinkollagendegradation unterstützt die Hypothese einer Kariogenität der Hefe.
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9. Anhang
9.1 Tabellenverzeichnis
1.1 Das DHS-System mit einigen klinisch wichtigen Erregern ............................. 2 1.2 Prädisponierende Faktoren für eine Mykose .................................................. 4 1.3 Übersicht medizinisch relevanter Nicht-albicans-Candida-Arten ................... 6 1.4 Klinische Formen der Infektion mit Candida albicans .................................... 7
3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ................................................................ 31 3.2 Chemikalien ................................................................................................... 34 3.3 Bestandteile der Kulturmedien ....................................................................... 36 3.4 Enzyme .......................................................................................................... 36 3.5 Antikörper ....................................................................................................... 36 3.6 Stämme von Candida albicans ...................................................................... 37 3.7 Puffersysteme ................................................................................................ 50 3.8 Getestete Proteinaseinhibitoren und Metallkationen ..................................... 52
4.1 Vergleich von Zellextrakt und Zellwandlysat .................................................. 60 4.2 Bilanz der Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand ....... 65 4.3 Zusammenstellung kinetischer Parameter von CaApe2 ................................ 72
Anhang 122
9.2 Abbildungsverzeichnis
1.1 Unterschiede zwischen der „white“ und „opaque“ Form des Candida-albicans- Stammes WO-1 ............................................................................................. 13 1.2 Wechselmöglichkeiten zwischen den morphologischen Formen von Candida albicans ........................................................................................... 14 1.3 Einteilung der Peptidasen .............................................................................. 18 1.4 Dendrogramm der Sap-Familie ...................................................................... 21 1.5 Expression der SAP-Gene der einzelnen phänotypischen Formen in vitro ... 23 3.1 Eichgerade für die Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Roti®- Nanoquant-Kit (repräsentatives Beispiel) ...................................................... 48 3.2 Eichgerade für die Hydroxyprolin-Bestimmung (repräsentatives Beispiel) .... 55 4.1 Volumenaktivität verschiedener Zellwandextrakte und Zellwandlysat ........... 58 4.2 Volumenaktivität der Zellwandextrakte aus verschiedenen Kulturmedien ..... 59 4.3 Chromatographie des Zellwandlysats an HiLoad 26/10 Q Sepharose HP .... 61 4.4 Chromatographie an Mono Q HR 5/5 ............................................................ 62 4.5 Chromatogramm nach Rechromatographie an Mono Q HR 5/5 .................... 63 4.6 Chromatographie an Superdex 200 10/300 GL ............................................. 64 4.7 Chromatographie an RESOURCE
TM ETH ..................................................... 65 4.8 Proteinmuster der Reinigungsschritte in der SDS-PAGE .............................. 66 4.9 Proteinmuster der RESOURCE
TM ETH-Fraktionen C15 bis D3 .................... 67 4.10 Identifizierung der isolierten Peptidase von Candida albicans ....................... 69 4.11 Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenzen der Aminopeptidase CaApe2 aus Candida albicans mit homologen Proteinen anderer Ascomycota 70 4.12 pH-Abhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 .................... 71 4.13 Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Arg-AMC-Konzentration 72 4.14 Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der L-Ala-AMC-Konzentration 73 4.15 Spezifische Aktivität der gereinigten Peptidase mit L-Leu-AMC als Substrat 74 4.16 Phenanthrolin-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 ..... 75 4.17 EDTA-Einfluss auf die Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 .................. 76 4.18 Einfluss von Metallkationen auf die Enzymaktivität ....................................... 77 4.19 Temperaturabhängigkeit der Hydrolyse von L-Arg-AMC durch CaApe2 ...... 78 4.20 Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ................ 79 4.21 Kollagenhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ......... 80 4.22 Analyse des Kollagenabbaus durch die gereinigte Peptidase mittels SDS-PAGE .................................................................................................. 81 4.23 Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans ............. 82 5.1 Candida albicans ATCC 2091 mit monoklonalem Antikörper gegen Sap2 .... 97
Anhang 123
9.3 Abkürzungsverzeichnis
L-Ala-AMC L-Alanin-7-Amido-4-Methylcoumarin
ALS Agglutinin-ähnliche Sequenz
AMC 7-Amino-4-Methylcoumarin
APE2 Aminopeptidase-2-Gen
APS Ammoniumperoxodisulfat
L-Arg-AMC L-Arginin-7-Amido-4-Methylcoumarin
AS Ammoniumsulfat
ATP Adenosintriphosphat
BHI Brain-Heart-Infusion
BLASTp Basic Local Alignment Search Tool for Proteins
bp Basenpaar
RSA Rinder-Serum-Albumin
CaApe2 Candida-albicans-Aminopeptidase 2
CaPLB Candida-albicans-Phospholipase-Gen der Gruppe B
CD Zellaufschluss (cells disrupted)
CEx Zellextrakt (cell extract)
CF Kulturüberstand (culture fluid)
CWP Zellwandpeptidase (cell wall peptidase)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’,-tetraessigsäure
ESI Elektrospray-Ionisation
FALGPA 2-Furylacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala
g Gravitationskonstante mit 9,81 m/s2
Glc Glukose
GPI-Anker Glycosylphosphatidylinositol-Anker
KBE Koloniebildende Einheit
kDa Kilodalton
LAP1 Leucin-Aminopeptidase-1-Gen
LIP Lipase-Gen
L-Leu-AMC L-Leucin-7-Amido-4-Methylcoumarin
Anhang 124
β-ME β-Mercaptoethanol
MMP Matrix-Metalloproteinase
MS/MS Tandem-Massenspektrometrie
mRNA Messenger-Ribonukleinsäure
NCBI National Center for Biotechnology Information
ORF offener Leserahmen
PAA Polyacrylamid
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR Polymerasekettenreaktion
PD-10 Entsalzungssäule
PDB Protein Data Bank
PIR Protein Information Resource
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PRF Protein Research Foundation
PZ-PLGPA 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg
RHE rekonstruiertes menschliches Epithel
rpm Rotationen in der Minute
RT-PCR Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription
S% Sättigungsprozent
Sap sezernierte Aspartylproteinase
ScAap1 Alanin/Arginin-spezifische Aminopeptidase 1 von S. cerevisiae
SDS Natriumdodecylsulfat
SH-Gruppe Sulfhydryl-Gruppe
spp. Spezies
TEMED N,N,N’,N’-Tetraethyl-Methylen-Diamin
TRIS Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan
U Unit
v/v Verhältnis Volumen/Volumen
w/v Verhältnis Masse/Volumen
YCB Yeast Carbon Base
YNB Yeast Nitrogen Base
YPD Hefeextrakt-Pepton-Glukose-Medium
ZWL Zellwandlysat
Anhang 125
9.4 Danksagung
Sehr herzlich möchte ich Herrn Prof. Dr. med. habil. H. Wolfgang Klimm für die interessante
Themenstellung, die Bereitstellung der Forschungsmittel, die Organisation der Forschungs-
tätigkeit und Hilfe bei der Abfassung der Arbeit danken. Mein ausgesprochener Dank gilt
Herrn Dr. med. H. Thomas Klinke für die sehr hilfreiche theoretische und praktische Unter-
stützung, für die konstruktive Diskussion und für das gründliche Korrekturlesen des
Manuskriptes. Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas M. Kriegel möchte ich gleichermaßen
sehr herzlich für das große Engagement an dem fachbereichsfremden Thema, die
Bereitstellung des Laborarbeitsplatzes, der Betreuung der zahlreichen Enzymreinigungen
sowie für die andauernde Diskussionsbereitschaft und für das kritische Korrekturlesen der
Arbeit danken. Besonderer Dank geht auch an Herrn Dr. Christian Lück und Frau Jutta
Paasche aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Medizinischen
Fakultät Carl Gustav Carus für die Betreuung des mikrobiologischen Anteils des Forschungs-
themas sowie für die Möglichkeit der Nutzung der Technik zur Anzucht der Kulturen.
Mein besonderer Dank richtet sich auch an Frau Dr. Eva-Christina Müller und Herrn Dr.
Albrecht Otto vom Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in Berlin für die Protein-
analytik mittels Massenspektrometrie sowie an Herrn Dr. Andreas Rump vom Institut für
Klinische Genetik der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität
Dresden für die Ergebnisse der DNA-Sequenzanalyse und an Herrn Prof. Dr. Wolfgang
Schellenberger vom Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät an der Universität
Leipzig für die enzymkinetischen Berechnungen.
Großer Dank gilt auch Frau Petra Strämel und Frau Dr. Karina Kettner aus dem Institut für
Physiologische Chemie für die Einweisung in die biochemischen Arbeitsmethoden und
Benutzung der Laborgeräte. Für die freundliche Hilfe bei der Suche nach selten benutzten
Chemikalien und die Diskussion von methodischen Problemen möchte ich mich bei Frau Dr.
Brigitte Bernard aus dem Institut für Physiologische Chemie bedanken.
Der Poliklinik für Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie danke ich für die freundliche Bereitstellung
von extrahierten Weisheitszähnen zur Gewinnung von Dentin. Bedanken möchte ich mich
ebenso bei Herrn Prof. Dr. P. Grellier vom Museum National d'Histoire Naturelle in Paris für
die freundliche Sendung von säurelöslichem Kollagen aus humaner Plazenta.
Zu guter Letzt möchte ich meiner Familie und meiner Freundin Roswitha Nitzsche herzlichen
Dank für die treue Begleitung sowie für die materielle und insbesondere seelische
Umsorgung in der Zeit während meiner Arbeit an der Dissertation aussprechen.
Anhang 126
9.5 Tabellarischer Lebenslauf
Name: Roman Pönisch Anschrift: Ehrlerstraße 1 73479 Ellwangen (Jagst) Geburtsdatum: 13. Juni 1980 Geburtsort: Dresden Eltern: Dr. Gerd Pönisch, Mathematiker Elisabeth Pönisch, Zahnärztin Geschwister: Christin Pönisch, cand. med. Staatsbürgerschaft: deutsch Familienstand: ledig
Schulausbildung: September 1987 bis Juni 1992 138. Polytechnische Oberschule in Dresden August 1992 bis Juli 1999 Andreas-Schubert-Gymnasium Dresden Schulabschluss: 1999, Abitur Wehrdienst: August 1999 bis Ende Juni 2000 Zivildienst bei der Volkssolidarität Dresden Studium der Zahnmedizin: Oktober 2000 bis Dezember 2005 Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus der Technischen Universität Dresden Zahnmedizinische Vorprüfung: März 2003 Auslandspraktikum: Juni bis Juli 2004 University of Alberta (Edmonton, Kanada) Staatsexamen: August bis Dezember 2005 Tag der Approbation: 6. Dezember 2005 Promotionsstudium: Januar 2006 bis Ende August 2006
Assistenzzahnarzt: seit September 2006 in Ellwangen (Jagst)
Anhang 127
9.6 Erklärung
Ich erkläre, dass ich die vorliegende Dissertation „Isolierung, Identifizierung und funktionelle
Charakterisierung der Metallo-Aminopeptidase CaApe2 – Ein experimenteller Beitrag zur
Beurteilung des kariogenen Potentials von Candida albicans“ unter der wissenschaftlichen
Betreuung von Herrn Prof. Dr. med. habil. H. Wolfgang Klimm und unter Mitwirkung von
Herrn Dr. med. H. Thomas Klinke und Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas M. Kriegel in
Dresden selbständig verfasst habe. Die Proteinanalytik mittels Massenspektrometrie wurde
von Frau Dr. Eva-Christina Müller und Herrn Dr. Albrecht Otto vom Max-Delbrück-Centrum
für Molekulare Medizin in Berlin durchgeführt, die vergleichende Sequenzanalyse führte Herr
Dr. Andreas Rump vom Institut für Klinische Genetik der Medizinischen Fakultät Carl Gustav
Carus der Technischen Universität Dresden durch und Herr Prof. W. Schellenberger vom
Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät an der Universität Leipzig nahm die
enzymkinetischen Berechnungen vor.
Andere als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen wurden von mir nicht benutzt. Alle
angeführten Zitate wurden kenntlich gemacht. Die Dissertation in dieser oder ähnlicher Form
wurde an keiner anderen Stelle zum Zwecke eines Promotions- oder anderen
Prüfungsverfahrens eingereicht. Es haben bisher keine erfolglosen Promotionsversuche
stattgefunden.
Dresden, den 30. Juli 2008 Roman Pönisch