Post on 02-Jul-2022
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
RIO DE JANEIRO
2017
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Instituto
Oswaldo Cruz como parte dos requisitos
para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em
Biologia Celular e Molecular
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
RIO DE JANEIRO
2017
ii
Elaborada pelo Sistema de Geraccedilatildeo Automaacutetica de Ficha Catalograacutefica da Biblioteca de ManguinhosICICT com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Bittencourt Tamiris Lameira
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias Tamiris Lameira Bittencourt Rio de Janeiro 2017
XV 81 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Instituto Oswaldo Cruz Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e
Molecular 2017
Orientador Milton Ozoacuterio Moraes
Bibliografia f 66-81
1 Autofagia 2 Mycobacterium leprae 3 Interferon tipo I I Tiacutetulo
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
EXAMINADORES
Prof Dra Maria Cristina Vidal Pessolani ndash PRESIDENTE (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Luzia Maria de Oliveira Pinto (IOCFIOCRUZ)
Prof Dra Luciana Silva Rodrigues (LIPUERJ)
SUPLENTES
Prof Dr Flavio Alves Lara ndash REVISOR (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Leonardo Holanda Travassos Correcirca (IBCCFUFRJ)
Rio de Janeiro 06 de novembro de 2017
iv
ldquoAos meus pais Cristina e Marcelo
e meu irmatildeo Lucas Muito obrigada
por depositarem tanto amor e confianccedila em mimrdquo
v
Agradecimentos
Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas
Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os
momentos te amo
Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim
Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade
Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha
formaccedilatildeo amo vocecircs
Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma
positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar
Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido
desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter
contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada
Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria
como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo
injusta
As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a
gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo
teria permanecido de peacute
A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela
confianccedila
Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha
segunda famiacutelia
Ao apoio financeiro do CNPq
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
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Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
i
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Instituto
Oswaldo Cruz como parte dos requisitos
para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em
Biologia Celular e Molecular
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
RIO DE JANEIRO
2017
ii
Elaborada pelo Sistema de Geraccedilatildeo Automaacutetica de Ficha Catalograacutefica da Biblioteca de ManguinhosICICT com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Bittencourt Tamiris Lameira
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias Tamiris Lameira Bittencourt Rio de Janeiro 2017
XV 81 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Instituto Oswaldo Cruz Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e
Molecular 2017
Orientador Milton Ozoacuterio Moraes
Bibliografia f 66-81
1 Autofagia 2 Mycobacterium leprae 3 Interferon tipo I I Tiacutetulo
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
EXAMINADORES
Prof Dra Maria Cristina Vidal Pessolani ndash PRESIDENTE (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Luzia Maria de Oliveira Pinto (IOCFIOCRUZ)
Prof Dra Luciana Silva Rodrigues (LIPUERJ)
SUPLENTES
Prof Dr Flavio Alves Lara ndash REVISOR (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Leonardo Holanda Travassos Correcirca (IBCCFUFRJ)
Rio de Janeiro 06 de novembro de 2017
iv
ldquoAos meus pais Cristina e Marcelo
e meu irmatildeo Lucas Muito obrigada
por depositarem tanto amor e confianccedila em mimrdquo
v
Agradecimentos
Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas
Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os
momentos te amo
Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim
Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade
Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha
formaccedilatildeo amo vocecircs
Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma
positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar
Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido
desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter
contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada
Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria
como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo
injusta
As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a
gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo
teria permanecido de peacute
A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela
confianccedila
Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha
segunda famiacutelia
Ao apoio financeiro do CNPq
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
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DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
ii
Elaborada pelo Sistema de Geraccedilatildeo Automaacutetica de Ficha Catalograacutefica da Biblioteca de ManguinhosICICT com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Bittencourt Tamiris Lameira
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias Tamiris Lameira Bittencourt Rio de Janeiro 2017
XV 81 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Instituto Oswaldo Cruz Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e
Molecular 2017
Orientador Milton Ozoacuterio Moraes
Bibliografia f 66-81
1 Autofagia 2 Mycobacterium leprae 3 Interferon tipo I I Tiacutetulo
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
EXAMINADORES
Prof Dra Maria Cristina Vidal Pessolani ndash PRESIDENTE (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Luzia Maria de Oliveira Pinto (IOCFIOCRUZ)
Prof Dra Luciana Silva Rodrigues (LIPUERJ)
SUPLENTES
Prof Dr Flavio Alves Lara ndash REVISOR (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Leonardo Holanda Travassos Correcirca (IBCCFUFRJ)
Rio de Janeiro 06 de novembro de 2017
iv
ldquoAos meus pais Cristina e Marcelo
e meu irmatildeo Lucas Muito obrigada
por depositarem tanto amor e confianccedila em mimrdquo
v
Agradecimentos
Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas
Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os
momentos te amo
Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim
Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade
Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha
formaccedilatildeo amo vocecircs
Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma
positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar
Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido
desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter
contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada
Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria
como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo
injusta
As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a
gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo
teria permanecido de peacute
A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela
confianccedila
Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha
segunda famiacutelia
Ao apoio financeiro do CNPq
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados
por micobacteacuterias
Tamiris Lameira Bittencourt
Orientador Prof Dr Milton Ozoacuterio Moraes
EXAMINADORES
Prof Dra Maria Cristina Vidal Pessolani ndash PRESIDENTE (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Luzia Maria de Oliveira Pinto (IOCFIOCRUZ)
Prof Dra Luciana Silva Rodrigues (LIPUERJ)
SUPLENTES
Prof Dr Flavio Alves Lara ndash REVISOR (IOCFIOCRUZ)
Prof Dr Leonardo Holanda Travassos Correcirca (IBCCFUFRJ)
Rio de Janeiro 06 de novembro de 2017
iv
ldquoAos meus pais Cristina e Marcelo
e meu irmatildeo Lucas Muito obrigada
por depositarem tanto amor e confianccedila em mimrdquo
v
Agradecimentos
Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas
Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os
momentos te amo
Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim
Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade
Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha
formaccedilatildeo amo vocecircs
Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma
positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar
Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido
desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter
contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada
Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria
como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo
injusta
As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a
gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo
teria permanecido de peacute
A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela
confianccedila
Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha
segunda famiacutelia
Ao apoio financeiro do CNPq
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
iv
ldquoAos meus pais Cristina e Marcelo
e meu irmatildeo Lucas Muito obrigada
por depositarem tanto amor e confianccedila em mimrdquo
v
Agradecimentos
Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas
Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os
momentos te amo
Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim
Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade
Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha
formaccedilatildeo amo vocecircs
Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma
positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar
Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido
desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter
contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada
Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria
como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo
injusta
As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a
gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo
teria permanecido de peacute
A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela
confianccedila
Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha
segunda famiacutelia
Ao apoio financeiro do CNPq
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
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articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
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Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
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A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
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duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
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lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
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Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
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simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
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captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
v
Agradecimentos
Primeiramente a Deus por todas as minhas conquistas
Ao meu noivo Mateus por aturar meu estresse e me apoiar em todos os
momentos te amo
Aos meus pais Marcelo e Cristina por todo suporte e amor dado a mim
Ao meu irmatildeo Lucas pelo carinho e lealdade
Agrave minha avoacute Sebastiana e minha tia Rosilene por terem ajudado na minha
formaccedilatildeo amo vocecircs
Agradeccedilo ao meu orientador Milton Ozoacuterio Moraes por influenciar de forma
positiva tantas mentalidades pelas discussotildees cientiacuteficas e por sempre nos motivar
Ao Dr Leonardo e ao Dr Bruno Jorge sem vocecircs esse trabalho natildeo teria sido
desenvolvido em especial ao Leacuteo por ser tatildeo chato (brincadeira rs) mas por ter
contribuiacutedo diretamente para o meu amadurecimento profissional muito obrigada
Agradeccedilo aos colegas de trabalho do LAHAN vocecircs fazem parte dessa histoacuteria
como satildeo muitos integrantes fiquei com receio de esquecer algum nome e acabar sendo
injusta
As mais lindas companheiras de laboraacutetoacuterio Mariana Jeacutessica Ana Carolina e a
gatiacutessima Mayara Mendes vocecircs fazem meus dias serem mais leves sem vocecircs eu natildeo
teria permanecido de peacute
A Dra Roberta Olmo sempre soliacutecita e pronta para nos acalmar obrigada pela
confianccedila
Agradeccedilo a famiacutelia do meu noivo pelo carinho ao longo desses anos minha
segunda famiacutelia
Ao apoio financeiro do CNPq
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
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Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulaccedilatildeo da autofagia mediada pela via de IFN tipo I em macroacutefagos infectados por
micobacteacuterias
RESUMO
Tamiris Lameira Bittencourt
Micobacteacuterias patogecircnicas como o Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) e o
Mycobacterium leprae (M leprae) tem a capacidade de subverter mecanismos
microbicidas de macroacutefagos a partir da permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada pelo
sistema de secreccedilatildeo ESX-1 Uma via de matildeo dupla eacute induzida onde a ativaccedilatildeo da
sinalizaccedilatildeo de STINGTBK1IRF3 leva tanto agrave modulaccedilatildeo positiva de IFN tipo I
favorecendo a infecccedilatildeo mas tambeacutem direcionam bacteacuterias para a autofagia mediada por
ubiquitinaccedilatildeo A regulaccedilatildeo da ativaccedilatildeo da via de IFN do tipo I influencia as funccedilotildees da
via de autofagia reconhecida como um sistema citoplasmaacutetico para a eliminaccedilatildeo direta de bacteacuterias Uma proteiacutena chave na autofagia eacute a parkina em que o gene PARK2 teve
polimorfismos associados com a suscetibilidade agrave hanseniacutease onde se observou que
nocautes para o gene natildeo satildeo capazes de induzir o processo e ativar a resposta
microbicida Nossos dados sugerem que a micobacteacuteria natildeo patogecircnica Mycobacterium
smegmatis (Ms) eacute capaz de modular positivamente a induccedilatildeo de autofagia responsaacutevel
pelo controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana onde observa-se o aumento da
viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos quando a autofagia foi
bloqueada Entretanto o Ms prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula
hospedeira Jaacute a micobacteacuteria patogecircnica M leprae se mostrou um fraco indutor de
genes do complexo autofaacutegico sendo capaz de modular negativamente a expressatildeo de
LC3 nos macroacutefagos THP-1 No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de
soro foi observado que o tratamento com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes
associados a autofagia bem como o gene PARK2 Entretanto em nossos experimentos
a induccedilatildeo do transcrito de parkina bem como a induccedilatildeo da expressatildeo de genes
relacionados ao processo autofaacutegico devido a privaccedilatildeo de soro natildeo foram suficientes
para aumentar a capacidade microbicida dos macroacutefagos Mesmo assim a viabilidade
intracelular do M leprae foi aumentada na presenccedila de IFNβ recombinante Tambeacutem
mostramos que o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo
de IFNβ natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Por fim natildeo observamos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina por Western Blot na presenccedila ou ausecircncia de soro na
infecccedilatildeo pelo M leprae o que pode explicar o motivo pelo qual natildeo foi observado
diferenccedila na viabilidade do bacilo Nossos dados sugerem um papel precoce do IFNβ na
modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M leprae definindo o balanccedilo
fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e susceptibilidade mediada
pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Modulation of autophagy mediated by the type I IFN pathway in macrophages infected
with mycobacteria
ABSTRACT
Tamiris Lameira Bittencourt
Pathogenic mycobacteria such as Mycobacterium tuberculosis (M tuberculosis) and
Mycobacterium leprae (M leprae) have the ability to subvert microbicidal macrophage
mechanisms from the phagosomal permeabilization mediated by the ESX-1 secretion
system A dual-pathway is induced where activation of STINGTBK1IRF3 signaling
leads to both positive modulation of type I IFN favoring infection but also directs
bacteria to ubiquitination-mediated autophagy The regulation of the activation of the
type I IFN pathway influences the functions of the autophagy pathway recognized as a
cytoplasmic system for the direct elimination of bacteria A key protein in autophagy is
parkin in which the PARK2 gene has polymorphisms associated with leprosy
susceptibility where it was observed that knockouts to the gene are not able to induce
the process and activate the microbicidal response Our data suggest that the non-
pathogenic mycobacterium Mycobacterium smegmatis (Ms) is capable of modulating
positively the autophagy induction responsible for the control of bacterial intracellular
replication where it is observed the increase in the viability and survival of Ms inside
the macrophages when autophagy was blocked However Ms impairs the induction of
the type I IFN pathway in the host cell The pathogenic mycobacterium M leprae was
shown to be a weak inducer of genes of the autophagic complex being able to
negatively modulate the expression of LC3 in THP-1 macrophages In the autophagy
induction model through serum deprivation it was observed that the treatment with
IFNβ seems to reverse the induction of genes associated with autophagy as well as the
PARK2 gene However in our experiments the induction of the parkin transcript as
well as the induction of the expression of genes related to the autophagic process due to
serum deprivation were not sufficient to increase the microbicidal capacity of the
macrophages Even so the intracellular viability of M leprae was increased in the
presence of recombinant IFNβ We also showed that the increase of IL-1β cytokine in
M leprae infection with the IFNβ stimulus was not able to contain the growth of the
bacillus Finally we observed no difference in the activation of Parkin by Western Blot
in the presence or absence of serum in M leprae infection which may explain why no
difference in bacillus viability was observed Our data suggest an early role of IFNβ in
the modulation of autophagy in the outcome of M leprae infection defining the fine
balance between resistance mediated by the activation of autophagy and susceptibility
mediated by the activation of type I IFN
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
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idad
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raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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independently of mammalian target of rapamycin inhibition J Biol Chem 2012
Apr 13287(16)12668-78
80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
3-MA - 3-metiladenina
AIM2 ndash do inglecircs ldquoAbsent in melanoma 2rdquo
Akt - Cepa Ak de camundongos associada a um retroviacuterus ldquotransformanterdquo Tambeacutem
pode ser chamada de Proteiacutena cinase B
AMP - Monofosfato de adenosina
AMPK - Proteiacutena cinase ativada por AMP
APC - Ceacutelulas apresentadoras de antiacutegenos
ATG - Genes (e proteiacutenas) relacionados com a autofagia
AU - Unidades arbitraacuterias
BAAR - Bacilo aacutelcool-aacutecido resistente
BB - Forma ldquoborderline borderlinerdquo
BCG - Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Gueacuterin
Bcl-2 - Proteiacutena recombinante linfoma de ceacutelulas B 2
BECN1- Beclina-1
BL - Forma ldquoborderlinerdquo lepromatosa
BSA - Albumina seacuterica bovina
BT - Forma ldquoborderlinerdquo tuberculoacuteide
CD - Grupamento de diferenciaccedilatildeo
cDNA - DNA complementar
CFP-10 - Antiacutegeno de filtrado decultura de 10 kDa
CFU - Unidades formadoras decolocircnias
cGAMP -do inglecircs ldquoCyclic guanosine monophosphatendashadenosine monophosphaterdquo
cGAS - do inglecircs ldquoCyclic GMP-AMP synthaserdquo
CLIR - LIR especiacutefico para interaccedilatildeo com LC3C
CO2 - Dioacutexido de carbono
CR - Receptores de complemento
CT - do inglecircs ldquoCycle thresholdrdquo
CYP27b1- Citocromo P450 famiacutelia27 subfamiacutelia B polipeptiacutedeo 1
DAPI - 46 diamidino-2-fenilindol
DC-SIGN CD209 - Moleacutecula de adesatildeo intercelular 3 especiacutefica de
ceacutelulas dendriacuteticas-natildeo ligante de integrinas
DEFB4 - ldquoDefensin beta 4Ardquo
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82
ix
DTT - Ditiotreitol
EDTA ndash Aacutecido etilenodiaminotetraaceacutetico
ELISA - Ensaio Imunoenzimaacutetico
ENH - Eritema nodoso hansecircnico oureaccedilatildeo tipo 2
ERRE - Retiacuteculo endoplasmaacutetico
ESAT-6 - Alvo antigecircnico de secreccedilatildeo inicial de 6 kDa
ESX-1 - Sistema de secreccedilatildeo do tipo VII ESAT-6
FcR - Receptor para porccedilatildeo Fc
FIP200 - Proteiacutena de interaccedilatildeo com ULK
g- Velocidade de sedimentaccedilatildeo em unidade gravitacional
GAPDH - Gliceraldeiacutedo 3-fosfato desidrogenase
GIR - Motivo de interaccedilatildeo com galectina
IB - Iacutendice baciloscoacutepico
IFN - Interferon
IL - Interleucina
IRF - Fator regulador de IFN
IRGM - GTPase M relacionada agrave imunidade
kDa - Quilodaacutelton
LAM - Lipoarabinomanana
LAMP-2 - Proteiacutena de membrana-2 associada ao lisossomo
LAP - Fagocitose associada agrave LC3
LC3Atg8 - proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de cadeia leve 3
LDL - Lipoproteiacutenas de baixa densidade
LIR - Motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3
LL - Forma lepromatosa
LRG-47 - GTPase de 47 kDa induzida por IFNγ
M1 - Macroacutefagos inflamatoacuterios
M2 - Macroacutefagos antiinflamatoacuterios
MAM - Membrana do ER associadaagrave mitococircndria
MB - Multibacilares
M leprae - Mycobacterium leprae
MOI - Multiplicidade de infecccedilatildeo
Ms - Mycobacterium smegmatis
Mtb - Mycobacterium tuberculosis
x
mTOR - Alvo da rapamicina nos mamiacuteferos
mTORC - Complexo mTOR
MΦs - Macroacutefagos
NI - Natildeo infectado
NBR1 - Proteiacutena vizinha ao gene BRCA1
NDP52 CALCOCO - Proteiacutena de antiacutegeno nuclear de 52 kDa do inglecircs ldquoCalcium
binding and coiled-coildomainrdquo
NF-κB - Fator nuclear κB
NOD - Domiacutenio de oligomerizaccedilatildeo de ligaccedilatildeo a nucleotiacutedeo
OASL - do inglecircs ldquo2-5-oligoadenylate synthetase likerdquo
OPTN - Optineurina
oxLDL - LDL oxidadas
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
PB - Paucibacilares
PB1 - Domiacutenio 1 de ligaccedilatildeo agraveproteiacutena
PBS - Salina tampatildeo fosfato
PCR - Reaccedilatildeo em cadeia dapolimerase
PGL-1 - Glicolipiacutedeo fenoacutelico-1
PI3K - Fosfatidilinositol 3-cinase
PI3KC - Complexo PI3K de classe III
PI3P - Fosfatidilinositol-3-fosfato
PMA - Acetato-13 de forbol miristato-12
PQT - Poliquimioterapia
Raptor - Proteiacutena regulatoacuteriaassociada agrave mTOR
RIG-I - Gene 1 induzido por retinoacuteide
RNAm - RNA mensageiro
RP - Rapamicina
RPL13A - ldquoRibosomal protein L13ardquo
RPMI - Meio do Instituto Memorial Roswell Park
RR - Reaccedilatildeo reversa ou reaccedilatildeo tipo1
RT-qPCR- Reaccedilatildeo da transcriptase reversa seguida de qPCR
SFB - Soro fetal bovino
SLR - Receptores do tipo sequestosoma SQSTM1p62
SMURF1 - do inglecircs ldquoSMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1rdquo
xi
SNC - Soro normal de cabra
SQSTM1p62 - Sequestosoma 1
SR - Receptores ldquoscavengerrdquo
STING - do inglecircs ldquoStimulator of interferon genesrdquo
TAX1BP1 - do inglecircs ldquoTax1 binding protein 1rdquo
TBK1 - Cinase 1 de ligaccedilatildeo a TANK
Th - Ceacutelula T auxiliar
THP-1 - Linhagem celular de leucemia monociacutetica aguda humana
TIM4 - do inglecircs T-cell immunoglobulin mucin protein 4rdquo
TNF - Fator de necrose tumoral
TT - Forma tuberculoacuteide
U - Unidade internacional
UBA - do inglecircs ldquoUbiquitin-associated protein domainrdquo
UBD - Domiacutenio de ligaccedilatildeo agrave ubiquitina
UBL - do inglecircs ldquoUbiquitin-like domainrdquo
UBQLN - do inglecircs ldquoUbiquilinrdquo
ULk - Famiacutelia similar a Unc-51
VDR - Receptor de vitamina D
VPS - Proteiacutena vacuolar associada agrave separaccedilatildeo
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de
2015 2
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da
Hanseniacutease 4
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M
leprae 7
Figura 14Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease 10
Figura 15Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica 12
Figura 16Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia 15
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos 18
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica 20
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal 21
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagia
dependente de galectina-8 e ubiquitina 23
Figura 41Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com
Ms41
Figura 42Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 42
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 43
Figura 441Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e
OASL diminuiacuteda 44
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos
THP145
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 46
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soro em diferentes
tempos 47
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3-II em macroacutefagos THP-1 estimulados
com o M leprae na privaccedilatildeo de SFB 49
xiii
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo
de macroacutefagos THP-1 pelo M leprae 51
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos
THP-1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF 53
Figura 491 A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina 54
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 55
Figura 4101A atividade de parkina fosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae 56
Figura 4102A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse
mecanismo 57
Figura 51 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo64
xiv
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Hanseniacutease 1
111 Epidemiologia 1
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo 2
113 Mycobacterium leprae 6
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro 8
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do citoplasma 11
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares 13
12 Autofagia 17
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia 17
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva 22
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares 23
13 Justificativa 27
2 OBJETIVO 28
21 Objetivo geral 28
22 Objetivos especiacuteficos 28
3 MATERIAL E MEacuteTODOS 29
31 Cultivo de micobacteacuterias 29
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis 29
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae 30
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH 30
32 Cultura de ceacutelulas THP-1 31
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia 31
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos 31
341 Extraccedilatildeo de RNA 32
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA 32
343 Tratamento do RNA com DNAse 33
344 Extraccedilatildeo do DNA 33
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica 34
351 Siacutentese de cDNA 34
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) 34
xv
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis 35
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real 36
36 Imunofluorescecircncia 36
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas 37
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT 37
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting 38
310 Anaacutelises estatiacutesticas 39
4 RESULTADOS 40
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1 40
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis 42
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos 43
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis 44
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae 46
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo
I47
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae 51
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae 52
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em macroacutefagos
THP-1 independente da retirada de SFB 54
5 DISCUSSAtildeO 57
6 CONCLUSOtildeES 65
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 66
1
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Hanseniacutease
111 Epidemiologia
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa crocircnica causada pelo Mycobacterium
leprae (M leprae) que acomete principalmente a pele e os nervos perifeacutericos
(Lockwood et al 2004) Haacute evidecircncias de que a hanseniacutease pode ser transmitida atraveacutes
da dispersatildeo de partiacuteculas infectadas pelas vias aeacutereas superiores de pacientes natildeo
tratados e com alta carga bacilar embora natildeo seja descartada a possibilidade de infecccedilatildeo
via lesotildees de pele (Bratschi et al 2015 Mohanty et al 2016) Esta doenccedila pode causar
incapacidade fiacutesica permanente devido ao acometimento dos nervos perifeacutericos por
isso eacute considerado um grave problema para a sauacutede puacuteblica Dentre os fatores que
contribuem para a incapacidade fiacutesica estaacute o diagnoacutestico tardio o abandono do
tratamento o niacutevel de esclarecimento sobre a doenccedila estigma e preconceito que
penalizam os portadores de Hanseniacutease dificultando a execuccedilatildeo das medidas de
controle (Lana 1992) Aleacutem disso seus sintomas provocam muitas vezes a rejeiccedilatildeo
social ao paciente A doenccedila tem alto poder incapacitante o que eacute ainda mais grave
porque atinge principalmente a faixa etaacuteria economicamente ativa das camadas mais
pobres (Minuzzo 2008)
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede a incidecircncia mundial
registrada no final de 2015 foi de 210758 casos (Figura 11) (WHO 2016) No Brasil
em 2015 foram detectados 28761 casos novos a menor taxa de incidecircncia dos uacuteltimos
10 anos mostrando uma reduccedilatildeo de quase 19000 casos quando comparado ao ano de
2006 poreacutem com um coeficiente geral de aproximadamente 1407 por 100 mil
habitantes iacutendice ainda maior do que a meta estabelecida pela Organizaccedilatildeo Mundial da
Sauacutede (OMS) para erradicaccedilatildeo da hanseniacutease que eacute de ateacute 10 casos a cada 100 mil
habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
2
Figura 11 Taxas de incidecircncia mundial da hanseniacutease reportadas agrave OMS no ano de 2015
As taxas de incidecircncia correspondem a cada 100000 habitantes Fonte Adaptado de WHOLEP
2016 acesso em 02 de Julho de 2017
Em 2015 81 dos casos novos detectados foram concentrados em Iacutendia Brasil
e Indoneacutesia Mesmo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede tendo adotado uma estrateacutegia
baseada no diagnoacutestico precoce e no tratamento com a poliquimioterapia (PQT) para
reduzir a prevalecircncia da hanseniacutease o Brasil no mesmo ano (2015) diagnosticou 28761
casos novos sendo o paiacutes responsaacutevel por 858 dos casos notificados no continente
americano e pelo segundo lugar mundial em nuacutemero total de casos novos notificados
(atraacutes apenas da Iacutendia) aleacutem disso ocupa o primeiro lugar na classificaccedilatildeo mundial de
novos casos por 100 mil habitantes (Brasil 2016 WHO 2016)
112 Aspectos cliacutenicos e classificaccedilatildeo
A hanseniacutease se manifesta atraveacutes de sinais e sintomas dermatoneuroloacutegicos ou
seja revela-se por meio de lesotildees ou regiotildees da pele que apresentam alteraccedilatildeo de
sensibilidade e comprometimento dos nervos perifeacutericos (Foss 1997) os quais satildeo
importantes na elaboraccedilatildeo do diagnoacutestico cliacutenico da doenccedila Os distuacuterbios sensitivos
nas lesotildees podem ser causados tanto pela accedilatildeo do bacilo nos nervos como pela reaccedilatildeo
do sistema imune ao bacilo A neurite pode levar a perda de forccedila muscular com
posterior paralisia o que pode originar incapacidades e deformidades como
3
articulaccedilotildees anquilosadas (sem movimento) e em garras associados ou natildeo a quadros de
ectroacutepio ou logoftalmo (desabamento da paacutelpebra inferior) (Ridley 1955) Algumas
vezes a hanseniacutease pode se manifestar apenas por lesotildees em nervos perifeacutericos sem
lesatildeo cutacircnea forma essa conhecida como neural pura (Yawalkar 2002)
O processo de diagnoacutestico deve ser realizado atraveacutes do exame cliacutenico e quando
disponiacutevel o exame baciloscoacutepico deve ser realizado para descartar diagnoacutesticos
suspeitos Ainda nesse contexto existe um esforccedilo para se implementar o dignoacutestico
soroloacutegico atraveacutes da realizaccedilatildeo de imunoensaio capaz de detectar anticorpos contra o
antiacutegeno PGL-I (Glicolipiacutedeo fenoacutelico I) no qual os niacuteveis de produccedilatildeo do IgM anti-
PGL-I indicam exposiccedilatildeo ao M leprae supostamente correlacionando-se com a
baciloscopia Um importante avanccedilo no diagnoacutestico laboratorial da hanseniacutease foi o
desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecccedilatildeo do DNA do bacilo baseados
na teacutecnica de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) A alta especificidade e
sensibilidade dessa teacutecnica permite sua utilizaccedilatildeo a partir de uma variedade de amostras
cliacutenicas tais como linfa sangue secreccedilatildeo nasal e bioacutepsias A identificaccedilatildeo molecular do
M leprae consiste na amplificaccedilatildeo de regiotildees especiacuteficas do DNA do bacilo Para isso
diferentes genes-alvo do patoacutegeno tecircm sido utilizados e comparados tais como o
elemento repetitivo RLEP Ag85B e o 16S RNA ribossomal (Martinez et al 2006
Martinez et al 2009 Martinez et al 2011)
A hanseniacutease pode ser classificada de acordo com os aspectos imunoloacutegicos
bacterioloacutegicos e histopatoloacutegicos que define um largo espectro de formas cliacutenicas
identificando o poacutelo lepromatoso (LL) e tuberculoide (TT) assim como as formas
intermediaacuterias chamadas de borderline (Ridley e Jopling 1966) Pacientes que natildeo se
enquadram em nenhum desses grupos mencionados satildeo definidos como portadores de
hanseniacutease indeterminada (Goulart et al 2002a) que geralmente se manifesta como
uma lesatildeo hipocrocircmica que pode evoluir para cura espontacircnea ou para outras formas
cliacutenicas da doenccedila (Yawalkar 2002)
No poacutelo lepromatoso da doenccedila os pacientes satildeo caracterizados pela ausecircncia
ou reduzida imunidade celular especiacutefica contra o M leprae levando a uma proliferaccedilatildeo
bacteriana descontrolada com vaacuterias lesotildees e com infiltraccedilatildeo extensa na pele e nervos
caracterizada pela presenccedila de macroacutefagos carregados de bacilos Jaacute os pacientes do
poacutelo tuberculoide satildeo caracterizados por apresentarem uma resposta imune celular
vigorosa ao M leprae a qual limita a doenccedila a poucas e bem definidas lesotildees cutacircneas
ou nervos lesionados (Britton amp Lockwood 2004)
4
Nas formas cliacutenicas intermediaacuterias [borderline lepromatosa (BL) borderline
borderline (BB) e borderline tuberculoide (BT)] a resposta imune celular eacute maior de
acordo com a proximidade ao poacutelo tuberculoide Segundo Goulart e colaboradores
(2002) os pacientes BT apresentam lesotildees com poucos bacilos os BB satildeo difiacuteceis de
definir com carga bacilar moderada e os do poacutelo BL possuem granulomas compostos
de macroacutefagos indiferenciados altamente parasitados
De acordo com a classificaccedilatildeo de 1982 da OMS (WHO 1982) as formas TT e
BT satildeo consideradas paucibacilares e as BB BL e LL satildeo classificadas como
multibacilares por apresentarem uma alta carga parasitaacuteria Apesar de pacientes com
uma uacutenica lesatildeo cutacircnea serem classificados como paucibacilares esse grupo eacute definido
oficialmente pela presenccedila de le 5 lesotildees Jaacute o grupo multibacilar eacute caracterizado pela
presenccedila de ge 6(Figura 12) (WHO 1987)
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do espectro cliacutenico da Hanseniacutease O poacutelo
tuberculoacuteide apresenta uma boa resposta imune celular ao M leprae formando granulomas
epitelioacuteides e secretando citocinas proacute-inflamatoacuterias O poacutelo lepromatoso apresenta uma
resposta imune humoral e secreccedilatildeo de citocinas antiinflamatoacuterias Os pacientes borderline
apresentam caracteriacutesticas intermediaacuterias se aproximando mais de um poacutelo ou outro de acordo
com o tipo de resposta imunoloacutegica ao M leprae Existem ainda os episoacutedios reacionais que
satildeo responsaacuteveis por grande destruiccedilatildeo de ramos nervosos e consequentes incapacidades a
reaccedilatildeo reversa (RR) que ocorre principalmente nas formas borderline e o Eritema Nodoso
Hansecircnico (ENH) que ocorre principalmente no poacutelo lepromatoso Fonte adaptado de
Lockwood amp Saunderson 2012
5
A doenccedila tem evoluccedilatildeo crocircnica podendo ser interrompida por episoacutedios de
inflamaccedilatildeo aguda associados com mudanccedilas na resposta imunoloacutegica denominados
estados reacionais (BRASIL 2002) Esses episoacutedios reacionais podem se manifestar em
todas as formas cliacutenicas da doenccedila Os quadros reacionais podem ocorrer
espontaneamente antes durante ou ateacute mesmo apoacutes o tratamento quando o paciente eacute
considerado curado bacteriologicamente (Sarno amp Sampaio 1996)
As reaccedilotildees satildeo classificadas como reaccedilotildees do tipo 1 ou reaccedilatildeo reversa (RR) que
ocorrem em pacientes paucibacilares e interpolares (borderlines) (Ridley amp Waters
1969 Hastings amp Job 1978 Kar amp Job 2005 Andrade et al 2015ab) e a reaccedilatildeo do
tipo 2 ou eritema nodoso hansecircnico (ENH) que ocorre nos pacientes multibacilares BL e
LL (Nery et al 1998 Kamath et al 2014) O ENL apresenta-se com exacerbaccedilatildeo das
lesotildees iniciais surgimento de novas lesotildees cutacircneas e neurites Esses episoacutedios
reacionais afetam principalmente pele e nervos e satildeo consideradas as principais causas
de mortalidade e incapacidade da funccedilatildeo do nervo perifeacuterico (Junqueira et al 2008)
O quadro cliacutenico da RR caracteriza-se por sinais de inflamaccedilatildeo aguda tais como
dor eritema infiltraccedilatildeo e edema de lesotildees preacute-existentes agraves vezes acompanhadas de
novas lesotildees (Trabulsi et al 2005) A ocorrecircncia de reaccedilatildeo reversa apoacutes o teacutermino da
poliquimioterapia eacute tentativamente explicada pela persistecircncia de antiacutegenos de bacilos
mortos e pelo desequiliacutebrio na regulaccedilatildeo da resposta imune inflamatoacuteria decorrente da
reduccedilatildeo da carga bacilar Lesotildees de troncos nervosos satildeo frequentes durante a RR
justificando o uso precoce de corticoides em altas doses para impedir o dano irreversiacutevel
dos nervos perifeacutericos (Sampaio et al 2000)
O risco de se desenvolver o eritema nodoso hansecircnico (ENH) ou reaccedilatildeo tipo 2 eacute
diretamente proporcional ao IB e a forma cliacutenica do paciente onde pacientes LL tem
maior risco (Manandhar et al 1999) As lesotildees cutacircneas podem apresentar-se como
eritematosas paacutepulas ou noacutedulos que podem ser superficiais ou profundos
Clinicamente o ENH eacute caracterizado por sintomas sistecircmicos como febre alta com
noacutedulos avermelhados mal-estar edema da face matildeos e peacutes (Pfaltzgraff et al 1989)
Tambeacutem apresentam outros sinais como neurites poreacutem eacute muito mais branda do que o
observado na reaccedilatildeo reversa
O tratamento dos pacientes com hanseniacutease eacute realizado com a PQT O
tratamento especiacutefico para pacientes paucibacilares eacute realizado utilizando uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) e dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) com
6
duraccedilatildeo de 6 meses (OMS 1991) Para pacientes multibacilares eacute utilizada uma
combinaccedilatildeo da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administraccedilatildeo
supervisionada) dapsona (uma dose de 100mg auto administrada diariamente) e de
clofazimina (uma dose mensal de 300 mg com administraccedilatildeo supervisionada e uma
dose diaacuteria de 50 mg auto administrada) com duraccedilatildeo de um ano (OMS 1991)
Pacientes com RR satildeo tratados com esteroacuteides (prednisona a 10 mgkg) enquanto
pacientes ENH satildeo tratados preferencialmente com talidomida (300 mgdia) ou
pentoxifilina (400 mg de 8 em 8 horas) associada ou natildeo a esteroides
113 O Mycobacterium leprae
O M leprae pertence agrave famiacutelia Micobacteriaceae e ao gecircnero Mycobacterium o
qual compreende uma vasta gama de organismos incluindo agentes patogecircnicos
oportunistas e espeacutecies saproacutefitas que satildeo encontradas na natureza O M leprae eacute um
bacilo que mede aproximadamente de 15 a 80 microm de comprimento por 02 a 05 microm de
largura Apesar de ser uma bacteacuteria gram-positiva natildeo se cora pelo meacutetodo tradicional
pois eacute um bacilo aacutelcool-aacutecido resistente (BAAR) (Rees 1985) Este bacilo tem tempo
de geraccedilatildeo de 12 a 14 dias tendo sido fracassadas todas as tentativas de cultivaacute-lo in
vitro dificultando o acompanhamento cliacutenico devido agrave progressatildeo lenta (Britton et al
2004) Os tecidos primeiramente infectados pelo M leprae satildeo siacutetios superficiais da
pele e nervo devido agrave sua preferecircncia por baixas temperaturas (de 27ordmC a 30ordmC)
Em termos morfoloacutegicos e estruturais a principal caracteriacutestica do gecircnero
Mycobacterium eacute a presenccedila de um envoltoacuterio celular extremamente rico em lipiacutedeos
complexos e distintos daqueles observados em outras bacteacuterias gram-positivas e gram-
negativas Os lipiacutedeos mais caracteriacutesticos do seu envelope celular satildeo aacutecidos graxos
ramificados com 60-90 aacutetomos de carbono denominados de aacutecidos micoacutelicos (Brennan
e Nikaido 1995)
Assim como em outras bacteacuterias o envoltoacuterio celular micobacteriano eacute
constituiacutedo de dois compartimentos distintos a membrana plasmaacutetica que se encontra
em contato com o citoplasma da ceacutelula e a camada mais externa constituiacuteda pela
parede celular propriamente dita A membrana plasmaacutetica eacute muito semelhante agrave das
demais bacteacuterias sendo formada por uma claacutessica bicamada fosfoliacutepidica com proteiacutenas
intercaladas O folheto externo eacute contudo rico em fosfatidilinositol manosiacutedios (PIMs)
7
lipoarabinomanana (LAM) e lipomanana (LM) (figura 13) O esqueleto da parede
celular propriamente dita eacute formado por um complexo supramolecular resultante da
ligaccedilatildeo covalente de trecircs macromoleacuteculas o peptideoglicano um polissacariacutedeo
ramificado (arabinogalactana) e os aacutecidos micoacutelicos (revisto por Scollard et al 2006)
Apresenta mais externamente o glicolipiacutedio fenoacutelico (PGL-1) dominante em sua
parede celular Por ser exclusivo do M leprae a sorologia baseada na detecccedilatildeo de
anticorpos contra PGL-I passou a ser vista como um paracircmetro potencialmente
aplicaacutevel no diagnoacutestico da doenccedila (Young et al 1989)
O genoma do M leprae foi completamente sequenciado em 2001 e gerou grande
expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseniacutease
Apenas 495 do genoma do M leprae (1605 genes) contecircm genes que codificam
proteiacutenas sendo o restante constituiacutedo de pseudogenes ou genes degenerados (Cole et
al 2001) Quando comparado ao Mycobacterium tuberculosis percebe-se a perda de
um grande nuacutemero de genes pelo M leprae muitos dos quais seriam importantes para o
crescimento e reproduccedilatildeo bacteriana o que poderia explicar o seu longo tempo de
geraccedilatildeo e sua incapacidade de multiplicaccedilatildeo in vitro (Vissa amp Brennan 2001)
Figura 13 Modelo esquemaacutetico do envelope celular do M leprae A membrana plasmaacutetica
do M leprae eacute envolvida por uma parede celular composta de peptidoglicano ligada
covalentemente a araginogalactana Nesse arranjo pode ser encontrado componente como
lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM) Aacutecidos micoacutelicos estatildeo ligados nas porccedilotildees
terminais de arabinose Na porccedilatildeo mais externa do envelope celular eacute encontrado
monomicolato trealose (TMM) glicolipiacutedeo fenoacutelico 1 (PGL-I) monosiacutedeos fosfatidilinositol
(PIMs) dimicocerosato ftiocerol (PDIM) e fosfolipiacutedeos (PL) Adaptado de Scollard et al
2006
8
Inicialmente o cultivo para fins acadecircmicos foi realizado em camundongos
(Mus musculus) (Shepard 1960) e posteriormente em tatu de nove bandas (Dasypus
novencinctus) (Coelho et al 1988) Ele permite o crescimento do bacilo de forma
disseminada durante 18 a 24 semanas comprometendo a pele nervos perifeacutericos
medula oacutessea fiacutegado baccedilo linfonodos pulmotildees meninges e olhos Apoacutes a purificaccedilatildeo
os bacilos podem ser usados vivos por ateacute uma semana ou letalmente irradiados
(Kirchheimer amp Storrs 1971) Atualmente os camundongos utilizados para a
multiplicaccedilatildeo dos bacilos satildeo os nuatiacutemicos e devido a isso carecem de ceacutelulas B e T
representando este o modelo mais utilizado para obtenccedilatildeo de bacilos por diversos
grupos de pesquisa em inoculaccedilotildees in vitro (Shepard 1960)
114 Invasatildeo fagocitose e interaccedilatildeo patoacutegeno hospedeiro
Em macroacutefagos derivados de monoacutecitos o M leprae eacute internalizado por
projeccedilotildees citoplasmaacuteticas e a fagocitose do bacilo eacute mediada pelos receptores de
complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11bCD18) e CR4 (CD11cCD18) (Schlesinger et
al 1991) Outro mecanismo envolvido na entrada da micobacteacuteria na ceacutelula eacute a
interaccedilatildeo de lipoarabinomanana (LAM) um componente da parede celular
micobacteriana com a moleacutecula DC-SIGN (CD209) Esse receptor eacute uma lectina do
tipo C presente em ceacutelulas dendriacuteticas e macroacutefagos e tem sido associada com a induccedilatildeo
de resposta adaptativa do tipo Th2 (Soilleux et al 2002) Anaacutelises da expressatildeo de
CD209 em bioacutepsias de pacientes com hanseniacutease apresentaram um predomiacutenio desse
receptor em lesotildees de pacientes do poacutelo lepromatoso (LL) quando comparado com
pacientes do poacutelo tuberculoide (BT) (Soilleux et al 2006 Montoya amp Modlin 2010)
Nos estaacutegios iniciais da infecccedilatildeo o M leprae eacute capaz de interagir com as ceacutelulas
apresentadoras de antiacutegenos como por exemplo macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas Essa
interaccedilatildeo com a ceacutelula hospedeira envolve receptores de reconhecimento de padrotildees
moleculares (PRRs) como receptores do tipo Toll (TLR) e NOD2 (revisto por Cardoso
et al 2011) Jaacute eacute bem descrito que lipoproteiacutenas microbianas satildeo capazes de ativar
respostas imunoloacutegicas do hospedeiro via TLR2 (Aliprantis et al 1999) Foi
demonstrado que a expressatildeo de TLR2 e TLR1 eacute elevada em bioacutepsias de pacientes
hansenianos do poacutelo TT quando comparado com o poacutelo LL (Krutzik et al 2003) Aleacutem
disso variaccedilotildees em genes responsaacuteveis pela adesatildeo e entrada da micobacteacuteria na ceacutelula
como TLRs satildeo cruciais na determinaccedilatildeo da resistecircncia natural do hospedeiro
9
simplesmente pela modulaccedilatildeo das taxas de entrada do bacilo na ceacutelula hospedeira
(Cardoso et al 2011) Isso reforccedila a hipoacutetese de que a regulaccedilatildeo da expressatildeo e
ativaccedilatildeo de TLRs eacute essencial para a composiccedilatildeo de uma resposta imune eficiente para a
eliminaccedilatildeo de patoacutegenos
Dentre os mecanismos microbicidas em monoacutecitos humanos induzidos pela
ativaccedilatildeo de TLR21 destacam-se 1) a induccedilatildeo da enzima CYP27b1 a qual eacute
responsaacutevel por converter a forma 25-hidroxivitamina D para sua forma biologicamente
ativa 125-hidroxivitamina 2) Regulaccedilatildeo positiva do receptor de vitamina D (VDR) e
3) induccedilatildeo de catelecidina um importante peptiacutedeo microbicida (Wang et al 2004 Liu
et al 2006 Liu et al 2007 Martineau et al 2007) Tanto a regulaccedilatildeo positiva de
CYP27b1 quanto de VDR ocorrem de forma dependente da citocina IL-15 (Krutzik et
al 2005) Ao mesmo tempo a ativaccedilatildeo de VDR juntamente com a produccedilatildeo de IL-1β
eacute capaz de induzir DEFB4 outro peptiacutedeo necessaacuterio para a atividade microbicida da
ceacutelula hospedeira (Liu et al 2009)
O receptor de reconhecimento de padratildeo NOD2 que foi implicada em estudos
pacircn-genocircmicos agrave hanseniacutease em Chineses (Zhang et al 2010) e posteriormente
confirmados em pacientes vietinamitas e brasileiros (De Sales-Marques et al 2014)
estaacute presente no citoplasma e eacute responsaacutevel por reconhecer peptideoglicanos incluindo
derivados de micobacteacuterias onde o principal ligante conhecido eacute o muramil dipeptiacutedeo
(MDP) (Giardin et al 2003) O reconhecimento de MDP por NOD2 eacute capaz de ativar o
fator transcricional NF-kB atraveacutes da moleacutecula adaptadora RIP2 (que tambeacutem foi
associada geneticamente agrave suscetibilidade agrave hanseniacutease) e iniciar a produccedilatildeo de
mediadores proacute-inflamatoacuterios Cooney e colaboradores mostraram que a ativaccedilatildeo de
NOD2 induz autofagia em ceacutelulas dendriacuteticas e eacute responsaacutevel por mediar o
processamento e apresentaccedilatildeo de antiacutegenos (Cooney et al 2010)
Montoya e colaboradores (2009) relataram que macroacutefagos com perfil fagociacutetico
caracterizados como Mϕ-2 apresentavam-se com maior frequecircncia em formas
multibacilares da hanseniacutease quando comparados a macroacutefagos inflamatoacuterios com
atividade microbicida Mϕ-1 predominantes no poacutelo tuberculoide da doenccedila e em lesotildees
de pacientes com RR (figura 14) mostrando o importante papel da diferenciaccedilatildeo
fenotiacutepica no controle da doenccedila
Somente macroacutefagos polarizados para o perfil Mϕ-1 satildeo capazes de secretar
altos niacuteveis de mediadores proacute-inflamatoacuterios (com perfil Th1) como IL-12 IL-23 IL-
1β IL-18 IL-6 e TNF Por outro lado tem sido evidenciado que IL-4 IL-10 e IL-13
10
aleacutem de inibir a ativaccedilatildeo de Mϕ-1 satildeo capazes de induzir a polarizaccedilatildeo para Mϕ-2
associados com a supressatildeo da resposta Th1 Adicionalmente Mϕ-2 secretam niacuteveis
consideraacuteveis de IL-8 MCP-1 MIP-1β e RANTES o que sugere um papel ativo dessas
ceacutelulas em recrutar e interagir com outros tipos celulares e participar na regulaccedilatildeo da
imunidade celular
Figura 14 Modelo de divergecircncia dos programas antimicrobiano e fagociacutetico na
hanseniacutease Em resposta ao estiacutemulo com IL-15 ocorre a induccedilatildeo da via da vitamina D
onde CYP27b1 converte a forma intracelular da vitamina D a 25D3 para a forma ativa
125D3 que interage com o receptor de vitamina D (VDR) produzindo peptiacutedeos
antimicrobianos como a catelecidina levando a morte da micobacteacuteria Jaacute apoacutes estiacutemulo
com IL-10 ocorre aumento da expressatildeo de receptores scavenger (SR) como o CD163
resultando na fagocitose do M leprae e de lipoproteiacutenas de baixa densidade oxidadas
(oxLDL) favorecendo a formaccedilatildeo de ceacutelulas espumosas e persistecircncia do M leprae
Fonte adaptado de Montoya et al 2009
Evidecircncias recentes sugerem que a regulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico possui um
papel importante na resposta do hospedeiro a patoacutegenos intracelulares Corpuacutesculos
lipiacutedicos induzidos por M leprae podem ser reguladores criacuteticos na subversatildeo da
resposta imune a hanseniacutease (Mattos et al 2010) A via de biossiacutentese de colesterol eacute
modulada positivamente na hanseniacutease lepromatosa uma vez que foi reportado o
aumento da expressatildeo de enzimas importantes dessa via como a 3-hidroxi-3-
metilglutaril-CoA redutase (HMGCR) em bioacutepsias de pacientes LL (Mattos et al
2014) Aleacutem disso o bacilo ainda aumenta a captaccedilatildeo de colesterol exoacutegeno
aumentando a expressatildeo do receptor de LDL principal responsaacutevel pela captaccedilatildeo de
LDL na sua forma nativa assim como de receptores scavengers responsaacuteveis pela
11
captaccedilatildeo de LDL modificado contribuindo ainda mais com o acuacutemulo do mesmo na
ceacutelula infectada (Mattos et al 2014) Os estudos ainda apontam que o acuacutemulo de
colesterol observado na ceacutelula infectada eacute crucial para a sobrevivecircncia do M leprae
uma vez que o tratamento da ceacutelula com estatinas que satildeo drogas classicamente
descritas como inibidores da biossiacutentese de colesterol reduz a viabilidade do M leprae
em monoacutecitos infectados in vitro (Mattos et al 2014) e em camundongos BALBc
infectados segundo o modelo de Shepard (Lobato et al 2014)
115 Sinalizaccedilatildeo citoplasmaacutetica por extravasamento do fagossomo
Micobacteacuterias virulentas tais como o M leprae e M tuberculosis possuem
mecanismos muito eficientes de sobrevivecircncia no ambiente intracelular da ceacutelula
hospedeira Uma vez estabelecida a infecccedilatildeo essas micobacteacuterias satildeo capazes de
interferir e modular ativamente a maquinaria da ceacutelula hospedeira garantindo assim um
nicho seguro para sua multiplicaccedilatildeo e disseminaccedilatildeo (Figura 15) Van der Wel e
colaboradores mostraram que a translocaccedilatildeo de micobacteacuterias do fagossomo para o
citosol de ceacutelulas mieloacuteides (macroacutefagos e ceacutelulas dendriacuteticas) depende dos genes
micobacterianos CFP-10 e ESAT-6 (antiacutegenos e fatores de virulecircncia codificados pelos
genes da regiatildeo RD1) Observou-se que a localizaccedilatildeo e a replicaccedilatildeo bacteriana
citosoacutelica satildeo caracteriacutesticas de micobacteacuterias patogecircnicas virulentas como o M
tuberculosis e M leprae o mesmo natildeo foi visto para M Bovis BCG (Van der Wel et al
2007) Embora o artigo original tenha observado que os lisossomos rapidamente se
fusionam com fagossomos contendo M leprae e que este seria capaz de se translocar
para o citoplasma da ceacutelula evitando assim a degradaccedilatildeo fagolisossomal (van der Wel
et al 2007) esse dado ainda natildeo foi confirmado independentemente De fato
verificou-se que o M leprae reside e replica em fagossomos com alto conteuacutedo lipiacutedico
Mesmo assim o extravasamento do conteuacutedo fagolisossomal mediado pela
atividade da protease ESAT-6 foi confirmado Assim o loacutecus RD1 que estaacute presente
em diferentes micobacteacuterias como o M tuberculosis M bovis M kansasii M
marinum M africanum e M leprae (Berthet et al 1998 Harboe et al1996) tem papel
fundamental no processo de contaminaccedilatildeo do ambiente esteacuteril do citoplasma levando ao
disparo da via do IFN tipo I capaz de subverter a resposta imune proacute-micobacteacuteria (seraacute
discutido mais abaixo) O M marinum escapa de fagossomos em macroacutefagos
infectados e acaba espalhando-se para ceacutelulas vizinhas por motilidade baseada em
12
actina (Stamm et al 2003 2005) Esses processos tambeacutem envolvem CFP-10 e ESAT-
6 (Gao et al 2006)
Um estudo utilizando o modelo de membranas lisossocircmicas que mimetizam
compartimentos fagossocircmicos demonstrou que o fator de virulecircncia ESAT-6 do M
tuberculosis possui atividade de interaccedilatildeo de membrana que natildeo eacute observado no
ortoacutelogo ESAT-6 da micobacteacuteria natildeo-patogecircnica M smegmatis (de Leon et al 2012)
O grupo observou que o Msmegmatis natildeo escapa para o citosol e seu sistema de
secreccedilatildeo ESX-1 parece natildeo possuir in vitro propriedades liacuteticas de membrana (de Leon
et al 2012 Simeone et al 2012) Bah e colaboradores evidenciaram que o M
smegmatis induz autofagia independentemente de ubiquitina e p62 indicando que nos
casos de infecccedilotildees micobacterianas as muacuteltiplas vias autofaacutegicas podem ser reguladas
por TLRs (Bah et al 2016) Um estudo comparando a induccedilatildeo de autofagia por
diferentes espeacutecies de micobacteacuterias identificou que as micobacteacuterias natildeo patogecircnicas
como o M smegmatis induzem uma resposta autofaacutegica mais robusta do que M
tuberculosis (cepa H37Rv) sugerindo possiacuteveis mecanismos adicionais para a ativaccedilatildeo
da autofagia (Gutierrez et al 2008 Zullo e Lee 2012) O M smegmatis tambeacutem pode
ser reconhecido pelos receptores NOD2 e Dectina-2 conhecidos por desencadear a
direcionamento da bacteacuteria para a via autofaacutegica aleacutem disso outros autores sugerem
que outros mecanismos independentes de ubiquitina estejam presentes neste processo
(Yadav e Schorey 2006 Coulombe et al 2009 Travassos et al 2010 Ma et al 2012)
O M bovis BCG possui capacidade comprometida em ativar STING uma vez
que essa bacteacuteria natildeo possui o sistema ESX-1 (ΔRD1) necessaacuterio para ativaccedilatildeo dessa
moleacutecula De fato micobacteacuterias deficientes em ESX-1 possuem capacidade
comprometida de replicaccedilatildeo intracelular em macroacutefagos (Guinn et al 2004 Stanley et
al 2007) O sistema de secreccedilatildeo ESX-1 tambeacutem estaacute envolvido na direcionamento de
M marinum pelo LC3 no entanto a ubiquitinaccedilatildeo natildeo parece ser necessaacuteria para este
processo (Lerena e Colombo 2011)
13
Figura 15 Modelo esquemaacutetico que mostra a modulaccedilatildeo da resposta microbicida por
uma micobacteacuteria patogecircnica versus natildeo patogecircnica A maioria das micobacteacuterias natildeo
patogecircnicas satildeo rapidamente mortas quando o fagossomo funde-se ao lisossomo Por outro lado
micobacteacuterias virulentas como o M tuberculosis permanece dentro dos fagossomos bloqueando
a fusatildeo fagossomo-lisossomo Adaptado de Warner amp Mizrahi 2007
116 Papel do IFNβ na infecccedilatildeo por patoacutegenos intracelulares
A classe de IFN tipo I (IFNαβ) compreende citocinas bem conhecidas por seus
efeitos antivirais e imunomoduladores representando assim a primeira barreira na
contenccedilatildeo de uma infecccedilatildeo viral A capacidade de IFNαβ em restringir a replicaccedilatildeo
viral eacute em grande parte atribuiacuteda agrave induccedilatildeo de ISGs (genes induzidos por IFN tipo I)
Estes genes satildeo expressos constitutivamente nas ceacutelulas em resposta a baixos niacuteveis de
IFNαβ no microambiente ou mais comumente em resposta ao IFNαβ produzido em
resposta agrave infecccedilatildeo o qual restringe o ciclo de replicaccedilatildeo viral em ceacutelulas que jaacute foram
infectadas (Yan et al 2012) ilustrando assim a importacircncia desta famiacutelia de citocinas
na proteccedilatildeo da ceacutelula hospedeira contra infecccedilatildeo viral
Durante infecccedilotildees bacterianas altas concentraccedilotildees de IFN tipo I podem bloquear
as respostas das ceacutelulas B ou levar agrave produccedilatildeo de moleacuteculas imunossupressoras
podendo tambeacutem reduzir a capacidade de resposta dos macroacutefagos agrave ativaccedilatildeo pelo
IFNγ como foi demonstrado para infecccedilotildees com Listeria monocytogenes (Rayamajhi et
al 2010) Atraveacutes de estudos em modelos experimentais com camundongos nocaute
para o receptor de IFN tipo I (IFNAR1--
) foi possiacutevel observar que a ativaccedilatildeo dessa via
eacute um mecanismo utilizado pela bacteacuteria capaz de inibir a resposta do hospedeiro contra
14
infecccedilotildees bacterianas uma vez que os camundongos IFNAR1--
satildeo altamente sensiacuteveis a
infecccedilotildees virais poreacutem resistentes agrave infecccedilatildeo com L monocytogenes (OrsquoConnell et al
2004) O mecanismo de induccedilatildeo de IFN tipo I por L monocytogenes ocorre de maneira
dependente da ruptura do fagossomo e entrada de conteuacutedo fagossomal no citoplasma
da ceacutelula hospedeira (OrsquoRiordan et al 2002) o que leva a ativaccedilatildeo da via TBK1IRF3
levando agrave produccedilatildeo de IFNβ (OrsquoConnell et al 2004) Adicionalmente camundongos
nocaute para o fator de transcriccedilatildeo IRF3 (IRF3--
) satildeo extremamente resistentes agrave
infecccedilatildeo por M tuberculosis (Manzanillo et al 2012)
A ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I pode ocorrer atraveacutes de diferentes PRRs como
TLRs (TLR9 e TLR7) e NOD2 ou ainda receptores citoplasmaacuteticos sensores de DNA
(CDS) Recentemente a moleacutecula adaptadora STING foi descrita como um regulador
chave da ativaccedilatildeo de TBK1IRF3 mediada por CDS (Bowie 2012) Foi demonstrado
que a ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP
(Figura 16) um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β e ativaccedilatildeo
de autofagia da ceacutelula hospedeira (Watson et al 2015 Collins et al 2015) Ainda
nesse contexto paralelamente agrave induccedilatildeo de TBK1IRF3 a ativaccedilatildeo de NOD2 tambeacutem
leva a produccedilatildeo de IFNβ de maneira dependente de RIP2IRF5 (Pandey et al 2009)
15
Figura 16 Esquema representativo da participaccedilatildeo da moleacutecula cGAS na resposta do
hospedeiro a patoacutegenos intracelulares e sua ligaccedilatildeo entre induccedilatildeo de IFN tipo I e
autofagia A ativaccedilatildeo de STING por M tuberculosis requer o reconhecimento do DNA
micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um
potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de IFN-β eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula
hospedeira Modificado de Watson et al 2015
Seguindo essa linha de raciociacutenio camundongos nocaute para o gene que
codifica um regulador negativo de IFNαβ a MAPK quinase quinase 8 (MAP3K8)
tiveram os niacuteveis de IFNαβ aumentados bem como a carga bacteriana Entretanto
esses niacuteveis foram reduzidos em camundongos duplo nocaute MAP3K8--
IFNAR1--
(receptor de IFN tipo I) durante a infecccedilatildeo por M tuberculosis e L Monocytogenes O
controle da carga bacteriana foi correlacionado com niacuteveis reduzidos de IL-10 e
aumento dos niacuteveis de IL-12 no soro (McNab et al 2013) Estudos de infecccedilatildeo com
cepas hiper-virulentas de M tuberculosis mostraram uma correlaccedilatildeo positiva entre
niacuteveis aumentados de IFNαβ e o aumento da virulecircncia (Manca et al 2005 Ordway et
al 2007)
Enquanto a ativaccedilatildeo de IFN tipo II (γ) representa um mecanismo importante na
eliminaccedilatildeo de bacteacuterias intracelulares diversos trabalhos tem contextualizado a
participaccedilatildeo de IFN tipo I na regulaccedilatildeo negativa da atividade antimicrobiana e sua
relaccedilatildeo com a permissividade do hospedeiro frente agrave infecccedilotildees por patoacutegenos
16
intracelulares (OrsquoConnell et al 2004 Manzanillo etal 2012 Teles et al 2013) O
IFNγ estaacute associado ao controle da infecccedilatildeo pelo M tuberculosis por um processo
relacionado agrave autofagia (Gutierrez et al 2004) Curiosamente a via autofaacutegica
converge com a via da vitamina D3-catelicidina a qual eacute preferencialmente observada
na forma paucibacilar da hanseniacutease (Krutzik et al 2008 Montoya et al 2009) A
vitamina D3 induz autofagia via catelicidina e eacute requerida para a atividade
antimicrobiana mediada pelo IFNγ (Yuk et al 2009 Fabri et al 2011)
Em hanseniacutease Teles e colaboradores observaram um padratildeo dicotocircmico onde
um antagonismo entre o IFN tipo I e tipo II satildeo observados Uma assinatura molecular
que exibe ativaccedilatildeo de genes da via de IFN tipo I eacute observada majoritariamente em
pacientes com a forma lepromatosa (disseminada) ao passo que a forma tuberculoacuteide
exibe uma assinatura de IFN tipo II ou IFNγ (Teles et al 2013) Aleacutem disso esse
estudo demonstrou que a resposta microbicida induzida por IFNγ pode ser inibida por
IFNβ e por IL-10 sugerindo fortemente que a produccedilatildeo diferenciada dos IFNs tipo I e
tipo II contribuem para proteccedilatildeo versus patogecircnese em infecccedilotildees bacterianas
Curiosamente Watson e colaboradores demonstraram utilizando baixa carga bacilar de
M tuberculosis que a permeabilizaccedilatildeo fagossomal mediada por ESX-1 eacute uma via de
matildeo dupla permitindo por outro lado que componentes citosoacutelicos de autofagia
mediada por ubiquitinaccedilatildeo acessem o fagossomo e direcionem o bacilo para
autofagossomos de forma dependente do reconhecimento de DNA micobacteriano e
ativaccedilatildeo de STING (Watson et al 2012) A detecccedilatildeo de DNA por esses receptores
pode levar a ativaccedilatildeo de diferentes vias de sinalizaccedilatildeo inflamassoma (Wassermann et
al 2015) autofagia e induccedilatildeo de interferon (IFN) tipo I (αβ) (Watson et al 2015)
Estudos recentes de expressatildeo gecircnica global e estudos de associaccedilatildeo do tipo
caso-controle foram recentemente realizados a fim confirmar a participaccedilatildeo de um gene
induzido por interferon do tipo I chamado de OASL na patogecircnese da hanseniacutease
(Robottom Ferreira et al 2011 Guerreiro et al 2013 Toledo-Pinto et al 2016) Neste
trabalho a classe de genes induzidos por IFN tipo I foi identificada como modulada em
ceacutelulas de Schwann primaacuterias infectadas por M leprae vivo por microarranjos de
DNA OASL foi rapidamente induzido em ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos THP1
frente a infecccedilatildeo por M leprae sugerindo que esse gene seja um sinal precoce da
infecccedilatildeo com a micobacteacuteria Aleacutem do mais M leprae vivo mas natildeo M leprae morto
ou BCG induziu RNAm codificante para OASL em macroacutefagos THP1 sugerindo que a
ativaccedilatildeo da via do IFN tipo I seja especiacutefica de micobacteacuterias patogecircnicas favorecendo
17
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia
(de Toledo-Pinto et al 2016) Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino
entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela
sinalizaccedilatildeo de STING ainda satildeo desconhecidos
12 Autofagia
121 Mecanismo de execuccedilatildeo da autofagia
O termo autofagia (do grego auto para proacuteprio e phagein significando comer)
surgiu em 1967 quando Christian de Duve referiu-se a um processo fisioloacutegico
conservado no qual porccedilotildees do citosol satildeo englobadas formando vesiacuteculas de dupla
membrana chamadas autofagossomos que satildeo direcionados agrave degradaccedilatildeo no
compartimento lisossomal pela accedilatildeo das hidrolases (Deter amp Duve 1967 Mizushima
2009 Yang amp Klionsky 2010)
A autofagia eacute uma via cataboacutelica essencial que degrada componentes celulares
dentro do lisossomo onde as organelas celulares que jaacute natildeo se encontram funcionais satildeo
abrangidas por uma membrana sendo posteriormente decompostas Existem trecircs vias
principais de degradaccedilatildeo as quais diferem essencialmente nos meios de entrega de
carga para o lisossomo que satildeo macroautofagia microautofagia e autofagia mediada
por chaperonas (AMC) (Murrow amp Debnath 2013) (Figura 17) A macroautofagia
(comumente referida apenas como autofagia) eacute caracterizada pela formaccedilatildeo de uma
estrutura de membrana dupla conhecida como autofagossomo Esta se funde com o
lisossomo originando o autolisossomo O seu conteuacutedo eacute posteriormente degradado por
enzimas lisossomais (Van Limbergen et al 2009) Na microautofagia os componentes
citosoacutelicos satildeo incorporados diretamente em lisossomos atraveacutes de invaginaccedilotildees da
membrana lisossomal (Van Limbergen et al 2009) Na autofagia mediada por
chaperonas (CMA) ocorre a degradaccedilatildeo seletiva de proteiacutenas com uma sequecircncia sinal
especiacutefica que eacute dependente de uma chaperona molecular chamada de hsc70 (Jiang amp
Mizushima 2014)
18
Figura 17 Diferentes processos autofaacutegicos Inicialmente o fagoacuteforo ou membrana de
isolamento eacute formado Ocorre o sequestro de constituintes celulares e forma-se o
autofagossomo Posteriormente ocorre a fusatildeo desta vesiacuteculade membrana dupla com o
lisossomo O compartimento fusionado eacute conhecido como autofagolisossomo local onde os
componentes celulares seratildeo degradados pela accedilatildeo das hidrolases aacutecidas lisossomais Adaptado
de Cheung 2009
A autofagia divide-se em trecircs processos distintos induccedilatildeo alongamento e
maturaccedilatildeo controlados pelos produtos dos genes Atg que foram primeiramente
descritos em leveduras e que estatildeo envolvidos no mecanismo de autofagia (Dwivedi amp
Ahnn 2009) Eacute regulada por diversas vias de sinalizaccedilatildeo Em mamiacuteferos a via que
regula negativamente a autofagia eacute controlada pela proteiacutena alvo de rapamicina de
mamiacuteferos (mTOR) uma proteiacutena cinase central no controle do metabolismo celular e
um dos principais reguladores de autofagia Em condiccedilotildees de abundacircncia nutricional o
complexo mTORC1 (composto por mTOR Raptor GβL e PRAS40) inibe o complexo
serinatreonina proteiacutena quinase (Ulk1) (Nazio et al 2013) impedindo a ativaccedilatildeo da
autofagia Ulk1 eacute o ortoacutelogo de Atg1 em leveduras e faz parte do complexo Ulk1-
Atg13-Atg101-Fip200 (Figura 18a) Sob condiccedilotildees de estresse nutricional ou ainda
sob o tratamento com rapamicina (lactona macrociacuteclica) a atividade de mTOR eacute
inibida ocorre a ativaccedilatildeo do complexo Ulk1 e consequentemente dessa via autofaacutegica
resultando na formaccedilatildeo do fagoacuteforo(Mizushima amp Komatsu 2011)
A membrana do autofagossomo pode ser originaacuteria da membrana plasmaacutetica
eou das membranas de organelas como o retiacuteculo endoplasmaacutetico Golgi e mitococircndria
19
(Militello amp Colombo 2011) Jaacute foi demonstrado que a formaccedilatildeo do fagoacuteforo requer a
proteiacutena Vps34 uma fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) de classe III que forma um
complexo com beclina 1 (Juenemann amp Reits 2012) (Figura 18a) Em um segundo
momento eacute necessaacuteria a expansatildeo da membrana que envolveraacute o material a ser
degradado Esse processo ocorre atraveacutes da participaccedilatildeo de dois sistemas independentes
No primeiro a Atg12 eacute conjugada agrave Atg5 em um passo que requer Atg7 e Atg10 e por
sua vez esse conjugado interage com Atg16L1 formando o complexo Atg12-Atg5-
Atg16L1 presente na parte externa da membrana de isolamento (Figura 18b) No
segundo sistema a protease Atg4 cliva a extremidade C-terminal da LC3 dando origem
a isoforma citosoacutelica denominada LC3-I (proteiacutena 1 associada aos microtuacutebulos de
cadeia leve 3) Em seguida a enzima Atg7 ativa LC3-I que eacute entatildeo conjugado ao
lipiacutedio fosfatidiletanolamina (PE) pela enzima Atg3 com auxiacutelio do complexo Atg12-
Atg5-Atg16L1 formando sua forma lipidada LC3-PE (ou LC3-II) que se transloca do
citoplasma principalmente para as pontas das partes interna e externa da membrana de
isolamento controlando entatildeo a expansatildeo da membrana de isolamento e o tamanho do
autofagossomo (Tanida et al 2004 Hanada et al 2007)
Ao final do processo de expansatildeo da membrana ocorre a captura de alvos
citoplasmaacuteticos que ficam retidos no interior dos autofagossomos Nesse momento
ocorre a dissociaccedilatildeo do conjugado Atg5-Atg12 permanecendo LC3-II associada agrave
membrana da organela Subsequentemente ocorre a fusatildeo autofagossomo-lisossomo
dando origem a uma nova organela conhecida como autofagolisossomo na qual os
componentes citoplasmaacuteticos satildeo degradados pelas enzimas lisossomais (Mizushima amp
Komatsu 2011) A fusatildeo entre o autofagossomo e o lisossomo eacute mediada pela Rab7 e
pela proteiacutena lisossomal transmembrana LAMP-2 sendo a degradaccedilatildeo do conteuacutedo
autofagossomal decorrente da atividade de vaacuterias proteases como a catepsinas D B e L
(Lee amp Lee 2012) Mesmo apoacutes a fusatildeo autofagolisossomal LC3-II permanece
associada agrave membrana por algum tempo sendo a sua conjugaccedilatildeo com a
fosfatidiletanolamina clivada pela Atg4 o que promove a sua dissociaccedilatildeo da membrana
do autofagolisossomo (Figura 18b) (Satoo et al 2009)
20
Figura 18 Maquinaria molecular e regulaccedilatildeo da via autofaacutegica (A) PI3Kclasse I-Akt
regula a autofagia negativamente ao ativar mTOR em resposta a fatores de crescimento Akt
tambeacutem regula negativamente a autofagia atraveacutes da fosforilaccedilatildeo de beclina-1 O complexo
mTORC1 inibe a Ulk1 quando existe disponibilidade de nutrientes e impede a autofagia Em
resposta a niacuteveis aumentados de AMP a cinase AMPK controla negativamente a mTOR e
fosforila Ulk1 A fosforilaccedilatildeo do complexo Ulk1-Atg13-Atg101-Fip200 eacute essencial para a fase
de nucleaccedilatildeo do autofagossomo A estimulaccedilatildeo do complexo beclina1-PI3KIII tambeacutem eacute crucial
para o iniacutecio da autofagia pois gera PI3P e promove a nucleaccedilatildeo da membrana do
autofagossomo As proteiacutenas Bcl-2 e Bcl-xL satildeo inibidoras da autofagia pois sequestram
beclina-1 (B) Dois sistemas de conjugaccedilatildeo ubiquitina-like satildeo necessaacuterios para o alongamento
do autofagossomo O primeiro sistema leva a formaccedilatildeo do complexo Atg5-Atg12-Atg16L1 e o
segundo envolve a conversatildeo de LC3-I em LC3-II Adaptado de Choi et al 2013
A autofagia tambeacutem pode ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de
mTOR (Kumar amp Rao 2011 Zullo amp Lee 2012) e das proteiacutenas Atg (Nishida et al
2009 Tsuboyama et al 2016) Este papel eacute baseado em um conjunto de atividades que
refletem a participaccedilatildeo natildeo autofaacutegica de um ou mais genes (e seus produtos) de
autofagia
No contexto de papeacuteis natildeo autofaacutegicos das proteiacutenas Atg incluem-se o processo
ligado a fagocitose que natildeo envolve a formaccedilatildeo de membranas duplas e natildeo eacute afetado
por rapamicina ou privaccedilatildeo de nutrientes Conhecido como fagocitose associada agrave LC3
(LAP) (Figura 19) este processo eacute independente de Ulk1 sendo dependente de outras
moleacuteculas da via de autofagia como Atg5 Atg7 e BECN1 envolvendo tambeacutem o
21
recrutamento da proteiacutena autofaacutegica LC3 para os fagossomos A LAP eacute ativada apoacutes a
fagocitose de partiacuteculas que se ligam a receptores de superfiacutecie como TLR12 TLR26
TLR4 TIM4 e FcR ou endossomais como TLR9 levando a uma raacutepida maturaccedilatildeo dos
fagossomos em autofagolisossomos e agrave degradaccedilatildeo de bacteacuterias e debris celulares (Li
et al 2013 Klionsky et al 2014 Martinez et al 2015)
Figura 19 Direcionamento de bacteacuterias intracelulares para destruiccedilatildeo lisossomal A
imagem superior mostra a maturaccedilatildeo constitutiva do fagossomo seguido da entrega da bacteacuteria
para o lisossomo Durante a fagocitose associada agrave LC3 (LAP) a conjugaccedilatildeo de
LC3GABARAP que estatildeo envolvidos na expansatildeo da vesiacutecula promove a maturaccedilatildeo
fagossomal (parte inferior da imagem) Adaptado de Youle et al 2014
Diversos estiacutemulos podem induzir o processo de autofagia como uma
diminuiccedilatildeo dos niacuteveis normais dos nutrientes e fatores de crescimento entre outros
(Van Limbergen et al 2009) Em condiccedilotildees onde a autofagia estaacute exacerbada como
situaccedilotildees de estresse quiacutemico (drogas) ou nutricional (escassez de aminoaacutecidos
accediluacutecares fatores de crescimento e oxigecircnio) a degradaccedilatildeo de componentes celulares
fornece a reciclagem de precursores metaboacutelicos essenciais para a sobrevivecircncia da
ceacutelula ateacute que a homeostase seja restabelecida (He amp Klionsky 2009 Kroemer et al
2010 Ravikumar et al 2010) No entanto em situaccedilotildees em que a homeostase natildeo pode
ser restabelecida devido ao estresse contiacutenuo altos niacuteveis de autofagia tendem a
favorecer a morte celular pela degradaccedilatildeo excessiva de moleacuteculas essenciais e de
organelas caracterizando a morte celular autofaacutegica (Shen amp Codogno 2011)
22
122 Autofagia seletiva e natildeo seletiva
Existem vaacuterias formas descritas de autofagia podendo ser seletivas (alvo
especiacutefica) ou natildeo seletivas (induzida por falta de nutrientes) diferindo principalmente
no tipo de carga e no local celular onde a carga eacute sequestrada Tanto na via seletiva
quanto na natildeo seletiva a formaccedilatildeo da membrana do vacuacuteolo autofaacutegico inicial com
dupla membrana denominado autofagosomo eacute dependente de proteiacutenas Atg
Nos uacuteltimos anos tem sido reportada a seletividade da via autofaacutegica em relaccedilatildeo
aos componentes degradados (Alers et al 2012b) Termos especiacuteficos satildeo atribuiacutedos
para a degradaccedilatildeo de diferentes alvos tais como retinofagia pexofagia mitofagia
ribofagia mielinofagia e xenofagia em referecircncia agrave degradaccedilatildeo do retiacuteculo
endoplasmaacutetico peroxissomos mitococircndria ribossomos mielina e patoacutegenos
respectivamente (Ravikumar et al 2010 Cebollero et al 2012) O reconhecimento de
microrganismos intracelulares pela autofagia ocorre principalmente por um grupo de
receptores da imunidade inata que funcionam como adaptadores autofaacutegicos para a
eliminaccedilatildeo dos alvos pela via autofaacutegica (autofagia seletiva) onde eles tambeacutem agem
como substratos e satildeo degradados no mesmo processo servindo como marcadores de
degradaccedilatildeo autolisossomal (Klionsky et al 2016) Esses receptores satildeo denominados
receptores do tipo sequestrassoma 1 (SQSTM1p62) (SLR) (Deretic et al 2013)
O p62 possui domiacutenio N-terminal (PB1) que o torna capaz de se auto-
oligomerizar e um domiacutenio C-terminal (UBA) capaz de interagir com proteiacutenas
ubiquitinadas (Johansen amp Lamark 2011) Essa famiacutelia inclui ainda os receptores
NBR1 NDP52 (tambeacutem conhecido como CALCOCO2) Optineurina e TAX1BP1
Estes receptores de carga reconhecem os alvos marcados com ubiquitina via domiacutenio de
ligaccedilatildeo agrave ubiquitina (UBD) que pode variar de acordo com o tipo de ubiquitina
reconhecida por cada receptor (por exemplo o domiacutenio UBA em p62 e NBR1 possui
afinidade por monoubiquitina e cadeias de poliubiquitina-K63) e atraveacutes de uma curta
sequecircncia hidrofoacutebica denominada de motivo da regiatildeo de interaccedilatildeo com LC3 (LIR)
interagem com a maquinaria autofaacutegica via ligaccedilatildeo com a proteiacutena LC3 (Figura 110)
(Deretic et al 2013 Shaid et al 2013 Kimura et al 2016)
23
Figura 110 Degradaccedilatildeo de patoacutegenos intracelulares pela xenofagiaautofagiadependente
de galectina-8 e ubiquitina Em vacuacuteolos danificados por patoacutegenos a exposiccedilatildeo de glicanos
de β-galactosiacutedeos expostos na face citoplasmaacutetica de membranas recruta o receptor galectina-8
cuja acumulaccedilatildeo fornece um sinal de eat-mersquorsquo para o receptor NDP52 ativando a autofagia
seletiva antibacteriana Parte inferior da imagem As proteiacutenas adaptadoras autofaacutegicas NDP52
p62 e Optineurina (OPTN) reconhecem as bacteacuterias poli-ubiquitinadas processo mediado pelo
LRSAM1 e parkina responsaacutevel por mediar a ligaccedilatildeo de ubiquitina para estruturas associadas
ao patoacutegeno desencadeando a autofagia dependente de ubiquitina Adaptado de Youle et al
2014
Um fato interessante eacute que o motivo LIR do adaptador NDP52 eacute especiacutefico para
interaccedilatildeo com LC3C sendo tambeacutem chamado de CLIR Aleacutem disso esse receptor
possui um exclusivo motivo de interaccedilatildeo com galectina conhecido como Gal8IR Foi
demonstrado que a galectina-8 reconhece glicanos de β-galactosiacutedeos expostos na face
citoplasmaacutetica de membranas de vacuacuteolos danificados por patoacutegenos e entatildeo se liga ao
motivo Gal8IR de NDP52 (Figura 110) ativando a autofagia seletiva antibacteriana
(Thurston et al 2012)
123 Autofagia e a regulaccedilatildeo da sobrevivecircncia de micobacteacuterias e outros
patoacutegenos intracelulares
A autofagia eacute um mecanismo que atua na defesa da ceacutelula hospedeira contra os
patoacutegenos sobretudo se estes conseguem escapar do fagossomo ou impedem a sua
fusatildeo com o lisossomo No entanto alguns patoacutegenos inibem a maturaccedilatildeo do
autofagossomo com o objetivo de favorecer a replicaccedilatildeo bacteriana como por exemplo
24
o M tuberculosis (Campoy amp Mariacutea I Colombo 2009 Cemma amp Brumell 2012) No
caso do M marinum a induccedilatildeo de autofagia pelo tratamento com rapamicina leva agrave
maturaccedilatildeo do compartimento que o conteacutem e promove a incorporaccedilatildeo de
autofagossomos contendo M avium em fagolisossomos (Lerena amp Colombo 2011)
Aleacutem da homeostase celular a autofagia funciona na eliminaccedilatildeo de agentes
patogecircnicos intracelulares como viacuterus parasitas e bacteacuterias (Levine etal 2011)
Atraveacutes de um processo denominado xenofagia que apresenta papel chave na defesa
imune inata patoacutegenos intracelulares satildeo direcionados para o autofagossomo Vaacuterios
patoacutegenos intracelulares incluindo o M tuberculosis satildeo direcionados para a xenofagia
atraveacutes da ligaccedilatildeo covalente de proteiacutenas de superfiacutecie de bacteacuterias agrave proteiacutena ubiquitina
(Zhao et al 2008 Watson et al 2012)
Haacute atualmente diversos trabalhos associando autofagia e infecccedilatildeo por
micobacteacuterias sendo a maioria com M tuberculosis Um estudo recente demonstrou
que a parkina uma ubiquitina E3 ligase natildeo soacute participa da eliminaccedilatildeo autofaacutegica de
mitococircndrias danificadas (Winklhofer 2014) mas tambeacutem catalisa a ligaccedilatildeo do
domiacutenio K63 da ubiquitina para estruturas associadas ao M tuberculosis promovendo a
resistecircncia do hospedeiro agrave tuberculose e listeriose por intermeacutedio da autofagia
dependente de ubiquitina (Manzanillo et al 2013) Tambeacutem foi observado que a
UBQLN1 um membro da famiacutelia de proteiacutenas que conteacutem um domiacutenio semelhante agrave
ubiquitina eacute responsaacutevel por restringir a replicaccedilatildeo bacteriana de M tuberculosis uma
vez que recruta ubiquitina p62 e LC3 para vacuacuteolos contendo o patoacutegeno (Sakowski et
al 2015) Franco e colaboradores mostraram que a ubiquitina ligase Smurf1 tambeacutem
participa da autofagia seletiva de bacteacuterias intracelulares incluindo o M tuberculosis e
L monocytogenes Adicionalmente camundongos knockout para a Smurf tiveram a
carga bacteriana aumentada bem como o aumento da inflamaccedilatildeo pulmonar e
mortalidade acelerada durante a infecccedilatildeo crocircnica (Franco et al 2017) O grupo tambeacutem
mostrou que a Smurf1 se associa com bacteacuterias nos pulmotildees de pacientes com
tuberculose pulmonar
De fato estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos
genes relacionados agrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo reguladora
de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da susceptibilidade do
hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) O extravasamento do conteuacutedo
citoplasmaacutetico mediado pelo sistema ESX-1 do M tuberculosis eacute capaz de induzir
autofagia seletiva dependente de ubiquitinaccedilatildeo um mecanismo da resposta imune inata
25
eficiente em conter o crescimento de patoacutegenos intracelulares (Watson et al 2012
Manzanillo et al 2013) A atividade da parkina uma ubiquitina-ligase eacute central no
processo de controle da ubiquinaccedilatildeo e com isso a regulaccedilatildeo da autofagia (Manzanillo et
al 2013) Recentemente foi demonstrado que a ativaccedilatildeo de STING por M
tuberculosis requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a
qual sintetiza o mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING
levando a produccedilatildeo de IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira
(Wassermann et al 2015 Watson et al 2015)
A induccedilatildeo de autofagia com IFNem macroacutefagos induz o recrutamento de LC3-
II para o fagossomo micobacteriano via moleacutecula efetora IRGMLRG-47 (Singh et al
2006) A IRGM controla a autofagia atraveacutes da interaccedilatildeo com Ulk1 e BECN1
governando assim a montagem do complexo de iniciaccedilatildeo e depois em conjunto com
Atg16L1 e o receptor NOD2 forma um complexo molecular que promove a defesa
antimicrobiana (Chauhan et al 2015) O IFNtambeacutem pode induzir a xenofagia de M
tuberculosis atraveacutes da UBQLN1 (Sakowskiet al 2015)
Aleacutem disso foi descrito que M tuberculosis induz a supressatildeo da autofagia o
que resulta em acuacutemulo de lipiacutedeos (Neyrolles et al 2006 Singh et al 2009 Kumar amp
Rao 2011) Estudos demonstraram que em macroacutefagos espumosos os fagossomos
contendo as micobacteacuterias migram na direccedilatildeo de corpuacutesculos lipiacutedicos e que isso resulta
no engolfamento do bacilo em partiacuteculas lipiacutedicas (de Chastellier et al 2009)
Eacute possiacutevel que o encapsulamento do bacilo em um meio ambiente rico em
lipiacutedeos contribua para a manutenccedilatildeo do reservatoacuterio nutricional que permite a
persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Esse processo tambeacutem protege o patoacutegeno
do estresse hipoacutexico e de outras respostas microbicidas do hospedeiro incluindo
aquelas que envolvem a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (de
Chastellier 2009) A autofagia parece desempenhar um importante papel na mediaccedilatildeo
da reciclagem de trigliceriacutedeos e eacutesteres de colesterol os principais componentes dos
corpuacutesculos lipiacutedicos
Mais recentemente nosso grupo observou que pacientes LL apresentam alta
carga bacilar devido ao bloqueio da via autofaacutegica utilizado pelo M leprae como um
mecanismo de subversatildeo da resposta do hospedeiro Entretanto ceacutelulas de pacientes TT
ou reacionais que apresentam aumento da citocina IFN apresentam maior capacidade
de induccedilatildeo de autofagia justificando a reduccedilatildeo da carga bacilar nesses casos (Silva et
26
al 2017) Podem ser incluiacutedas outras funccedilotildees da via de autofagia eou suas proteiacutenas
nos mecanismos efetores durante infecccedilotildees e nos mecanismos de resposta inata e
adaptativa tais como remoccedilatildeo de corpos apoptoacuteticos regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de
citocinas inflamatoacuterias regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I maturaccedilatildeo do
fagossomo citoproteccedilatildeo contra fatores ou toxinas microbianas e recrutamento de
moleacuteculas efetoras imunes para membranas intracelulares (Pua et al 2007 2009
Motensen et al 2010 Levine et al 2011 Mizushima amp Komatsu 2011)
27
13 Justificativa
Micobacteacuterias patogecircnicas como o M leprae tem a capacidade de subverter
mecanismos microbicidas dos macroacutefagos sobrevivendo e replicando no interior dessas
ceacutelulas Em nosso laboratoacuterio observamos que a ativaccedilatildeo da via de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 leva agrave induccedilatildeo da resposta transcricional que inclui uma assinatura
de genes da via de IFN tipo I sendo o OASL (oligoadenilato sintetase ldquolikerdquo) o gene
mais diferencialmente expresso com importante papel proacute-micobacteacuteria favorecendo a
sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo negativa da autofagia (de
Toledo-Pinto et al 2016) A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 tambeacutem ativa a
segmentaccedilatildeo de uma subpopulaccedilatildeo de bacteacuterias para a via da autofagia mediada por
ubiquitina onde a parkina uma ubiquitina-ligase tem papel fundamental por mediar o
clareamento de patoacutegenos intracelulares (Manzanillo et al 2013) De fato estudos
geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em diversos genes relacionados a
imunidade inata em especial os encontrados na parkina (PARK2) estatildeo associados com
o aumento da susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004)
Entretanto os mecanismos que definem o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de
autofagia) ou patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFNβ) mediada pela sinalizaccedilatildeo de STING ainda
satildeo desconhecidos
Portanto o presente estudo pretende avaliar se a ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I
reduz a capacidade microbicida dependente de parkina e de autofagia em macroacutefagos
infectados com M leprae Os mecanismos autofaacutegicos associados bem como o
envolvimento do IFN tipo I na progressatildeo da doenccedila pode levar a melhores estrateacutegias
de prevenccedilatildeo da hanseniacutease tratamento e diagnoacutestico
28
2 OBJETIVO
21 Objetivo geral
Avaliar o envolvimento da ativaccedilatildeo da via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo do processo
de autofagia em macroacutefagos THP-1 infectados com micobacteacuterias
22 Objetivos especiacuteficos
Avaliar a induccedilatildeo de autofagia e sua participaccedilatildeo na atividade microbicida dos
macroacutefagos infectados com M smegmatis
Investigar a expressatildeo de genes autofaacutegicos e da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo
por M smegmatis
Avaliar o efeito do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia em macroacutefagos THP-1
infectados com M leprae bem como a produccedilatildeo de citocinas nas mesmas condiccedilotildees
Avaliar a ativaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de PARK2 em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia bem como o seu envolvimento na viabilidade intracelular do M leprae
29
3 MATERIAL E MEacuteTODOS
31 Cultivo de micobacteacuterias
311 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium smegmatis
O M smegmatis mc2 155 foi doado por Thomas Dick da Universidade de
Singapura sendo cultivado em meio Middlebrook 7H10 (Beckton Dickinson
andCompany Sparks MD USA) suplementado com 005 de Tween 80 e 10 de
ADC (02 de glicose 05 de albumina de soro bovino [BSA] 0085 de cloreto
de soacutedio) sob agitaccedilatildeo constante com barras magneacuteticas em estufaa 37degC O tempo de
cultivo foi de aproximadamente trecircs dias Nesse periacuteodo a cultura foi centrifugada a
500 rpm por 5 min para evitar grumos micobacterianos e o sobrenadante foi utilizado
para aferir a densidade oacuteptica (DO600) Ao atingir aproximadamente 08 (DO600 08 =
2x108 bacteacuteriasmL) correspondente agrave fase exponencial do crescimento micobacteriano
o cultivo foi interrompido e aliquotado em 20 glicerol e estocado em freezer -70ordmC
para posterior uso em ensaios de infecccedilatildeo Para a utilizaccedilatildeo nos ensaios de infecccedilatildeo as
aliacutequotas congeladas de M smegmatis em 20 glicerol foram centrifugadas a 14000
rpm por 10 min e ressuspensas em meio RPMI-1640 sem adiccedilatildeo de antibioacuteticos
A pureza do cultivo foi avaliada pelo meacutetodo de Kinyoun Brevemente foram
adicionados 10 μL da cultura em lacircmina de vidro e realizado um esfregaccedilo Depois de
seco o esfregaccedilo foi fixado por calor utilizando-se bico de Bunsen Posteriormente a
lacircmina de vidro foi coberta com fucsina fenicada por cerca de 5 min O excesso de
fucsina foi retirado por lavagem delicada em aacutegua corrente e em seguida adicionado
soluccedilatildeo aacutelcool-aacutecido para descoloraccedilatildeo Apoacutes lavagem em aacutegua corrente foi adicionado
azul de metileno por cerca de 30 segundos Apoacutes essa etapa a lacircmina foi novamente
lavada e apoacutes secagem em temperatura ambiente foi levada para avaliaccedilatildeo em
microscoacutepio oacuteptico com lente de imersatildeo (Nikon Eclipse E400) em aumento de 100x A
cultura foi determinada livre de contaminaccedilatildeo quando observados apenas bacilos
corados com fucsina (em rosa) Uma vez determinada a pureza a quantificaccedilatildeo da
cultura foi determinada por contagem direta das lacircminas como descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade foi determinada por coloraccedilatildeo fluorescente utilizando o
meacutetodo LiveDead BacLight bacterial viability kit (Life Technologies EUA) Atraveacutes
da microscopia de fluorescecircncia bacteacuterias vivas e mortas foram quantificadas por
contagem dos bacilos verdes e vermelhos respectivamente
30
312 Obtenccedilatildeo do Mycobacterium leprae
Nos ensaios de interaccedilatildeo entre patoacutegeno e ceacutelula hospedeira foram utilizadas
suspensotildees de M leprae vivo cedido pela Dra Patriacutecia Sammarco Rosa (Instituto
Lauro de Souza Lima Bauru SP) A cepa Thai-53 de M leprae foi proveniente da
infecccedilatildeo do coxim plantar de camundongos atiacutemicos nude Cerca de nove meses apoacutes a
inoculaccedilatildeo dos bacilos as patas foram colhidas e enviadas ao laboratoacuterio de
Microbiologia Celular (FIOCRUZ RJ) para purificaccedilatildeo De modo esteacuteril as patas
foram homogeneizadas em meio de cultura RPMI-1640 (LGC biotecnologia SP) Os
bacilos foram quantificados por contagem direta conforme descrito por Shepard e
McRae (1968) e a viabilidade medida pelo meacutetodo LiveDead BacLight (Life
Technologies EUA) (Trombone et al 2014)
313 Marcaccedilatildeo de micobacteacuterias com o kit PKH
Para obtenccedilatildeo de M leprae e M smegmatis fluorescente foram utilizados os kits
para marcaccedilatildeo de membranas celulares PKH67 ldquogreenrdquo um fluorocromo verde com
pico de excitaccedilatildeo em 490 nm e emissatildeo em 502 nm de acordo com as instruccedilotildees do
fabricante (Sigma-Aldrich) Para isso aproximadamente 107 bacilos foram
centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos agrave temperatura ambiente O sobrenadante foi
descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100uL da soluccedilatildeo diluente A
Posteriormente foi adicionado 1 uL do corante PKH67 e homogeneizado A mistura foi
incubada por 10 minutos agrave temperatura ambiente Em seguida a marcaccedilatildeo foi
bloqueada adicionando igual volume de SFB e incubando por 1 minuto para a
neutralizaccedilatildeo A suspensatildeo de bacilos foi entatildeo diluiacuteda em igual volume de meio RPMI-
1640 completo e centrifugada por 10 minutos a 14000 rpm Apoacutes a centrifugaccedilatildeo o
sobrenadante foi descartado e as bacteacuterias foram lavadas por trecircs vezes com meio
RPMI-1640 para a retirada do excesso de fluorocromo Ao final as bacteacuterias foram
ressuspendidas no volume inicial com meio RPMI-1640
Apoacutes a marcaccedilatildeo as suspensotildees de M leprae e Ms foram homogeneizadas 10
vezes em seringa de insulina ultrafina de 100 U com agulha 31G (Becton Dickinson
NJ EUA) para desfazer as globias As culturas celulares foram infectadas com M
31
leprae ou M smegmatis de forma a se obter multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) igual a 5
10 ou 50 organismosceacutelula e incubadas por 24 e 48 horas a 33ordmC
32 Cultura de ceacutelulas THP-1
Ceacutelulas THP-1 foram obtidas do ldquoAmerican Type Culture Collectionrdquo
(ATCCRockville EUA) As culturas celulares foram mantidas em garrafas de cultura
(Sigma-Aldrich Missouri EUA) atraveacutes de repiques semanais contendo meio
RPMI1640 suplementado com 10 de soro fetal bovino (SFB) L glutamina a 2 mM
penicilina a 100 UmL e estreptomicina 100 μgmL (meio completo todos obtidos da
Gibco CA EUA) e incubadas em estufa a 37ordmC com atmosfera contendo 5 CO2 (Shel
Lab OR EUA)
Para os ensaios de infecccedilatildeo as ceacutelulas foram quantificadas em cacircmara de
Neubauer e a viabilidade aferida pelo meacutetodo de exclusatildeo por coloraccedilatildeo pelo azul
Tripan (Sigma-Aldrich EUA) Posteriormente foram estimuladas com 200 nM de
acetato de forbol-miristila PMA (Calbiochem Darmstadt Alemanha) para diferenciaccedilatildeo
em macroacutefagos-ldquolikerdquo ou macroacutefagos THP-1 Apoacutes 24h de estiacutemulo as ceacutelulas foram
lavadas com o meio para a retirada de PMA e entatildeo adicionado meio fresco Os
antibioacuteticos do meio completo foram substituiacutedos por ampicilina 100 μgmL (Sigma-
Aldrish) durante a infecccedilatildeo por M leprae
33 Induccedilatildeo e inibiccedilatildeo de autofagia
A induccedilatildeo de autofagia em macroacutefagos diferenciados a partir de monoacutecitos
THP-1 foi realizada atraveacutes da adiccedilatildeo de rapamicina (200 ngmL Enzo Life Sciences
NY EUA) ao meio completo e incubaccedilatildeo por 24 horas a 37ordmC (Pinheiro et al 2009
Fabri et al 2011) A ativaccedilatildeo da autofagia tambeacutem foi realizada por privaccedilatildeo de soro
fetal bovino (ldquostarvationrdquo) atraveacutes da incubaccedilatildeo de ceacutelulas em RPMI por 24 h a 37ordmC
(Klinkenberg et al 2012)
Quando indicado foi realizada a inibiccedilatildeo da autofagia utilizando o inibidor
farmacoloacutegico 3-MA (10 mM Acros Organics NJUSA) 1 hora antes da induccedilatildeo de
autofagia que foi avaliada por imunofluorescecircncia
34 Purificaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos
32
341 Extraccedilatildeo de RNA
Monoacutecitos THP-1 diferenciados em macroacutefagos apoacutes estiacutemulo com PMA foram
cultivados em placas de 24 poccedilos Apoacutes o periacuteodo de infecccedilatildeo o sobrenadantedas
culturas foi coletado e o RNA total das ceacutelulas foi extraiacutedo utilizando o reagente TRIzol
(Life Technologies EUA) segundo a metodologia descrita pelo fabricante Apoacutes
raspagem com a ponteira o conteuacutedo lisado foi transferido para tubos de 15 mL Em
seguida adicionou-se 200 μL de clorofoacutermio (Merck Alemanha) em cada tubo e os
mesmos foram homogeneizados por inversatildeo ateacute se obter um aspecto leitoso Apoacutes isso
os tubos foram centrifugados a 12000 x g por 15 min a 4ordm C A fase aquosa contendo o
RNA (fase superior) foi transferida para novos tubos de 15 mL contendo 500 μL de
isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e incubada a -70ordm C por no
miacutenimo um dia As fases intermediaacuterias e orgacircnicas foram armazenadas a -20 ordmC para
posterior extraccedilatildeo de DNA Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 2 μL de
GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do sedimento e
entatildeo centrifugados a 14000 x g por 20 min a 4ordm C Os sobrenadantes foram descartados
e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por centrifugaccedilatildeo a 10000
x g por 10 min a 4ordm C Em seguida os sobrenadantes foram removidos os sedimentos
secos agrave temperatura ambiente por cerca de 10 min e em seguida ressuspensos em 20 μL
de aacutegua tratada com dietilpirocarbonato 001 (DEPC Life Technologies EUA)
342 Quantificaccedilatildeo e anaacutelise da integridade do RNA
O RNA total purificado foi quantificado em espectrofotocircmetro NanoDrop ND-
1000 (Thermo Scientific EUA) e sua integridade avaliada por gel desnaturante de
agarose 12 (Life Technologies EUA) em tampatildeo MOPS 1X (Sigma-Aldrich EUA)
A avaliaccedilatildeo da pureza foi determinada pela razatildeo da absorbacircncia (A) em dois
comprimentos de onda A260280 indica o grau de contaminaccedilatildeo por proteiacutenas enquanto
A260230 indica o grau de contaminaccedilatildeo por compostos orgacircnicos As amostras foram
consideradas com alto grau de pureza quando as razotildees A260280 e A260230 apresentaram
valores gt18 Foi feito um gel de agarose 12 para determinaccedilatildeo da integridade do
RNA O gel 12 de agarose foi preparado com agarose ultra pura (Invitrogen)
dissolvida em MOPs (aacutecido 3- (N-morfolino) propano sulfocircnico)) 1x em aacutegua livre de
RNAse tratada com DEPC com auxiacutelio de aquecimento ao microondas Foram
33
utilizados 400ng de RNA a estes foram acrescentados 7 microL de tampatildeo de amostra (azul
de bromofenol e xileno cianol 03 formamida 70 e MOPS 2x) 1 microL de SYBR e
aacutegua livre de RNAse qsp 15 microL As amostras foram aquecidas a 65 degC no banho seco
por 15 minutos e aplicadas no gel A corrida foi realizada no gel imerso no tampatildeo
MOPS 1x a 120 V por 1 hora e o gel foi visualizado com a iluminaccedilatildeo ultravioleta
(UV) no transiluminador (MiniBis pro ndash DNR BioImaging System) O RNA foi
considerado iacutentegro quando observadas as subunidades ribossomais esperadas (28S e
18S) sem rastros
343 Tratamento do RNA com DNAse
Apoacutes a quantificaccedilatildeo e confirmada a integridade do RNA extraiacutedo o mesmo foi
submetido ao tratamento com DNAse Para tal foi utilizado o kit TURBO DNA-freetrade
(Life tecnhologies EUA) seguindo as recomendaccedilotildees do fabricante em uma reaccedilatildeo
com volume final de 30 μL Inicialmente em tubos de 06 mL foi adicionado 3 μg de
RNA 01 volume de tampatildeo de enzima 10X e 1 μL da enzima Turbo DNAse seguido
por incubaccedilatildeo a 37ordm C durante 30 min Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo foi adicionado 01
volume do reagente de inativaccedilatildeo enzimaacutetica Em seguida os tubos foram incubados agrave
temperatura ambiente durante 5 min agitando os tubos manualmente 2-3 vezes durante
esse periacuteodo para homogeneizar o conteuacutedo Apoacutes isso os tubos foram centrifugados a
10000 x g por 2 min os sobrenadantes contendo o RNA foram cuidadosamente
transferidos para novos tubos e o RNA novamente quantificado como descrito no item
anterior (412)
344 Extraccedilatildeo do DNA
A fase intermediaacuteria armazenada a -20ordm C foi utilizada para a extraccedilatildeo de DNA
para a realizaccedilatildeo dos experimentos de viabilidade bacteriana Em cada tubo foi
adicionado 100 μL de tampatildeo TE (5mM Tris 01 mM EDTA) e 150 μL de clorofoacutermio
A mistura foi homogeneizada no aparelho FastPrepreg 120 (MP biomedicals EUA) na
configuraccedilatildeo de velocidade a 65 metros por segundo (ms) por 45 seg Os tubos foram
incubados no gelo por 5 min e centrifugados a 12000 x g por 10 min agrave temperatura
ambiente A fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo de 15 mL
contendo 300 μL de isopropanol (Sigma-Aldrich EUA) misturada por inversatildeo e
34
armazenada a -70ordm C por no miacutenimo um dia Apoacutes a incubaccedilatildeo foram adicionados 2 μL
de GlycoBluereg (Ambion EUA) em cada tubo para melhor visualizaccedilatildeo do pellet e
entatildeo centrifugados a 12000 x g por 30 min em temperatura ambiente Os sobrenadantes
foram descartados e o material sedimentado lavado com 500 μL de etanol 70 por
centrifugaccedilatildeo a 12000 x g por 15 min em temperatura ambiente Em seguida os
sobrenadantes foram removidos os sedimentos secos agrave temperatura ambiente por 15
min e ressuspensos em 20 μL de aacutegua de ampola
35 RT-PCR em tempo real para anaacutelise da expressatildeo gecircnica
351 Siacutentese de cDNA
O cDNA foi obtido a partir do RNA total de 2x105 de monoacutecitos diferenciados
em macroacutefagos THP-1 mediante o uso da enzima transcriptase reversa Superscript
VILOtrade (Invitrogen EUA) em uma reaccedilatildeo com volume final de 20 μL Inicialmente
500 ng de RNA foram incubados com 4uL do mix de reaccedilatildeo 5X VILOtrade 2 μL do mix
da enzima 10X SuperScripttrade e aacutegua de ampola Essa mistura foi incubada a 25degC
durante 10 minutos para a linearizaccedilatildeo da moleacutecula de RNA 42ordm C por 1 hora para
transcriccedilatildeo seguida de incubaccedilatildeo a 85ordmC por 5 min para inativaccedilatildeo da enzima Apoacutes a
incubaccedilatildeo as amostras foram armazenadas a -20ordm C
352 Reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR)
Para anaacutelise da expressatildeo gecircnica de OASL e PARK2 foi realizada qPCR
utilizando-se o sistema SYBR Green I (Applied Biosystems) seguindo as instruccedilotildees do
fabricante Para isso foi realizada uma reaccedilatildeo de 20 μL onde foram adicionados 5 μL
de cada cDNA transcrito com Oligo (dT) previamente diluiacutedo (15) 025 μM de cada
oligonucleotiacutedeo e SYBR Green PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems) Para cada
amostra foi amplificado o cDNA dos genes de interesse e o gene constitutivo RPL13a
ou GAPDH As reaccedilotildees foram incubadas no sistema de PCR em tempo real StepOne
Plusreg (Applied Biosystems EUA) seguindo as condiccedilotildees da reaccedilatildeo 95deg C por 10
minutos para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 40 ciclos de 95deg C por 15 segundos para a
desnaturaccedilatildeo da fita e 60degC por 1 minuto para o anelamento do primer e extensatildeo da
fita de cDNA Ao final da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo as amostras foram submetidas a uma
nova incubaccedilatildeo para geraccedilatildeo da curva de dissociaccedilatildeo onde se determina o ponto
35
correspondente agrave temperatura de dissociaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos de suas sequecircncias
alvo
Para a avaliaccedilatildeo da expressatildeo de genes relacionados agrave autofagia (Atg5
MAP1LC3B LAMP2 BECLIN1) por qPCR foi utilizado um kit de PCR ldquoarrayrdquo da via
autofaacutegica (Real Time Primers HATPL-I) composto por 88 alvos e 8 genes de
referecircncia (ACTB B2M GAPDH GUSB HPRT1 PGK1 PPIA e RPL13A) A lista
completa de genes alvos estaacute disponibilizada em
httprealtimeprimerscomhuauprlihtml (Anexo) A qPCR ldquoarrayrdquo foi realizada a 50ordmC
por 2 min e 95ordmC por 10 min para ativaccedilatildeo da DNA polimerase 50 ciclos a 95ordmC por 10
segundos para a desnaturaccedilatildeo da fita e a 58ordmC por 45 segundos para o anelamento do
primer e extensatildeo da fita de cDNA utilizando o Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems MA EUA) em um termociclador StepOnePlus qPCR System
(Applied Biosystems MA EUA) com o auxiacutelio do software StepOne versatildeo 23 A
curva de ldquomeltingrdquo foi feita de modo contiacutenuo a 95ordmC por 15 segundos e 60ordmC por 1
min
353 Determinaccedilatildeo da viabilidade do M leprae e M smegmatis
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi realizado qPCR em
tempo real para detecccedilatildeo dos niacuteveis de RNAr 16S do bacilo com algumas
modificaccedilotildees como descrito por Martinez et al (2009) A partir das ceacutelulas infectadas
com o bacilo foi extraiacutedo o DNA e o RNA onde este uacuteltimo foi reversamente transcrito
em cDNA com a utilizaccedilatildeo de Random Primer conforme descrito anteriormente para os
genes humanos (no item 351) Os niacuteveis de RNAr 16S foram normalizados pela
detecccedilatildeo de DNA 16S Os oligonucleotiacutedeos utilizados foram os descritos em Martinez
et al 2009 As reaccedilotildees de qPCR foram realizadas com 500 ng de DNA e cDNA em
volume final de 20 μL contendo TaqMan PCR Master Mix 1X (Applied Biosystem) 01
μM da sonda e 05 μM de cada oligonucleotiacutedeo As reaccedilotildees foram incubadas a 50ordm C
por 2 min 95ordm C por 10 min seguido de 40 ciclos a 95ordm C por 15 segundos e 60ordm C por 1
min no sistema de PCR em tempo real StepOne Plusreg
Para o ensaio de viabilidade intracelular do M smegmatis os macroacutefagos
infectados foram lisados com Triton X-100 01 para recuperaccedilatildeo das bacteacuterias viaacuteveis
e em seguida diluiccedilotildees seriadas foram submetidas a Meio de cultura soacutelido 7H10
suplementado com ADC 10 em placa de Petri O crescimento bacteriano foi estimado
atraveacutes da contagem de unidades formadoras de colocircnias (CFU)
36
354 Anaacutelise dos dados de qPCR em tempo real
A anaacutelise da expressatildeo gecircnica foi realizada utilizando-se o meacutetodo delta-delta CT
(ΔΔCT) (Livak e Schmittgen 2001) Inicialmente foi calculado o ΔCT subtraindo-se os
valores de CT (do inglecircs threshold cycle limiar do ciclo) do gene alvo dos valores de CT
do gene normalizador (GADPH) Uma vez determinado o ΔCT das amostras foi
escolhido como amostra normalizadora o cDNA referente agrave condiccedilatildeo experimental de
ceacutelulas natildeo estimuladas Para calcular o ΔΔCT foi utilizada a seguinte foacutermula [ΔCT
(amostra) - ΔCT (amostra normalizadora)] Por fim os valores de expressatildeo gecircnica
relativa foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
Para estimar a viabilidade intracelular do M leprae foi utilizado tambeacutem o
meacutetodo descrito acima Entretanto para o caacutelculo do ΔCT subtraiu-se os valores de CT
referentes ao cDNA de 16S dos valores de DNA genocircmico 16S A condiccedilatildeo
experimental de macroacutefagos-ldquolikerdquo infectados com M leprae sem tratamento foi
selecionada como amostra normalizadora Apoacutes se obter o ΔΔCT os valores de
expressatildeo relativa de 16S foram obtidos aplicando-se a foacutermula 2- ΔΔCT
36 Imunofluorescecircncia
Para verificar a redistribuiccedilatildeo do marcador de autofagia LC3 nas culturas
celulares foram utilizadas 5 x 105 ceacutelulas por poccedilo em placas de 24 poccedilos (Corning
EUA) onde as ceacutelulas foram diferenciadas sobre lamiacutenulas de vidro Ao final dos
ensaios de infecccedilatildeo o meio de cultura foi removido as ceacutelulas lavadas duas vezes com
PBS 1X (LGC biotecnologia Brasil)e fixadas com paraformaldeiacutedo 4 durante 10 min
a 4ordmC Em seguida as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS acrescido de Triton X-
100 001 (ou saponina 005 Sigma-Aldrich) e bloqueadas com uma soluccedilatildeo de SFB
10 SNC 10 e BSA 1 por 1 hora agrave temperatura ambiente Apoacutes esse periacuteodo as
ceacutelulas foram incubadas ldquoovernightrdquo a 4ordmC com o anticorpo primaacuterio de interesse LC3
(diluiccedilatildeo 150 monoclonal coacutedigo M152-3 MBL International) Em seguida as
ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo de PBSTriton X-100 001 e foi entatildeo
realizada a incubaccedilatildeo com o anticorpo secundaacuterio por 2 horas agrave temperatura ambiente
fabricado em cabra anti-IgG de camundongoAlexa Fluor 568 (1500 coacutedigo A21124
Molecular Probes) Apoacutes esse periacuteodo as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com a soluccedilatildeo
de PBSTriton X-100 001 e foi realizada incubaccedilatildeo com DAPI por 5 min em
37
temperatura ambiente Posteriormente as ceacutelulas foram lavadas 3 vezes com PBS e as
lacircminas foram montadas em meio anti- ldquofadingrdquo Permafluor (Thermo Fisher Scientific)
e seladas com esmalte nas bordas Controles negativos tambeacutem foram realizados
consistindo na utilizaccedilatildeo de isotipos correspondentes ou omissatildeo do anticorpo
primaacuterio
As ceacutelulas foram fotografadas utilizando o microscoacutepio AxioObserverZ1
equipado com os sistemas Colibri2 e ApoTome2 (Carl ZeissOberkochen Germany) e
as objetivas de oacuteleo EC Plan-Neofluar de 40x130 63x140 e 100x130 As imagens
foram capturadas com a cacircmera digital AxioCam HRm e auxiacutelio do programa
AxioVision Rel 4820 (Carl Zeiss) O nuacutemero de marcaccedilotildees puntiformes para LC3 por
campo foi determinado utilizando uma adaptaccedilatildeo do macro GFP-LC3 (Dagda et al
2008) e o ldquopluginrdquo ldquoAnalyze Particlesrdquo no software de anaacutelise de imagens ImageJ
versatildeo 150 g (Wayne Rasband National Institutes of Health) Este nuacutemero foi
normalizado pelo nuacutemero de nuacutecleos corados com DAPI por campo Para as anaacutelises
cada experimento envolveu a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao
menos 10 campos randocircmicos
37 Ensaio para detecccedilatildeo de citocinas
Os sobrenadantes dos experimentos de infecccedilatildeo com M leprae foram coletados
e estocados a -20ordmC ateacute o momento da utilizaccedilatildeo Para dosagem de IL-1β foi utilizado o
kit de ELISA Human IL-1β (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887261-88) para IL-10
kit de ELISA Human IL-10 (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887106-22) e para o
TNF kit de ELISA Human TNF (Ready-SET-Go 2nd
Gen cataacutelogo 887346-88) onde
os sobrenadantes foram processados conforme orientaccedilatildeo do fabricante (eBioscience)
(Waghabi et al 2002 Oliveira et al 2005) As amostras de sobrenadantes de cada
condiccedilatildeo experimental foram analisadas em duplicata e a concentraccedilatildeo de cada citocina
calculada atraveacutes do software SoftMax Pro 53
38 Ensaio de reduccedilatildeo do sal de tetrazoacutelio MTT
A reduccedilatildeo do MTT eacute um meacutetodo colorimeacutetrico raacutepido frequentemente usado
para medir proliferaccedilatildeo celular e citotoxicidade (Mosman 1983) Neste ensaio as
ceacutelulas foram cultivadas na presenccedila ou ausecircncia de SFB nos tempos de 6 24 48 e 72h
seguida da adiccedilatildeo da soluccedilatildeo de MTT (5 mg mL) em PBS durante 4 horas a 37degC e
38
5 de atmosfera de CO2 Apoacutes o tempo de incubaccedilatildeo os cristais de formazan
resultantes da reduccedilatildeo do MTT foram dissolvidos numa soluccedilatildeo de SDS 10 (volume
igual ao do meio contido no poccedilo anterior agrave adiccedilatildeo de MTT) e a absorvacircncia foi medida
atraveacutes do leitor de ELISA (SPECTRA MAX190 Molecular Devices LLC USA) a
um comprimento de onda de 590 nm Os valores da viabilidade celular foram expressos
em percentagem relativa agrave absorvacircncia determinada nas ceacutelulas controle
39 Anaacutelise dos niacuteveis de parkina por Western blotting
Apoacutes as dosagens 20 μg das proteiacutenas extraiacutedas a partir do tampatildeo RIPA na
presenccedila de inibidores de protease e fosfatase (1100 SIGMA) foram diluiacutedas em
tampatildeo de amostra 4 vezes concentrado (para 10 mL de soluccedilatildeo 125 mL de Tris pH
68 a 05 M 4 mL de Glicerol 02 g de SDS 05 mL de β-Mercaptoetanol 025 mL de
azul de bromofenol a 005 completado com aacutegua deionizada) e fervidas por 10 min
As amostras e o padratildeo de peso molecular (Kaleidoscopetrade Prestained SDS-PAGE
Standards broad range cataacutelogo 1610324) foram aplicados em gel de poliacrilamida
composto por um gel de empilhamento a 12 Apoacutes corrida eletroforeacutetica a 100 V em
tampatildeo contendo Tris a 25 mM e glicina a 250 mM foi realizada a transferecircncia das
proteiacutenas do gel para membrana de nitrocelulose (Hybond-C Extra Amershan
Biosciences NJ EUA) A transferecircncia foi feita em tampatildeo de transferecircncia (Tris a 25
mM glicina a 190 mM e metanol a 20) a 100 V por 45 min em cuba semi-seca (Bio-
Rad)
Apoacutes a transferecircncia as membranas foram coradas com soluccedilatildeo de Amido Black
(metanol 40 aacutecido aceacutetico 10 Amido Black 01) para a confirmaccedilatildeo da
transferecircncia e identificaccedilatildeo do padratildeo de peso molecular e posteriormente descoradas
por lavagens com soluccedilatildeo de TBST (10 mM Tris pH 80 150 mM Nacl Tween-20
005) Em seguida as membranas foram bloqueadas com soluccedilatildeo de TBST com BSA
4 por 40 min e incubadas por 1 h com anticorpo primaacuterio policlonal anti-pPARK
(coacutedigo ab73016 Abcam) na diluiccedilatildeo de 1500 em TBST com 2 de BSA Apoacutes esta
incubaccedilatildeo as membranas foram lavadas por trecircs vezes com TBST durante 10 a 15 min
e logo em seguida foram incubadas por 1 h com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de
coelho conjugada agrave peroxidase (coacutedigo P0448 DakoCytomation) diluiacutedo 12000 em
TBST com leite desnatado 3 As membranas foram lavadas trecircs vezes com TBST
por 10 min e reveladas em cassete de revelaccedilatildeo
39
A revelaccedilatildeo foi realizada adicionando-se sobre a membrana 400 μl do substrato
quimioluminescente (ECL Advance Western Blotting Detection Kit GE Satildeo Paulo
Brasil) Em uma cacircmara escura um filme (Hyperfilm ECL GE Satildeo Paulo Brasil) foi
colocado sobre cada membrana por aproximadamente 30 segundos e em seguida
revelado utilizando-se soluccedilatildeo reveladora e fixadora (Kodak)
Apoacutes a revelaccedilatildeo a membrana foi incubada com NaOH 02 M sob agitaccedilatildeo por
5 min para a remoccedilatildeo dos anticorpos A membrana foi entatildeo novamente bloqueada com
TBST com 4 BSA por 40 min e entatildeo um novo Western Blot foi realizado para
GAPDH (Santa Cruz Biotechnology EUA) numa diluiccedilatildeo de 1500 de TBST com 2
de BSA (albumina seacuterica bovina) seguindo um protocolo semelhante ao utilizado para
pPARK poreacutem com uma adaptaccedilatildeo o anticorpo secundaacuterio utilizado foi anti-IgG de
camundongo conjugado agrave peroxidase (coacutedigo P0447 DakoCytomation Glostrup
Dinamarca) na diluiccedilatildeo de 11000
Os graacuteficos de anaacutelise densitomeacutetrica apresentados foram realizados utilizando o
programa ImageJ (NIH EUA) Os resultados foram gerados a partir do caacutelculo da razatildeo
entre valores de densitometria do perfil de bandas de expressatildeo de pPARK e GAPDH e
expressos em unidades arbitraacuterias
310 Anaacutelises estatiacutesticas
A significacircncia estatiacutestica foi calculada atraveacutes dos testes Wilcoxon
(monocaudal) ou Kruskal-Wallis (com o poacutes-teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla de Dunn)
utilizando o programa GraphPad Prism 50 (GraphPad Software CA EUA) Os valores
foram considerados estatisticamente significativos quando P lt 005 Os dados foram
apresentados como meacutedia plusmn desvio padratildeo
40
4 RESULTADOS
41 Mycobacterium smegmatis regula positivamente a induccedilatildeo de LC3 em
macroacutefagos THP-1
Micobacteacuterias patogecircnicas tem a habilidade de subverter mecanismos
microbicidas da ceacutelula hospedeira como a inibiccedilatildeo da fusatildeo fagossomo-lisossomo e dos
mecanismos de autofagia (Gutierrez et al 2004 Jordao et al 2008 Cemma amp Brumell
2012) Inicialmente buscamos avaliar a capacidade do Mycobacterium smegmatis (Ms)
uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica na induccedilatildeo do mecanismo autofaacutegico em macroacutefagos
THP1
Para tal avaliamos por imunofluorescecircncia a expressatildeo de caracteriacutestica
puntiforme da proteiacutena LC3 marcador do autofagossomo maduro amplamente utilizada
como indicador de induccedilatildeo de autofagia (Kabeya et al 2000 Mizushima amp Yoshimori
2007)Nossa anaacutelise revelou um maior nuacutemero de ceacutelulas expressando LC3 puntiforme
em macroacutefagos THP-1 infectados com Ms quando comparados agraves ceacutelulas natildeo infectadas
(Ms = 351plusmn 061 versus NI =140 plusmn 053) Aleacutem disso o tratamento dos macroacutefagos
com a droga inibidora de PI3K 3-MA (3-metiladenina) um potente inibidor autofaacutegico
foi capaz de reduzir a expressatildeo de LC3 (3MA = 058 plusmn 018) (Figura 41A) A
quantificaccedilatildeo dos macroacutefagos expressando LC3 eacute mostrada na Figura 41B Desse
modo demonstramos que a micobacteacuteria avirulenta Ms eacute capaz de aumentar a formaccedilatildeo
de autofagossomos durante a infecccedilatildeo
41
A
B
NI
MS
MS +
3M
A3M
A
0
1
2
3
4
5
LC
3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
Figura 41 Anaacutelise da expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 apoacutes infecccedilatildeo com Ms (A)
Ensaio de imunofluorescecircncia detectando LC3 marcado com Alexa 568 (verde) em macroacutefagos
infectados com Ms previamente marcado com PKH67 (vermelho) em MOI de 101 por 24
horas A marcaccedilatildeo nuclear foi realizada com DAPI (azul) Barra de escala 10 μm (B) Anaacutelise
quantitativa dos resultados de imunofluorescecircncia Para as anaacutelises cada experimento envolveu
a contagem de pelo menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos Os
resultados satildeo representativos de 2 experimentos independentes
42
42 Autofagia restringe o crescimento da micobacteacuteria avirulenta M smegmatis
Em seguida decidimos avaliar se a ativaccedilatildeo da via autofaacutegica pelo Ms estaacute
relacionada com a capacidade microbicida do macroacutefago na eliminaccedilatildeo da
micobacteacuteria Deste modo o passo seguinte foi avaliar a sobrevivecircncia intracelular da
micobacteacuteria em macroacutefagos infectados apoacutes inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo autofaacutegica Para tal
os macroacutefagos foram preacute-tratados com a droga 3-MA (inibidor de autofagia) e
infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) por 24 horas Apoacutes esse periacuteodo as bacteacuterias
intracelulares foram recuperadas e cultivadas em meio 7H10 por 72h e o nuacutemero total
de unidades formadoras de colocircnias (UFC) foi mensurado Nossos resultados mostram
que na presenccedila de 3-MA houve um aumento de 531 no nuacutemero de bacteacuterias
intracelulares quando comparado agrave cultura natildeo tratada indicando um aumento
significativo na viabilidade e sobrevivecircncia de Ms no interior dos macroacutefagos (Figura
42) Estes dados mostram que a autofagia parece ser um importante mecanismo no
controle da viabilidade intracelular de Ms
MS
MS +
3M
A
00
05
10
15
20
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 42 Avaliaccedilatildeo da sobrevivecircncia de Ms em macroacutefagos THP1 Viabilidade
intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de 3-MA (3-metiladenina 10 mM)
obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes 24 horas Cada resultado
representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica
foi calculada pelo teste Wilcoxon ( plt005)
43
43 Mycobacterium smegmatis eacute um indutor de genes autofaacutegicos
Visto que a infecccedilatildeo pela micobacteacuteria avirulenta Ms induziu o aumento no
nuacutemero de autofagossomos nos macroacutefagos THP-1 e que a autofagia tem um papel
crucial na eliminaccedilatildeo dessa bacteacuteria fomos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo degenes
importantes relacionados a autofagia durante a infecccedilatildeo (Figura 43) Nossos dados
sugerem que os genes que codificam para ATG5 (Ms 144 plusmn 088 versus NI 049 plusmn
044) MAP1LC3 (Ms 229 plusmn 209 versus NI 071 plusmn 055) BECLIN1 (Ms 249 plusmn 288
versus NI 066 plusmn 029) LAMP2 (Ms 145 plusmn 173 versus NI 040 plusmn 051) e PARK2 (Ms
179 plusmn 096 versus NI 054 plusmn 039) estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por
Ms corroborando com os dados anteriores onde mostramos que a infecccedilatildeo por Ms ativa
a capacidade autofaacutegica dos macroacutefagos THP-1
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
1
2
3
4
5NI
MS
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 43 A infecccedilatildeo por Ms induz a expressatildeo de genes autofaacutegicos em macroacutefagos
THP1 As ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M
smegmatis (101 bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de
qPCR foi realizada para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 relacionados agrave via de autofagia
bem como para o gene que codifica para a proteiacutena de membrana lissosomal e para a ubiquitina-
ligase E3 respectivamente LAMP2 e PARK2 Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio
padratildeo de 3 experimentos independentes
44
44 Regulaccedilatildeo da via de IFN tipo I na infecccedilatildeo por M smegmatis
Dados recentes da literatura evidenciaram que a induccedilatildeo da via de IFN tipo I
modula negativamente a capacidade antimicrobiana de macroacutefagos e estaacute fortemente
relacionada com o sucesso da infecccedilatildeo de micobacteacuterias virulentas como M leprae e M
tuberculosis (Manzanillo et al 2012 Teles et al 2013 de Toledo et al 2016) A
induccedilatildeo dessa via atraveacutes da expressatildeo do RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido
por IFNβ) na infecccedilatildeo por Ms foi avaliada Para isto macroacutefagos foram infectados com
Ms em uma relaccedilatildeo bacteacuteriaceacutelula 101 e apoacutes 24 horas a expressatildeo gecircnica foi
analisada por qPCR em tempo real Nossos dados sugerem que o Ms regula
negativamente a expressatildeo gecircnica do IFNβ (Ms 025plusmn002 versus NI 092plusmn010) e do
gene OASL (Ms 038plusmn 003 versus NI 097plusmn003) nas ceacutelulas infectadas em comparaccedilatildeo
com as natildeo infectadas (Figura 441) Desse modo parece que o Ms natildeo eacute um fraco
indutor da via de IFN tipo I
IF
NOASL
00
05
10
15
MS
NI
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 441 Apoacutes infecccedilatildeo com Ms macroacutefagos THP-1 tem a expresssatildeo de IFNβ e OASL
diminuiacutedaValores de expressatildeo gecircnica normalizados em relaccedilatildeo ao NI (deltadeltaCt) dos
genes descritos a partir da infecccedilatildeo de macroacutefagos THP-1 por Ms (MOI de 101) por 24 horas
Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
45
Visto que o mecanismo autofaacutegico estaacute envolvido no controle da infecccedilatildeo por
Ms e esta micobacteacuteria parece ser capaz de modular negativamente a expressatildeo do
RNAm de IFNβ e de OASL (gene induzido por IFNβ) nos perguntamos se a resposta ao
IFN tipo I poderia favorecer a persistecircncia do bacilo na ceacutelula hospedeira Para isso
macroacutefagos THP-1 foram infectados com Ms (101 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de soro fetal bovino (SFB) e apoacutes 30 minutos tratados com IFNβ recombinante
durante 24 horas A determinaccedilatildeo do nuacutemero de bacteacuterias apoacutes 72 horas de incubaccedilatildeo
mostra que o tratamento com IFNβ leva a um efeito significativo de 511 na
persistecircncia da bacteacuteria comparado a infecccedilatildeo de Ms na privaccedilatildeo de SFB (Figura
442) Quando retiramos o SFB observamos a reduccedilatildeo no nuacutemero de bacteacuterias
mostrando que a induccedilatildeo de autofagia estaacute associada ao clearance da infecccedilatildeo por Ms
Por outro lado o tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por Ms na privaccedilatildeo de SFB natildeo eacute
suficiente para provocar um efeito expressivo a favor da bacteacuteria
00
05
10
15
20
IFN
M smegmatis
- - ++
+ SFB
- SFB
+ + + +
UF
C
(aum
ento
rela
tivo
)
Figura 442 INFβ promove a sobrevivecircncia de M smegmatis em macroacutefagos THP1
Estimativa da viabilidade intracelular do M smegmatis (Ms) na presenccedila ou ausecircncia de IFNβ
recombinante (10 ngmL) obtida pela contagem de unidades formadoras de colocircnia (UFC) apoacutes
24 horas Cada resultado representa a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 3 experimentos independentes
e a significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo teste de Friedman com poacutes-teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla de Dunn ( plt005)
46
45 Induccedilatildeo dos genes relacionados a via autofaacutegica na infecccedilatildeo pelo
Mycobacterium leprae
Ao contraacuterio do que vimos ateacute agora na infecccedilatildeo pelo avirulento Ms o M leprae
induz a via de IFN do tipo I poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de modo importante os
mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017) Por esse motivo
decidimos avaliar a regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica de importantes genes relacionados a
autofagia durante a infecccedilatildeo pelo M leprae (Figura 45) De fato nossos dados
sugerem que os genes que codificam para MAP1LC3A (ML 033 plusmn 021 versus NI 070
plusmn 041) BECLIN1(ML 038 plusmn 023 versus NI 090 plusmn 014) mostraram diferenccedila em
relaccedilatildeo a ceacutelula natildeo infectada Entretanto LAMP2 (ML 224 plusmn 055 versus NI 089 plusmn
014) PARK2 (ML 104 plusmn 031 versus NI 046 plusmn 004) e ATG5 (ML 526 plusmn 037 versus
NI 115 plusmn 022) mostraram um aparente aumento apesar de natildeo significativo na
expressatildeo Agrave exceccedilatildeo de ATG5 os demais genes relacionados agrave autofagia apresentaram
um aumento discreto indicando a necessidade de incrementar a induccedilatildeo de autofagia
em nosso modelo de estudo atraveacutes da privaccedilatildeo de soro
ATG
5
MAP1L
C3B
BEC
LIN1
PARK2
LAM
P2
0
2
4
6NI
ML
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
Figura 45 M leprae eacute um fraco indutor de genes autofaacutegicos em macroacutefagos THP1 As
ceacutelulas THP-1 diferenciadas em macroacutefagos foram incubadas ou natildeo com M leprae (51
bacteacuteriaceacutelula) durante 24 h Apoacutes a lise o RNA foi extraiacutedo e anaacutelise de qPCR foi realizada
47
para os genes ATG5 MAP1LC3B BECLIN1 PARK2 e LAMP2 (n=2) Os resultados
representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos independentes
46 A autofagia induzida pela retirada de SFB eacute modulada pela via de IFN tipo I
Uma vez que o M leprae tem capacidade reduzida em induzir genes da via de
autofagia comparado a infecccedilatildeo por Ms avaliamos um modelo de induccedilatildeo de autofagia
pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Nessa etapa do trabalho fomos avaliar
se a privaccedilatildeo de SFB era capaz de modular a viabilidade de macroacutefagos THP-1 Nosso
dado mostrou que a privaccedilatildeo de SFB nos tempos de 24 e 72h foram capazes de alterar
significativamente a viabilidade da ceacutelula comparada ao controle de 24 e 72h (Figura
461) No entanto ao compararmos a viabilidade dos macroacutefagos entre os diferentes
tempos na privaccedilatildeo de SFB natildeo observamos diferenccedila significativa
MTT
6h 24h
48h
72h
0
50
100
150Controle
Sem SFB
Tempo apoacutes a privaccedilatildeo de SFB
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
()
Figura 461Viabilidade dos macroacutefagos THP-1 na privaccedilatildeo de soroem diferentes tempos
Curva de viabilidade celular dos macroacutefagos THP-1 durante a privaccedilatildeo de soro fetal bovino
(SFB) nos tempos de 6 24 48 e 72 horas atraveacutes do ensaio de MTTOs resultados representam
a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 4 experimentos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi
calculada pelo teste Two-way ANOVA seguido do poacutes-teste Bonferroni
Como mencionado anteriormente os interferons tipo 1 (IFNαβ) satildeo citocinas da
resposta inata que podem contribuir para a patogecircnese durante a infecccedilatildeo por M
tuberculosis e M leprae Desse modo fomos investigar se o M leprae poderia modular
48
negativamente a expressatildeo de LC3 bem como avaliar o efeito do tratamento com IFNβ
durante a privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo com M leprae
Observamos atraveacutes da realizaccedilatildeo de ensaio por imunofluorescecircncia uma
reduccedilatildeo da expressatildeo de LC3 puntiforme 24h apoacutes a infecccedilatildeo com M leprae
confirmando seu efeito na modulaccedilatildeo negativa da autofagia em macroacutefagos Aleacutem
disso a anaacutelise mostrou que o aumento de LC3 nas ceacutelulas infectadas com M leprae
durante a privaccedilatildeo de SFB parece ser parcialmente revertido no tratamento com IFNβ
recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no tempo de 24h (Figura 462) Estes
resultados indicam que a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB possa ser modulada
pela via do IFN tipo I
A B
Figura 462 O IFNβ diminui a expressatildeo de LC3 em macroacutefagos THP-1 infectados com o
M leprae na privaccedilatildeo de SFB Macroacutefagos THP-1 foram estimulados com o M leprae-
PKH67 (verde) (MOI 101) na ausecircncia do SFB e apoacutes 30 minutos foram tratados com 10 ng de
IFNβ por 24 horas (A) A expressatildeo de LC3 foi avaliada por microscopia de imunofluorescecircncia
utilizando o anticorpo anti-LC3 III (verde) sendo o nuacutecleo corado com DAPI (azul) Natildeo
infectado (NI) ML+SFB ML+SFB+IFNβ ML-SFB e ML-SFB+IFNβ (B) Avaliaccedilatildeo da
expressatildeo de LC3 puntiforme Para as anaacutelises cada experimento envolveu a contagem de pelo
NI
ML +
SFB
ML +
SFB
+ IN
F
ML -
SFB
ML -
SFB
+ IF
N
00
05
10
15L
C3 p
un
tifo
rmec
eacutelu
la
49
menos 100 ceacutelulas por amostra em ao menos 10 campos randocircmicos As imagens representam
um experimento Barra de escala 10 μm
47 A induccedilatildeo dos transcritos associados agrave via de autofagia eacute reduzida pelo
tratameto com IFNβ na infecccedilatildeo pelo M leprae
O dado anterior sugere que o tratamento com IFNβ modulou negativamente a
ativaccedilatildeo autofaacutegica Portanto fomos investigar a influecircncia desta via na induccedilatildeo de
genes relacionados a autofagia atraveacutes de qPCR em tempo real Nesse contexto
macroacutefagos foram infectados com M leprae (51 bacteacuteriaceacutelula) na presenccedila ou
ausecircncia de SFB seguido ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos
apoacutes a infecccedilatildeo Depois de 24 horas nossos dados demonstram um efeito bioloacutegico na
induccedilatildeo do transcrito ATG5 (ML-SFB= 1185 plusmn 560) (Figura 47A) MAP1LC3B (ML-
SFB= 445 plusmn 143) (Figura 47B) e LAMP2 (ML-SFB= 526 plusmn 177) (Figura 47C) nas
ceacutelulas infectadas com M leprae durante a privaccedilatildeo de SFB Apesar da variacircncia e do
baixo nuacutemero de replicatas experimentais pode-se confirmar a induccedilatildeo de autofagia
Entretanto o estiacutemulo com IFNβ parece modular negativamente a induccedilatildeo dos
transcritos associados agrave via de autofagia na infecccedilatildeo por M leprae nos macroacutefagos na
presenccedila de SFB Tambeacutem observamos o aumento significativo da expressatildeo gecircnica de
OASL (ML+SFB+IFNβ= 1211 plusmn 283) (2-5 oligoadenilato sintetase-like) no
tratamento com IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae na presenccedila de SFB quando comparado
ao controle natildeo infectado (Figura 47D) Em conjunto os dados sugerem a participaccedilatildeo
do IFNβ na modulaccedilatildeo negativa da expressatildeo dos genes autofaacutegicos de macroacutefagos
infectados pelo M leprae
50
A B
C D
Figura 47 IFNβ modula a autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 pelo M leprae Valores de expressatildeo gecircnica normalizados (deltadeltaCt)
de (A) ATG5 (B) MAP1LC3B(C) LAMP2 e (D) OASL em ceacutelulas THP-1 infectadas com M
leprae (MOI 51) seguido do estiacutemulo com IFNβ (10 ngmL) 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo no
tempo total de 24 horas Os resultados representam a meacutedia plusmn desvio padratildeo de 2 experimentos
independentes com exceccedilatildeo do gene OASL (n=3) A significacircncia estatiacutestica foi calculada pelo
teste de Kruskal-Wallis com poacutes-teste Dunn ( plt005)
0
5
10
15
20
ATG5 mRNA
IFN
M leprae
-
-
-
+
+
+
-
+
+
+
+ SFB
- SFB
Exp
ress
atildeo r
ela
tiva
0
2
4
6
MAP1LC3B mRNA
IFN
M leprae
-
- +
+- - +
+ + +
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
5
10
15
OASL mRNA
IFN
M leprae
-
-
- -
+
+
+
+
++
+ SFB
- SFB
Expre
ssatilde
o r
ela
tiva
0
2
4
6
8
LAMP2 mRNA
IFN
M leprae
-
- +
- -+ +
+ + +
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
51
48 Secreccedilatildeo de citocinas por macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB na ausecircncia
ou presenccedila de IFNβ na infecccedilatildeo por M leprae
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante privaccedilatildeo de soro apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo
aumentada de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto O
grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF (Ma et al
2017) Nossos dados demonstram que parece ocorrer a reduccedilatildeo de IL-1β (ML-SFB=
1142plusmn2162 versus ML+SFB= 3023plusmn1310) (Figura 48A) e TNF (ML-SFB=
9753plusmn3067 versus ML+SFB= 1222plusmn6614)(Figura 48B) na privaccedilatildeo de SFB em
macroacutefagos infectados com M leprae comparados agrave condiccedilatildeo com SFB Entretanto a
citocina antiinflamatoacuteria IL-10 (ML-SFB= 1343plusmn4309 versus ML+SFB=
9724plusmn2011) (Figura 48C) parece aumentar na retirada de SFB comparada a infecccedilatildeo
na presenccedila de SFB Curiosamente houve o aumento significativo de IL-1β durante a
infecccedilatildeo pelo M leprae no tratamento com IFNβ comparada agrave ceacutelula natildeo infectada
(ML+IFNβ+SFB= 3196plusmn1339 versus NI= 3215plusmn1509)
52
A B
C
Figura 48 A privaccedilatildeo de SFB parece aumentar a secreccedilatildeo de IL-10 em macroacutefagos THP-
1 estimulados com o M leprae mas natildeo a de IL-1β e TNF Detecccedilatildeo de (A) IL-1β (B) TNF
e (C) IL-10 em sobrenadantes de ceacutelulas THP-1 infectadas com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia de SFB tratadas com IFNβ por 24 horas Dados representados como meacutedia (plusmn DP) de 3
experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada por ANOVA Kruskal-Wallis
seguida do poacutes-teste de Dunn ( plt005)
49 A induccedilatildeo da expressatildeo de parkina na privaccedilatildeo de soro natildeo eacute suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos infectados com M leprae
Como jaacute foi descrito que a atividade de parkina uma ubiquitina ligase E3 eacute
essencial para o direcionamento de micobacteacuterias para a degradaccedilatildeo por autofagia no
modelo de tuberculose (Manzanillo et al 2013) decidimos avaliar a induccedilatildeo do gene
0
1000
2000
3000
4000
5000
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+
+
+
-
+ +
+
Plt 006
IL-1
(
pg
mL
)
0
100
200
300
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
-
-
+ +
-
+ +
+ +
TN
F (
pg
mL
)
0
50
100
150
200
IFN
M leprae
+ SFB
- SFB
-
- +
- +
+ + +
- +
IL-1
0 (
pg
mL
)
53
PARK2 na presenccedila de indutores de autofagia Foi observado um aumento significativo
na expressatildeo de mRNA de parkina na ausecircncia de SFB comparado agraves ceacutelulas tratadas
com rapamicina (sem SFB 456plusmn354 versus rapamicina 055plusmn023) (Figura 49A)
mostrando que a induccedilatildeo desse gene eacute mediada pela privaccedilatildeo de SFB
Em seguida fomos avaliar a expressatildeo de parkina em condiccedilotildees de induccedilatildeo de
autofagia na privaccedilatildeo de SFB durante a infecccedilatildeo com M leprae na presenccedila ou
ausecircncia do IFNβ Nossos dados mostram um aumento significativo da expressatildeo de
PARK2 na ausecircncia de SFB e curiosamente o tratamento com IFNβ parece reverter a
induccedilatildeo dos transcritos de PARK2 na infecccedilatildeo por M leprae (Figura 49B)
A B
Figura 491A privaccedilatildeo de soro induz aumento da expressatildeo de parkina (A) Valores
normalizados (deltadeltaCt) de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas THP-1 tratadas sem soro
fetal bovino (SFB) e com 02microgmL de rapamicina (inibidor da atividade de mTOR) durante
24h (B) Valores normalizados de expressatildeo gecircnica de PARK2 em ceacutelulas infectadas com M
leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados
representam a meacutedia plusmn DP de 3 experimentos independentes e significacircncia estatiacutestica calculada
por ANOVA Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
Posteriormente fomos avaliar a viabilidade intracelular da bacteacuteria nas mesmas
condiccedilotildees Observou-se que o tratamento com IFNβ aumentou de maneira significativa
a sobrevivecircncia intracelular do M leprae entretanto a induccedilatildeo dos transcritos de
parkina durante a privaccedilatildeo de SFB apoacutes 24h de infecccedilatildeo natildeo foi suficiente para
aumentar a capacidade microbicida em macroacutefagos THP-1 (Figura 492) Em conjunto
PARK2 mRNA
0
1
2
3
4
5
IFN
M leprae
-
-
-
+
+ +
+ +
-
+
+ SFB
- SFB
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
PARK2 mRNA
Contr
ole
Sem
SFB
Rap
amic
ina
0
2
4
6
8
Exp
ressatildeo r
ela
tiva
54
nossos dados mostram que o tratamento com IFNβ recombinante favorece a viabilidade
do bacilo em macroacutefagos na ausecircncia de SFB
Figura 492 IFNβ favorece a viabilidade do bacilo em macroacutefagos THP-1 Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ Os dados mostrados representam a meacutedia (plusmn DS) de 4
experimentos bioloacutegicos independentes e a significacircncia estatiacutestica foi calculada por ANOVA
Kruskal-Wallis seguida pelo poacutes-teste de Dunn ( plt005)
410 A ativaccedilatildeo de parkina natildeo eacute alterada na infecccedilatildeo por M leprae em
macroacutefagos THP-1 independente da retirada de SFB
Como o modelo de induccedilatildeo de autofagia proposto em nosso estudo natildeo foi capaz
de alterar a viabilidade do M leprae embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes
autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina decidimos avaliar a ativaccedilatildeo da ubiquitina ligase
parkina atraveacutes do seu grau de fosforilaccedilatildeo Para tal macroacutefagos foram infectados com
M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB por 24 horas e foi realizado o western
blotting para verificar a ativaccedilatildeo por meio da fosforilaccedilatildeo de parkina Nessas condiccedilotildees
observamos o aumento da parkina fosforilada na presenccedila ou ausecircncia de SFB
comparado a ceacutelula natildeo infectada No entanto se compararmos a abundacircncia dessa
proteiacutena nos macroacutefagos durante a privaccedilatildeo de SFB (098 plusmn 011) natildeo observamos
diferenccedila na abundacircncia de parkina fosforilada comparando agraves ceacutelulas infectadas com
M leprae na presenccedila de SFB (092 plusmn 011) Esses dados podem explicar o motivo pelo
0
2
4
6
8
-IFN -+ +
+ SFB
- SFBV
iab
ilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
55
qual natildeo foi observado diferenccedila na viabilidade do bacilo uma vez que natildeo vimos
diferenccedila na ativaccedilatildeo de parkina (Figura 410)
A B
Figura 4101 A atividade de parkinafosforilada natildeo eacute alterada na presenccedila ou ausecircncia
de soro em macroacutefagos THP-1 infecados com M leprae Macroacutefagos THP-1 foram
diferenciados por 24 horas na presenccedila de 200 nM de PMA o meio foi trocado e apoacutes 24h o
SFB foi retirado da cultura em seguida foram estimulados com M leprae 101 (A) A expressatildeo
de parkina fosforilada foi avaliada por Western blotting utilizando anticorpo anti-pPARK (B) O
resultado representa a anaacutelise densitomeacutetrica de dois experimentos NI natildeo infectado
Como proacutexima etapa fomos avaliar a sobrevivecircncia do bacilo em condiccedilotildees de
induccedilatildeo de autofagia pela privaccedilatildeo de SFB utilizando uma multiplicidade de infecccedilatildeo
(MOI) de 101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) na presenccedila ou ausecircncia do IFNβ Para isso
macroacutefagos foram infectados com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB seguido
ou natildeo do tratamento com IFNβ recombinante 30 minutos apoacutes a infecccedilatildeo Utilizando a
MOI de 501 foi possiacutevel observar o aumento da viabilidade do M leprae na presenccedila
de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso este efeito
eacute beneficiado pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
Sendo assim havendo muitos bacilos por ceacutelula o M leprae parece ser capaz de
subverter de modo eficaz a atividade autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN
NI
ML +
SFB
ML -
SFB
00
05
10
15
pP
AR
KIN
AG
AP
DH
(un
idad
e a
rbit
raacuteri
a )
56
Figura 4102 A autofagia induzida pela privaccedilatildeo de soro diminui a viabilidade do M
leprae mas o tratamento com IFNβ eacute capaz de reverter esse mecanismo Estimativa da
viabilidade intracelular do M leprae obtida pela razatildeo da expressatildeo de 16S RNA normalizada
pela detecccedilatildeo 16S DNA nas ceacutelulas infectadas com M leprae na presenccedila ou ausecircncia de SFB
seguido do estiacutemulo com IFNβ (10ngmL) O dado representa um uacutenico experimento bioloacutegico
101
501
0
2
4
6
8
10+ SFB
+ SFB + IFN
- SFB
- SFB + IFN
Via
bilid
ad
eM
le
pra
e
16S
RN
A
16S
DN
A
(Fo
ld c
han
ge)
57
5 DISCUSSAtildeO
Os mecanismos moleculares que regulam a ativaccedilatildeo da autofagia apoacutes a infecccedilatildeo
bacteriana parecem ser influenciados por inuacutemeros fatores tais como a virulecircncia
bacteriana a carga e o tempo de infecccedilatildeo o traacutefego dentro da ceacutelula hospedeira bem
como o microambiente onde a interaccedilatildeo entre bacteacuteria e ceacutelula se encontra (Zullo amp
Lee 2012 Huang amp Brumell 2014 Shibutani amp Yoshimori 2014) O presente trabalho
buscou avaliar o envolvimento da via de IFN tipo I (especificamente do IFNβ) na
regulaccedilatildeo da autofagia na infecccedilatildeo por micobacteacuterias
Em nosso estudo a anaacutelise da expressatildeo de LC3 durante a infecccedilatildeo de
macroacutefagos THP-1 por uma micobacteacuteria natildeo-patogecircnica apontaram o aumento no
nuacutemero de autofagossomos maduros o que estaacute diretamente relacionado com a ativaccedilatildeo
do mecanismo celular autofaacutegico Esse aumento da autofagia tambeacutem descrito como
xenofagia estaacute associado ao controle da replicaccedilatildeo intracelular bacteriana dado que a
inibiccedilatildeo farmacoloacutegica da autofagia com a droga 3-MA foi associada ao aumento da
contagem de bacilos no meio intracelular Na literatura o tratamento de ceacutelulas RAW
2647 com preparaccedilotildees lipiacutedicas totais de Ms ou BCG foram capazes de induzir niacuteveis
semelhantes de resposta autofaacutegica (Zullo amp Lee 2012)
Estudos recentes apontaram que o TLR2 participa da ativaccedilatildeo da autofagia na
infecccedilatildeo com Ms em macroacutefagos THP-1 o grupo observou diminuiccedilatildeo na expressatildeo
proteica de LC3-II quando o receptor TLR2 foi bloqueado bem como a reduccedilatildeo da
colocalizaccedilatildeo de LC3 com Ms ΔpmmB (mutante deficiente para lipoglicano) (Bah et al
2016) Neste mesmo trabalho foi demonstrado a induccedilatildeo de vaacuterios genes (Atg5 LC3B
hVps34 UVRAG e STX17) envolvidos na via autofaacutegica (Bah et al 2016)
Corroborando com os dados da literatura nosso trabalho comprova que a infecccedilatildeo por
Ms induz a regulaccedilatildeo positiva de genes associados agrave via autofaacutegica (Atg5 MAP1LC3B
LAMP2 e BECLIN1) Embora natildeo tenhamos observado diferenccedilas significativas em
alguns dos marcadores estudados os dados parciais levam a crer que estaacute ocorrendo o
aumento dos niacuteveis de RNAm desses genes e a significacircncia estatiacutestica seraacute atingida
com o aumento do nuacutemero de replicatas experimentais Portanto o conjunto de dados
gerados com Ms indicam que a via de autofagia eacute ativada na infecccedilatildeo pelo Ms
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
O M tuberculosis e o M leprae satildeo micobacteacuteras patogecircnicas que sabidamente
possuem a capacidade de modular os mecanismos antimicrobianos das ceacutelulas
58
hospedeiras sobrevivendo e replicando no interior destas ceacutelulas Ambas micobacteacuterias
induzem a produccedilatildeo de IFN tipo I durante a infecccedilatildeo de macroacutefagos de forma
dependente de CDS (via sensor citoplasmaacutetico de DNA) e do eixo de sinalizaccedilatildeo
STINGTBK1IRF3 onde se observou que o IFN tipo I apresenta a capacidade de
promover a infecccedilatildeo (Manzanillo et al 2012 Telles et al 2013 Dorhoi et al 2014)
Entretanto o conhecimento sobre o papel do IFN tipo I em infecccedilotildees por micobacteacuterias
natildeo-tuberculosas ainda eacute limitado Desse modo a proposta do nosso trabalho consistiu
em investigar se o tratamento com IFNβ recombinante na infecccedilatildeo por Ms seria capaz
de favorecer sua sobrevivecircncia Nesse contexto o presente estudo eacute o primeiro a sugerir
que o IFNβ possui papel proacute-micobacteacuteria na infecccedilatildeo por Ms uma vez que observamos
o aumento significativo na contagem de bacilos apoacutes 24h de infecccedilatildeo Por outro lado a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por Ms ajuda a reduzir o nuacutemero
de bacteacuterias
Um estudo atual mostrou que macroacutefagos murinos infectados com Ms e M
avium ssp paratuberculosis (MAP) foram capazes de induzir IFNβ via ativaccedilatildeo de
cGAS-STING-TBK1-IRF37 sem o envolvimento do sistema de secreccedilatildeo ESX-1
(Ruangkiattikul et al 2017) Associado a isso jaacute foi demonstrado que o Mtb tambeacutem eacute
capaz de ativar a expressatildeo de IFNβ ao liberar o DNA extracelular no citosol de ceacutelulas
hospedeiras de modo dependente do sistema ESX-1 Aleacutem disso muitos estudos
mostram queo sistema de secreccedilatildeo ESX-1 do Ms natildeo apresenta a capacidade de
permeabilizar ou danificar a membrana do fagossomo (De Leon et al 2012 Houben et
al 2012) o que corrobora com nossos achados uma vez que o Ms apoacutes 24 horas de
infecccedilatildeo parece regular negativamente a expressatildeo de genes associados a via de IFN
tipo I (IFNβ e OASL) Ao contraacuterio do que observamos macroacutefagos RAW 2647 e
BMDM infectados com Ms induziram niacuteveis elevados de IFNβ apoacutes 5 horas de infecccedilatildeo
(Ruangkiattikul et al 2017) Acreditamos que a diferenccedila no tempo de infecccedilatildeo bem
como o modelo utilizado no estudo possa influenciar de modo consideraacutevel nas
diferenccedilas observadas referente agrave expressatildeo do IFNβ
Como seguimento decidimos avaliar a induccedilatildeo de genes relacionados a via
autofaacutegica em macroacutefagos THP-1 na infecccedilatildeo pelo M leprae na tentativa de aprofundar
o entendimento dos mecanismos que levam a permissividade induzida pela infecccedilatildeo e
mediada por IFN tipo I Jaacute se sabe que o M leprae apresenta a capacidade de induzir a
via de IFN do tipo I (de Toledo-Pinto et al 2016) poreacutem natildeo eacute capaz de ativar de
modo importante os mecanismos autofaacutegicos durante a infecccedilatildeo (Silva et al 2017)
59
Nossos dados sugerem que os genes que codificantes para MAP1LC3B e BECLIN1 natildeo
estatildeo sendo regulados positivamente na infecccedilatildeo por M leprae Entretanto apesar de
natildeo significativa observamos que a expressatildeo do gene ATG5 estaacute aparentemente
aumentada Visto que o Atg5 integra um complexo que participa do processo de
expansatildeo da membrana do autofagossomo e soacute o faz quando associado aos outros
integrantes do complexo fica claro a importacircncia de observar o efeito bioloacutegico de
todos os genes avaliados e natildeo apenas nos atermos para a transcriccedilatildeo de um uacutenico gene
neste caso o Atg5 Para que a etapa de alongamento e fechamento da vesiacutecula ocorra eacute
necessaacuterio o recrutamento de dois sistemas de conjugaccedilatildeo Atg5-Atg12-Atg16 e LC3-
PE (fosfatidiletanolamina)
As diferenccedilas observadas na induccedilatildeo dos genes autofaacutegicos entre as duas
espeacutecies micobacterianas podem refletir uma seacuterie de fatores incluindo as diferenccedilas de
infecciosidade a concentraccedilatildeo de macromoleacuteculas ativadoras e a atividade de
mecanismos de inibiccedilatildeo Nossa hipoacutetese para explicar a magnitude diferencial na
ativaccedilatildeo dos genes autofaacutegicos por Ms e M leprae estaacute relacionada a capacidade que a
bacteacuteria tem de induzir IFN tipo I Optamos em nosso estudo por uma baixa taxa de
infecccedilatildeo (5 bacteacuteriasceacutelula) que talvez favoreccedila o direcionamento da via cGAS-
STING-TBK1 para o eixo que induzativa a autofagia Um trabalho recente do nosso
grupo mostrou que a infecccedilatildeo por M leprae eacute capaz de induzir a liberaccedilatildeo de IFNβ via
STING-TBK1-IRF3 em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de 501
(bacteacuteriasceacutelulas) Uma vez que utilizamos um nuacutemero reduzido de bacteacuterias (5
bacteacuteriaspor ceacutelula) acredita-se que a ceacutelula seja capaz de realizar o clearance das
bacteacuterias fagocitadas
Classicamente a autofagia eacute descrita como um mecanismo de reuso celular
conservado de forma evolutiva que ocorre em um niacutevel basal em todas as ceacutelulas Pode
ser induzido ainda por vaacuterios estiacutemulos incluindo privaccedilatildeo de nutrientes hipoxia e
tratamento com citocinas tais como IFNγ e TGFβ (Duttaet al 2012) Desse modo
propomos um modelo de induccedilatildeo de autofagia pela retirada de SFB na infecccedilatildeo pelo M
leprae com a finalidade de termos maior controle do processo para avaliar os
mecanismos de regulaccedilatildeo que levam a permissividade da infecccedilatildeo mediada por IFN tipo
I
Adicionalmente apesar de ser um uacutenico experimento o M leprae vivo parece
conter a induccedilatildeo dos niacuteveis de LC3 no nosso modelo este achado corrobora com dados
do nosso grupo em que o M leprae vivo mas natildeo o morto foi capaz de inibir a
60
formaccedilatildeo de autofagossomos em monoacutecitos primaacuterios humanos (Silva et al 2017) Em
adiccedilatildeo outro estudo tambeacutem mostrou uma resistecircncia seletiva agrave etapa de maturaccedilatildeo da
autofagia em autofagossomos que continham uma cepa virulenta de M tuberculosis
(Chandra et al 2015) reforccedilando nossos achados
A ativaccedilatildeo do eixo STINGTBK1 mediado pela infecccedilatildeo por M tuberculosis
requer o reconhecimento do DNA micobacteriano pela enzima cGAS a qual sintetiza o
mensageiro secundaacuterio cGAMP um potente agonista de STING levando a produccedilatildeo de
IFNβ eou ativaccedilatildeo de autofagia da ceacutelula hospedeira (Wassermann et al 2015 Watson
et al 2015 Collins et al 2015) A regulaccedilatildeo da produccedilatildeo de IFNs do tipo I parece
influenciar as funccedilotildees da via de autofagia embora os mecanismos natildeo estejam ainda
elucidados Nesse contexto as evidecircncias apresentadas no trabalho demonstram que o
tratamento com IFNβ parece modular negativamente a autofagia (MAP1LC3B LAMP2
ATG5) induzida pela privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo pelo M leprae Eacute provaacutevel que essa
modulaccedilatildeo possa ser mediada pela ativaccedilatildeo do gene OASL (ISG) uma vez que a induccedilatildeo
desse gene favorece a sobrevivecircncia intracelular do M leprae atraveacutes da modulaccedilatildeo
negativa da autofagia (de Toledo-Pinto et al 2016) De fato observamos o aumento
significativo na expressatildeo do gene OASL quando infectamos os macroacutefagos THP-1 com
M leprae e em seguida tratamos essas ceacutelulas com IFNβ
Um estudo recente mostrou que macroacutefagos infectados com M leprae vivo
durante starvation apresentam niacuteveis reduzidos de IL-1β e TNF e secreccedilatildeo aumentada
de IL-10 comparado aos macroacutefagos estimulados com M leprae morto (Ma et al
2017) O grupo observou uma relaccedilatildeo inversa entre autofagia e niacuteveis de citocinas proacute-
inflamatoacuterias na infecccedilatildeo pelo M leprae vivo incluindo IL-1β IL-6 IL-12 e TNF-α
Adicionalmente observamos em nosso estudo a reduccedilatildeo de IL-1β e TNF na induccedilatildeo de
autofagia pela privaccedilatildeo de SFB jaacute a citocina antiinflamatoacuteria IL-10 parece estar
aumentada Uma relaccedilatildeo direta entre autofagia e inflamaccedilatildeo foi demonstrada por
Kleinnijenhuis e colaboradores (2011) onde se observou que o bloqueio da autofagia
em monoacutecitos derivados de voluntaacuterios saudaacuteveis estimulados com M tuberculosis
leva agrave reduccedilatildeo dos niacuteveis de TNF com aumento de IL-1β Por outro lado a induccedilatildeo de
autofagia por privaccedilatildeo de nutrientes (modelo escolhido para o nosso estudo) ou IFNγ
teve o efeito contraacuterio corroborando com nossos dados de reduccedilatildeo de IL-1β Outros
estudos identificaram que o bloqueio da via autofaacutegica leva ao aumento de IL-1β por
um mecanismo que leva agrave ativaccedilatildeo do inflamassoma NLRP3 mediada por espeacutecies
reativas do oxigecircnio produzidas por mitococircndrias danificadas (Nakahira et al 2011)
61
De fato a via autofaacutegica eacute a responsaacutevel por controlar a produccedilatildeo de IL-1β em
macroacutefagos seja pelo direcionamento da proacute-IL-1β ou de inflamassomas ubiquitinados
para degradaccedilatildeo autolisossomal (Shi et al 2012) ou via secreccedilatildeo natildeo convencional de
IL-1β mediada pela autofagia (Jiang et al 2013)
Nos uacuteltimos anos o mecanismo antimicrobiano dependente de autofagia tem
sido descrito como determinante no controle de infecccedilotildees causadas por patoacutegenos
intracelulares Trabalhos recentes no modelo de M tuberculosis descreveram a
participaccedilatildeo de duas ubiquitinas-ligase (parkina e Smurf) no processo de autofagia
bacteriana mostrando seu papel na marcaccedilatildeo seletiva da micobacteacuteria para degradaccedilatildeo
autofagolissosomal (Manzanillo et al 2013 Franco et al 2017) Franco e
colaboradores observaram que mesmo tratando macroacutefagos derivados da medula oacutessea
(BMDMs) de animais Smurf--
com um indutor de autofagia (Tat-beclina1) um peptiacutedeo
derivado de uma sequecircncia curta da proteiacutena autofaacutegica Beclina 1 estes macroacutefagos natildeo
eram capazes de reduzir o crescimento de M tuberculosis (Franco et al 2017)
Em hanseniacutease estudos geneacuteticos tecircm evidenciado que polimorfismos em
diversos genes relacionadosagrave imunidade inata em especial os encontrados na regiatildeo
reguladora de parkina (PARK2) tambeacutem estatildeo associados com o aumento da
susceptibilidade do hospedeiro agrave hanseniacutease (Mira et al 2004) PARK2 pode ser
induzida na privaccedilatildeo de soro e na ausecircncia total de nutrientes em ceacutelulas de
neuroblastoma humanas SH-SY5Y (Klinkenberg et al 2012) De maneira semelhante
ocorreu um aumento na expressatildeo de mRNA de Parkina em macroacutefagos THP1 quando
retiramos o SFB da cultura quando comparado as ceacutelulas natildeo tratadas ou tratadas com a
droga farmacoloacutegica rapamicina (indutor de autofagia) A via autofaacutegica pode ser
induzida pelo tratamento com rapamicina ou pela privaccedilatildeo de nutrientes ambos
apresentam a capacidade de induzir o processo autofaacutegico por inibir mTOR (um
regulador central do crescimento da ceacutelula que integra fatores de crescimento e sinais de
nutrientes) (Kim et al 2011) por esse motivo esperavamos que a expressatildeo de PARK2
fosse similar nas duas condiccedilotildees No entanto sabe-se que a autofagia tambeacutem pode
ocorrer por vias natildeo canocircnicas independentemente de mTOR (Zullo amp Lee 2012) e das
proteiacutenas Atg (Nishida et al 2009 Tsuboyama et al 2016) Desse modo nos
perguntamos se a induccedilatildeo de parkina poderia ser mediada por um mecanismo
independente de mTOR essa hipoacutetese eacute vaacutelida e seratildeo necessaacuterios experimentos
adicionais para determinar se o aumento da sinalizaccedilatildeo de parkina eacute dependente de
mTOR
62
Em seguida fomos avaliar os niacuteveis de parkina na infecccedilatildeo por M leprae na
presenccedila ou ausecircncia do IFNβ nossos dados mostram o aumento significativo dos
transcritos de PARK2 na privaccedilatildeo de SFB na infecccedilatildeo por M leprae Curiosamente a
autofagia induzida pela privaccedilatildeo de SFB parece natildeo afetar a viabilidade do bacilo
embora tenha aumentado a expressatildeo dos genes autofaacutegicos e a expressatildeo de parkina
Em princiacutepio esperaacutevamos utilizando a MOI de 51 um efeito microbicida expressivo
mediado pela induccedilatildeo de autofagia dado que trabalhos anteriores mostraram esse efeito
utilizando diferentes espeacutecies de micobacteacuterias com uma multiplicidade de infecccedilatildeo
similiar (5 e 10 bacteacuteriasceacutelula) a escolhida para nosso estudo (Zullo e Le et al 2012
Bah et al 2016) De fato Gutierrez e colaboradores observaram que a autofagia
induzida por starvation em ceacutelulas RAW 2647 foi capaz de diminuir o crescimento da
micobacteacuteria virulenta H37Rv e que esse efeito foi restabelecido na presenccedila do
inibidor 3-MA (Gutierrez et al 2004) Algumas diferenccedilas devem ser levadas em
consideraccedilatildeo dentre elas o modelo utilizado pelo grupo a cepa H37Rv (Mtb) bem
como o meacutetodo utilizado para induzir autofagia Eacute possiacutevel que a baixa carga de
infecccedilatildeo utilizada natildeo seja capaz de atingir o limiar de produccedilatildeo de IFNβ necessaacuterio
para favorecer a sobrevivecircncia do bacilo Sendo assim havendo poucos bacilos por
ceacutelula o M leprae parece natildeo ser capaz de subverter de modo eficaz a atividade
autofaacutegica do macroacutefago mediada por IFN Esse limiar pode ainda explicar o motivo
pelo qual natildeo foi observada diferenccedila na proporccedilatildeo de bacteacuterias viaacuteveis em condiccedilotildees
artificiais de autofagia comparada agrave condiccedilatildeo normal Para testar essa hipoacutetese
decidimos avaliar a viabilidade do bacilo em uma multiplicidade de infecccedilatildeo (MOI) de
101 e 501 (bacteacuteriasceacutelulas) Nestas condiccedilotildees foi possiacutevel observar o aumento na
viabilidade do bacilo na presenccedila de SFB comparado agrave induccedilatildeo de autofagia por
privaccedilatildeo de SFB na MOI 501 isso indica que o IFNβ quando produzido em
quantidades suficientes contribui para a sobrevivecircncia do bacilo ao passo que quando
a autofagia eacute induzida a resposta microbicida do macroacutefago eacute melhorada Poreacutem este
efeito eacute revertido pelo tratamento com IFNβ recombinante apoacutes 24 horas de infecccedilatildeo
No presente estudo natildeo observamos diferenccedila no grau de fosforilaccedilatildeo ou seja na
atividade de ubiquitina ligase na presenccedila ou ausecircncia de SFB durante a infecccedilatildeo por M
leprae este dado poderia nos ajudar a entender o motivo pelo qual natildeo vimos diferenccedila
na viabilidade do bacilo uma vez que esta proteiacutena poderia auxiliar no direcionamento
do bacilo para a degradaccedilatildeo lisossomal mediada pela autofagia dependente de
ubiquitina Ainda nesse contexto demonstramos que o tratamento com IFNβ aumenta
63
significativamente a viabilidade intracelular da bacteacuteria Desse modo fica claro que o
niacutevel de expressatildeo de IFN tipo I seja decisivo para promover a infecccedilatildeo
Em siacutentese nosso estudo demonstrou o real envolvimento do IFNβ na
viabilidade do bacilo assim como estabeleceu seu papel na modulaccedilatildeo da autofagia
induzida pela privaccedilatildeo de SFB Aleacutem disso nossos resultados demonstraram que Ms
prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I da ceacutelula hospedeira Tambeacutem mostramos que
o aumento da citocina IL-1β na infecccedilatildeo pelo M leprae com o estiacutemulo de IFNβ
recombinante natildeo foi capaz de conter o crescimento do bacilo Nossos dados sugerem
um papel precoce do IFNβ na modulaccedilatildeo da autofagia no desfecho da infecccedilatildeo por M
leprae definindo o balanccedilo fino entre resistecircncia mediada pela ativaccedilatildeo de autofagia e
susceptibilidade mediada pela ativaccedilatildeo de IFN tipo I As evidecircncias da participaccedilatildeo da
via de IFN tipo I na modulaccedilatildeo da autofagia fazem dessa via um potencial alvo para
estrateacutegias de interferecircncia no controle da hanseniacutease
51 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O presente estudo demonstrou que no caso do M leprae o IFN tipo I interfere
na induccedilatildeo de autofagia e na formaccedilatildeo do complexo autofaacutegico contribuindo para a
sobrevivecircncia do bacilo dentro da ceacutelula hospedeira Observamos que o tratamento
exoacutegeno com IFNβ na infecccedilatildeo com Ms estaacute envolvido no favorecimento de sua
persistecircncia na ceacutelula hospedeira Entretanto o mecanismo parece ser regulado
especificamente dado que a carga bacilar na infecccedilatildeo por M leprae foi capaz de regular
o balanccedilo fino entre proteccedilatildeo (induccedilatildeo de autofagia) e patogecircnese (ativaccedilatildeo de IFN-β)
favorecendo o processo autofaacutegico microbicida quando utilizada uma baixa taxa de
infecccedilatildeo Em conjunto esses dados contribuem para uma maior compreensatildeo dos
mecanismos de controle micobacteriano associados a infecccedilotildees por micobacteacuterias com
implicaccedilotildees promissoras no desenvolvimento de alternativas de tratamento eou
estrateacutegias na prevenccedilatildeo da hanseniacutease
64
Figura 5 Modelo esquemaacutetico dos possiacuteveis desfechos na infecccedilatildeo por M leprae e M
smegmatis baseado nos resultados abordados nesse estudo Uma vez no interior do
macroacutefago o M leprae eacute capaz de induzir o aumento de IFN-β de maneira dependente da
ativaccedilatildeo de STING que parece modular negativamente a ativaccedilatildeo de parkina uma ubiquitina-
ligase importante para o fenoacutetipo de resistecircncia agrave infecccedilatildeo bem como dos genes associados agrave
via autofaacutegica (MAP1LC3B BECLIN1 ATG5) e a via lisossomal (LAMP2) Dessa forma
demonstramos que a via de IFN tipo I por meio da induccedilatildeo de OASL parece reduzir agrave ativaccedilatildeo
de autofagia Em contraste a infecccedilatildeo por M smegmatis promove a autofagia natildeo soacute por regular
positivamente alguns genes envolvidos na via autofaacutegica mas tambeacutem por aumentar LC3
funcionando como um mecanismo de contenccedilatildeo da infecccedilatildeo em macroacutefagos THP-1
65
6 CONCLUSOtildeES
A infecccedilatildeo por M smegmatis modula positivamente a induccedilatildeo de autofagia nos
macroacutefagos
M smegmatis prejudica a induccedilatildeo da via de IFN tipo I na ceacutelula hospedeira que
pode favorecer a ativaccedilatildeo autofaacutegica
M leprae eacute um fraco indutor da expressatildeo de genes autofaacutegicos na
multiplicidade de infeccedilatildeo utilizada indicando que a autofagia eacute diferencialmente
regulada por uma micobacteacuteria avirulenta e virulenta
No modelo de induccedilatildeo de autofagia atraveacutes da privaccedilatildeo de soro o tratamento
com IFNβ parece reverter a induccedilatildeo de genes associados agrave autofagia bem como o gene
que codifica para a ubiquitina-ligase parkina
O tratamento com INFβ recombinante aumenta a expressatildeo de OASL e a
sobrevivecircncia do M leprae
A atividade de parkina natildeo eacute alterada durante a privaccedilatildeo de soro na infecccedilatildeo por
M leprae
66
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immunity to intracellular pathogens Cell Host Microbe 2008 Nov 134(5)458-
69
Zullo AJ Lee S Mycobacterial induction of autophagy varies by species and occurs
independently of mammalian target of rapamycin inhibition J Biol Chem 2012
Apr 13287(16)12668-78
80
8 ANEXO
Siacutembolo Nome
AKTIS1 AKT1 substrate 1 (proline-rich)
AMBRA1 Autophagybeclin-1 regulator 1
APOL1 Apolipoprotein L 1
ATF4 Activating transcription factor 4
ATG1O ATG1O autophagy related 10 homolog (S cerevisiae)
ATG12 ATG12 autophagy related 12 homolog (S cerevisiae)
ATG16L1 ATG16 autophagy related 16-like 1 (S cerevisiae)
ATG16L2 ATG16 autophagy related 16-like 2 (S cerevisiae)
ATG2A ATG2 autophagy related 2 homolog A (S cerevisiae)
ATG2B ATG2 autophagy related 2 homolog B (S cerevisiae)
ATG3 ATG3 autophagy related 3 homolog (S cerevisiae)
ATG4A ATG4 autophagy related 4 homolog A (S cerevisiae)
ATG4B ATG4 autophagy related 4 homolog B (S cerevisiae)
ATG4C ATG4 autophagy related 4 homolog C (S cerevisiae)
ATG4D ATG4 autophagy related 4 homolog D (S cerevisiae)
ATG5 ATG5 autophagy related 5 homolog (S cerevisiae)
ATG7 ATG7 autophagy related 7 homolog (S cerevisiae)
ATG9A ATG9 autophagy related 9 homolog A (S cerevisiae)
BARKOR BARKOR (KIAA0831)
BAX BCL2-associated X protein
BCL2 B-cell CLLlymphoma 2
BCL2L1 BCL2-like 1
BECLIN1 Beclin1
BECN1L1 Becn1L1
BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1
BN1P3 BCL2adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3
DDIT3 DNA-damage-inducible transcript 3
DRAM Damage-regulated autophagy modulator
EIF4EBP1 Eukarvotic translation initiation factor 4E binding protein 1
EIF4EBP2 Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2
EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1
EPS15L1 Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like1
FKBP15 FK506 binding protein 15 133kDa
FRAP1 FK506 binding protein 12-rapamvcin associated protein 1
FRS2 Fibroblast growth factor receptor substrate 2
FRS3 Fibroblast growth factor receptor substrate 3
GABARAP GABA( A) receptor-associated protein
GABARAPL1 GABA(A) receptor-associated protein like 1
GABARAPL2 GABA(A) receptor-associated protein-like 2
GBL G protein beta subunit-like
GFI1B Growth factor independent 1B transcription repressor
GNAI3 Guanine nucleotide binding protein (G protein) alpha inhibiting activity polypeptide 3
GPSM1 G-protein signaling modulator 1 (AGS3-like C elegans)
GPSM2 G-protein signaling modulator 2 (AGS3-like C elegans)
GPSM3 G-protein signaling modulator 3 (AGS3-Iike C elegans)
81
HIF1A Hypoxia inducible factor 1 alpha
HSPA5 Heat shock 70kDa protein 5
LAMP1 Lysosomal-associated membrane protein 1
LAMP2 Lysosomal-associated membrane protein 2
LAMP3 Lysosomal-associated membrane protein 3
LETM1 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1
LETM2 Leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 2
MAP1LC3A Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha
MAP1LC3B Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta
MAP1LC3B2 Microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta 2
MAP1LC3C Microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma
MCL1 Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)
PIK3C3 Phosphoinositide-3-kinase class 3
PIK3R4 Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 4
PPM1K Protein phosphatase 1K (PP2C domain containing)
RAPTOR Raptor
RASD1 RAS dexamethasone-induced 1
RB1CC1 RB 1-inducible coiled-coil 1
RGS19 Regulator of G-protein signaling 19
RICTOR Rapamycin-insensitive companion of Mtor
SEC16A SEC16 homolog A (S cerevisiae)
SEC16B SEC16 homolog B (S cerevisiae)
SEC23A SEC23 homolog A (S cerevisiae)
SEC23B SEC23 homolog B (S cerevisiae)
SEC24A SEC24 related gene fumily member A (S cerevisiae)
SEC24B SEC24 related gene family member B (S cerevisiae)
SEC24C SEC24 related gene family member C (S cerevisiae)
SEC24D SEC24 related gene family member D (S cerevisiae)
SH3GLB1 SH3-domain GRB2-like endophilin B1
SH3GLB2 SH3-domain GRB2-like endophilin B2
SNX30 Sorting nexin family member 30
SQSTM1 Sequestosome 1
TP53 Tumor protein p53
TP73 Tumor protein p73
TPR Translocated promoter region (to activated MET oncogene)
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (C elegans)
ULK2 Unc-51-like kinase 2 (C elegans)
ULK3 Unc-51-like kinase 3 (C elegans)
ULK4 Unc-51-like kinase 4 (C elegans)
UVRAG UV radiation resistance associated gene
WDR45L WDR45-like
WlPI1 WD repeat domain phospboinositide interacting 1
WlPI2 WD repeat domain phosphoinositide interacting 2
Actb Actin beta
B2m Beta-2-microglobulin
Gapd Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
Gusb Glucuronidase beta
Hprt1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
Pgk1 Phosphoglycerate kinase 1
Ppia Peptidylprolyl isomerase A
Rpl13a Ribosomal protein L 13a
82